Efeitos ultraestruturais do diabetes nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos

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1 UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Programa de pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento NATALIE SOUZA DE ANDRADE Efeitos ultraestruturais do diabetes nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos São Paulo 2016

2 UNIVERSIDADE SÃO JUDAS TADEU Centro de Ciências Biológicas e da Saúde Programa de pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento NATALIE SOUZA DE ANDRADE Efeitos ultraestruturais do diabetes nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos Dissertação apresentada ao programa de Mestrado em Ciência do Envelhecimento Da Universidade São Judas Tadeu para a Obtenção do Título de Mestre. São Paulo 2016

3 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Universidade São Judas Tadeu Bibliotecária: Daiane Silva de Oliveira - CRB 8/8702 A553e Andrade, Natalie Souza de Efeitos ultraestruturais do diabetes nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos / Natalie Souza de Andrade. - São Paulo, f. ; 30 cm. Orientador: Romeu Rodrigues de Souza. Dissertação (mestrado) Universidade São Judas Tadeu, São Paulo, Diabetes - Idosos. 2. Envelhecimento. I. Souza, Romeu Rodrigues de. II. Universidade São Judas Tadeu, Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento. III. Título CDD

4 Natalie Souza de Andrade Efeitos ultraestruturais do diabetes nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos Área de concentração: Aspectos biológicos e funcionais do envelhecimento Orientador: Prof. Romeu Rodrigues de Souza Dissertação apresentada ao programa de Mestrado em Ciência do Envelhecimento da Universidade São Judas Tadeu para obtenção do Título de Mestre. SÃO PAULO 2016

5 FOLHA DE AVALIAÇÃO Natalie Souza de Andrade Efeitos ultraestruturais do diabetes nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos Dissertação apresentada ao programa de Mestrado em Ciência do Envelhecimento da Universidade São Judas Tadeu para obtenção do Título de Mestre. Área de concentração: Aspectos biológicos e funcionais do envelhecimento Orientador: Prof. Romeu Rodrigues de Souza Data: 17/03/2016 Banca examinadora Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Julgamento: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Julgamento: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Julgamento:

6 DEDICATÓRIA Ao meu pai Alirio Teles de Andrade (in memoriam), Verdadeiramente o maior amor. A minha amada mãe e avó. Sem vocês não teria sentido.

7 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus pelas oportunidades oferecidas, principalmente por ter conhecido pessoas que me ajudaram com palavras especiais e apoio. Agradeço especialmente ao meu orientador Professor Romeu Rodrigues, por todo carinho e dedicação, a minha família que de uma forma tão especial se faz sempre presente, em especial a minha sobrinha Paloma Andrade Noda, pela ajuda nos momentos difíceis, não poderia esquecer de agradecer aos meus diretores Professor Marcus Vinicius Gava, Suzana Bellizia Amaral, Ana Maria Bellizia e Romulo Bellizia, pela oportunidade de estudar e trabalhar. Aos professores do Mestrado Ciências do Envelhecimento, meu eterno agradecimento. Aos alunos e professores do Curso de Graduação em Estética e Cosmetologia das Faculdades Metropolitanas Unidas, que foram meu principal motivo de enfrentar e de me dedicar ao rico mundo do Saber... Aos meus colegas do mestrado, em especial a Jadia, que mesmo distantes, sempre serão lembrados.

8 Efeitos ultraestruturais do diabetes nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos RESUMO Autora: Natalie Souza de Andrade Orientador: Prof. Romeu Rodrigues de Souza Programa de Pós-graduação Stricto Sensu em Ciências do Envelhecimento Universidade São Judas Tadeu Os efeitos do diabetes em células musculares dos ventrículos cardíacos são bem conhecidos. Entretanto, seus efeitos em cardiomiócitos atriais são menos estudados. Estas células possuem um conjunto de estruturas, denominado aparelho secretor que produz e secreta os hormônios ANP e BNP na corrente sanguínea, os quais são importantes no controle da pressão arterial. Trabalhos realizados mostram que no diabetes ocorre diminuição da produção de ANP. Entretanto, a literatura consultada não mostrou nenhum trabalho evidenciando a influência do diabetes nos componentes do aparelho secretor dos cardiomiócitos do átrio direito em ratos idosos. O objetivo do presente estudo foi analisar os efeitos do diabetes em parâmetros quantitativos citoplasmáticos e nucleares em cardiomiócitos do átrio direito de ratos idosos. Foram utilizados oito ratos Wistar machos idosos sacrificados com 16 meses de idade, que receberam uma dose única de estreptozotocina(70 mg/kg) para indução do diabetes aos 14 meses (Grupo Diabético,GD) (mantidos diabéticos por 60 dias). Outros oito ratos não diabéticos (Grupo Controle, GC), foram sacrificados aos 16 meses de idade. O átrio direito de cada animal foi isolado, do qual foram feitos trechos de cerca de 4mm 2,que foram fixados em solução de glutaraldeído a 2%, pós fixados em solução tampão de cacodilato de sódio (0,2 m, ph 7,3) os quais foram tratados convenientemente para realização de cortes ultrafinos para análise ao microscópio eletrônico (ICB, USP) para estudo quantitativo de seus componentes nucleares e citoplasmáticos: densidade numérica de ANP e BNP em conjunto; densidade numérica de ANP; densidade numérica do BNP; diâmetro dos grânulos de ANP; diâmetro dos grânulos de BNP; densidade de volume das mitocôndrias; densidade de volume do complexo de Golgi e densidade de volume do retículo endoplasmático e densidade de poros por 10 nm de membrana nuclear. Foram

9 também calculadas as distribuições de freqüências dos grânulos de ANP e BNP de acordo com seu tamanho, divididos arbitrariamente em pequenos, médios e grandes. Os dados obtidos a partir do estudo quantitativo dos cardiomiócitos foram tabulados e comparados através de análise estatística apropriada (nível de significância igual a p<0.05). Os resultados obtidos mostraram que: 1- Não há diferença significante entre os valores da PA nos grupos de animais (p > 0.05). Os valores da glicemia nos animais do GD são compatíveis com a presença de diabetes nesse grupo (p < 0.05); 2- Houve aumento nas densidades numéricas de NPs. 3-Esse aumento ocorreu às custas de grânulos de ANP pequenos e diminuição dos grandes; 4- No caso do BNP esse aumento ocorreu às custas dos grânulos médios; 5-O diâmetro dos grânulos não sofreu influência do diabetes; 6- As densidades de volume dos componentes do citoplasma, mitocôndrias, retículo endoplasmático e aparelho de Golgi também não sofreram influência do diabetes. Palavras-Chave: estreptozootocina, cardiomiócitos atriais, microcopia eletrônica, morfometria, envelhecimento.

10 SUMMARY Ultra structural effects of diabetes in cardiomyocytes of the right atrium of aged rats Wistar Author: Natalie Souza de Andrade; Advisor: Prof. Romeu Rodrigues de Souza Post-graduate Program in Sciences of Aging São Judas Tadeu University The effects of diabetes in muscle cells of the heart ventricles are well known. However, its effects on atrial cardiomyocytes are less studied. These cells have a number of structures, called secretory apparatus which produces and secretes the ANP and BNP hormones into the bloodstream, which are important in the control of blood pressure. Works carried out show that diabetes promotes decreased production of ANP. However, the literature showed no studies on the influence of diabetes on the components of the secretory apparatus of cardiomyocytes of the right atrium in aged rats. The aim of this study was to analyze the effects of diabetes on cytoplasmic and nuclear quantitative parameters in cardiomyocytes of the right atrium of aged rats. Male Wistar rats (n=8) aged 14 months of age were used, which were given a single dose of streptozotocin (70 mg / kg) to the diabetes induction at 14 months (Group Diabetic GD) (diabetics kept for 60 days). Eight other non-diabetic mice (control group, CG), were used. Rats were sacrificed at 16 months of age. The right atrium of each animal was isolated, from which stretches were made of about 4mm 2, which were fixed in glutaraldehyde 2% solution, post fixed in buffer solution of sodium cacodylate (0.2 M, ph 7.3). They were properly treated to perform ultrathin sections for analysis by electron microscope (ICB, USP) for quantitative study of their nuclear and cytoplasmic components: number density of ANP and BNP together; numerical density of ANP; Numerical density of the BNP; diameter of the ANP granules; BNP diameter of the granules; volume density of mitochondria; volume density of the Golgi complex and volume density of the endoplasmic reticulum and the number of pores per 10 nm of nuclear membrane. They were also calculated the frequency distributions of ANP and BNP granules according to their size, arbitrarily divided into small, medium and large. The data obtained from the quantitative study of cardiomyocytes from the 2 groups were tabulated and compared using appropriate statistical analysis (significance level

11 of p <0.05). The results showed that: 1. No significant difference was observed between BP values in the groups of animals (p> 0.05). Blood glucose values in GD animals are consistent with the presence of diabetes in this group (p <0.05); 2- There was an increase in the densities of NPs. 3-This increase was at the expense of small ANP granules and decreased of the large; 4- In the case of BNP this increase occurred at the expense of medium-sized granules; 5-The diameter of the granules was not influenced by diabetes; 6- The volume densities of cytoplasm components, mitochondria, endoplasmic reticulum and Golgi apparatus also were not affected by diabetes. Keywords: streptozotocin, atrial cardiomyocytes, electronic microcopy, morphometry, aging.

12 Lista de Figuras Figura 1- Esquema representativo da estrutura molecular do ANP, BNP e CNP...17 Figura 2- Micrografias eletrônicas de cardiomiócitos do átrio direito de ratos dos grupos: GC e GD (b) utilizadas para contagem dos grânulos de peptídeos natriuréticos, ANP e BNP em conjunto. São observados grânulos no citoplasma junto ao núcleo (N), entre mitocôndrias (M) Figura 3 Fotomicrografia eletrônica do citoplasma de cardiomiócito do átrio direito, mostrando a área retangular utilizada (54µm 2 ) para contagem e medida dos diâmetros dos grânulos de ANP, BNP e G-Vesículas do aparelho de Golgi...26 Figura 4 Fotomicrografias eletrônicas de cortes de cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar mostrando estruturas que foram quantificadas: poro nuclear (seta preta, em a) grânulos de ANP (setas brancas) e BNP (cabeças de setas), mitocôndrias (M), aparelho de Golgi (G, em a), reticulo endoplasmático (ER), eucromatina (E) e núcleo (N)...27 Figura 5- Fotomicrografias eletrônicas de corte de cardiomiócito do átrio direito mostrando os componentes citoplasmáticos a serem quantificados (a) e o sistema teste com 90 pontos superposto (em amarelo) (b). N-Núcleo do cardiomiócito. ER- Retículo endoplasmático. G-Aparelho de Golgi. Setas: grânulos de ANP. Cabeça de seta: grânulo de BNP...28 Figura 6 - Fotomicrografias eletrônicas de cortes de cardiomiócitos do átrio direito dos grupos GC (a) e GD (b) de ratos Wistar com pequeno aumento. Os

13 cardiomiócitos contem numerosos grânulos (setas) próximo ao núcleo (N). No GD (b) são observados mais grânulos (setas) no citoplasma do que no GC. Mitocôndrias (M)...30 Figura 7- Fotomicrografias eletrônicas de cortes de cardiomiócitos do átrio direito dos grupos GC (a) e GD (b) de ratos Wistar com aumento maior do que da figura 6. O cardiomiócito do GD (b) contem grânulos (setas brancas) menores do que os do GC (a). A seta preta mostra um poro da membrana nuclear. G- Aparelho de Golgi ER- Retículo endoplasmático. M-Mitocôndrias. N- Núcleo do cardiomiócito...31 Figura 8- Média e Erro Padrão da Média da Densidade numérica de ANP e BNP em conjunto, somente de ANP e de BNP nos grupos GC e GD. *Significante vs. GC (p<0,0001)...32 Figura 9- Médias e respectivos erros padrões da média do diâmetro dos grânulos de ANP e de BNP nos grupos GC e GD. *Significante vs. GC (p<0,0001)...32 Figura 10. Médias e respectivos erros padrões da média da densidade de volume de mitocôndrias, retículo endoplasmático e complexo de Golgi nos grupos GC e GD...33 Figura 11. Porcentagem de grânulos de ANP e BNP, pequenos, médios e grandes nos grupos GC e GD. *Significante vs. P e M (p<0,01); **Significante vs. M e P (p<0.01); ***Significante vs. P (p<0.01)...33

14 Lista de Abreviaturas ANP PEPTIDEO NATRIURETICO ATRIAL...16 BNP BRAIN NATRIURETIC PEPTIDE...16 CNP PEPTIDEO NATRIURETICO CEREBRAL...16 RFG- RITMO DE FILTRAÇÃO GLOMERULAR...17 ENaC- CANAIS DE SÓDIO EPITELIAIS...17 DM- DIABETES MELLITUS...21 TG TRIGLICÉRIDES...21 HDL - HIGH DENSITY LIPOPROTEINS...21 PNAD - PESQUISA NACIONAL POR AMOSTRA EM DOMÍCILIOS...21 GC - GRUPO CONTROLE...24 GD - GRUPO DIABETICO...24 PN- PEPTIDEO NATRIURETICO...25 M MITOCÔNDRIA...27 ER RETICULO ENDOPLASMATICO...27 E EUCROMATINA...27 N NÚCLEO...27 PA PRESSÃO ARTERIAL...29

15 Lista de tabelas Tabela 1 Valores da pressão arterial sistólica e da glicemia em ambos os grupos de animais estudados (GC e GD)...29

16 SUMÁRIO RESUMO...vii SUMMARY...ix LISTA DE FIGURAS...xi LISTA DE ABREVIATURAS...xiii LISTA DE TABELAS...xiv 1.INTRODUÇÃO Cardiomiócitos atrais Cardiomócitos atrias no idoso Efeitos do Diabetes nos cardiomiócitos OBJETIVOS Geral Específico MATERIAL E MÉTODOS Animais Medida da pressão arterial sistêmica Indução do Diabetes e coleta do material Análise morfológica e quantitativa dos cardiomiócitos Densidade de volumes Análise estatística RESULTADOS Valores da pressão sistólica e da glicemia Ultraestrura dos cardiomiócitos Morfometria dos cardiomiócitos DISCUSSÃO CONCLUSÕES...40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...41

17 16 1. INTRODUÇÃO O crescimento do número de pessoas acima de 60 anos de idade é um fenômeno mundial. De acordo com o censo de 2000, o número de idosos no Brasil era de de indivíduos, representando um aumento de 35,6% em relação ao ano de Nos próximos 20 anos, as estimativas apontam para a possibilidade de que o número de idosos ultrapasse os 30 milhões, devendo representar quase 13% da população (FIBGE, 2002). Consequentemente, aumenta também a incidência de doenças crônicas. Dentre essas, destaca-se o diabetes, por seus efeitos deletérios nos tecidos. Além disso, é frequente que os diabéticos tenham outras doenças crônicas quase duas vezes mais em relação aos não diabéticos. Vários fatores de risco podem explicar esse aspecto: tabagismo, o consumo excessivo de álcool, a hipertensão não controlada, o sedentarismo, os maus hábitos alimentares, a obesidade, todos estes fatores modificáveis e que somados podem ser ainda mais agravantes (MARCOPITO et al, 2005). Estudo longitudinal sobre envelhecimento realizado em Amsterdã (Holanda) chama a atenção para o fato dos diabéticos referirem maior número de doenças crônicas quando comparados aos portadores de doença pulmonar, doença cardiovascular e osteoartrite/atrite reumática (VAN et al, 2007). Estes dados chamam a atenção para a necessidade de estudos relacionados ao diabetes e seus efeitos nos tecidos, especialmente em idosos. Embora existam numerosos estudos sobre os efeitos do diabetes em diferentes tecidos e órgãos, em idosos, alguns aspectos necessitam ainda esclarecimentos. É o caso, por exemplo dos efeitos do diabetes nos cardiomiócitos atriais. Alguns aspectos desta doença nesses cardiomiócitos são ainda incompletos. 1.1 Os cardiomiócitos atriais Os cardiomiócitos atriais produzem vários hormônios natriuréticos, sendo descritos quatro tipos: peptídeo atrial natriurético (ANP), peptídeo natriurético do tipo B (BNP), peptídeo natriurético do tipo C (CNP) e peptídeo natriurético do tipo D (DNP) (WOODARD, 2007; DE BOLD et al, 1981; SUDOH et al, 1988), dentre os quais se destacam o Peptídeo Natriurético Atrial (ANP) e o Peptídeo Natriurético Cerebral (BNP). O ANP e o BNP ficam armazenados no citoplasma dos

18 17 cardiomiócitos atriais, sob a forma de grânulos eletrodensos de número e tamanho variados, situados junto ao núcleo centralmente localizado, próximo a numerosas mitocôndrias, miofibrilas, retículo endoplasmático e o aparelho de Golgi (CAVALLINI et al, 1994). Figura 1 Esquema representativo da estrutura molecular do ANP, BNP e CNP (SILVA et al, 2003). Os grânulos de ANP são esféricos, regulares e apresentam-se ao microscópio eletrônico como círculos contendo um limite nítido, envolvendo um halo em torno de uma área mais escura, contendo o ANP. Os grânulos de BNP não possuem halo e são geralmente menores apresentando freqüentemente espículas na sua superfície, contendo o BNP (CLERICO et al, 1998; DICSTEIN, 1998; MAEDA et al, 1998; MAISEL et al, 2001). O ANP e o BNP são secretados por distensão dos átrios e pela elevação da pressão arterial (WOODARD, 2007; DE BOLD et al, 1981; SUDOH et al, 1988). Os peptídeos quando lançados no sangue, atuam nos túbulos renais produzindo redução da pressão arterial, pelo aumento da secreção de sódio e água e conseqüente queda da volemia (CALIARI e TAFURI, 1993; MCGRATHET al, 2005; CLERICO et al, 2006; CHARLOUX et al, 2007; PAN, 2008). Os efeitos agudos dos peptídeos natriuréticos são aumento do ritmo de filtração glomerular (RFG) e da excreção renal de Na+ e água, através da inibição da bomba de Na+-K+-ATPase e dos canais de sódio epiteliais (ENaC), bem como supressão da secreção de renina e de aldosterona. Este último efeito é um exemplo do papel dos hormônios peptídicos na interação coração-rim. O ANP e o BNP também promovem vasodilatação sistêmica e renal, aumento da permeabilidade vascular, efeitos anti-inflamatórios, antiproliferativos e antifibróticos (WOODARD; ROSADO,

19 ; SILVER, 2006; OLIVER, 1997; KNOWLES, 2001; CAO, 1995; TAMURA et al, 2000). O ANP também ativa a mobilização e a oxidação lipídica e inibe efeitos de outros hormônios como a endotelina e a vasopressina e hormônios do sistema renina-angiotensina-aldosterona (WIESNER, 2010). O ANP foi descoberto em 1981, pelo Dr. A. J. de Bold e colaboradores, que encontraram grânulos em células musculares cardíacas atriais contendo o peptídeo. Esta descoberta deu ao coração a função endócrina, além daquela de bomba propulsora de sangue. Dois anos depois, o peptídeo estava purificado e seqüenciado. Mais tarde, foram descobertos outros peptídeos natriuréticos, entre os quais: o BNP, produzido pelas paredes dos ventrículos cardíacos, mas descoberto inicialmente no cérebro e o CNP, encontrado no sistema nervoso, produzido por células endoteliais. Este hormônio é importante no mecanismo de regulação da pressão arterial. A partir dessa descoberta, numerosos trabalhos têm sido realizados sobre os grânulos de ANP e BNP (KISCH et al., 1956; PALADE et al., 1961; De BOLD et al., 1981; IIDA et al., 1988; CALIARI; TAFURI, 1993; SILVA et al., 2003). O ANP tem também como função, proteger o sistema cardiovascular a partir dos efeitos de sobrecarga do volume sanguíneo. O hormônio é liberado pelos cardiomiócitos na corrente sanguínea que irá atuar em vários tecidos, induzindo à vasodilatação e promovendo a natriurese e diurese. O ANP inibe efeitos de outros hormônios como a endotelina e a vasopressina e do sistema renina-angiotensinaaldosterona e ativa a mobilização e a oxidação lipídica (WIESNER, 2010). No miocárdio, a maior parte dos grânulos de ANP está localizada junto ao núcleo dos cardiomiócitos atriais, em associação com o aparelho de Golgi (PALADE et al., 1961; JAMIESON, 1964; IIDA et al., 1988;). Alguns poucos grânulos encontram-se espalhados pelo citoplasma do cardiomiócito (TOYOSHIMA et al., 1996; SILVA et al., 2003; DE SOUZA et al., 2005). O número de grânulos de ANP, por ser significativamente maior no átrio direito, sugere uma maior capacidade de síntese de ANP nesse local em relação às outras regiões do coração, indicando que ele é secretado principalmente no átrio direito e em maior quantidade quando comparado com o átrio esquerdo. Este é um dos motivos pelos quais a maior parte dos estudos sobre os grânulos de ANP tem sido realizada no átrio direito (GAMA, 2006).

20 19 Os grânulos de ANP podem medir cerca de 100 a 250 nm de diâmetro, ocorrendo variações entre as espécies. Em condições normais, não somente o ANP dos átrios, mas todos os peptídeos natriuréticos cardíacos são secretados de forma pulsátil em períodos de 20 a 48 minutos, sendo que a meia-vida do ANP é de 2 a 5 minutos em seres humanos (SILVERTHORN, 2003; CHARLOUX et al., 2008). Morfologicamente, à microscopia eletrônica de transmissão, os grânulos de ANP contendo os peptídeos são eletrondensos e a membrana do grânulo é bastante evidente.com aumentos maiores do que x observa-se que a membrana externa é separada do conteúdo escuro por um halo vazio de 20 nm, situado junto à face interna desta membrana (MAREI, 2002). Os grânulos de ANP são armazenados principalmente nos átrios cardíacos e em menor quantidade nos ventrículos e rins (GIRALDO et al, 2011). O BNP foi descoberto recentemente e sua designação decorre de Brain Natriuretic Peptide. Este peptídeo foi identificado, inicialmente, no cérebro de macacos, sendo que em humanos, é liberado, principalmente pelos átrios e ventrículos cardíacos, em resposta a uma sobrecarga de pressão ou volume e, assim como o ANP promove diurese e vasodilatação (DICSTEIN, 1998; MAEDA et al, 1998; MAISEL et al, 2001). Além de ser produzido principalmente no cérebro, ele difere também do ANP pelo fato de ter uma vida curta, de apenas 22 minutos (MAISEL et al, 2001), o que sugere que ele seja um hormônio de emergência, refletindo o momento de sobrecarga ventricular (VILLACORTA et al, 2002). Na microscopia eletrônica de transmissão apresentam-se mais pálidos que os grânulos de ANP, contendo granulações de aspecto fibroso. Os grânulos não apesentam membranas. Ambos os tipos (ANP e BNP) liberam seu conteúdo na circulação sanguínea em resposta à dilatação atrial e à sobrecarga de pressão. Esses peptídeos promovem natriurese, vasodilatação e inibição do sistema renina angiotensina e da atividade do sistema nervoso simpático. Verificou-se que o BNP é importante também como fator que impedia hipertrofia do miocárdio no diabetes, o que comprometeria os mecanismos do endotélio cardíaco (ROSENKRANZ et al., 2003). Existem ainda, grânulos de peptídeos do tipo C, os quais são corpúsculos residuais produzidos por células endoteliais e liberam seu conteúdo em resposta ao estímulo de forças de cisalhamento (GIRALDO et al., 2011).

21 20 O ANP e o BNP são liberados dos grânulos quando há distensão da parede atrial, especialmente durante a elevação da pressão arterial, promovendo assim o aumento da concentração plasmática do ANP (LACHANCE et al., 1991; GARCIA, 1974; SEUL et al., 1992; SILVA et al., 2003). No ser vivo, o ANP e o BNP são secretados para a corrente sanguínea e atuam nos túbulos renais, controlando a ação do sistema renina-angiotensina, o sistema simpático e os fluidos extracelulares e aumentando o fluxo e a permeabilidade capilar. Agindo como vasodilatadores, diminuem a reabsorção de água e sódio aumentando a natriurese e a diurese diminuindo a volemia e, consequentemente, a pressão arterial (OHBA et al., 2001; MCGRATH et al., 2005). 1.2 Os cardiomiócitos atriais no idoso Com o envelhecimento, os cardiomiócitos sofrem vários tipos de alterações. O número de cardiomiócitos tanto nos átrios como nos ventrículos é menor no idosos do que no jovem (LAKATTA et al., 1987; THOMPSON, 1988; ANVERSA et al., 1990; FLEG et al., 1995; CHANG et al., 2000; ARONSON, 2003) o que induz à hipertrofia dos cardiomiócitos remanescentes (ÁGUILA et al, 1998). Esta hipertrofia é caracterizada por um pronunciado aumento do número de miofibrilas e por uma relativa redução no número de mitocôndrias e do retículo endoplasmático, fatores responsáveis pela produção e armazenamento de ANP (CHIMENTI et al., 2003). Entretanto, as informações sobre quantidade de grânulos de ANP em cardiomiócitos dos átrios de idosos são escassas e os resultados contraditórios. Alguns trabalhos mostram que nos cardiomiócitos do átrio direito do rato idoso, o conteúdo de ANP encontra-se reduzido significantemente enquanto no plasma está aumentado, em relação ao grupo jovem (Wu et al. 1997). Mifune et al. (1991) também observaram menor número e menor diâmetro dos grânulos de ANP em átrio direito de gerbil idoso em relação ao jovem, ao passo que Cavallini et al. (1994) e Reckelhoff et al. (1992) não observaram diferença significante no número e tamanho dos grânulos de ratos idosos em relação aos ratos jovens. Como se pode observar pela literatura apresentada, não há ainda um consenso sobre as alterações dos cardiomiócitos atriais com o envelhecimento.

22 Efeitos do diabetes nos cardiomiócitos atriais O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome de causas múltiplas, devido à falta de insulina e ou da incapacidade da exercer seus efeitos de forma adequada. A doença se caracteriza por altas taxas glicêmicas acompanhadas por distúrbios do metabolismo dos carboidratos, lipídeos e proteínas. As consequências do DM em longo prazo incluem disfunção e falência de vários órgãos, especialmente rins, olhos, nervos, coração e vasos sanguíneos. O DM é progressivo e se agrava a cada dia quando não diagnosticado e tratado a tempo. A intolerância à glicose tende a aumentar com a idade, associando-se a alterações no perfil lipídico: (aumento de Triglicérides (TG), diminuição de HDL), hipertensão, aumento dos níveis de fibrinogênio e do peso corpóreo. Essas modificações metabólicas são atribuídas ao aumento da resistência à insulina, característica do DM no idoso (diabetes tipo II) (LERCO et al., 2003). O diabetes se destaca como importante causa de morbidade e mortalidade, principalmente entre indivíduos idosos. O crescimento acelerado do número de idosos, a maior tendência ao sedentarismo e hábitos alimentar esta cada vez mais inadequados contribuindo para os crescentes níveis de incidência e prevalência do diabetes (SBD, 2005; OPAS, 2003). Estudos apontam que, enquanto em 2000 havia 171 milhões de pessoas com diabetes no mundo, em 2030 esse valor deverá atingir 366 milhões. O Brasil terá cerca de 11,3 milhões de diabéticos (WILD, 2004). De acordo com os dados da PNAD (Pesquisa Nacional por Amostra em Domicílios), em 1998 a prevalência de diabetes referida era de 10,3%, sendo que essa prevalência subiu em 2003, onde foi verificado um aumento para 12% nos homens e 16% nas mulheres, na faixa etária entre 70 a 79 anos de idade (BARROS, 2003). As complicações decorrentes são graves, com destaque para a doença isquêmica do coração e doenças vasculares periféricas, que estão entre as maiores causas de morbidade e mortalidade nos portadores de diabetes em todo o mundo (LAURENTI, 1982). A maioria dos estudos sobre efeitos do diabetes em cardiomiócitos foram realizados tão somente em cardiomiócitos ventriculares. Estes estudos mostram resultados discrepantes. Um trabalho realizado em ratos Wistar com 15 semanas de DM induzido mostrou não haver diferenças significantes no miocárdio do ventrículo esquerdo de animais normais e diabéticos (MELO et al., 2004). Alguns autores

23 22 (MATSUBARA et al., 1990, FREDERSDORF et al., 2004 e OKOSHI et al., 2007) observaram hipertrofia dos cardiomiócitos enquanto outros encontraram atrofia em animais diabéticos (GIACOMELLI; WIENER, 1976; KAWAGUCHI et al., 1999). Do ponto de vista ultraestrutural, trabalhos mostram que os cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de animais com DM possuem menor densidade de retículo endoplasmático e túbulos transversos (THOMPSON, 1988), e a presença de mitocôndrias dilatadas e fragmentadas (GIACOMELLI; WIENER, 1976; REINILA; AKERBLOM 1984; BHIMJI, et al., 1986 e HSIAO et al., 1987) além da presença de corpos lisossômicos eletrondensos perinucleares (MATSUBARA et al., 1990), dados que falam a favor de menor síntese de substâncias nos cardiomiócitos. A maioria dos conhecimentos que se tem sobre os peptídeos natriuréticos tem sido obtidos graças à utilização de animais de laboratório. Dentre estes, o rato de laboratório tem sido utilizado por numerosos autores para estudar a adaptação dos cardiomiócitos atriais ao diabetes e muita informação importante tem emergido destes estudos (HUSSEIN et al, 2011; KATO et al, 2011; MUSIAL et al, 2012; MARIA et al, 2015). O objetivo da presente investigação é ampliar conhecimentos prévios em dois pontos importantes. Primeiro, o diabetes neste modelo animal pode ter um impacto importante na função dos cardiomiócitos no envelhecimento e há uma relação importante entre a função dos cardiomiócitos e parâmetros quantitativos dos peptídeos ANP e BNP. Não há porém trabalhos sobre aspectos quantitativos dos cardiomiócitos nos quais ratos diabéticos foram comparados com ratos normais, tomados como controles. No presente estudo, os efeitos do diabetes (por dezesseis semanas) na função dos cardiomiócitos foram acessados comparando densidades numéricas dos peptídeos em dois grupos de animais: ratos idosos normais, não diabéticos, da mesma idade, e outros com pesos semelhantes como o grupo diabético. As avaliações quantitativas foram realizadas utilizando técnicas morfométricas em fotomicrografias obtidas em microscópio eletrônico de transmissão. Segundo, para avaliar os efeitos quantitativos do diabetes em componentes estruturais dos cardiomiócitos diretamente relacionados com a produção e secreção do ANP e BNP, fotomicrografias eletrônicas e técnicas morfométricas foram utilizadas para estudar a densidade de volume das mitocôndrias, do complexo de Golgi e do retículo endoplasmático de cardiomiócitos atriais de ratos diabéticos comparados com controles normais.

24 23 2. OBJETIVOS 2.1 Geral Avaliar os efeitos do DM na estrutura e produção de peptídeos natriuréticos dos cardiomiócitos do átrio direito de ratos idosos. 2.2 Específicos 1-Avaliar os efeitos do DM na densidade numérica e no diâmetro de ANP e BNP e avaliar a distribuição de frequências (%) dos grânulos de ANP e BNP de acordo com seu diâmetro nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos para verificar se os efeitos do diabetes se fazem mais intensamente sobre algum tipo específico de grânulo; 2- Avaliar os efeitos do DM na densidade de volume das mitocôndrias, do complexo de Golgi e do retículo endoplasmático nos cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar idosos para verificar se existe relação entre os achados quantitativos do diabetes sobre os peptídeos natriuréticos e os componentes citoplasmáticos envolvidos na sua produção.

25 24 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Animais Foram utilizados no presente estudo 2 grupos de ratos Wistar machos com 16 meses de idade, com 8 animais por grupo: GC Grupo controle (animais com 16 meses de idade) e GD Grupo Diabético (animais com 16 meses de idade, diabéticos a partir dos 14 meses de idade). Os animais de ambos os grupos foram eutanasiados aos 16 meses de idade. Os animais permaneceram em gaiolas coletivas (2 em cada) em ambiente com temperatura de 23º C e ciclo claro-escuro controlado de 12h/12h. Os ratos foram alimentados com dieta padrão contendo 52% de carboidratos, 21% de proteínas e 4% de lípides (Nuvilab CR1, Nuvtal Nutrientes Ltda., Curitiba-PR) e receberam água ad libitum. Ao final do tratamento os animais foram pesados, tiveram sua glicemia avaliada por glicosímetro (Accu-Chek Active, Roche) e foram anestesiados utilizando-se quetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (i.p.), para subsequentes protocolos experimentais. O projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal, ICB, USP (Protocolos 079/03 e 100/08). 3.2 Medida da pressão arterial sistólica A pressão sistólica foi medida em dois momentos: no início do experimento e no momento do sacrifício dos animais. A pressão sistólica foi obtida indiretamente através do método tail-cuff (BRITO et al, 2008). 3.3 Indução do DM e coleta do material O DM foi induzido nos animais por uma injeção intravenosa de Streptozootocina (70 mg/kg, Sigma) (ALBA-LOUREIRO et al., 2006) após uma noite de jejum (8-10 horas). Ratos do grupo controle receberam somente veículo (10 ml de tampão citrato, ph 4,5) após uma noite de jejum.

26 25 Ao final do tratamento (após 30 dias da indução ao DM) os animais foram pesados, tiveram sua glicemia avaliada por glicosímetro (Accu-Chek Active, Roche) e foram anestesiados utilizando-se quetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) (i.p.), para subsequentes protocolos experimental.. Os animais de todos os grupos foram eutanasiados com Pentobarbital sódico e seus ventrículos perfundidos com solução salina heparinizada (1 mg/300 ml da 23 solução). Os átrios direitos foram retirados e reduzidos a fragmentos de aproximadamente 4 mm³. Os fragmentos foram colocados em solução fixadora de glutaraldeído a 2% em solução tampão de cacodilato de sódio (0,2 m, ph 7,3) durante três horas. A seguir, os fragmentos foram lavados três vezes com a mesma solução tampão por 5 minutos cada vez, e colocados subsequentemente em uma solução de tetróxido de ósmio a 1% em tampão e cacodilato de sódio durante 2 horas. Os fragmentos permaneceram durante a noite no acetato de uranila a 0,5% com sucrose (54 mg/100 ml) e após terem sido lavados com o tampão foram desidratados na série crescente e álcool absoluto e óxido do propileno, durante 8 horas, sob rotação. A seguir, os fragmentos foram incluídos em resina pura durante 5 horas e finalmente deixados na mesma resina a 60º C durante 5 dias. Os cortes ultrafinos foram obtidos com uma faca de diamante, em ultramicrótomo (Sorvall MT- 2), e após terem sido contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo foram utilizados para realizar fotomicrografias dos cardiomiócitos em microscópio eletrônico de transmissão (Jeol) do Instituto de Ciências Biomédicas da USP. 3.4 Análise morfológica e quantitativa dos cardiomiócitos Para análise dos aspectos morfológicos dos cardiomiócitos e quantitativo dos grânulos de ANP e BNP do átrio direito foi utilizado microscópio Zeiss, acoplado a um programa de análise de imagens computadorizado (Axio Vision, Zeiss) do Laboratório de Estudos Morfoquantitativos e Imuno-histoquímicos (LEMI) da Universidade São Judas Tadeu. Foram utilizadas as imagens de cada animal e de cada grupo, capturadas previamente em microscópio eletrônico e gravadas em pen-drives. Para uniformizar os dados, somente os cardiomiócitos que continham o núcleo com formato aproximadamente circular foram fotografados (Figura 2).

27 26 Figura 2- Micrografias eletrônicas de cardiomiócitos do átrio direito de ratos dos grupos: GC e GD (b) utilizadas para contagem dos grânulos de peptídeos natriuréticos ANP e BNP em conjunto (setas). São observados grânulos no citoplasma junto ao núcleo (N), entre mitocôndrias (M). Para a contagem e medida dos diâmetros dos grânulos dos tipos ANP e BNP foram utilizadas 10 fotomicrografias por animal dos cardiomiócitos com aumento de x15000, que continham grânulos em uma área quadrangular de 54 µm 2 Foram medidos o maior e o menor diâmetro de cada grânulo e as médias aritméticas de ambas as medidas foram utilizadas para os cálculos finais (Figura 3). Figura 3 Fotomicrografia eletrônica do citoplasma de cardiomiócito do átrio direito, mostrando a área retangular utilizada (54µm 2 ) para contagem e medida dos diâmetros dos grânulos de ANP (seta) e BNP (cabeça de seta). G-Vesículas do aparelho de Golgi.

28 Densidades de volume de mitocôndrias, do complexo de Golgi, retículo endoplasmático e o número de poros da membrana nuclear. Dez micrografias eletrônicas por animal examinadas com aumento de x15000 foram utilizadas para determinar os volumes relativos (%) de mitocôndrias, reticulo endoplasmático e do aparelho de Golgi (MANDARIM-DE-LACERDA, 2003) no citoplasma e o número de poros por 10 µm de membrana nuclear. Figura 4 Fotomicrografias eletrônicas de cortes de cardiomiócitos do átrio direito de ratos Wistar mostrando estruturas que foram quantificadas: em a- poro nuclear (seta preta), aparelho de Golgi (G); em a e b: grânulos de ANP (setas brancas) e BNP (cabeças de setas), mitocôndrias (M), reticulo endoplasmático (ER). São mostradas também a eucromatina (E) (não quantificada) e núcleo (N). O volume relativo corresponde à área ocupada pela estrutura no campo em porcentagem. Ele foi obtido utilizando um sistema-teste equipado com 80 pontos (considerado como 100%) colocado sobre cada fotomicrografia (Fig. 5).

29 28 Figura 5- Fotomicrografias eletrônicas de corte de cardiomiócito do átrio direito mostrando os componentes citoplasmáticos a serem quantificados (a) e o sistema teste com 80 pontos superposto (em amarelo) (b). N-Núcleo do cardiomiócito. ER- Retículo endoplasmático. G-Aparelho de Golgi. Setas: grânulos de ANP. Cabeça de seta: grânulo de BNP. A seguinte fórmula foi utilizada para obter os volumes relativos dos componentes dos cardiomiócitos: Vv [estrut] = ΣP [estrut] 100/TP; onde, Vv [estrut] = Volume Relativo da estrutura, ΣP [estrut] = númerode pontos sobre a estrutura em questão, e TP= Número Total de pontos (80) do sistema-teste (GUNDERSEN, 1986; MAYHEW and LUCOCQ, 2008). As medidas foram realizadas utilizando o programa de análise de imagens Axio Vision (ZEISS, 2009).

30 Análise estatística Os dados obtidos para cada parâmetro foram tabulados, as médias calculadas e comparadas estatisticamente entre os grupos, para verificar os efeitos do envelhecimento sobre cada parâmetro e a influência do DM sobre estes efeitos. As comparações estatísticas entre as médias dos grupos de animais foram feitas utilizando o Anova e o teste t de Student com nível de significância de p < 0, RESULTADOS 4.1 Valores da pressão sistólica e da glicemia A tabela 1 mostra os resultados obtidos para a medida da pressão sistólica e da glicemia dos animais em ambos os grupos obtidos no momento do sacrifício dos animais. Verificamos que não há diferença significante entre os valores da PA nos grupos de animais (p > 0.05). Os valores da glicemia nos animais do GD são compatíveis com a presença de diabetes nesse grupo (p < 0.05). Tabela 1 Valores da pressão arterial sistólica e da glicemia em ambos os grupos de animais estudados (GC e GD). Valores representam a média ± desvio padrão. O ANOVA e o teste t de Student foram utilizados para a análise estatística. *Significante vs GC (p < 0.05) 4.2. Ultraestrutura dos cardiomiócitos Em ambos os grupos de animais, os cardiomiócitos atriais contém um núcleo central, numerosas mitocôndrias, miofibrilas, quantidade variável de retículo endoplasmático, aparelho de Golgi e grânulos eletron-densos. Os grânulos mostram número e tamanho variados e estão na maioria localizados na região perinuclear em

31 30 associação com os componentes do aparelho de Golgi (Fig. 6). Maior número de grânulos foram observados no citoplasma no GD do que no GC. O GC contém grânulos menores do que o GD (Fig. 7) e encontram-se dispersos entre os componentes do citoplasma do cardiomiócito. Figura 6- Fotomicrografias eletrônicas de cortes de cardiomiócitos do átrio direito dos grupos GC (a) e GD (b) de ratos Wistar com pequeno aumento. Os cardiomiócitos contem numerosos grânulos (setas) próximo ao núcleo (N). No GD (b) são observados mais grânulos (setas) no citoplasma do que no GC. Mitocôndrias (M).

32 31 Figura 7- Fotomicrografias eletrônicas de cortes de cardiomiócitos do átrio direito dos grupos GC (a) e GD (b) de ratos Wistar com aumento maior do que da figura 6. O cardiomiócito do GD (b) contem grânulos (setas brancas) menores do que os do GC (a). A seta preta mostra um poro da membrana nuclear. G- Aparelho de Golgi ER- Retículo endoplasmático. M-Mitocôndrias. N- Núcleo do cardiomiócito. 4.3 Morfometria dos cardiomiócitos O número e o diâmetro dos grânulos nos cardiomiócitos do átrio direito em ambos os grupos de ratos são mostrados nas figuras 8 a 15. A figura 8 mostra os resultados obtidos para as médias e respectivos erros padrões da média da densidade numérica dos grânulos de ANP e BNP em conjunto, de ANP e BNP isoladamente nos grupos GC e GD. Observamos que os valores obtidos para o GD são

33 DIâmetro ANP (nm) Diâmetrode BNP (nm) Densidade numérica de ANP e BNP Densidade numérica Densidad e 32 significantemente maiores do que os de GC tanto para os grânulos em conjunto como isoladamente ( p<0,0001) GC GD GC GD GC GD Figura 8. Densidade numérica de ANP e BNP em conjunto, somente de ANP e de BNP nos grupos GC e GD. *Significante vs. GC (p<0,0001). Os resultados obtidos para as médias e respectivos erros padrões da média do diâmetro dos grânulos de ANP e BNP (valor da média) nos grupos GC e GD aparecem na figura 9.. Observamos que em ambos os tipos de grânulos os valores obtidos para o GD são significantemente menores do que os de GC (p<0,0001). 1 0,8 0,5 0,6 0,4 0,3 0,4 0,2 0,1 0 GC GD 0,2 0 GC CD Figura 9. Densidade numérica do diâmetro dos grânulos de ANP e de BNP nos grupos GC e GD. *Significante vs. GC (p<0,0001).

34 ANP % BNP % Densidade de volume de mitocôndreas (%) Densidade e volume de Retículo Densidade e volume do Complexo de Golgi (%) 33 A figura 10. Densidade de volume de mitocôndrias, retículo endoplasmático e complexo de Golgi nos grupos GC e GD. Observamos que em todos os casos os valores obtidos para o GD são menores do que os do GC, porém, a diferença não foi significante (p>0,05) GC GD 0 GC GD 0 GC GD Figura 10. Densidade de volume de mitocôndrias, retículo endoplasmático e complexo de Golgi nos grupos GC e GD. Na figura 11 podem ser observados os resultados obtidos para a distribuição de freqüências (%) dos grânulos de ANP e BNP de acordo com seu diâmetro nos grupos GC e GD. Os resultados para o ANP mostram que houve diminuição da porcentagem dos grânulos médios e grandes mas não dos pequenos nos animais diabéticos. Os resultados para o BNP mostram que houve diminuição da porcentagem dos grânulos pequenos e aumento das porcentagens dos médios e grandes nos animais diabéticos GC GD GC GD 0 P M G 0 P M G

35 34 Figura 11. Distribuição de frequência de ANP e BNP, pequenos, médios e grandes nos grupos GC e GD. *Significante vs. P e M (p<0,01); **Significante vs. M e P (p<0.01); ***Significante vs. P (p<0.01). 5. DISCUSSÃO Existem dois principais achados no presente trabalho. Primeiro, a densidade numérica do ANP e do BNP nos cardiomiócitos foi significantemente maior no grupo idoso diabético comparado com o grupo controle e o tamanho dos grânulos de ANP e BNP foi significantemente menor no grupo diabético em relação ao controle, indicando que o diabetes teve influência na produção dos peptídeos natriuréticos. Segundo, ratos idosos submetidos ao diabetes, não mostraram influência significante desta doença na densidade de organelas citoplasmáticas dos cardiomiócitos, comparados com o grupo controle. Após a análise morfológica e o término das contagens e medidas dos grânulos de ANP e da análise estatística dos dados, os resultados mostraram alterações promovidas nos cardiomiócitos e nos grânulos de ANP pelo diabetes associado ao envelhecimento. Embora se saiba que existem 4 tipos de grânulos (A, B, C e D), neste trabalho foram analisados os efeitos do diabetes sobre grânulos dos tipos A e B, que são os mais conhecidos e estudados (BERGER; RONA, 1971; MAREI, 2002; GIRALDO et al., 2011). No presente estudo, cardiomiócitos de ratos idosos diabéticos mostraram um aumento na densidade numérica de ANP e BNP, quando comparados com animais do grupo não diabético. Estes resultados são semelhantes aos de KORYTKOVSKI; LANDENSON, (1991); WU et al., (1997). GAROTO (2012), por sua vez não encontrou diferenças na densidade numérica entre ratos diabéticos idosos e ratos normais. Estes autores porém trabalharam com animais mais jovens e realizaram medidas utilizando técnicas diferentes em relação às que utilizamos. No presente estudo, a análise quantitativa dos grânulos de ANP foi realizada em fotomicrografias eletrônicas dos cardiomiócitos dos grupos, as quais foram submetidas as técnicas morfométricas em sistema de análise de imagens computadorizado apropriado. As técnicas que empregamos para quantificação do ANP e BNP foram também utilizadas por outros autores (MIFUNE et al, 1992; Wu et al. (1997); CHIMENTI et al., 2003).

36 35 O aumento da densidade de grânulos de ANP e BNP que observamos no citoplasma dos cardiomiócitos dos animais diabéticos pode ser devido a um aumento na produção dos peptídeos ou a uma diminuição de sua secreção para a corrente sanguínea. Trabalhos semelhantes realizados em camundongos, mostram que os níveis de ANP e BNP no sangue estavam menores nos animais diabéticos do que nos normais, sugerindo que a secreção destes peptídeos estavam reduzidas nos animais diabéticos (MIFUNE et al, 1992), ou seja ocorreu diminuição de secreção desses peptídeos. Os autores explicam o achado dizendo que talvez seja devido a alterações nos mecanismos de secreção dos peptídeos com a idade associada ao diabetes. O aumento do número de grânulos de ANP e BNP no citoplasma dos cardiomiócitos nos animais diabéticos talvez representem um aumento dos precursores polipeptídicos destes hormônios como consequência da redução da secreção. Sabe-se que no diabetes ocorre poliúria com glicosúria devido à hiperglicemia. É possível que os cardiomiócitos do diabético retenham o ANP e o BNP nos cardiomiócitos, elevando assim seus níveis, a fim de que não haja perda excessiva de sódio se houvesse saída de ANP e BNP dos cardiomiócitos. É que, como é conhecido, esses peptídeos, quando lançados no sangue atuam nos rins aumentando a saída de sódio e água (OHBA et al., 2001; MCGRATH et al., 2005). Em outras palavras, sugere-se que a redução de secreção de ANP e BNP ocorra para manter as taxas de sódio extracelular no animal com diabetes. No presente trabalho verificou-se que o diabetes e o envelhecimento dos ratos promoveram efeitos significantes no tamanho médio tanto dos grânulos de ANP como de BNP, sendo que no grupo diabético os grânulos foram menores que os dos animais idosos normais, ou seja, o diabetes influenciou no mecanismo de produção dos grânulos, tornando-os menores, o que também foi observado por GAROTO (2012) em seu trabalho com ratos de meia-idade. Os resultados obtidos neste trabalho, em relação à distribuição de frequências dos grânulos quanto ao seu tamanho nos grupos considerados, permite dizer que o diabetes influenciou não somente o tamanho, mas também a proporção dos grânulos quanto ao seu tamanho. Os resultados mostraram que houve uma mudança na distribuição quantitativa dos tipos de grânulos quanto ao seu tamanho. Assim podemos supor que o aumento observado no número de grânulos nos animais diabéticos foi devido ao aumento de grânulos pequenos em relação aos médios e grandes, que por sua

37 36 vez diminuíram relativamente. Este resultado explica a diminuição no tamanho médio observado nos grânulos dos animais diabéticos. No caso dos grânulos de BNP, verificou-se que a perda de grânulos no diabetes foi causada pela diminuição do número de grânulos pequenos, mas não dos médios e grandes. Tanto nos caso grânulos de ANP como de BNP as causas deste fenômeno são desconhecidas. Nossos achados de que as mitocôndrias, o aparelho de Golgi e o retículo endoplasmático dos cardiomiócitos não sofreram alterações quantitativas na vigência do diabetes estão em desacordo com dados da literatura, que mostram efeitos nestes componentes, em cardiomiócitos ventriculares. Esta diferença pode ser devida especialmente ao tempo em que os animais permaneceram diabéticos. A literatura mostrou artigos sobre este tema nos cardiomiócitos ventriculares somente em relação às mitocôndrias. Em nosso trabalho, foi observado que as mitocôndrias presentes nos cardiomiócitos dos animais do grupo diabético eram pouco coradas e possuindo forma irregular, sendo suas cristas não visíveis, o que também foi observado por Garoto (2012) em animais diabéticos de meia-idade. A manutenção do número de mitocôndrias é controlada por vários mecanismos incluindo fissão e fusão, mitofagia e biogênese. As lesões mitocondriais observadas frequentemente em ratos diabéticos indicam falência dos mecanismos de controle mitocondriais (LIANQ, KOBAYASHI, 2015). Ao que tudo indica este fenômeno não ocorreu no presente trabalho. Vários estudos tem relacionado a função mitocondrial ao equilibrio entre demanda de energia e suprimento nutritivo, sugerindo que alterações nas mitocôndrias possam atuar como mecanismo de adaptação bioenergética durante remodelação cardíaca patológica. Outra função da mitocôndrias é a remoção de mitocôndrias velhas e lesadas não funcionais através de mitofagia (VASQUEZ-TRINCADO et al, 2015). Embora neste trabalho não tenhamos avaliado lesões mitocondriais, ao que parece este também não foi um fenômeno observado no presente estudo. Entretanto, de acordo com os resultados obtidos neste trabalho, estes achados sobre as mitocôndrias estão de acordo com os achados de que não houve diminuição na densidade de grânulos de ANP e BNP nos cardiomiócitos. Não encontramos referências sobre efeitos do diabetes em aparelho de Golgi ou retículo endoplasmático em cardiomiócitos, seja atriais seja ventriculares. Em outros tipos de células, podemos citar que os achados do presente estudo em

38 37 cardiomiócitos, difere da maioria dos autores que tem observado alterações nestas organelas em função do diabetes. Assim por exemplo, em trabalho realizado com ratos diabéticos, Kodowiak et al (2005) verificaram que o diabetes altera membranas do aparelho de Golgi. Estes autores observaram diminuição de membranas do complexo de Golgi em células hepáticas no grupo diabético em relação ao grupo controle. O mesmo se pode dizer em relação ao retículo endoplasmático e o diabetes. Trabalho recente mostrou que as células pancreáticas produtoras de insulina as quais possuem um retículo endoplasmático exuberante também são afetadas quantitativamente pelo diabetes (LAMPROPOULOU et al, 2016). A mesma explicação dada para a manutenção da densidade de mitocôndrias nos animais diabéticos, vale para o aparelho de Golgi e retículo endoplasmático. No presente estudo, os animais não mostraram presença de hipertensão arterial nas aferições realizadas, ou seja eles permaneceram normotensos. Desta forma podemos dizer que o aumento da produção de ANP e BNP pelos cardiomiócitos não foi devido à presença de hipertensão. Esta afirmação se justifica porque o ANP e o BNP tem participação importante na manutenção da pressão arterial (ANANDA-SRIVASTAVA; TRACHTE, 1993; ESPINER et al., 1995). Assim, é possível afirmar que o aumento na produção de ANP e BNP nos cardiomiócitos de animais diabéticos se deveu exclusivamente ao diabetes. No presente trabalho utilizamos o rato Wistar por ser animal de fácil manejo e frequentemente utilizado em pesquisa morfológica e fisiológica. Um levantamento mostrou que os ratos, nas quatro principais bases de dados, foram os animais mais utilizados em trabalhos científicos, seguidos pelos camundongos, coelhos, cães, porcos e primatas. Em média, 85% dos artigos do Medline e 70,5% dos trabalhos citados no Lilacs utilizaram ratos e camundongos (FAGUNDES &TAHA, 2004). Vale ressaltar que quando se faz estudo sobre envelhecimento, utilizando o rato de laboratório, é necessário levar em consideração as diferenças na anatomia, fisiologia, desenvolvimento e fenômenos biológicos entre esse animal e os seres humanos. Por esse motivo, pode-se afirmar que os resultados do presente trabalho são válidos para o rato Wistar idoso e nas condições da pesquisa realizada. Ou seja, os efeitos do diabetes foram avaliados em ratos Wistar machos idosos sacrificados com 16 meses de idade, que receberam uma dose única de estreptozotocina (70 mg/kg) para indução do diabetes aos 14 meses e, portanto mantidos diabéticos por 60 dias. Outros oito ratos não diabéticos foram sacrificados aos 16 meses de idade,