AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA

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1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA Helena Luisa de Arruda Milani 1 Adriana Xavier Viana Teixeira 2 Elizabeth Cardoso de Sousa 3 Valdemir Aparecido de Abreu 4 Maria Fernanda Melo Lopes Ninahuaman 5 Resumo: O alho é pesquisado devido à sua rica composição, eficaz no tratamento de diversas patologias com ações antineoplásica, antimicrobiana, antifúngica e anti-helmíntica. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana in vitro, do extrato fresco dos bulbos de alho (Allium sativum L.), frente a cepas de bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli e do fungo Candida albicans. Foi usado o método da 1 Graduada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP). helena.a.amilani@hotmail.com. 2 Graduada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP). adrixviana@gmail.com. 3 Graduada em Ciências Biológicas pelo Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP). elizabethcardosos22@gmail.com. 4 Doutor e mestre em Farmacologia pela Universidade Estadual de Campinas. Graduado em Ciências Biológicas pela Universidade Guarulhos. valdemir.abreu@unasp.edu.br. 5 Mestre em Farmacologia pela Universidade Federal de São Paulo. Graduado em Farmácia pela Universidade Federal do Rio de Janeiro. Pesquisador do laboratório de investigação em saúde e professora do Centro Universitário Adventista de São Paulo (Unasp-SP). maria.ninahuaman@unasp.edu.br.

2 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA 48 difusão em ágar pela técnica do disco e técnica do poço com 20 µl e 100 µl de extrato fresco de Allium sativum, respectivamente. O extrato fresco foi obtido através de maceração e espremido com a ajuda de gaze. Foram usadas cepas padronizadas de Staphylococcus aureus ATCC# 6538, Escherichia coli ATCC# 8739 e Candida albicans ATCC# Como controle negativo, utilizou-se disco em branco e, como positivo, discos comerciais contendo penicilina G 10 UI, amicacina 30 µg e miconazol 50 µg. Nos testes pelo método de difusão em Agar, a medida do diâmetro do halo de inibição variou entre 20 a 70 mm e o extrato fresco de alho mostrou considerável ação antimicrobiana (p<0,001), especialmente frente à cândida e ao estafilococo, nas maiores concentrações. Conclui-se que o extrato fresco de Allium sativum, in vitro, apresenta atividade antimicrobiana em ambas as técnicas frente aos microrganismos testados. Palavras-chave: Allium sativum; Atividade antimicrobiana; Extrato fresco. Abstract: Garlic has been the subject of much research because of their rich composition making it effective in the treatment of several pathologies by anticancer, antimicrobial, antifungal and anthelmintic actions. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity, in vitro, of fresh garlic bulbs extract (Allium sativum L.) against bacterial strains Staphylococcus aureus, Escherichia coli and fungi Candida albicans. It was used the method agar diffusion by technique hard and well technique with 20 µl and 100 µl of fresh extract of Allium sativum, respectively. The fresh extract was obtained by maceration and squeezing with a gauze. We used standardized strains of Staphylococcus aureus ATCC # 6538, Escherichia coli ATCC # 8739 and Candida albicans ATCC # It was used blank disc as negative Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA control and commercial discs containing antimicrobials: penicillin G 10 UI, amikacin 30 µg and miconazole 50 µg as positive control. In tests by the agar diffusion method, measuring the diameter of inhibition zone ranged from 20 to 70 mm and fresh garlic extract showed significant antimicrobial activity (p<0,001), especially against the Staphylococcus and Candida at the highest concentrations. We conclude that the extract of fresh Allium sativum, in vitro, showed antimicrobial activity in both techniques against the tested microorganisms. Keywords: Allium sativum; Antimicrobial activity; Fresh extract. A fitoterapia é tão antiga quanto a história do ser humano. Sua citação mais antiga é encontrada no documento Rhizotomika, em que Diocles, um dos discípulos de Aristóteles, descreve com detalhes os efeitos fisiológicos das plantas medicinais (ELDIN; DUNFORD, 2001). Em países em desenvolvimento, a extração das drogas ainda é feita, muitas vezes, de forma caseira, sem controle das doses ou da observação de contraindicações ou até mesmo de efeitos colaterais (MATSUDA; NEGRAES, 2002). No Brasil, o uso de plantas medicinais passa de geração à geração, baseando-se na prática indígena, influenciada pelas culturas africana e portuguesa (MACEDO, 2004; ALMEIDA, 2011). Desde a implantação do Sistema Único de Saúde (SUS), na década de 1980, o governo estimula o uso dos recursos naturais para a promoção da saúde através de tecnologias eficazes, visando a integração do ser humano com o meio ambiente e a sociedade (BRASIL, 2001). O alho é alvo de muitas pesquisas devido à sua rica composição, tornando-o eficaz no tratamento de diversas patologias como, por exemplo: doenças endócrinas, cardiovasculares; ele ainda age como 49 Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p

4 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA antineoplásico, antimicrobiano, antifúngico e anti-helmíntico. Sua alta concentração de zinco, selênio e outras substâncias favorecem o aumento da produção de células do sistema humoral, melhorando assim o sistema imune (QUINTAES, 2001; KATZUNG et al., 2003). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antimicrobiana, in vitro, pelo método de difusão em Agar Técnica do poço e técnica do disco, do extrato fresco de Allium sativum L. frente às bactérias Staphylococcus aureus ATCC # 6538, Escherichia coli ATCC # 8739 e ao fungo Candida albicans ATCC # Método 50 Para obtenção do extrato fresco, utilizou-se 15 bulbos de Allium sativum, adquiridos no supermercado. O bulbo do alho foi prensado com auxílio de um espremedor, e a massa obtida foi colocada em um almofariz e macerada com o auxílio de um pistilo. Gaze estéril foi utilizada para espremer a massa dentro de um béquer, para obtenção do extrato bruto. Além disso, utilizou-se cepas de bactérias Gram positivas Staphylococcus aureus ATCC #6538, Gram-negativas Escherichia coli ATCC#8739 e também fungos Candida albicans ATCC#10231, padrão ATCC (American Type Culture Collection), fornecidas pelo laboratório Controlbio Assessoria Técnica e Microbiológica S/S Ltda., por serem as mais comuns no organismo humano. Foram preparados 500 ml de Agar Mueller Hinton e 300 ml de Meio Agar Sabouraud Dextrosado, conforme especificação do fabricante (Becton Dickinson e CO. Sparks). Adicionou-se 25 ml do meio em placas de Petri descartáveis 90x15 mm e 100mL em placas de 150x15mm ambas adquiridas no Laboratório J. Prolab. O procedimento Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA foi realizado em câmara de fluxo laminar (Trox Technik). Os inóculos bacterianos foram fornecidos pelo laboratório Controlbio Assessoria Técnica Microbiológica S/S Ltda., com a turvação correspondente a 0,5 na escala McFarland (equivalente a 1,5x10 8 UFC/mL), para bactérias e de 1,0 na escala de McFarland (equivalente a 3,0x10 8 UFC/mL), para leveduras. Essa concentração foi alcançada por meio do densitômetro Densimat-Biomerieux. Para o método de difusão em Ágar - Técnica do Disco e do Poço (GROVE; RANDALL, 1955), as placas contendo Agar Mueller Hinton e Sabouraud Dextrosado, preparadas antecipadamente, foram deixadas em repouso para atingir a temperatura ambiente. Flambou-se a boca de um tubo de ensaio de 10mm de diâmetro e preparou-se o poço no Agar, um por placa. O inóculo microbiano foi, então, distribuído uniformemente sobre a superfície do Agar, utilizando um swab estéril. As placas permaneceram em repouso, na temperatura ambiente, até que a solução fosse absorvida pelo Agar (aproximadamente 5 minutos). Nos respectivos poços foram dispensados 100µL do extrato fresco de alho utilizando micropipeta. Para o método de difusão Ágar - Técnica do Disco e do Poço (BAUER et al., 1966; NCCLS, 1997), utilizou-se discos de papel secos, esterilizado por radiação gama, sem impregnação, medindo 6 mm de diâmetro, fornecido pelo Laboratório CECON (São Paulo). Distribuiu-se 5 discos, em uma placa de Petri esterilizada, previamente identificada. Pipetou-se sobre os discos 20µL do extrato fresco de alho com o auxílio de uma micropipeta. Os discos ficaram em repouso em temperatura ambiente até o extrato ser absorvido completamente. Placas contendo Agar Mueller Hinton e Saboraud Dextrosado, preparadas antecipadamente, foram deixadas em repouso até atingir a 51 Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p

6 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA 52 temperatura ambiente e o inóculo foi distribuído uniformemente sobre a superfície do Agar, com swabs estéreis. Utilizando-se uma pinça esterilizada, distribuiu-se os discos impregnados com o extrato fresco de alho, um disco seco (controle negativo) e um disco contendo o antimicrobiano. Os antimicrobianos utilizados foram: penicilina G (10 UI) para bactérias Gram-positivas, amicacina (30µg) para Gram-negativas e miconazol (50µg) para leveduras (CECON, São Paulo). Os procedimentos foram realizados dentro da capela de fluxo laminar. As placas foram deixadas durante 30 minutos à temperatura ambiente para absorção do extrato fresco e, em seguida, incubadas em estufa a 37 C durante 48 horas. Ao final do período de incubação, foi observada a formação do halo de inibição do crescimento bacteriano e fúngico, medido em milímetros, utilizando-se régua milimetrada. A análise dos dados foi feita pela medida do diâmetro das zonas de inibição (halo), formadas pela amostra e pelo padrão. Os testes foram realizados em quintuplicata e os resultados expressos em mm pela média aritmética do diâmetro do halo de inibição, formado ao redor dos discos e poços nas repetições. Os resultados foram expressos como média (M) ± erro padrão (SEM) de média, e a significância avaliada pela análise de variância ANOVA (GraphPad Prism 5) seguida pelo teste de Tukey, considerando p < 0,05 como diferença significativa. Resultados Os resultados obtidos da ação do extrato fresco de alho in natura (Allium sativum L.), após a realização dos testes de Difusão em Ágar - Técnica do Disco e do Poço, apresentaram halos de inibição (mm), formados ao redor dos discos impregnados com 20 µl e dos poços, nos quais foram Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

7 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA depositados 100 µl do extrato fresco de Allium sativum L. A medida do diâmetro do halo de inibição variou entre 20 a 70 mm. Com relação a Staphylococcus aureus ATCC #6538, os halos de inibição obtidos para Penicilina G 10UI e Extrato fresco de alho (20mL) e (100mL) foram respectivamente 48,0 ± 0,01; 20,0 ± 0,0 e 63,3 ± 2,7 ***. Para Escherichia coli ATCC #8739, os halos de inibição obtidos para Amicacina 30μg e Extrato fresco de alho (20mL) e (100mL) foram respectivamente 28,0 ± 0,02; 28,0 ± 0,0 e 34,4 ± 0,2***. Para Candida albicans ATCC #10231, os halos de inibição obtidos para Miconazol 50μg e Extrato fresco de alho (20mL) e (100mL) foram respectivamente 60,0 ± 0,03; 60,0 ± 0,0 e 70,0 ± 0,0***, conforme mostrado na Tabela 1 e Figura 1. Tabela 1 - Diâmetros dos halos de inibição de crescimento bacteriano de 20 µl e 100 µl de extrato fresco de Allium sativum L., pelo Método de Difusão em Agar Técnica do Disco e do Poço respectivamente. 53 Média* ± SEM do halo de inibição (mm) Controle (n=5) Extrato fresco de Allium sativum (n=5) Microrganismos 20 µl (disco) 100 µl (poço) Staphylococcus aureus / ATCC # ,0 ± 0,0 1 20,0 ± 0,0 63,3 ± 2,7 *** Escherichia coli /ATCC # ,0 ± 0,0 2 28,0 ± 0,0 34,4 ± 0,2 *** Candida albicans /ATCC # ,0 ± 0,0 3 60,0 ± 0,0 70,0 ± 0,0 *** Controle de antimicrobianos: 1) Penicilina G 10UI; 2) Amicacina 30μg, 3) Miconazol 50μg. ANOVA (teste Tukey) (***) estatisticamente significativo frente ao do controle positivo p<0,001. Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p

8 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA S. aureus E. coli C. albicans 54 Figura 1 - Diâmetro dos halos de inibição de crescimento de Staphylococcus aureus ATCC #6538, Escherichia coli ATCC #8739 e Cândida albicans ATCC #10231, frente aos antibióticos específicos Penicilina G 10UI (PEN), Amicacina 30μg (AMI), Miconazol 50μg (MCZ) e Extrato fresco de Alium sativum L., 20 µl e 100 µl pelo Método de Difusão em Agar Técnica do Disco (Alho D) e do Poço (Alho P) Alho Prespectivamente. estatisticamente significativo frente ao do controle positivo p<0,001. Discussão Amaral (2006) considera o Brasil como um dos países de maior diversidade vegetal, com 55 mil espécies catalogadas e inúmeras plantas com potencial terapêutico. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) o comércio de medicamentos fitoterápicos no Brasil é calculado em torno de 5% do mercado total de remédios (CORREA; ALVES, 2008). O alho (Allium sativum L.) é utilizado como tratamento de diversas doenças desde a antiguidade e estudos recentes confirmam sua ação antimicrobiana (VENTUROSO et al., 2011; FONSECA et al., 2014). Ele também possui alta concentração de fitoquímicos, relacionados à Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

9 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA resposta da planta às agressões de ambientes inóspitos. A maior concentração de fitoquímicos está nos bulbos, mais conhecidos como dentes de alho (MARCHIORI, 2006). Quintaes (2008) reporta que o extrato de alho fresco diluído 128 vezes apresenta resultados significativos, demonstrando o potencial de inibição em cerca de 14 espécies de bactérias, entre elas Escherichia coli e Staphylococcus aureus, responsáveis por danos à saúde humana. Em um estudo de revisão sobre propriedades funcionais do alho, Marchiori (2006) afirma que ele apresenta ação antimicrobiana, tanto contra bactérias Gram positivas e Gram negativas quanto contra vírus e fungos como Candida albicans. O extrato fresco de Allium sativum L., (20µL), impregnado nos discos, não apresentou atividade antibacteriana significativa frente à cepa de Staphylococcus aureus ATCC #6538, quando comparado à ação da penicilina testada. No entanto, o mesmo volume testado em Escherichia coli ATCC #8739 demonstrou o mesmo grau de eficiência antimicrobiana da Amicacina testada e a mesma ação antifúngica do Miconazol frente à cepa de Cândida albicans ATCC #10231, sugerindo uma ação promissora. Extratos aquosos e hidroalcoólicos de Allium sativum L., bem como discos de alho fresco, possuem efeito inibitório sobre o crescimento de bactérias e fungos (OTA et al., 2010; VENTUROSO et al., 2011; FONSECA et al., 2014). O aumento da concentração do extrato fresco de Allium sativum L. para 100µL, no método de difusão em Ágar - Técnica do Poço, demonstrou que o alho apresentou atividade antimicrobiana estatisticamente significativa contra Staphylococcus aureus ATCC #6538 e Escherichia coli ATCC #8739, quando comparado ao controle positivo, Penicilina e Amicacina 55 Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p

10 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA (p<0,001), respectivamente. Da mesma forma, o alho apresentou uma ação antifúngica expressiva contra Cândida albicans ATCC #10231, quando comparada à ação do Miconazol, demonstrando assim, a eficiência do alho como antimicrobiano. Considerações finais 56 Nossos resultados, com a utilização do extrato fresco de Allium sativum L., frente às culturas de Staphylococcus aureus ATCC #6538, Escherichia coli ATCC #8739, corroboram as informações publicadas sobre a eficiência do alho como agente antimicrobiano. Da mesma forma, demonstram também uma ação antifúngica frente à Candida albicans ATCC # Em ambos os casos, os resultados foram notadamente significativos (p<0,001), com a maior concentração do extrato fresco de alho (100 µl), em relação aos antimicrobianos comerciais utilizados no presente estudo. Assim, novos experimentos devem ser ainda efetuados, com a finalidade de se empregar o extrato fresco de Allium sativum L., como opção para o uso de antibióticos naturais. Referências ALMEIDA, M. Z. Plantas medicinais. 3. ed. Salvador: EDUFBA, AMARAL, C. F.; RODRIGUES, A. G.; RIBEIRO, J. E. G.; SANTOS, M. G.; JUNIOR, N. L. N. A fitoterapia no SUS e o programa de pesquisas de plantas medicinais da central de medicamentos. Brasília: Ideal Ltda., Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp

11 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO DO ALHO (ALLIUM SATIVUM) IN NATURA BAUER, A. W.; KIRBY, W. M.; SHERRIS, J.C; TURCK, M. Antibiotic susceptibility testing by standartized single disk method. American Journal of Clinical Pathology, v. 45, p , CORRÊA, C. C.; ALVES A. F. Plantas Medicinais como ALTERNATIVA DE Negócios- Caracterização e Importância. Maringá, Disponível em: < Acesso em: 13 set ELDIN, S.; DUNFORD, A. Fitoterapia: na atenção primaria à saúde. Barueri: Editora Manole Ltda., FONSECA, G. M.; PASSOS, T. C.; NINAHUAMAN, M. F. M. L.; CAROCI, A. S.; COSTA, L. S. Avaliação da atividade antimicrobiana do alho (Allium sativum Liliaceae) e de seu extrato aquoso. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, v. 16, n. 3, p , GROVE D. C.; RANDALL, W. A. Assay methods os antibiotic: a laboratory manual. New York: Medical Encyclopedia, KATZUNG, B. G. Farmacologia Básica e Clínica. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, MACEDO, M.; FERREIRA, A. R. Plantas hipoglicemiantes utilizadas por comunidades tradicionais na Bacia do Alto Paraguai e Vale do Guaporé, Mato Grosso - Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 14, p , MARCHIORI, V. F. Propriedades funcionais do alho (Allium sativum L.), Disponível em: < Acesso em: 20 ago Acta Scientia Biologica. v. 1, n. 1, p

12 ACTA SCIENTIA BIOLOGICA MATSUDA, A. H; NEGRAES P. F. Fitoterápicos: Complementos Nutricionais ou Medicamentos? In: TORRES, E. A. F. S. Alimentos do milênio: a importância dos transgênicos, funcionais e fitoterápicos para a saúde. São Paulo: Signus, NCCLS. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests: approved standard. Villanova: NCCLS Publication M2-A5, OTA, C. C. C.; SILVA, D. V. G.; JACON, K. C.; BAURA, V.; NUNES, S. Avaliação da atividade antimicrobiana e anti-inflamatória do extrato hidroalcoólico do Allium sativum (alho), Disponível em: < Acesso em: 16 out QUINTAES, K. D. Alho, nutrição e saúde. Revista Nutri Web, v. 3, Disponível em:< Acesso em: 19 set VENTUROSO, L. R.; BACCHI, L. M. A.; GAVASSONI, W. L.; CONUS, L. A.; PONTIM, B. C. A.; BERGAMIN, A. C. Atividade antifúngica de extratos vegetais sobre o desenvolvimento de fitopatógenos. Summa Phytopathologica, v. 37, n. 1, p , Centro Universitário Adventista de São Paulo - Unasp