ATIVIDADE SANIFICANTE DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON FLEXUOSOS CONTRA BIOFILMES SIMPLES FORMADOS POR PSEUDOMONAS AERUGINOSA

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1 ATIVIDADE SANIFICANTE DO ÓLEO ESSENCIAL DE CYMBOPOGON FLEXUOSOS CONTRA BIOFILMES SIMPLES FORMADOS POR PSEUDOMONAS AERUGINOSA PENNO, Taciara do Amaral 1 ; SHUCH, Vanessa 1 ; GRIS, Claudia Regina 1 ; SILVEIRA, Sheila Mello da 2 ; MILLEZI, Alessandra Farias Discente do curso Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense campus Concórdia, Bolsista PIBIT /CNPq CEP: Concórdia SC Brasil. Telefone: (49) (pennotaci@gmail.com). 2- Docente do curso Engenharia de Alimentos, Instituto Federal Catarinense campus Concórdia CEP: Concórdia SC Brasil. Telefone: (49) (sheila.silveira@ifcconcordia.edu.br ). 3- Orientadora, Docente do curso de Agronomia, Instituto Federal Catarinense campus Concórdia CEP: Concórdia SC Brasil. Telefone: (49) (alessandra.millezi@ifcconcordia.edu.br ). 1- INTRODUÇÃO As bactérias, em sua maioria, vivem em comunidades de alto grau de complexidade, isso ocorre quando estão em seu habitat natural, as quais são associadas a superfícies bióticas ou abióticas, podendo assim formar um biofilme (CAIXETA, 2006). Biofilmes são formados basicamente por bactérias e biopolímeros extracelulares que elas produzem (ARCURI, 2000). O termo biofilme com associação a uma superfície sólida, associa-se a matriz de células viáveis, ou seja, biologicamente ativas, (KUMAR, 1998) e substâncias poliméricas extracelulares (MILLEZI, 2012). Biofilme ainda pode ser definido como um consórcio funcional de microrganismos que foram aderidos a uma superfície e onde ocorre sua incorporação nas substâncias poliméricas produzidas pelos microrganismos (KUMAR, 1998). Em indústrias de alimentos, os biofilmes podem ser benéficos, em alguns casos (MACÊDO, 2000), mas também podem causar sérios problemas quando formados em superfícies (MILLEZI et al., 2012) Por exemplo, em estações de tratamento de água ou efluentes, produção de vinagre, produção de ácido cítrico, além de aplicações farmacêuticas através de produção de metabólitos secundários (XAVIER, 2008). Em outros casos, microrganismos patogênicos podem se aderir e crescer em superfícies alimentares e nos ambientes de processamento, podendo assim ocorrer contaminação cruzada (MILLEZI et al., 2012). Cymbopogon flexuosos é uma planta conhecida como capim-limão, pertence à família Poaceae (Gramuneae), há também o Cymbopogon citratus, que é conhecido por capim-limão, assim como o Cymbopogon flexuosos. As plantas são do mesmo gênero e

2 apresentam características muito semelhantes devido a isso. Os chás das folhas de ambas as espécies são utilizados como calmante na medicina tradicional (SILVA, 2010). Pseudomonas aeruginosa é bactéria com forma de bacilo reto ou curvo, é Gram negativa e aeróbia estrita, pertence à família Pseudomonadaceae, é móvel com flagelo polar. Apresenta reação positiva para catalase e oxidase, além de ser capaz de utilizar uma grande variedade de compostos orgânicos, e ainda produz pigmentos hidrossolúveis, enzimas proteolíticas e lipolíticas (FRANCO,2005). Esse trabalho teve por finalidade avaliar a capacidade sanificante do óleo essencial Cymbopobon flexuosos, para eliminar os biofilmes simples formados pela bactéria patogênica Pseudomonas aeruginosa. 2- MATERIAIS E MÉTODOS As análises do presente experimento foram realizadas no laboratório de Microbiologia de Alimentos do Instituto Federal Catarinense Câmpus Concórdia. Foi utilizada no experimento cepa de Pseudomonas aeruginos, que se encontrava liofilizada, assim, foi recuperada previamente por inoculação em Ágar Nutriente (AN) e mantida em placa de petri sob refrigeração. A partir da cultura em estoque foi inoculado duas alçadas da bactéria em 50 ml de Caldo Triptona de Soja (TSB), sendo esse incubado a 35ºC por 24 horas. Para a padronização do inóculo foi realizada a leitura em ELISA com absorbância de 630nm e depois realizado o cálculo baseado na curva de crescimento da bactéria em questão, para obter UFC ml -1. Foram inoculados 200 µl em cada poço da placa de 96 poços, e assim incubado a 35ºC por 24 horas com 80 rotações por minuto em Shaker orbital. Após a incubação, descartou-se o conteúdo da placa, lavou-se a placa com água destilada estéril e secou-se próximo a chama, prosseguindo então para a adição do óleo essencial. Foram testadas três concentrações 0,39%, 0,78% e 1,56%, e deixado agir por 15 minutos, lavando novamente a placa com água destilada estéril e secando próximo a chama. Desde modo podendo prosseguir para as diferentes análises de quantificação da biomassa (CV) e de atividade metabólica (MTT). Para a análise de quantificação de biomassa, após a ação do óleo nos poços, adicionou-se metanol, deixando-o agir por 15 minutos, descantando novamente o

3 conteúdo e secando próximo a chama, assim adicionando cristal violeta, deixando agir por 5 minutos, lavou-se a placa em água corrente com baixa vazão, secou-se próximo a chama, adicionou-se ácido acético 33% para então realizar a leitura em Elisa com OD 630 nm. Para a análise de atividade metabólica, após a ação do óleo nos poços, adicionou-se a solução de MTT, a placa foi incubada por duas horas e 30 minutos, após foi realizada a leitura em Elisa com OD 630 nm. 3- RESULTADOS E DISCUSSÃO Óleos essenciais são muito utilizados, devido sua propriedade antibacteriana antifúngica e inseticida, que podem ser observadas na natureza, tornando-se importantes para algumas áreas como: alimentos, perfumaria, cosméticos, farmacêutica e agronomia (OLIVEIRA, 2013). Os óleos essenciais têm seus compostos divididos em dois grupos de origem biossintética, o principal grupo dos terpenos e o outro dos fenilpropanóides. A primeira interação estre a célula microbiana e o óleo essencial podem ser por difusão passiva da molécula, onde em bactérias Gram-positivas e fungos se dá por meio da parede celular, e em bactérias Gram-negativas por meio da membrana externa (OLIVEIRA, 2013). A partir dos valores gerados pela leitura em Elisa, nas análises de MTT e CV, foram realizados os cálculos de média e desvio padrão, após aplicou-se o teste de ANOVA pelo método de Bonferroni: Compare Select Pairs of Columns, tendo 99% como nível de significância, gerando assim os seguintes gráficos. Figura 1 - Resultado da análise de CV, utilizando óleo essencial C. flexusosos, como sanificante.

4 A figura 1 apresenta os resultados obtidos para a análise de CV, a qual determina a quantificação de biomassa do biofilme. O controle apresentou translucidez próxima a 1,2 em OD 630 nm, enquanto nos poços que foi realizada a aplicação do óleo essencial apresentou translucidez em torno de 0,4 em OD 630 nm. Comparando o resultado do controle com os resultados dos tratamentos, pode-se observar boa redução da quantidade de biomassa, por meio de análise estatística essa redução foi significativa (P<0,05). Figura 2 - Resultado da análise de MTT, utilizando óleo essencial C. flexusosos, como sanificante. A figura 2 apresenta os resultados obtidos para a análise de MTT, a qual determina a atividade metabólica do biofilme. O controle apresentou translucidez próxima a 1,2 em OD 630 nm, enquanto nos poços que foi realizada a aplicação do óleo essencial apresentou translucidez em torno de 0,4, na mesma faixa de leitura. Comparando o resultado do controle com os resultados dos tratamentos, pode-se observar boa redução da atividade metabólica, por meio de análise estatística essa redução foi significativa (P<0,05). 4- CONCLUSÃO As análises realizadas, para avaliar a eficiência do óleo essencial de C. flexuosos na eliminação de biofilmes formados por P. aeruginosa, apresentaram bons resultados, mostrando assim que o óleo essencial é capaz de reduzir o biofilme, concluindo-se que houve boa eficiência como sanificante contra a bactéria estudada.

5 REFERÊNCIAS ARCURI, E. F. Biofilmes bacterianos na indústria de alimentos. Revista Leite e Derivados. 53, v. 9, p , CAIXETA, D. S. Sanificantes químicos no controle de biofilmes formados por duas espécies de Pseudomonas em superfície de aço inoxidável Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola) Universidade Federal de Lavras, Lavras. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M Microbiologia de Alimentos. São Paulo: Atheneu. KUMAR, C. G.; ANAND, S. K. Significance of microbial biofilms in food industry: a review. International Journal of Food Microbiology. 42, p 9-27, MACÊDO, J. A. B. Biofilmes bacterianos, uma preocupação da indústria farmacêutica. Revista Fármacos & Medicamentos, v.2, n.7, Nov/Dez. p 19-24, MILLEZI, F. M.; et al. Susceptibility of monospecies and dual-species biofilms of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to essential oils. Journal of Food Safety, 32, p , OLIVEIRA, M. M. M.; BRUGNERA, D. F.; PICOLLI, R. H. Biofilmes em indústrias de laticínios: aspectos gerais e uso de óleos essenciais como nova alternativa de controle. Rev. Inst. Latic. Cândido Tostes, Jan/Fev, n. 390, p , SILVA, A. F.; SANTOS, A. P.; RABELO, M. F. R. Identificação botânica das plantas medicinais. Plantas medicinais e aromáticas. Belo Horizonte, v. 31, n. 255, p. 77-xx, Mar/Abr, XAVIER, J. B.; PICIOREANU, C.; ALMEIDA, J. S.; VAN LOODRECHT, M. C. M. Monitoruzação e modelação da estrutura de biofilmes. Boletim de Biotecnologia. V.3, p. 2-13, 2008.