Farmacêutica, egressa do curso de Farmácia do CEULJI/ULBRA,

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1 1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIBACTERIANA DO EXTRATO AQUOSO DE FOLHAS DE JAMBO (Syzygiummalaccense (L.)) Lisiane Marculino Costa 1, Anatiele Pigoli Siqueira 2, Wesley Pimenta Cândido 3, Natália Vallejo Malavasi 4 RESUMO O Syzygiummalaccense (Myrtaceae), conhecido popularmente como jambeiro vermelho, é uma árvore frutífera, geralmente empregada de forma ornamental e também utilizada como planta medicinal. No Brasil a espécie é encontrada na região Norte, Nordeste e regiões quentes do Sudeste, onde o chá de folhas da planta é utilizado no tratamento de diabetes, hipertensão, infecções, inflamações e várias enfermidades. Estudos apontaram que o S. malaccenseapresentou atividade antibacteriana, antiviral, antinflamatória, dentre outras. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antibacteriana do extrato aquoso de folhas de S. malaccense frente às cepas de Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella e Staphylococcus aureus,através da técnica de difusão em disco. Como controles positivos foram utilizados antibióticos específicos para cada bactéria. Os resultados demonstraram que o extrato aquoso de S. malaccense não apresentou atividade antibacteriana relevante sobre S. aureus, no entanto, frente à Escherichia coli, Salmonella spp. e Shigella, apresentou atividade altamente significativa. Dessa forma, comprova-se que a planta realmente pode exercer um efeito terapêutico, assegurando o uso etnofarmacológico do S. malaccense pela população. Palavras-chave: Syzygiummalaccense, atividade antimicrobiana, extrato aquoso. 1 Farmacêutica, egressa do curso de Farmácia do CEULJI/ULBRA, (lisi.marc@hotmail.com) 2 Farmacêutica, egressa do curso de Farmácia do CEULJI/ULBRA, (natypigoli@gmail.com) 3 Discente do curso de Biomedicina do CEULJI/ULBRA, (wesleyeletrotec17@gmail.com) 4 Biomédica e Doutora em Tecnologia Nuclear- Aplicações, Docente do CEULJI/ULBRA (natmalavasi@bol.com.br)

2 2 INTRODUÇÃO De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) cerca de 80% da população mundial já utilizou algum tipo de planta na busca de alívio de alguma sintomatologia dolorosa ou desagradável. No Brasil, grande parte da população faz o uso de plantas medicinais. Algumas das espécies utilizadas têm exclusivamente a função terapêutica, outras, são árvores frutíferas, que através do conhecimento etnofarmacológico, também são empregadas para o tratamento de diversos processos patológicos (Martins et al., 1998). Nos últimos anos, a resistência de micro-organismos patogênicos a múltiplos fármacos tem aumentado devido ao uso indiscriminado de antimicrobianos, comumente comercializados e empregados no tratamento de doenças infecciosas. Essa situação tem forçado os cientistas à busca de novos medicamentos, sendo que os vegetais são uma excelente opção, tendo em vista que a diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior àquela derivada dos processos de síntese química (Novais et al., 2003). O jambeiro-vermelho (Syzygiummalaccense (L.)) originário do continente asiático, da Índia e de algumas ilhas da Malásia, pode ser encontrado na região Norte, Nordeste e Sudeste do Brasil (Silva, 2001; Donadio et al., 1998). No Brasil, diversas partes da planta são utilizadas como medicamentos para constipação, diabetes, diarreia, tosse, catarro pulmonar, inflamações, dor de cabeça, entre outras doenças. Frutos sem sementes, sementes, cascas e folhas tem demonstrado atividade antibacteriana e exercem algum efeito sobre a pressão arterial e a respiração (Santos, 2013). As espécies da família Myrtaceae são uma rica fonte de compostos fenólicos biologicamente ativos. Na espécie S. malaccense, estudos têm demonstrado o efeito antiviral e antibacteriano (Locher et al., 1995). Em estudos fitoquímicos foi comprovada a presença de taninos, ácidos, flavonoides e xantonas, compostos que apresentam atividade antioxidante, antinflamatória, antitumoral e anticarcinogênica (Reynertson et al., 2008). Sendo o S. malaccense utilizado pela população como planta medicinal para diversos fins, dentre eles para infecções, considerando a biodiversidade vegetal da região Norte e a necessidade da descoberta de novas moléculas bioativas, é de grande relevância o estudo do potencial antimicrobiano de plantas dessa região.

3 3 O objetivo deste trabalho foi analisar a atividade antibacteriana do extrato aquoso de folhas de S. malaccense em diferentes concentrações frente às cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella spp. e Shigella, utilizando o método de Kirby-Bauer (método de disco-difusão), técnica laboratorial empregada para medir a sensibilidade in vitro das bactérias aos agentes antimicrobianos. Método recomendado e padronizado pelo documento do ClinicalandLaboratory Standards Institute CLSI/NCCLS (M2-A8) (Bauer et al., 1966). MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal e preparo do extrato e diluições As folhas foram coletadas sempre no período da manhã, durante os meses de agosto e setembro, na cidade de Ji-Paraná, Estado de Rondônia, Brasil. O material foi submetido aos processos de herborização e identificado pela botânica Josiane Bessa. Uma exsicata do espécime Syzygiummalaccensefoi incorporada, sob o número 251, ao acervo do herbário Antônio Dalla Martha (JPCU) da Instituição de Ensino Superior Centro Universitário Luterano de Ji-Paraná. O extrato aquoso das folhas foi preparado segundo dados da medicina popular, de acordo com a concentração geralmente utilizada pela população. O chá é feito por decocção, utilizando cerca de 20 folhas verdes (~150,5 g) de S. malaccense em 2 litros de água, o decocto é mantido em processo de fervura até que evapore metade do volume de água, obtendo uma concentração final de 0,15 g/ml. Partindo do extrato de maior concentração (1,2g/mL), foram feitas diluições seriadas à razão de 2, dessa forma, totalizando 7 diferentes concentrações: 1,2g/mL, 0,6g/mL, 0,3g/mL, 0,15g/mL, 0,075g/mL, 0,037g/mL, 0,018 g/ml. Preparo dos discos Os discos foram devidamente esterilizados em autoclave, assim como todo material utilizado. Foram utilizados discos de papel filtro Quanty faixa azul de 6 mm de diâmetro, que foram embebidos individualmente com 10 μl da concentração correspondente e mantidos em dessecador durante 48 horas. Após este período, foram armazenados em recipientes estéreis e mantidos a 2ºC até a utilização.

4 4 Microrganismos As linhagens bacterianas utilizadas neste estudo foram, uma cepa Gram-positiva, a Staphylococcus aureus, e três Gram-negativas, Salmonella spp. e Shigella e Escherichia coli (ATCC 25922), as cepas foram obtidas a partir da bacterioteca do Centro Universitário Luterano de Ji-Paraná - CEULJI/ULBRA. Foram transferidas para meio líquido BHI (infuso cérebro coração Brain Heart Infusion) e a suspensão bacteriana foi ajustada de acordo com a turvação em água destilada e estéril até a escala de 0,5 de Mac Farland (aproximadamente 1,5 x 10 6 UFC/mL). Ensaios de atividade antibacteriana Foram dispensados 80 μl de cada suspensão de bactérias, convenientemente diluídas, em placas de Petri contendo o meio ágar Müeller-Hinton. Com o auxílio da alça de Drigalski a suspensão foi espalhada uniformemente por toda superfície do ágar, aguardado 5 minutos, de maneira que o excesso de líquido presente na superfície fosse absorvido antes da aplicação dos discos (CLSI/NCCLS). Com uma pinça de metal estéril, os discos, contendo as diferentes concentrações, foram colocados sobre o ágar, e a seguir as placas foram incubadas em estufa a 37ºC durante 24 horas. Para verificar a sensibilidade bacteriana foram utilizados discos de amoxicilina (20 μg) para S. aureus, ciprofloxacino (5μg) para Salmonella spp. e Shigella, e ceftriaxona (30μg) para E. coli, e como controle negativo (água destilada estéril). Os ensaios foram realizados em triplicatas. Após o período de incubação foi realizada a leitura, observando os halos de inibição de crescimento bacteriano, quantificados em milímetros com o auxílio de uma régua. Halos com diâmetro maior que 6 mm foram considerados com ação antibacteriana positiva (Bona et al., 2014). Os dados foram tabulados utilizando o software Microsoft Office Excel 2007, as análises estatísticas foram realizadas com programa GraphpadPrism 5.01, com análise de variância ANOVA seguida do teste de Tukey com análise de significância para p<0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na Tabela 1, observa-se os resultados do teste da atividade antimicrobiana com diferentes concentrações do extrato aquoso de folhas de S. malaccense frente à cepa de Escherichia coli. Houve formação de halo de inibição em seis das sete concentrações

5 5 testadas, sendo a diluição de maior concentração (1,2 g/ml) a única que não apresentou halo. As concentrações entre 0,6 e 0,075 g/ml demonstraram halos com valores acima de 6 mm diâmetro que quando foram submetidos a análise de variância não apresentaram diferença significativa, no entanto, segundo Bona et al. (2014), quando ocorre a formação de um halo de inibição maior que 6 mm de diâmetro a atividade antimicrobiana é considerada positiva. TABELA 1. Médias dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento bacteriano (mm), obtidos a partir de diferentes concentrações do extrato aquoso de folhas de Syzygiummalaccense frente à cepa de Escherichia coli. (-) não houve formação de halo de inibição. *** p<0,0001 (Teste de Tukey ANOVA). Nas concentrações de 0,6, 0,3, 0,15 e 0,075 g/ml, as médias dos diâmetros dos halos tiveram um crescimento inversamente proporcional às diluições, quanto menor a concentração, maior foi o tamanho do halo (6,33, 6,67, 7,33 e 7,67 mm, respectivamente), demonstrando a ocorrência de atividade antibacteriana. Nas duas menores concentrações (0,037 e 0,018 g/ml) as médias dos halos foram iguais, com 9,33 mm de diâmetro, evidenciando um resultado altamente significativo em relação ao controle negativo (p<0,0001). Diâmetros dos halos (mm) Controle negativo - H2O 1,2 - Diferentes 0,6 6,33 ± 0,58 0,3 6,67 ± 0,58 concentrações 0,15 7,33 ± 0,58 (g/ml) 0,075 7,67 ± 1,15 0,037 9,33 ± 0,58 *** 0,018 9,33 ± 0,58 *** Controle positivo Ceftriaxona 13,00 ± 0,00 A atividade antibacteriana do extrato aquoso de folhas de S. malaccense frente a E. coli verificada no presente estudo apresentou halos de inibição relevantes, corroborando com os resultados encontrados por Loguercio e colaboradores (2005), que avaliaram a atividade antimicrobiana de extrato hidroalcoólico de Syzygiumcumini (Myrtaceae), o qual apresentou atividade antibacteriana significante sobre esta mesma

6 6 bactéria. No entanto, diferindo dos resultados mencionados por Melo (2009), no qual ensaios com o extrato aquoso de folhas de S. malaccense submetido à E. coli demonstrou atividade insatisfatória, e da avaliação feita por Silva et al. (2007), que também analisou a atividade antimicrobiana de extrato hidroalcoólico de Syzygiumcumini, porém não ocorreu formação de halos frente à E. coli. A ação antimicrobiana expressiva demonstrada pelo extrato aquoso de S. malaccense pode estar relacionada à presença de compostos terpenoides. Nos vegetais, sabe-se que desempenham numerosos papéis vitais na fisiologia, exercendo um papel de comunicação, defesa e evolução nas plantas. Porém, o mecanismo de ação dos terpenoides ainda não foi totalmente esclarecido, entretanto, supõe-se que envolve o rompimento da membrana celular por compostos lipofílicos (Cowan, 1999), dado que pode confirmar a atividade exercida sobre a E. coli, espécie que possui parede celular com alto teor lipídico. Observa-se na Tabela 2 as médias dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento microbiano frente à cepa de Salmonella spp. A partir das diferentes concentrações do extrato aquoso de folhas de S. malaccense, obteve-se a formação de halos que variam de 6,33 a 9,67 mm de diâmetro. TABELA 2. Médias dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento bacteriano (mm), obtidos a partir de diferentes concentrações do extrato aquoso de folhas de Syzygiummalaccense frente à cepa de Salmonella spp. Diâmetros dos halos (mm) Controle negativo - H2O 1,2 9,00 ± 0,00 *** Diferentes 0,6 7,00 ± 1,00 0,3 6,33 ± 0,58 concentrações 0,15 6,33 ± 0,58 (g/ml) 0,075-0,037 9,67 ± 1,15 *** 0,018 - Controle positivo Ciprofloxacino 13,00 ± 0,00 (-) não houve formação de halo de inibição. *** p<0,0001 (Teste de Tukey ANOVA).

7 7 As concentrações 0,3 e 0,15 g/ml, ambas demonstraram halos de 6,33 mm, a diluição de 0,6 g/ml apresentou halo de 7,0 mm, demonstrando a presença de atividade antibacteriana. As concentrações 1,2 e 0,037 g/ml apresentaram halos de inibição de 9,0 e 9,67 mm de diâmetros, respectivamente, sendo as diluições que expressaram resultados mais significativos frente à Salmonella spp. Os resultados obtidos assemelham-se aos encontrados por Loguercio et al. (2005), nos quais o extrato hidroalcoólico de Syzygiumcumini revelou atividade antimicrobiana bastante significativa quando submetido à Salmonellaspp, tal atividade pode ter ocorrido devido à presença de flavonoides como a miricetina, mearnsetina, quercitina, quercitrina e rutina, os quais foram isolados do S. malaccense (Reynertson et al., 2008; Oliveira et al. 2006). Os flavonoidespossuem a capacidade de modular a atividade enzimática e de afetar sistemas biológicos, sendo as principais razões atribuídas às diferentes atividades destes compostos (Flambó, 2013). Na Tabela 3, constata-se a ação antibacteriana do extrato de folhas de S. malaccense, em diversas concentrações, sobre a bactéria Shigella. Podendo ser observada a formação de halos de inibição maiores do que 6 mm de diâmetro. TABELA 3. Médias dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento bacteriano (mm), obtidos a partir de diferentes concentrações do extrato aquoso de folhas de Syzygiummalaccense frente à cepa de Shigella. Diâmetros dos halos (mm) Controle negativo - H2O 1,2 9,00 ± 0,00 *** Diferentes 0,6 6,33 ± 0,58 0,3 - concentrações 0,15 - (g/ml) 0,075 8,00 ± 1,00 *** 0,037-0,018 - Controle positivo Ciprofloxacino 23,00 ± 0,00 (-) não houve formação de halo de inibição. *** p<0,0001 (Teste de Tukey ANOVA).

8 8 De sete diluições testadas frente à Shigella, somente três apresentaram atividade antimicrobiana, na qual a concentração 0,06 g/ml apresentou halo de 6,33 mm, e as diluições de 0,075 g/ml e 1,2 g/ml demonstraram halos com resultados altamente significativos, 8,0 e 9,0 mm de diâmetro, respectivamente. Dessa forma, reforçando os estudos realizados por Silva e colaboradores (2007), que testaram o extrato hidroalcoólico de Syzygiumcumini frente à Shigella, o qual apresentou atividade antibacteriana considerável, resultando em médias de halos de inibição de 8,3 mm de diâmetro, bem parecidas com as médias apresentadas nesse estudo. Pressupõe-se que atividade antibacteriana demonstrada sobre a Shigella seja devido a compostos presentes no S. malaccense como catequinas (Noreen et al., 1998), flavonoides (Oliveira et al., 2006; Melo, 2009), taninos (Melo, 2009) e terpenos (Melo, 2009). Os resultados das médias dos diâmetros dos halos de inibição do crescimento bacteriano frente à cepa de Staphylococcus aureus não demonstrou atividade antibacteriana, tendo em vista que os halos variaram entre 6,33 e 7,33 mm de diâmetro, não obtendo diferença significativa em relação ao controle negativo. Resultado este que não corrobora com a avaliação feita por Melo (2009), o qual demonstrou atividade antibacteriana altamente significativa sobre à cepa de S. aureus. No estudo de Melo (2009) foram isolados flavonoides e taninos do extrato aquoso. O termo tanino refere-se a um grupo de substâncias que tem propriedades de adstringência e são encontradas na maioria dos órgãos vegetais, muitas atividades fisiológicas humanas tem sido atribuídas a ação dos taninos (Cowan, 1999). Mediante a diferença observada entre este estudo e o de Melo (2009), deve-se considerar possíveis variações nos compostos químicos da espécie devido a fatores geográficos (clima, localidade, estação do ano). Este estudo apontou que o extrato aquoso de folhas de S. malaccense apresentou atividade relevante em três cepas bacterianas das quatro testadas, constatando que a espécie realmente apresenta ação antibacteriana e pode ser uma opção terapêutica através de seu uso como planta medicinal, no entanto, em concentrações adequadas. O uso irracional de antimicrobianos tem constituído nas últimas décadas, uma das maiores causas de surgimento de micro-organismos multirresistentes, diante deste fato, se torna indispensável a constante busca por novas opções terapêuticas, neste

9 9 cenário plantas de uso etnofarmacológico são fontes promissoras para o desenvolvimento de novos medicamentos derivados de vegetais (Cowan, 1999). CONCLUSÕES O extrato aquoso de folhas da planta Syzygiummalaccense (L.) (jambo), utilizando a metodologia de difusão em disco, não apresentou halos considerados significativos, quando comparados ao controle negativo, sobre a Staphylococcus aureus. Porém, houve a formação de halos de inibição de crescimento bacteriano frente às cepas de Escherichia coli, Salmonella spp. e Shigella, demonstrando atividade antibacteriana relevante. Tais dados indicam que o S. malaccense pode ser uma opção considerável no tratamento de enfermidades causadas por essas espécies de bactérias. No entanto, estudos in vivo, estudos para determinar uma concentração ótima e que avaliem o mecanismo de ação dos compostos fitoquímicos presentes no S. malaccense são necessários para melhor entendimento de suas propriedades antimicrobianas e terapêuticas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAUER, A.W. et al. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. American Journal of Clinical Pathology, v.45, n.4, p , Disponívelem: < Acesso em: 09 out BONA, E.A.M. et al. Comparação de métodos para avaliação da atividade antimicrobiana e determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) de extratos vegetais e aquosos e etanólicos. Arquivos do Instituto Biológico. v.81, n.3, p , Disponível em: < Acesso em: 25 set ClinicalLaboratory Standards Institut CLSI. Padronização dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos por Disco-difusão: Norma Aprovada - 8ª ed. M2- A8. v.23, n.1. Substitui a Norma M2-A7, v.20, n.1, COWAN, M.M. Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews, v.12, n.4, p , Disponível em: < Acesso em: 09 out DONÁDIO, L.C.; NACHTIGAL, J.C.; SACRAMENTO, C.K. Frutas Exóticas. Jaboticabal: Funep, p.

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