AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE FILME ANTIMICROBIANO INCORPORADO COM NISINA SOBRE O CRESCIMENTO DE Staphylococcus sp*

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1 Alim. Nutr., Araraquara v.17, n.1, p.91-95, jan./mar ISSN AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE FILME ANTIMICROBIANO INCORPORADO COM NISINA SOBRE O CRESCIMENTO DE Staphylococcus sp* Nathália Ramos de MELO** Nilda de Fátima Ferreira SOARES** Nélio José de ANDRADE** Danielle Vieira LIMA** Ana Clarissa dos Santos PIRES** RESUMO: Avaliou-se a eficiência de filme antimicrobiano incorporado com nisina sobre Staphylococcus sp. em diferentes meios de cultura. Os filmes incorporados ou não com nisina passaram ou não por um processo de lavagem com NaCl 2%. Estes apresentaram espessura média de 70µm ± 0,01 µm, boa flexibilidade; porém baixa resistência ao rasgo. Em caldo Brain Heart Infusion (BHI) a avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada por meio de curva de crescimento. Observou-se menor velocidade específica de crescimento (p<0,05) do microrganismo na presença do filme incorporado com nisina não lavado. Para os meios sólidos, a avaliação antimicrobiana se deu pelo método de difusão em ágar. Em ágar Baird-Parker verificou-se zonas de inibição para os filmes incorporados com nisina, lavados ou não lavados, enquanto em Plate Count Agar (PCA), as zonas de inibição ocorreram apenas com o filme incorporado com nisina não lavado. No ágar BHI não se observou a formação de zona de inibição em nenhum dos tratamentos. Devido às diferenças da eficiência antimicrobiana do filme em diferentes meios, é importante se conhecer a composição do alimento no qual será utilizado o filme. Os filmes incorporados com nisina apresentaram eficiência antimicrobiana sobre Staphylococcus sp. e apresentaram grande potencial de uso para acondicionamento de alimentos. PALAVRAS-CHAVE: Embalagem ativa; filme antimicrobiano; bacteriocina; nisina; Staphylococcus sp.; conservação de alimentos. INTRODUÇÃO Mudanças nas práticas de armazenamento e distribuição de produtos alimentícios têm ocorrido com as novas tendências de compras e internacionalização dos supermercados devido à facilidade de importações. Estas mudanças têm resultado no aumento da distância de distribuição e, conseqüentemente, no aumento do período de estocagem dos produtos. 21 As embalagens também podem ser um fator de importância na conservação dos alimentos. Tradicionalmente, as embalagens devem ser inertes frente ao produto que é acondicionado, não interagindo com este, tendo como principal função atuar como uma barreira a impactos físicos e/ou mecânicos, reações químicas e invasão por microrganismos. No entanto, há uma nova tendência para aumentar a qualidade e a segurança dos alimentos, por meio da interação da embalagem com o alimento. 10,12 Nos últimos anos, diversos sistemas de embalagem vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de interagir de forma desejável com o produto. Esses sistemas são as embalagens ativas e/ou inteligentes, conceito inovador que vem sendo estudado por mais de 40 anos, sendo importante para a conservação de alimentos e bebidas durante a distribuição. Estas embalagens mudam as condições de acondicionamento para aumentar a vida útil e melhorar a segurança ou as propriedades sensoriais do produto, mantendo sua qualidade. Nesses sistemas, ocorre uma interação embalagem-alimento, em que as atribuições da embalagem vão além das funções de barreira contra o ambiente externo ao produto. 18 Dentre as embalagens ativas podem-se citar os absorvedores de O 2, absorvedores de etileno, indicadores de temperatura e filmes antimicrobianos. 1 Filmes antimicrobianos são filmes de resinas sintéticas ou naturais, adicionados de agentes que têm como objetivo retardar ou inibir o crescimento de microrganismos quando em contato com o produto acondicionado. A eficiência destes filmes pode ser devido à migração do agente para a superfície ou atuando apenas pelo contato. 12,13 No Brasil, o conceito de embalagem ativa vem sendo difundido recentemente, com a divulgação dos trabalhos realizados no Departamento de Tecnologia de Alimentos na Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais. Dentre os trabalhos realizados pode-se citar a incorporação de agentes antimicrobianos em filmes, usados como embalagens, na conservação de massa de pastel, queijo, salsichas, pães (submetidos a patente). 10,11,17,19 A liberação de aditivos por embalagens ativas aumenta a segurança do consumidor, uma vez que esses * Trabalho elaborado com o apoio financeiro da FAPEMIG, FINEP e CNPq. ** Departamento de Tecnologia de Alimentos - Universidade Federal de Viçosa Viçosa - MG - Brasil. 91

2 compostos, ao invés de diretamente adicionados ao alimento, são liberados de maneira controlada em sua superfície. Este controle se dá pelo tempo de contato do produto com relação ao processo de difusão. Desta forma o aditivo se encontra em menor quantidade apenas onde sua presença é requerida, isto é, na superfície do produto, onde a maior parte das deteriorações ocorrem e onde se encontra uma maior contaminação microbiana. 1,8 Estimativas do Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos calculam 76 milhões de casos de doenças alimentares por ano, com aproximadamente 5000 óbitos. Muitas destas doenças estão associadas com bactérias como Campylobacter jejuni, Clostidium perfringens, Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella sp., Staphylococcus aureus e Toxoplasma gondii. 5 No Brasil, no estado de Minas Gerais, de 1995 a março de 2001, foram verificados 112 surtos de intoxicação alimentar causados por enterotoxina estafilocócica, acometendo pessoas e provocando 17 óbitos. Destes surtos, 23 foram em função da ingestão de diversos queijos, ocasionando um óbito e 6 pela ingestão de leite e derivados, sendo estes sem óbitos. 4 A nisina é uma bacteriocina naturalmente produzida em vários alimentos fermentados, especialmente produtos lácteos. Isolada de bactérias de ácido lático, bactérias que produzem nisina em seu processo fisiológico natural já tem o seu uso aprovado em alimentos em mais de 50 países 3 e em 1988, o FDA concedeu-lhe o status de GRAS ("Generally Recognized As Safe"). A nisina, após testes toxicológicos e estudos de resistência cruzadas, foi considerada segura como aditivo, sendo digerida no sistema digestivo pela enzima - quimotripsina. 5 Cleveland et al. 5 e Bower et al. 3 mostraram a habilidade da nisina em inibir o crescimento de bactérias Gram-positivas, inclusive as patogênicas de alto risco em alimentos, como: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Clostridium botulinum, Listeria monocytogenes, entre outras. Dawson et al. 7 usaram nisina e lisozima em filmes de proteína de soja e milho para inibir o crescimento de Lactobacillus plantarum e Escherichia coli em suspensão. L. plantarum foi inibido pelo filme contendo nisina ou lisozima e a adição de EDTA aumentou o efeito inibitório dos filmes sobre a E. coli. Segundo Schillinger et al., 15 embalagens contendo bacteriocinas para controlar o crescimento de patógenos como a L. monocytogenes e S. aureus é uma área de pesquisa promissora. Além disso, segundo Oliveira 12 e Markarian, 9 o desenvolvimento de embalagens ativas utilizando agentes antimicrobianos, como a nisina têm-se destacado. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a eficiência antimicrobiana do filme de base celulósica, incorporado com nisina (patente requerida: PI ) sobre o microrganismo Staphylococcus sp. em diferentes meios de cultura. MATERIAL E MÉTODOS 1. Produção do filme de base celulósica Os filmes antimicrobianos incorporados com nisina (patente requerida) foram preparados pelo método "cast", segundo metodologia aplicada por Soares. 18 Os filmes obtidos foram submetidos ou não à lavagem com solução esterilizada de NaCl 2% na proporção de 8,2 cm 2.mL -1, mantidos sob agitação a 150 rpm por 15 min e, em seguida, secos com papel absorvente. Para identificação foram denominados como: Filme sem nisina lavado e não lavado (filmes controles) e filme incorporado com nisina lavado e não lavado. Os filmes foram cortados em amostras com diâmetros de 10 cm, pesados e submetidos à exposição de luz UV (Prodicil, 110v, 254nm) para esterilização por 2 minutos. 2. Análise microbiológica do filme incorporado com nisina Culturas de Staphylococcus sp. (de campo) foram ativadas por duas vezes em meio BHI (Merck) líquido com incubação a 37 o C por 12 horas para execução das análises pelo método da suspensão e difusão em ágar Método da suspensão O experimento foi realizado segundo metodologia de Melo. 10 Foram preparadas suspensões de Staphylococcus sp., contendo, aproximadamente, 10 3 UFC.mL -1 em caldo BHI. Nos frascos, contendo a suspensão, foram adicionadas as amostras dos filmes na proporção de 1 ml de suspensão de Staphylococcus sp., para 3 cm 2 de filme, considerando os dois lados do filme. No frasco controle não foi adicionado filme. Os frascos foram mantidos a temperatura de 37 o C sob agitação com barra magnética para a realização da curva de crescimento do microrganismo inoculado. Alíquotas da suspensão de Staphylococcus sp. foram retiradas periodicamente e o crescimento desse microrganismo avaliado por meio da densidade ótica desse meio de cultura, com auxílio de um espectrofotômetro (Pharmacia LKB, Novaspec II), no comprimento de onda 640 nm. As leituras foram realizadas até que o crescimento atingisse a fase estacionária. A eficiência do filme antimicrobiano foi avaliada comparando as velocidades específicas de crescimento (µ) calculadas a partir dos dados gerados pelas curvas de crescimentos do Staphylococcus sp. em presença das amostras preparadas e do controle sem a presença de filme. A determinação de µ foi realizada pela regressão linear dos dados plotados em um gráfico de logaritmo neperiano da densidade ótica versus tempo, considerando a fase exponencial de crescimento do Staphylococcus sp. Para análise dos resultados os dados foram submetidos à ANOVA e ao teste de Duncan, com auxílio do programa Statistical Analysis System (SAS), versão

3 2.2.2 Método de difusão em ágar O experimento foi realizado segundo metodologia de Scannell 14. Uma alíquota de 0,1 ml de uma suspensão de Staphylococcus sp., contendo, aproximadamente, 10 4 UFC.mL -1, foi espalhada sobre a superfície dos meios de cultura Plate Count Agar (PCA) (Merck), ágar Baird-Parker (Merck) e ágar Brain Heart Infusion (BHI) solidificados em placas de Petri. Sobre a inoculação foi adicionada, assepticamente, uma amostra do filme com dimensões de 1,5x1,5 cm. Este procedimento foi repetido para cada tratamento avaliado (filme sem nisina lavado e não lavado e filme incorporado com nisina lavado e não lavado). As placas foram incubadas a 37 o C por horas e a eficiência do filme antimicrobiano foi avaliada pela formação de zona de inibição nas proximidades destes. A zona de inibição é formada devido a difusão da nisina no meio sólido inoculado com Staphylococcus sp. inibindo o crescimento do microrganismo indicando a eficiência do filme antimicrobiano. As zonas de inibição foram medidas a partir do centro do filme. Todo o experimento foi realizado em triplicata. RESULTADOS E DISCUSSÃO Para a avaliação do efeito antimicrobiano dos filmes sobre Staphylococcus sp. em meio de cultura líquida, o filme incorporado com nisina e não lavado mostrou que o Staphylococcus sp. teve menor velocidade específica de crescimento (µ) (Tabela 1) demonstrando maior eficiência antimicrobiana, inibindo o crescimento do Staphylococcus sp.. O valor de µ observado para os tratamentos sem incorporação de nisina lavado e não lavado não diferiram (p<0,05) entre si. Contudo, foram inferiores ao tratamento controle (curva de crescimento gerada sem a adição de filme para avaliação), sugerindo que células do microrganismo podem ter aderido ao filme, ocasionando uma diminuição da leitura de densidade óptica e conseqüentemente uma redução da velocidade especifica de crescimento. Esta observação se faz coerente, uma vez que este filme apresenta porosidade de aproximadamente 100 µm de diâmetro, 18 podendo manter em seus poros alguns microrganismos presentes no meio, reduzindo sua presença na suspensão. O tratamento controle, ou seja, que não continha filme, apresentou µ superior a todos, permitindo a observação do crescimento do Staphylococcus sp. na ausência de qualquer efeito inibidor. O filme incorporado com nisina e submetido à etapa de lavagem não diferiu (p<0,05) do filme sem incorporação de nisina, indicando que a nisina incorporada estava fracamente ligada à superfície do filme e foi removida pelo processo de lavagem e então, pela ausência do antimicrobiano o microrganismo não teve seu crescimento inibido. A eficiência do filme antimicrobiano sobre Staphylococcus sp. crescidos em meios de cultura sólidos apresentaram diferenças (p<0,05), que foram dependentes do tipo de meio utilizado, podendo estar relacionado com a composição destes, uma vez que diferem entre si quanto a seletividade e disponibilidade de nutrientes. Toledo 20 relatou que a formação da zona de inibição é dependente da difusão da bacteriocina e da velocidade de crescimento do microrganismo. Tais parâmetros são influenciados pelo estado fisiológico da cultura indicadora, umidade do ágar, tempo de difusão da bacteriocina anterior ao início do crescimento da cultura indicadora e do próprio meio de cultura, uma vez que a composição do meio afeta tanto a velocidade de crescimento do microrganismo, quanto à velocidade de difusão da bacteriocina. Tabela 1 - Velocidade específica de Crescimento (µ) de Staphylococcus sp. em meio BHI em relação as amostras de filmes com e sem nisina e tratados ou não com lavagem em solução de NaCl 2. Tratamento Media µ (h -1 ) Sem amostra do filme Filme sem nisina e lavado Filme sem com nisina não lavado Filme com nisina lavado Filme com nisina não lavado 2,107 a 1,359 b 1,548 b 1,178 b 0,711 c * Médias seguidas de pelo menos uma mesma letra, não diferem entre si, em nível de 5% de probabilidade, pelo teste de Duncan. Em ágar Baird-Parker, os filmes antimicrobianos incorporados com nisina, submetidos ou não à etapa de lavagem, apresentaram zona de inibição com valor médio de 3,8 cm de diâmetro para ambos os tratamentos (Figura 1). Isto pode ter ocorrido devido a uma maior facilidade de difusão da nisina neste meio, até mesmo de uma pequena quantidade remanescente existente no filme lavado. FIGURA 1 - Fotografias de placas inoculadas com Staphylococcus sp. em ágar Baird-Parker, contendo amostra do filme antimicrobiano em sua superfície. Filme incorporado com nisina que sofreu o processo de lavagem (A), sem sofrer o processo de lavagem (B) e filme sem incorporação de nisina (C). 93

4 Sendo esse meio de cultura seletivo para o Staphylococcus sp., ele apresenta substâncias inibidoras para outros microrganismos reduzindo a velocidade de crescimento deste microrganismo. 20 Esta redução na velocidade de crescimento de Staphylococcus sp. permitiu que maior quantidade de nisina estivesse presente no ágar, por meio de difusão, antes do início do crescimento microbiano, aumentando, dessa forma, a zona de inibição. No Plate Count Agar (PCA), apenas o filme incorporado com nisina e não lavado apresentou formação de zona de inibição, obtendo valor médio de 2,21 cm de diâmetro (Figura 2). O meio de cultura PCA é um meio que apresenta uma riqueza de nutrientes intermediária entre os meios testados. Isto pode explicar a não formação da zona de inibição ao redor do filme com nisina que sofreu o processo de lavagem. Apesar da não observação de formação da zona de inibição observou-se que não houve crescimento microbiano na superfície de contato desse filme com o meio de cultura. Este resultado é similar ao ocorrido no experimento de Scannell et al. 14 Eles imergiram filmes de polietileno/ poliamida em solução de nisina para que ocorresse uma adsorção desta para os filmes. Como resultado eles verificaram que o filme de polietileno/poliamida apresentou inibição no crescimento do microrganismo indicador somente na superfície de contato com o meio de crescimento. FIGURA 3- Fotografias de placas inoculadas com Staphylococcus sp. em ágar BHI, contendo o filme de base celulósica em sua superfície. Filme incorporado com nisina que sofreu o processo de lavagem (A) e filme incorporado com nisina sem sofrer o processo de lavagem (B). O crescimento do microrganismo em um meio mais rico, ou seja, um meio com maior disponibilidade de nutrientes e sem nenhum agente seletivo como o existente no meio de cultura Baird-Parker (seletivo para Staphylococcus), como o ágar BHI, é mais rápido, não permitindo que a nisina presente no filme se difunda no meio a tempo de inibir o desenvolvimento microbiano. A diferença quanto à inibição microbiana nos meios de cultura sólidos pode também estar relacionada com possíveis interações da nisina com componentes do meio como mostram Sebti & Coma 16 que incorporaram nisina em filme de hidroxi-propil-metil-celulose e, por este ser altamente hidrofílico, adicionaram ácido esteárico para promover uma melhoria na barreira a umidade. Estudos anteriores realizados por estes mesmos autores, já haviam mostrado que o efeito antimicrobiano do filme é reduzido, indicando uma possível interação entre a nisina e o ácido esteárico. FIGURA 2 - Fotografias de placas inoculadas com Staphylococcus sp. em meio Plate Count Agar (PCA), contendo o filme em sua superfície. Filme incorporado com nisina que sofreu o processo de lavagem (A) e sem sofrer o processo de lavagem (B). Quando o Staphylococcus sp. foi inoculado em placas, contendo ágar BHI, não houve formação de zonas de inibição nos filmes testados (Figura 3). O ágar Brain Heart Infusion (Agar BHI) é o meio mais rico dentre os três utilizados, permitindo maior velocidade de crescimento do microrganismo, não havendo tempo suficiente para a difusão da nisina incorporada do filme para o ágar. A diferença entre os resultados dos meios BHI líquido e sólido pode estar relacionada com a diferença de difusão da nisina, visto que em meio líquido, os filmes incorporados com nisina apresentaram atividade antimicrobiana. Coma et al. 6 em seu experimento verificaram que a concentração mínima inibitória (MIC) de nisina sobre Listeria innocua e S. aureus era maior em meio sólido que no meio líquido, concordando com Blom et al. 2 que afirmaram a necessidade de um MIC maior em meio sólido devido a dificuldade de difusão da nisina para o meio. CONCLUSÃO A incorporação de nisina no filme apresentou resultados satisfatórios quanto à inibição de Staphylococcus sp.. Filme antimicrobiano incorporado com nisina, mediante os resultados obtidos, apresenta grande potencial de aplicação como embalagem ativa antimicrobiana para o acondicionamento de alimentos, reduzindo as possíveis contaminações microbiológicas destes. Uma vez verificada a diferença quanto à eficiência do filme antimicrobiano em diferentes meio de cultura e também quanto ao seu estado físico (líquidos e sólidos), nota-se a importância de se conhecer a composição e a natureza do alimento no qual o filme antimicrobiano será utilizado. Os filmes incorporados com nisina apresentaram eficiência sobre Staphylococcus sp. e, portanto, apresenta grande potencial para uso em embalagens de alimentos. As embalagens antimicrobianas podem ser de grande importância para a redução dos riscos de contaminação com patógenos e aumentar a vida útil dos alimentos. No entanto, não substituirão a boa qualidade da matéria prima e as boas práticas de fabricação a ser empregada no processamento. 94

5 MELO, N.R.; SOARES, N.F.F.; ANDRADE, N.J.; LIMA, D. V.; PIRES, A.C.S. Evaluation of the efficiency of nisinincorporated antimicrobial film on Staphylococcus sp. growth. Alim. Nutr., Araraquara, v.17, n.1,p.91-96, ABSTRACT: Efficiency of nisin-incorporated antimicrobial film was evaluated against Staphylococcus sp. in different broth and solid media. Films incorporated with nisin and films without nisin were submitted or not to washing with NaCl 2%. The films had thickness of 70µm ± 0,01 µm, good flexibility, but lower resistance to tear. Antimicrobial activity against Staphylococcus sp. in Brain Heart Infusion (BHI) was evaluated through growth curve. Smaller specific rate of growth of the microorganism (p<0,05), was observed in the presence of the non-washed nisin-incorporated film. In Baird-Parker agar there an was inhibition zone for the films incorporated with nisin, washed or non-washed, while in Plate Count Agar (PCA) the inhibition zone occurred only with non-washed nisinincorporated film. In BHI agar, there was no verified inhibition zone in any of the treatments. Because of the influence of the broth composition on the efficiency of the antimicrobial films, it is important to verify the food composition that will be in contact with the antimicrobial film. The nisin-incorporated films showed antimicrobial efficiency against Staphylococcus sp., therefore presenting potential use for food packaging. KEYWORDS: Active packaging; antimicrobial fackagin films; bacteriocins; nisin; Staphylococcus sp.; food preservation. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. APPENDINI, P.; HOTCHKISS, J.H. Review of antimicrobial food packaging. Innovative Food Sci. Emerg. Technol., v. 3, p , BLOM, H.T. et al. A model to demonstrate how intrinsic factors affect diffusion of bactericins. J. Food Microbiol., v. 38, p , BOWER, C.K. et al. Protein antimicrobial barriers to bacterial adhesion: in vitro and in vivo evaluation of nisin-treated implantable materials. Colloids Surf., v. 25, p , CARMO, L.S. Intoxicação alimentar. Minas Faz Ciênc., v.11, p.25-27, CLEVELAND, J. et al. Bacteriocins: safe, natural antimicrobials for food preservation. Int. J. Food Microbiol., v. 71, p. 1-20, COMA, V. et al. Antimicrobial edible packaging based on cellullosic ethers, fatty acids, and nisin incorporation to inhibit Listeria innocua and Staphylococcus aureus. J. Food Prot., v. 64, n. 4, p , DAWSON, P.I.; HAN, I.Y.; PADGETT, T.R. Effect of lauric acid on nisin activity in edible protein packaging film. Poult. Sci., v. 76, suppl., p. 74, GONTARD, N. Active packaging. In: SOBRAL, P.J.A.; CHUZEL, G. (Ed.) Workshop sobre biopolímeros. Pirassununga: FZEA, p MARKARIAN, J. Additives in food packaging. Plast. Addit. Compound., p , abr MELO, N.R. Avaliação de embalagem ativa por incorporação de nisina na inibição de Staphylococcus sp f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MELO, N.R. et al. Avaliação da atividade antimicrobiana de filmes incorporados com lactato de sódio em salsichas embaladas a vácuo. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, 18, 2002, Porto Alegre. Anais Porto Alegre: CBCTA, CD-ROM. 12.OLIVEIRA, L.M. Filmes plásticos incorporados de agentes antimicrobianos. Bol. Técnico Centro Tecnol. Embalagem, v. 14, n. 2, p. 4-7, QUINTAVALLA, S.; VICINI, L. Antimicrobial food packaging in meat industry. Meat Sci., v. 62, p , SCANNELL, A.G.M. et al. Development of bioactive food packaging materials using immobilized bacteriocins lacticin 3147 and Nisaplin. J. Food Microbiol., v. 60, p , SCHILLINGER, U. et al. Use of bacteriocinogenic lactic acid bacteria to inhibit spontaneous nisin-resistant mutants of Listeria monocytogenes Scott A. J. Applied Microbiol., v. 85, p , SEBTI, I.; COMA, V. Active edible polysaccharide coating and interactions between solution coating compounds. Carbohydr. Polym., v. 49, p , SILVEIRA, M.F.A. Filme antimicrobiano de acetato de celulose incorporado com ácido sórbico na conservação de massa de pastel f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, SOARES, N.F.F. Bitterness reduction in citrus juice through naringinase immobilized into polymer film f. Dissertação (Ph.D. Food Science and Technology) - Cornell University, New York, SOARES, N.F.F. et al. Inhibition of microbial growth in bread through active packaging. Packaging Technol. Sci., v. 15, p , TOLEDO, M.M. Crescimento de Lactococcus lactis Subsp. lactis NCK 400 e produção de nisina em meio à base de extratos vegetais f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, VERMEIREN, L. et al. Development in the active packaging of foods. Trends Food Sci. Technol., v. 10, p ,