EMPREGO DA METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA A AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO MICROBIANO EM UM SISTEMA ALIMENTÍCIO

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1 EMPREGO DA METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA PARA A AVALIAÇÃO DO DESENVOLVIMENTO MICROBIANO EM UM SISTEMA ALIMENTÍCIO M.G. Cattelan 1, T.M.V. Gonçalves 2, F.L. Hoffmann 3, A.R. Coelho 4 1-Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas CEP: São José do Rio Preto SP Brasil, Telefone: 55 (17) Fax: 55 (17) (mariliagcattelan@gmail.com) 2-Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas CEP: São José do Rio Preto SP Brasil, Telefone: 55 (17) Fax: 55 (17) (taniamv@ibilce.unesp.br) 3-Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas CEP: São José do Rio Preto SP Brasil, Telefone: 55 (17) Fax: 55 (17) (hoffmann@ibilce.unesp.br) 4-Departamento de Tecnologia de Alimentos Universidade Tecnológica Federal do Paraná CEP: Londrina PR Brasil, Telefone: 55 (43) (arcoelho@utfpr.edu.br) RESUMO Embora diversos compostos naturais possuam propriedades biológicas evidenciadas em pesquisas in vitro, sua eficácia é reduzida quando em sistemas in situ, como os alimentos. Assim, essa pesquisa objetivou avaliar os efeitos do óleo essencial de orégano (OEO) e do sal (NaCl) sobre o desenvolvimento de Escherichia coli (ATCC 8739) em molho para salada, utilizando a metodologia de superfície de resposta. Empregou-se um delineamento composto central rotacional 2 2 com 4 pontos axiais e 3 repetições do ponto central. Foi possível predizer de maneira significativa o desenvolvimento de E. coli por meio do emprego da metodologia de superfície de resposta, sugerindo a adoção das concentrações de OEO variando entre 0,4 e 0,5% em combinação com o sal (1,1 1,2 %) ou de teores de OEO na faixa entre 0,1 e 0,2 % adicionados de sal (1,3 1,4 %), para o controle do desenvolvimento de E. coli em molhos para salada. ABSTRACT Although many natural compounds have biological properties evidenced in vitro, its effectiveness is reduced when employed in food systems, in situ. Thus, this study aimed to evaluate the effects of oregano essential oil (OEO) and salt (NaCl) on the development of Escherichia coli (ATCC 8739) in salad dressing, using the response surface methodology. It was employed a 2 2 central composite rotatable design with four axial points and three replications of the center point. It was possible to significantly predict the development of E. coli by the use of response surface methodology, suggesting the adoption of OEO concentrations ranging between 0.4 and 0.5% in combination with salt (1.1 to 1.2%) or OEO contents ranging between 0.1 and 0.2% with salt (1.3 to 1.4%) to control de E. coli count in salad dressing. PALAVRAS-CHAVE: compostos naturais; superfície de resposta; orégano; antimicrobiano. KEYWORDS: natural compounds; response surface; oregano; antimicrobial.

2 1. INTRODUÇÃO De acordo com Scallan et al. (2011), nos Estados Unidos da América, ocorrem em média hospitalizações anuais em decorrência de DTAs, sendo que, em aproximadamente 64 % do casos, espécies bacterianas distintas são os micro-organismos responsáveis. No Brasil, o perfil epidemiológico das DTAs ainda é pouco conhecido em virtude da escassez de dados oficiais sobre os agentes etiológicos mais comuns e alimentos frequentemente envolvidos (Van Omson et al., 2006). Sabe-se, porém, que dentre os micro-organismos comumente envolvidos em DTAs podem ser destacados Escherichia coli, Salmonella Typhimurium e Staphylococcus aureus (Randrianarivelo et al., 2009). As alterações no perfil epidemiológico das DTAs ocorrem devido à expansão do mercado consumidor, à globalização econômica, as mudanças dos hábitos alimentares e ao aumento no consumo de alimentos industrializados ou produzidos fora do lar (Shinohara et al., 2008). A suspeita sobre a toxicidade de alguns aditivos químicos e o abuso na utilização de compostos constituem fatores de suma importância na busca por compostos alternativos que possam ser empregados como conservantes naturais de alimentos (Haberbeck et al., 2012). O uso de antimicrobianos naturais em alimentos, como temperos, condimentos e extratos vegetais tende a ser uma alternativa eficaz ao uso de aditivos químicos, principalmente quando empregado em combinação com outras tecnologias já existentes (Castilho et al., 2012). Diversos óleos essenciais de especiarias já se encontram categorizados como seguros ou GRAS, Generally Recognized as Safe, pela US Food and Drug Administration FDA (Benavides et al., 2012) e, embora diversos estudos evidenciem as suas propriedades in vitro, as informações sobre os efeitos antimicrobianos nos produtos alimentícios e sua interação com os componentes dos alimentos ainda são escassas (Pesavento et al., 2015). Por conseguinte, a presente pesquisa visou avaliar o efeito do óleo essencial de orégano (OEO) e do sal (cloreto de sódio) sobre o desenvolvimento in situ de E. coli por meio da metodologia de superfície de resposta. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Materiais Os meios de cultura empregados nesta pesquisa foram provenientes da HiMedia Laboratories e o polisorbato 80, Tween 80, da empresa Sigma Aldrich. O óleo essencial de orégano (grau de pureza de 100%) foi adquirido da empresa Laszlo Aromaterapia Ltda. As demais matérias-primas empregadas na elaboração dos molhos para salada foram adquiridas no mercado local de São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil, consistindo em óleo de soja (Vila Velha - Louis Dreyfus Commodities Brasil), extrato de soja integral em pó (Mãe Terra Produtos Naturais Ltda.), leite em pó integral (Itambé Alimentos S/A), sal - cloreto de sódio (Lebre - Norte Salineira S/A) e água mineral Leve. Optou-se por empregar o sal refinado iodado (NaCl) comumente utilizado na produção industrial de alimentos, de modo a obter resultados similares aqueles que podem vir a ocorrer nos produtos alimentícios. Para a avaliação do efeito in situ, o sal e o OEO foram empregados diretamente no alimento, em uma relação peso/peso, para que a contagem microbiana pudesse ser avaliada. O OEO foi escolhido para ser empregado no presente estudo em virtude dos resultados evidenciados por

3 Cattelan et al. (2013) sobre a atividade antibacteriana de OEO sobre E. coli, em diferentes concentrações. 2.2 Cultura bacteriana A cepa E. coli (ATCC 8739) foi mantida em Ágar Padrão para Contagem (PCA) a 4 C, e reativada no mesmo meio de cultura, com incubação a 35 C por 24 horas. Para o estudo in situ, a carga bacteriana foi padronizada na concentração de 10 4 UFC/mL, a partir da escala 0,5 Mc Farland com sucessivas diluições decimais. 2.3 Processamento dos molhos para salada e delineamento experimental Em um misturador de baixa velocidade (Walita RI 2044) foram constantemente homogeneizados óleo vegetal de soja (64,12 g), água mineral (30,53 g), leite em pó integral (3,8 g) e extrato de soja integral (1,55 g). O OEO e o sal (variáveis independentes) foram adicionados no final de cada mistura, gerando assim um delineamento composto central rotacional, contendo 4 pontos fatoriais, 4 pontos axiais e 3 repetições do ponto central, totalizando 11 ensaios (Tabela 1). A variável dependente avaliada foi a contagem de E. coli (UFC/g). Para estimar os efeitos dos fatores (concentrações de OEO e de sal) sobre o desenvolvimento in situ de E. coli, e avaliar possível predição modelo matemático empregou-se a análise de variância (ANOVA) com metodologia de superfície de resposta, fazendo uso do software Statistica 7,0 (StatSoft Inc., Oklahoma, EUA). A variável dependente avaliada foi a contagem bacteriana, conforme delineamento experimental disposto previamente na Tabela 1. O nível de significância adotado foi de 5 %. Tabela 1 Delineamento experimental com as variáveis codificadas e reais empregadas nas formulações do molho para salada, utilizadas no estudo antibacteriano in situ. Tratamento Variáveis codificadas Variáveis reais a X 1 X 2 Sal (%) OEO (%) ,14 0, ,30 0, ,14 0, ,30 0,40 5-1,41 0 1,11 0, ,41 0 1,33 0, ,41 1,22 0, ,41 1,22 0, ,22 0, ,22 0, ,22 0,30 a Percentagens de óleo essencial de orégano (OEO) e de sal em relação a 100 g de mistura de água mineral, leite integral em pó, óleo vegetal de soja e extrato de soja integral em pó (peso/peso). 2.4 Influência do óleo essencial de orégano e sal sobre o desenvolvimento de E. coli O produto alimentício foi contaminado, logo após o preparo, com a cepa E. coli em uma contagem de 10 4 UFC/g. Para a contagem de bacteriana, empregou-se a metodologia descrita por Kornacki e Johnson (2001). As análises microbiológicas foram efetuadas no Laboratório de

4 Microbiologia de Alimentos, do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos da UNESP de São José do Rio Preto, SP. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados da avaliação estatística para a variável contagem de E. coli (log UFC/g) estão apresentados na Tabela 2. Os valores de P são utilizados para checar a significância de cada coeficiente na variável resposta. Assim, evidencia-se que a concentração de sal e a combinação do OEO e do sal exerceram efeitos estatisticamente significantes, em um nível de 95 % de confiança, na contagem de E. coli. A interação entre o OEO e o sal promoveu um efeito positivo na redução da contagem bacteriana, enquanto que o sal propiciou efeito negativo, isto é, com a redução dos teores de sal foi possível promover a redução da contagem de E. coli. Tabela 2 Efeitos e interações para a variável contagem de Escherichia coli (log UFC/g) em molho para salada, em função das concentrações de óleo essencial de orégano (OEO) e sal. Termo Efeito Erro Puro t(2) Valor P Média 6,0768 0, ,8544 < 0,001 (1) Sal (%) (L) -0,0684 0,0126-5,4357 0,0322 Sal (%) (Q) 0,1956 0, ,7225 0,0061 (2) OEO (%) (L) -0,0313 0,0125-2,5093 0,1288 OEO(%) (Q) 0,0306 0,0149 2,0495 0,1769 OEO x Sal 0,3600 0, ,5018 0,0024 Regressão (ANOVA) < 0,001 Falta de ajuste ,0538 (L): linear; (Q): quadrático. O nível de significância adotado foi de 5 %. De acordo com a análise de variância, ANOVA (Tabela 3), um modelo de segunda ordem (Equação 1) descrevendo a contagem de E. coli em função das concentrações de OEO e sal foi gerado. Os termos não significantes foram adicionados à falta de ajuste para o cálculo do coeficiente de determinação (R 2 ) e do teste F. O coeficiente de determinação foi de 0,8610, indicando que o modelo matemático proposto explica 86,10 % da variável resposta. O teste F foi superir ao valor F ( 3; 7; 0,95 ). Por conseguinte, o modelo matemático gerado (Equação 1) pode ser considerado preditivo e ajustado. Tabela 3 Análise de variância (ANOVA) para a variável contagem de Escherichia coli (log UFC/g) em molho para salada. Fonte Soma dos quadrados Graus de liberdade Quadrados médios Teste F Regressão 0, ,2507 4,96 Resíduo 0, ,0116 Falta de ajuste 0, ,0157 0,68 Erro puro 0, ,0012 Total 0, *R 2 = 0,8610; F ( 3; 7; 0,95 ) = 4,35.

5 (1) O modelo matemático (Equação 1) foi empregado para gerar a superfície de resposta e o diagrama de contorno, conforme Figura 1 (A-B). As contagens mais baixas de E. coli podem ser observadas quando o OEO foi empregado nas concentrações de 0,4 e 0,5% em combinação com o sal em teores de 1,1 e 1,2 % ou quando o OEO foi usado na faixa de 0,1 e 0,2% e o sal entre 1,3 e 1,4%. O óleo essencial e o sal exerceram efeitos antibacterianos sobre a cepa E. coli quando empregados em concentrações inversamente proporcionais. Figura 1 Superfície de resposta (A) e diagrama de contorno (B) para a contagem de Escherichia coli (log UFC/g) em função das concentrações de óleo essencial de orégano (OEO) e sal em molho para salada. (A) (B) De acordo com Calo et al. (2015), lipídeos, proteínas, atividade de água, ph e enzimas podem influenciar potencialmente na eficácia de óleos essenciais sobre a inibição microbiana. Existem relatos na literatura científica de que os lipídeos e as proteínas presentes nos alimentos são capazes de absorver os componentes antimicrobianos presentes nas especiarias, reduzindo sua eficácia (Shekarforoush et al., 2014). Conforme análises efetuadas por Cattelan (2015), as diferentes formulações do molho para salada empregadas nesse estudo apresentaram teores lipídicos elevados, que variaram entre 57,89 e 60,09 %. Por sua vez, o cloreto de sódio é capaz de reduzir a atividade de água do alimento e, consequentemente, prevenir o desenvolvimento microbiano. 4. CONCLUSÕES Dentro dos parâmetros do estudo foi possível predizer de maneira significativa o desenvolvimento de E. coli em molhos para salada à base de orégano, por meio do emprego da metodologia de superfície de resposta, sendo o delineamento experimental capaz de predizer, em um intervalo de confiança 95%, cerca de 83 % dos dados observados. Desse modo, sugere-se a adoção das concentrações de OEO variando entre 0,4 e 0,5% em combinação com o sal (1,1 e 1,2 %) ou quando o OEO foi usado na faixa de 0,1 e 0,2 % e o sal entre 1,3 e 1,4 % para o controle do desenvolvimento de E. coli.

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Benavides, S., Villalobos-Carvajal, R., & Reyes, J. E. (2012). Physical, mechanical and antibacterial properties of alginate film: Effect of the crosslinking degree and oregano essential oil concentration. Journal of Food Engineering, 110, Calo, J. R., Crandal, P. G., O Bryan, C. A., & Ricke, S. C. (2015). Essential oils as antimicrobials in food systems - A review. Food Control, 54, Castilho, P. C., Savluchinske-Feio, S., Weinhold, T. S., & Gouveia, S. C. (2012). Evaluation of the antimicrobial and antioxidant activities of essential oils, extracts and their main components from oregano from Madeira Island, Portugal. Food Control, 23, Cattelan, M. G. et al. (2013). Antibacterial activity of oregano essential oil against foodborne pathogens. Nutrition & Food Science, 43(2), Cattelan, M. G. (2015). Atividade antibacteriana de óleo essencial de orégano (Origanum vulgare): ações in vitro e in situ para preservação de alimento (Tese de doutorado). Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto. Haberbeck, L. U., Riehl, C. A. S., Salomão, B. C. M., & Aragão, G. M. F. (2012). Bacillus coagulans spore inactivation through the application of oregano essential oil and heat. LWT-Food Science and Technology, 46, Kornacki, J. L., & Johnson, J. L. (2001). Enterobacteriaceae, coliforms, and Escherichia coli as quality and safety indicators. In: F. P. Downes, & K. Ito (Eds.), Compendium of Methods for the Microbiologycal Examinations of Foods (pp ). Washington: American Public Health Association. Pesavento, G., Calonico, C., Bilia, A. R., Barnabei, M., Calesini, F., Addona, R., Mencarelli, L., Carmagnini, L., Di Martino, M. C., & Lo Nostro, A. (2015). Antibacterial activity of Oregano, Rosmarinus and Thymus essential oils against Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in beef meatballs. Food Control, 54, Randrianarivelo, R., Sarter, S., Odoux, E., Brat, P., Lebrun, M., Romestand, B., Menut, C., Andrianoelisoa, H. S., Raherimandimby, M., & Danthu, P. (2009). Composition and antimicrobial activity of essential oils of Cinnamosma fragrans. Food Chemistry, 114, Scallan, E., Hoekstra, R. M., Ângulo, F. J., Tauxe, R. V. Widdowson, M.-A., Roy, S. L. et al. (2011). Foodborne illness acquired in the United States-major pathogens. Emerging Infectious Disease, 17, Shekarforoush, S. S.; Firouzi, R.; Kafshdozan, K. (2014). Antimicrobial activities of oregano and nutmeg essential oils combined with emulsifier/stabilizer compound in ready-to-cook barbecued chicken. Iranian Journal of Veterinary Research, 15, 2, Shinohara, N. K. S., Barros, V. B., Jimenez, S. M. C., Machado, E. C. L., Dutra, R. A. F., & Lima Filho, J. L. (2008). Salmonella spp. Importante agente patogênico veiculado em alimentos. Ciencia e Saúde Coletiva, 13, Van Amson, G., Haracemiv, S. M. C., & Masson, M. L. (2006). Levantamento de dados epidemiológicos relativos à ocorrências/surtos de doenças transmitidas por alimentos (DTAs) no estado do Paraná Brasil, no período de 1978 a Ciencia e Agrotecnologia, 30,