PREVALÊNCIA E FATORES ASSOCIADOS AO CARREAMENTO DAS FORMAS SEXUAIS DE PLASMODIUM VIVAX, EM UMA ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS PREVALÊNCIA E FATORES ASSOCIADOS AO CARREAMENTO DAS FORMAS SEXUAIS DE PLASMODIUM VIVAX, EM UMA ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA ANNE CRISTINE GOMES DE ALMEIDA MANAUS 2014

2 i ANNE CRISTINE GOMES DE ALMEIDA PREVALÊNCIA E FATORES ASSOCIADOS AO CARREAMENTO DAS FORMAS SEXUAIS DE PLASMODIUM VIVAX, EM UMA ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical, da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro Co- orientador: Prof. Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda MANAUS 2014

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4 iii FOLHA DE JULGAMENTO PREVALÊNCIA E FATORES ASSOCIADOS AO CARREAMENTO DAS FORMAS SEXUAIS DE PLASMODIUM VIVAX, EM UMA ÁREA ENDÊMICA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA ANNE CRISTINE GOMES DE ALMEIDA Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Banca Julgadora: Prof. Dr. Wuelton Marcelo Monteiro Presidente Prof. Dr. Marcus Tolentino Silva Membro Prof. Dr. Felipe Gomes Naveca Membro

5 iv DEDICATÓRIA Ao meu filho Gustavo Brito, Pelo seu sorriso que me alegra todos os dias, pelos beijos e abraços que confortam meu coração. Você me tornou mãe e mulher e me mostrou o que é o verdadeiro amor. Ao meu querido Marcelo Brito, Pelo carinho, dedicação e lealdade para comigo e com nosso filho durante os últimos anos, pelo incentivo ao meu crescimento profissional, por nunca desistir dos nossos sonhos juntos, pelo apoio nos momentos mais difíceis da minha vida.

6 v AGRADECIMENTOS aqui. A Deus, que me amparou em todas as dificuldades pelas quais passei até Ao meu filho Gustavo Brito e ao meu Marcelo Brito, pelo amor e carinho dedicados a mim e pelo apoio incondicional em todos os momentos. Aos meus queridos pais, Zioneia Almeida e João Raimundo Almeida, pelo incentivo constante ao meu crescimento pessoal e profissional e pelos ensinamentos que levarei durante toda a minha vida. As minhas irmãs Lahis Gomes e Thais Gomes e ao meu primo Erick Frota, pelo companheirismo e pelas risadas nos momentos mais necessários. Ao meu orientador Wuelton Monteiro, pela paciência e compreensão que precisei, pela sua dedicação e pelos seus ensinamentos. Ao meu co-orientador Marcus Lacerda, pela confiança depositada no meu trabalho e pela oportunidade de fazer parte de seu grupo de pesquisa em Malária. A minha companheira de sala e de bancada, Andrea Kuhn, que foi de fundamental importância na execução deste trabalho, por auxiliar-me em todas as etapas do mesmo, com atenção e paciência. TransEpi. À enfermeira Sheila Vítor pela coordenação das equipes de campo do Projeto Às minhas amigas Keillen Campos e Larissa Brasil, por sua lealdade e companheirismo nestes dois anos de convivência. Aos meus colegas e professores do Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, bem como a secretaria do programa, pela atenção e auxílio prestados a mim.

7 vi A todos os integrantes do projeto TransEpi (equipes de campo e de laboratório) que contribuíram para realização deste estudo. À gerente de malária, Mônica Costa e a todos os técnicos da Gerência de Malária da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, que de alguma forma fizeram parte deste trabalho. À Universidade do Estado do Amazonas e a FMT-HVD, pela infra-estrutura cedida para execução do projeto. Às agências de fomento FAPEAM e Fundação Bill e Melinda Gates, pela concessão de bolsa de pesquisa e pelo apoio finaceiro ao estudo. Aos pesquisadores, mestrandos e doutorandos particicipantes do XVIII Seminário Laveran & Deane sobre Malária, que com suas sugestões contribuíram para a melhoria deste trabalho.

8 vii DECLARAÇÃO DAS AGENCIAS FINANCIADORAS Meus agradecimentos: À Fundação de Amparo a Pesquisa do Amazonas, pela concessão de bolsa de pesquisa durante o período de execução deste Mestrado Acadêmico; À Fundação Bill e Melinda Gates, pelo suporte financeiro que tornou possível a execução deste trabalho.

9 viii RESUMO A malária ainda representa um problema de saúde pública no mundo. A infecção assintomática de malária muitas vezes cursa com parasitemia submicroscópica, mas que é potencial fonte de gametócitos para os anofelinos vetores da doença. Apesar de seu papel fundamental na transmissão da malária, a prevalência de gametócitos e os fatores associados a gametocitemia não estão bem esclarecidos. Este trabalho teve como objetivo estimar a prevalência e os fatores associados ao carreamento de formas sexuais de e Plasmodium vivax em área endêmica na Amazônia Brasileira. Foi realizado um estudo transversal com 2012 participantes, residentes em área periurbana da cidade Manaus-AM, com aplicação de questionários e coleta de amostras de sangue para detecção de infecção malárica pelos métodos de Microscopia Óptica (MO) e qpcr, e de formas sexuais de P. vivax, pela MO e pela técnica de RT-qPCR. A partir de dados do questionário e dos resultados moleculares, foi possível estabelecer os fatores associados a infecção e ao carreamento de gametócitos de P. vivax, utilizando análise univariada e regressão logística. Foi verificado o desempenho da qpcr e RT-qPCR na detecção de Plasmodium sp. e dos gametócitos, utilizando a MO como referência. A prevalência de infecção por P. vivax foi de 4,32% e de gametocitemia foi de 2,14%. A prevalência de infecção assintomática correspondeu a 85,06% do total de carreadores de P. vivax (74/87).Os fatores associados a infecção malárica são febre (OR=3,18; IC95%=1,70-5,98; p<0,001), histórico de malária (OR=4,03; IC95%= 1,82-8,89; p=0,001) e uso recente de antimalárico (OR=2,71; IC95%= 1,63-4,5; p<0,001). Os fatores associados ao carreamento de gametócitos são febre (OR= 4,59; IC95%= 2,14-9,84; p<0,001), histórico de malária (OR= 6,25; IC95%= 1,45-26,32; p=0,01), uso recente de antimalárico (OR= 3,26; IC95%= 1,51-7,05; p<0,001) e maior quantidade de estágios sanguíneos do parasita (OR= 3,22; IC95%= 1,30-7,69; p=0,01). Em indivíduos assintomáticos (não febris), foram encontrados os mesmos fatores associados à infecção e à gametocitemia. A sensibilidade e especificidade da técnica de qpcr em relação a MO foi de 88,89% e 97,22%, respectivamente; a técnica de RT-qPCR teve sensibilidade de 85,71% e especificidade de 98,44% em relação a MO. Baixas parasitemias e infecções submicroscópicas são suficientes para manter a endemia na área periurbana de Manaus-AM. Mais da metade dos infectados por P. vivax carreavam gametócitos, sendo estes indivíduos potenciais transmissores do parasita para o vetor anofelino. As técnicas moleculares qpcr e RT-qPCR foram duas vezes mais sensíveis que a MO para diagnóstico de infecção malárica e de gametocitemia. São necessários estudos longitudinais nessas localidades para determinar a incidência de infecção malárica e os fatores de risco para o carreamento de formas sexuais de P. vivax. Palavras-chave: Malária. Plasmodium vivax. Gametócito. RT-qPCR. Epidemiologia.

10 ix ABSTRACT Malaria remains a public health problem in the world. Asymptomatic malaria infection often progresses with submicroscopic parasitemia, a potential source of gametocytes for Anopheles vectors. Despite its key role in the transmission of malaria, the prevalence of gametocytes and the factors associated with gametocitemia are not well clear. This study aimed to estimate the prevalence and factors associated with the carrying of sexual forms of Plasmodium vivax in endemic areas of the Brazilian Amazon. A cross-sectional study was conducted with 2012 participants living in periurbans areas of Manaus-AM city, was made questionnaires application blood samples collection and collection to detect malarial infection by the methods of light microscopy (LM) and qpcr, and sexual forms of P. vivax, by the LM and the RTqPCR methods. From the questionnaire data collected and results of molecular methods, it was possible to establish the factors associated with the infection and the carrying of gametocytes of P. vivax, using univariate and logistic regression analysis. QPCR and RT-qPCR performance to detect Plasmodium sp. and gametocytes was evaluated, using LM as gold standard. The prevalence of P. vivax infection was 4.32% and 2.14% for gametocitemia. The prevalence of asymptomatic infection was 85.06% of total carriers of P. vivax (74/87). The factors associated with malaria infection are fever (OR = 3.18; 95%CI= 1.70 to 5.98; p<0.001), malaria previous episodes (OR = 4.03; 95%CI= 1.82 to 8.89; p= 0.001) and recent use of antimalarial drugs (OR= 2.71; 95%CI= 1.63 to 4.5; p<0.001). The factors associated with gametocytes carrying are fever (OR = 4.59; 95%CI= 2.14 to 9.84; p<0.001), previous malaria episodes (OR= 6.25; 95%CI= 1.45 to 26,32; p= 0.01), recent use of antimalarial drugs (OR = 3.26, 95% CI 1.51 to 7.05, p<0.001) and the greater amount of blood stages parasites (OR= 3.22; 95%CI= 1.30 to 7.69; p= 0.01). In asymptomatic individuals (non-febrile individuals), the same factors associated with infection and gametocitemia wer found. The sensitivity and specificity of qpcr technique are 88.89% and 97.22%, respectively; the technique of RT-qPCR sensitivity is 85.71% and the specificity is 98.44%, compared to LM. Low parasitemia and submicroscopic infections are sufficient to maintain endemic disease in periurban area of Manaus-AM. More than half of those infected with P. vivax carry gametocytes, which are potential transmitters of the parasite for anopheles vectors. Molecular techniques RT-qPCR and qpcr were twice sensitive compared to LM, for malaria infection and gametocytes carriage diagnostic. Longitudinal studies are needed in these locations to analyze the incidence of malaria infection and the risk factors for the carrying of sexual forms of P. vivax. Key words: Malaria. Plasmodium vivax. Gametocyte. RT-qPCR. Epidemiology.

11 x RESUMO POPULAR A malária ainda é um importante problema de saúde no mundo. As pessoas que residem em áreas com muitos casos de malária nem sempre apresentam sintomas e tem poucos parasitas da malária no sangue, mas, mesmo assim, esses indivíduos continuam a transmitir a doença para o mosquito por meio dos gametócitos, uma das formas do parasita no sangue. Depois que o mosquito adquire o parasita, ele pica outra pessoa, continuando assim a transmissão da doença na comunidade. Nosso trabalho quis identificar quantas pessoas tem gametócitos no sangue e o que faz algumas pessoas terem essa forma do parasita e outras pessoas não. Para isso nós realizamos coleta de sangue nas comunidades do Brasileirinho, Ipiranga e Puraquequara e entrevistamos as pessoas sobre uso de medidas para prevenir a malária, histórico de malária e ainda registramos a idade, sexo e ocupação das pessoas que aceitaram participar do nosso estudo. Nós tentamos encontrar os gametócitos no sangue através da gota espessa (método mais comum) e usando um outro método mais eficaz, a PCR. Como resultados, encontramos que 4,32% das pessoas (de um total de 2012) moradoras dessas comunidades tinham malária e 2,14% dessas pessoas tinham o gametócito, sendo então capazes de transmitir a doença para o mosquito da malária. A maioria das pessoas com malária não tinham sintomas no momento em que coletamos o sangue. Os principais fatores que fazem as pessoas ter gametócitos são: já ter tido episódios de malária durante a vida e ter tido malária pouco tempo antes desta coleta do sangue. O método da PCR conseguiu encontrar melhor a malária nas pessoas do que a gota espessa. Apesar de apenas algumas pessoas apresentarem malária nas comunidades estudadas, isto é suficiente para manter a doença na área, pois estas pessoas, mesmo não apresentando sintomas e com baixa quantidade de parasita no sangue, continuam transmitindo a doença para o mosquito, mantendo assim a transmissão. São necessários outros estudos nessas comunidades para investigar melhor esses resultados.

12 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Países e áreas de risco de transmissão de Malária. Figura 2. Índice Parasitário Anual na região das Américas. Figura 3. Ciclo Biológico de Plasmodium sp. Figura 4. Gráfico do Índice Parasitário Anual nas localidades do estudo. Figura 5. Localidades de execução do estudo em Manaus, AM. Figura 6. Fluxograma demostrando as etapas do estudo. Figura 7. Fluxograma da Análise Molecular das amostras do estudo. Figura 8. Mapa da localização dos participantes do corte transversal. Figura 9. Gráfico de correlação entre número de cópias de 18s rrna (qpcr) vs número de cópias de Pvs25 (RT-qPCR). Figura 10. Gráficos de correlação entre parasitemia assexual e gametocitemia (MO). Figura 11. Gráfico da densidade de P. vivax (microscopia óptica) nos diferentes grupos de idade. Figura 12. Gráfico da densidade de P. vivax (qpcr, RT-qPCR) nos diferentes grupos de idade. Figura 13. Gráfico da curva padrão do ensaio Qmal e eficiência do ensaio Qmal, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Figura 14. Gráfico da curva padrão do ensaio espécie-específico para P. vivax e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Figura 15. Gráfico da curva padrão do ensaio espécie-específico para P. falciparum e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão.

13 xii LISTA DE FIGURAS (cont.) Figura 16. Gráfico da curva padrão do ensaio gametócito-específico para P. vivax e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Figura 17. Gráfico da curva padrão do ensaio gametócito-específico para P. falciparum e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Figura 18. Gráfico de correlação entre parasitemia (MO) e número de cópias de 18S rrna (qpcr). Figura 19. Gráfico de correlação entre gametocitemia (MO) e número de cópias de Pvs25 (RT-qPCR).

14 xiii LISTA DE TABELAS Tabela 1. Características dos participantes. Tabela 2. Prevalência de infecção malárica e de gametocitemia. Tabela 3. Fatores de risco para o carreamento de P. vivax Tabela 4. Fatores de risco para o carreamento de P. vivax em indivíduos assintomáticos. Tabela 5. Fatores de risco para o carreamento de gametócitos de P. vivax Tabela 6. Fatores de risco para o carreamento de gametócitos de P. vivax em indivíduos assintomáticos Tabela 7. Performance diagnóstica da qpcr para o gene 18S rrna, tendo como referência a Microscopia Óptica. Tabela 8. Performance diagnóstica da RT-qPCR para os genes Pvs25 and Pfs25, tendo como referência a Microscopia Óptica.

15 xiv LISTA DE ABREVIATURAS E UNIDADES DE MEDIDAS µl microlitro 18S rrna gene da porção 18S do RNA ribossomal cdna DNA complementar Ct cycle threshold, ciclo limiar DNA Ácido desoxirribonucléico GE Gota Espessa IC95% - Intervalo de confiança 95% IPA Índice Parasitário Anual Méd. Geom Média Geométrica mm 3 milímetro cúbico mrna RNA mensageiro OMS Organização Mundial da Saúde OPAS Organização Pan americana de Saúde OR odds ratio P. falciparum Plasmodium falciparum P. malariae Plasmodium malariae P. ovale Plasmodium ovale P. vivax Plasmodium vivax PCR Reação em cadeia da polimerase PF - Plasmodium falciparum Pfs25 - gene da proteína 25 da superfície do oocineto de P. falciparum. POP Procedimento Operacional Padrão PV - Plasmodium vivax Pvs25 gene da proteína 25 da superfície do oocineto de P. vivax. qpcr Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa RT-qPCR Reação em Cadeia da Polimerase com Transcrição Reversa quantitativa QT-NASBA - Amplificação Quantitativa da Sequência de Ácidos Nucléicos R 2 Coeficiente de correlação RNA - Ácido ribonucléico SIVEP Sistema de Vigilância Epidemiológica

16 xv SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO Aspectos epidemiológicos da Malária Ciclo Biológico do Plasmodium sp Manifestações Clínicas da Malária Infecção assintomática Gametocitemia na Malária Justificativa OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos MATERIAIS E MÉTODOS Tipo de Estudo Locais e População do estudo Procedimento do estudo tranversal Definições Visita domiciliar e coleta de amostras Diagnóstico de Infecção Malárica Determinação do carreamento de formas sexuais Aspectos Éticos Análise dos dados RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS... 54

17 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 Aspectos epidemiológicos da malária A malária é a mais importante doença parasitária em todo o mundo, representando um importante problema de saúde pública, ocorrendo em mais de 108 países incluindo regiões tropicais e subtropicais da África, Ásia, América Central e América do Sul (Figura 1) (1). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que em 2012 ocorreram 207 milhões de casos de malária e 627 mil mortes. Cerca de 80% dos casos e 90% das mortes ocorreram na África, sendo que 77% destas mortes ocorreu entre crianças menores de 5 anos de idade (2). Nas Américas, o Brasil é o principal responsável pela grande morbidade atribuída à malária (3) Malária: Países e áreas de risco de transmissão Figura 1. Países e áreas de risco de transmissão de Malária (2). A malária é uma doença infecciosa causada por protozoários da ordem Apicomplexa e gênero Plasmodium, sendo as quatro espécies que infectam o homem: Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale, e são transmitidas por mosquitos do gênero Anopheles(4); ressalta-se que o P. ovale ainda não foi descrito no Brasil. Recentemente Plasmodium knowlesi tem sido implicado também em doença humana, inclusive com gravidade clínica (5).

18 2 No Brasil, a malária é um importante problema de saúde, com cerca de casos registrados em Embora o principal mosquito vetor, Anopheles darlingi, esteja presente em cerca de 80% do país, atualmente a incidência de malária no Brasil ocorre, em 99,8% dos casos, nos estados da Amazônia Legal (6). Outros anofelinos também são implicados como vetores de malária na Amazônia, dentre eles Anopheles albitarsis, Anopheles nuneztovari, Anopheles triannulatus e Anopheles intermedius e Anopheles braziliensis (7). Devido a este motivo, o Ministério da Saúde tem intensificado as ações de controle nos estados que registram elevada Incidência Parasitária Anual (IPA) (Figura 2). Em 2011, no estado do Amazonas, foi notificado um total de casos de malária (6); as aglomerações urbanas em contínuo desenvolvimento econômico desencadeiam intenso processo migratório, como o ocorrido na cidade de Manaus, capital do estado, ajudando a manter a doença em níveis endêmicos (8). Malária nas Américas, de acordo como IPA, 2011 Figura 2. Índice Parasitário Anual na região das Américas (9). A malária no Brasil é principalmente relacionada ao P. vivax desde a década de 1990, quando as ferramentas de controle disponíveis foram intensificadas, como

19 3 o diagnóstico rápido pela gota espessa em todos os pacientes febris, e livre acesso aos antimaláricos, integradas num sistema descentralizado de atenção à saúde. Embora a malária vivax seja responsável por baixa mortalidade em comparação com a malária falciparum, ela é a causa da maior parte da morbidade e de diminuição na produtividade em comunidades endêmicas (10). 1.2 Ciclo biológico do Plasmodium sp. Quando esporozoítos dos parasitos são inoculados na pele pela picada do vetor, invadem os hepatócitos, fase esta chamada de pré-eritrocítica, ou esquizogonia tecidual. Nos hepatócitos, multiplicam-se, dando origem a milhares de novos parasitos (merozoítos), que rompem os hepatócitos, caindo na circulação sanguínea, onde irão invadir as hemácias, iniciando-se à segunda fase do ciclo, chamada eritrocítica (esquizogonia sanguínea). Nessa fase sanguínea aparecem os sintomas da malária. Nas infecções por P. vivax, alguns parasitos se desenvolvem rapidamente no hepatócito, enquanto outros podem ficar em estado de latência, sendo por isso, denominados hipnozoítos. Acredita-se que os hipnozoítos são responsáveis pelas recaídas da doença, que ocorrem após períodos variáveis de incubação (geralmente após seis meses) (11, 12). Na fase sanguínea do ciclo, os merozoítos formados rompem a hemácia e invadem outras, dando início a ciclos repetitivos de multiplicação eritrocitária, ocorrendo dentro de 48 horas nas infecções por P. vivax e P. falciparum e 72 horas nas infecções por P. malariae. Depois de algumas gerações de merozoítos nas hemácias, alguns se diferenciam em formas sexuadas: os macrogametas (feminino) e microgametas (masculino). Esses gametas no interior das hemácias (gametócitos) não se dividem e, quando ingeridos pelos insetos vetores irão fecundar-se para dar origem ao ciclo sexuado do parasito (11, 12)(Figura 3).

20 4 Figura 3. Ciclo Biológico de Plasmodium sp. (13). A reprodução sexuada (esporogonia) do parasito da malária ocorre após diferenciação dos gametócitos em gametas e a sua fusão, com formação do ovo (zigoto) (Figura 3). Para P. falciparum, a formação e maturação dos gametócitos dividem-se em cinco fases reconhecíveis morfologicamente. Na fase inicial, os gametócitos são sequestrados na medula óssea; no estágio IV, as diferenças entre gametócitos masculinos e femininos se tornam mais aparentes morfologicamente a partir do qual são caracterizados por uma forma alongada com extremidades pontiagudas. Apenas gametócitos no estágio maduro (estágio V) circulam no sangue periférico, onde podem ser ingeridos por mosquitos (14). Diferentemente dos primeiros estágios de gametócitos de P. falciparum, que se desenvolvem na medula óssea, pouco se sabe sobre o local de diferenciação dos gametócitos de P. vivax. Uma vez ingerido por mosquitos, cada um possui um gametócito feminino (macrogameta) e até 8 gametócitos masculinos (microgametas) (13). No intestino médio do mosquito, ocorre a formação do zigoto, que posteriormente se desenvolve em oocineto móvel. O oocineto penetra a parede do intestino médio, para formar os oocistos, no interior do qual se desenvolverão os esporozoítos. Os esporozoítos

21 5 produzidos nos oocistos são então liberados na hemolinfa do inseto e migram até as glândulas salivares, de onde são transferidos para o sangue do hospedeiro humano durante o repasto sanguíneo. O tempo requerido para que se complete o ciclo esporogônico nos insetos varia com a espécie de Plasmodium e também com a temperatura, situando-se geralmente em torno de 10 a 12 dias (11) 1.3 Manifestações Clínicas da Malária O período de incubação da malária varia principalmente com a espécie do plasmódio, sendo de 9-14 dias para o P. falciparum, dias para o P. vivax, dias para o P. malarie e dias para o P. ovale (12). Os primeiros sintomas da malária são inespecíficos e semelhantes aos sintomas da maioria das doenças virais. Eles incluem: dor de cabeça, cansaço, desconforto, fadiga abdominal, dores musculares e articulares, geralmente acompanhados de febre, calafrios, sudorese, anorexia, vômitos e mal-estar (15). A forma clínica mais característica de malária aguda é o paroxismo que aparece com a lise dos eritrócitos infectados no final do ciclo eritrocitário. A periodicidade do quadro está ligada ao padrão da curva febril, produzindo a febre terçã (na infecção por P. vivax e P. falciparum) e a quartã (P. malariae) relacionada com a esquizogonia eritrocitária que se repete a cada 48 ou 72hs (16). Este ataque paroxístico agudo (acesso malárico) é geralmente acompanhado de calafrio e sudorese. Esta fase dura de 15 minutos à uma hora, sendo seguida por uma fase febril, com temperatura corpórea podendo atingir 41 C ou mais. Após um período de 2 a 6 horas, ocorre defervescência da febre, levando o paciente a sudorese profusa e fraqueza intensa. Depois de algumas horas, os sintomas desaparecem e o paciente sente-se melhor. Após a fase inicial a febre assume caráter intermitente, relacionado com o tempo de ruptura de uma quantidade suficiente de hemácias contendo esquizontes maduros (12, 16). Na fase inicial, sem evidência de disfunção de órgãos vitais, os pacientes podem ser facilmente tratados, com recuperação completa, se o tratamento eficaz

22 6 for fornecido. Se, no entanto, os medicamentos não são fornecidos ou forem ineficazes (resistência parasitária), ou se o tratamento for retardado, particularmente nos casos de infecção por P. falciparum, a carga parasitária continua a aumentar e malária grave pode ocorrer (16). Em áreas de baixa endemicidade ou de malária instável, embora a infecção assintomática tenha sido referida na literatura (17), os sintomas são considerados altamente sensíveis para sugerir o diagnóstico, mas pouco específicos para confirmá-lo, contra-indicando o uso de tratamentos presuntivos. Sinais e sintomas de malária aguda como febre, cefaléia e calafrios (tríade clássica) confundem-se com os de outras doenças infecciosas (16). Em áreas de alta endemicidade ou elevada intensidade de transmissão, além desses sintomas de malária, é necessário um limiar de parasitemia periférica para se fazer o diagnóstico e também descartar outras doenças que simulam a malária (18-20). A malaria grave é definida como a infecção com manifestações e complicações potencialmente fatais no homem. A literatura sempre associou malária grave às complicações causadas por P. falciparum (21). O diagnóstico de malária grave é realizado quando achados clínicos e laboratoriais são encontrados, incluindo fadiga muscular, consciência prejudicada, síndrome da angústia respiratória aguda, convulsões repetidas, colapso circulatório, edema pulmonar, sangramento espontâneo, icterícia, hemoglobinúria, anemia grave, hipoglicemia, disfunção renal, hiperlactatemia e hiperparasitemia (5). Estudos recentes demonstram uma mudança no paradigma de P. vivax como um parasita não-virulento (22-26). A OMS declara que, apesar de sua baixa letalidade, a malária por P. vivax pode causar uma grave e debilitante doença febril e resultar em doença grave, assim como a malária por P. falciparum. As manifestações graves da malária por P. vivax, já relatadas são: malária cerebral, anemia grave, pancitopenia e trombocitopenia, icterícia, ruptura do baço, insuficiência renal aguda e síndrome da angústia respiratória aguda; algumas destas já foram descritas na Amazônia Brasileira (22, 25).

23 7 1.4 Infecção assintomática Apesar de uma grande quantidade de estudos sobre a gravidade clínica da malária, as infecções assintomáticas desta doença são pouco compreendidas. A malária assintomática é prevalente em regiões endêmicas e tornou-se motivo de preocupação, sendo considerado um desafio nos esforços para eliminar o parasito (27). O diagnóstico da malária assintomática não é simples, devido à falta manifestações clínicas e muitas vezes o nível submicroscópico dos parasitos (28). Em áreas de malária hiper e holoendêmica, nas quais as pessoas sofrem picadas infectantes frequentes, observa-se aquisição progressiva da imunidade levando a uma diminuição no número de ataques maláricos à medida que aumenta a idade (29). Assim, nessas áreas, o maior número de casos de malária acontece nas crianças entre os 6 meses e 2 anos de idade, que tem infecções que cursam com altas parasitemias. A imunidade clínica vai aparecendo nas crianças entre 1 e 4 anos, ou entre 5 e 9 anos, dependendo do nível de endemicidade do local (30). A partir dos anos, observa-se uma marcada diminuição da parasitemia que às vezes chega a níveis indetectáveis pela gota espessa. No entanto, com as técnicas de biologia de molecular, tem sido demonstrado que a infecção permanece até a idade adulta (28, 31). A malária assintomática não se limita somente às regiões de alta transmissão, onde a exposição é relacionada com desenvolvimento de imunidade, mas também tem sido relatada em regiões de baixa transmissão, como a Amazônia (Peru, Brasil e Colômbia) (27, 32-35). Em estudo realizado nas Ilhas Salomão, outra área de baixa transmissão, apenas 5,5% da população que teve microscopia positiva para malária, apresentava-se febril (36). Foi demonstrado que a malária assintomática por P. vivax e P. falciparum está presente em regiões do Rio Negro, no estado do Amazonas, e nestes locais, as infecções assintomáticas seriam de 4-5 vezes mais elevadas do que as sintomáticas e se mostram correlacionadas com grupos de idade avançada (17, 37). Em outro estudo realizado no estado de Rondônia, em área urbana, demonstrou que as infecções assintomáticas foram mais prevalentes em adultos, entre os 16 e 40 anos

24 8 de idade, variando de 14,3 e 19%; neste estudo não houve associação entre sexo e infecção assintomática (38). Evidências recentes sugerem que o carreamento assintomático de parasitas da malária, em longo prazo, protegeu contra a doença subseqüente na Tanzânia e Senegal, possivelmente através da redução do risco de super-infecção com cepas mais virulentas (39, 40). Estes dados sugerem que a erradicação de infecções assintomáticas pode aumentar o risco de malária clínica em uma estação subsequente de transmissão. Por causa de suas principais implicações na saúde pública, estes achados necessitam de validação, com ajuste de potenciais fatores de confusão, como a exposição cumulativa a malária e imunidade adquirida em diversas áreas endêmicas, como a Bacia Amazônica (41). Os critérios amplamente utilizados para o diagnóstico de portadores assintomáticos de malária são: presença de parasitas no sangue periférico, visualizados por meio de esfregaço sanguíneo/gota espessa, temperatura axilar >37,5 C e ausência de sintomas relacionados com a malária (40, 42-44). Realizar a quantificação da parasitemia, ao invés de observar apenas a presença ou ausência de parasitas, pode ser uma consideração importante no diagnóstico da malária assintomática. O uso da técnica de PCR (Reação em cadeia da polimerase) espécie-específica para malária, mais sensível que a MO, também se mostra uma ferramenta poderosa para detecção de malária assintomática dentro de uma população (43). A dinâmica da transmissão da malária é complexa. Mesmo em áreas endêmicas, a transmissão não é totalmente estável, podendo ser irregular e dependente de fatores como o clima, a localização de criadouros de mosquitos e as áreas de habitação humana, que servem como reservatórios de parasitos para a infecção do mosquito (45). As infecções assintomáticas muitas vezes passam despercebidas e estes casos ficam sem tratamento, o que resulta em uma fonte de gametócitos para os vetores (32). O tratamento dos indivíduos assintomáticos pode ser uma importante estratégia de intervenção, e se estes reservatórios forem amplamente reduzidos, este fato proporcionará um impacto na transmissão da doença.

25 9 1.5 Gametocitemia na malária A transmissão da infecção de um hospedeiro humano infectado para um mosquito suscetível é mediada através dos gametócitos, que são os estágios sexuais do plasmódio. Para P. falciparum estas fases diferem substancialmente dos seus precursores assexuados, sendo que pelo genes são especificamente associados ao desenvolvimento dos gametócitos e aproximadamente 300 proteínas são encontradas exclusivamente nestas formas (46, 47). Porém, os fatores desencadeadores da gametocitogênese ainda são pouco compreendidos (13). Os gametócitos imaturos de P. falciparum são seqüestrados na microvasculatura (predominantemente na medula óssea); os gametócitos maduros são detectáveis na corrente sanguínea de 7 a 15 dias após o aparecimento das formas assexuadas. O tempo médio de circulação de gametócitos maduros de P. falciparum foi estimado entre 3 a 6 dias, sendo no máximo de 22 dias (48). Os gametócitos de P. vivax podem ser detectados três dias após o aparecimento das primeiras formas assexuadas e podem ser detectados de forma contínua durante o período inicial da infecção (13). A carga de gametócitos de P. vivax é acentuadamente menor do que para P. falciparum e na ausência de tratamento, gametócitos da primeira espécie podem circular por um período máximo de três dias (49). Os gametócitos só são detectados em uma minoria de infecções clínicas e assintomáticas por P. falciparum por meio de Microscopia óptica (MO) (13). É cada vez mais aceito que a MO não é capaz de detectar baixas densidades de gametócitos. As ferramentas moleculares para a detecção de gametócitos são baseadas na amplificação de mrna ou cdna correspondentes a genes expressos apenas em gametócitos. Os marcadores de gametócitos na fase tardia (pfs25 e pvs25) são atualmente a base da detecção e quantificação de gametócitos pela amplificação de cdna utilizando a Reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-qPCR) e pela amplificação direta do RNA usando a Amplificação quantitativa da sequência de ácidos nucleicos (QT-NASBA) (50-53).

26 10 Estas ferramentas de detecção molecular têm sensibilidades na faixa de 0,02-0,1 gametocito/ml e gametócitos de P. falciparum foram detectadas 3-10 vezes mais frequentemente por QT-NASBA ou RT-qPCR em comparação com a MO (39-90% vs 4-26%), enquanto a frequência de gametócitos de P. vivax gametócitos aumentou até 8 vezes por QT-NASBA (13, 53, 54). Os gametócitos de P. falciparum são mais comumente observados em indivíduos com uma maior duração da infecção, que se apresentam sem febre e com infecções recrudescentes (13). A prevalência de gametócitos em indivíduos assintomáticos se aproxima da frequência de parasitas assexuados, estimando-se pela MO ou pela detecção molecular (55-57). Em áreas de alta transmissão de P. falciparum, os gametócitos são mais prevalentes nas faixas etárias mais jovens, que também têm a maior prevalência e densidade de formas assexuais (13). Os gametócitos são mais facilmente encontrados nas infecções por P. vivax, sendo detectados pela MO na maioria ou em todas as infecções (58-60). Por causa da alta taxa de produção de gametócitos e de sua curta longevidade, a gametocitemia por P. vivax segue de perto a parasitemia assexual. Em episódios clínicos de malária, a gametocitemia por P. vivax tem sido associada com maior densidade parasitária, idade mais jovem, menor hemoglobina e ausência de febre (13). Estudo realizado na Tailândia, em área de baixa transmissão de malária, descreveu como fatores de risco para presença de gametocitemia de P. falciparum 1) ausência de febre, 2) baixa parasitemia assexuada, 3) anemia, 4) infecção apenas por P. falciparum, ao invés de infecções mistas e 5) baço palpável (61). Em outro estudo, também na Tailândia, que analisava fatores de risco associados ao carreamento de gametócitos de P. vivax, foi demonstrado que os pacientes portadores de gametócitos apresentaram maiores parasitemias assexuadas, bem como menores contagens de eritrócitos, monócitos e linfócitos, além de menores concentrações de albumina e menores temperaturas corporais do que os pacientes sem gametócitos detectáveis (62).

27 11 Uma explicação para a forte ligação entre a anemia e gametócitos seria que a destruição de eritrócitos e do transporte de oxigênio, com consecutiva hipóxia tecidual pode ser propícia para a gametocitogênese (63). Estudo realizado em crianças no Gâmbia, também relatou a ausência de febre, baixa densidade parasitária e anemia como fatores de risco para presença de gametócitos de P. falciparum. Crianças menores de 5 anos apresentaram maior frequência de carreamento de gametócitos do que crianças maiores. Ainda neste estudo, não houve diferença significativa entre a prevalência de gametócitos e grupos étnicos ou sexo (64). Estudo realizado na Tailândia, Tanzânia e Gâmbia teve como fatores associados ao carreamento de gametócitos de P. falciparum: idade mais jovem, tempo de doença maior ou igual a 3 dias, ter anemia ou anemia severa, menor parasitemia e ausência de febre (65). Ao contrário dos estudos citados, um estudo realizado na Nigéria demonstrou que apesar de a anemia não ter sido um fator de risco independente para presença de gametócitos de P. falciparum, o surgimento de gametócitos foi significativamente mais freqüente em crianças anêmicas em comparação com crianças não anêmicas (66). Em uma coorte realizada no Reino Unido, com uma população de viajantes adultos com malária por P. falciparum, foram analisados fatores associados com a gametocitemia, demonstrando que os pacientes que apresentavam gametócitos no momento da inclusão foram mais propensos a ter anemia e ter uma contagem de plaquetas normal, menores parasitemias e menores chances de desenvolver doença grave do que aqueles que desevolveram gametocitemia subsequente (67). Outro estudo, realizado na Coréia, em pacientes com infecção por P. vivax, demonstrou presença de gametócitos em 92,2% dos mesmos e uma alta parasitemia assexuada como fator associado. Por outro lado, os marcadores de anemia, como nível de hemoglobina, hematócrito e contagem de células vermelhas foram significativamente maiores em pacientes sem gametócitos. Os intervalos entre

28 12 o início do primeiro sintoma e o diagnóstico foram significativamente maiores em pacientes com gametócitos (68). Altas densidades de gametócitos de P. falciparum não necessariamente resultam em infecção para o mosquito (58, 69, 70) assim como baixas densidades não excluem a infecciosidade (70-72). O motivo de altas densidades de gametócitos não resultarem em infecção do mosquito pode ser explicado pela imaturidade dos gametócitos (73, 74), que após a sua liberação para a circulação, requerem de 2 a 3 dias para se tornar infecciosos para os vetores (74, 75). Semelhante à infecção por P. falciparum, a associação entre a densidade de gametócitos de P. vivax e as taxas de infecção de mosquitos foi descrita como fraca (58, 69, 76) ou mesmo ausente (71). Uma comparação da transmissão de P. vivax e P. falciparum sugeriu que a transmissão de P. vivax pode ser mais eficiente do que a de P. falciparum, com uma menor concentração de gametócitos resultando em infecção do mosquito (59). 1.6 Justificativa Apesar de seu papel fundamental na transmissão da malária, algumas das questões referentes a gametocitemia, como por exemplo, os fatores associados a presença/densidade de formas sexuais, padrões espaciais e temporais dos gametócitos, bem como a infecciosidade para os mosquitos permanecem controversas ou desconhecidas. Esta lacuna é maior para P. vivax e para o contexto não-africano da malária. Uma reavaliação do conceito de reservatório infeccioso por meio de conjuntos coordenados de estudos de base populacional é necessária para otimizar os estudos já existentes ou desenvolver novas ferramentas de controle antigametocitocidas para, eventualmente, atingir a eliminação da malária na América e na Região da Ásia-Pacífico. Apesar da grande quantidade de estudos sobre a gravidade clínica da malária, as infecções assintomáticas ainda são pouco compreendidas. A malária assintomática continua sendo um desafio para os programas de controle da doença, uma vez que influencia significativamente a dinâmica de transmissão. É necessária

29 13 uma melhor compreensão da sua epidemiologia e de seus fatores de risco em áreas endêmicas. Sabe-se que a infecção malárica não tratada pode resultar em carreamento de parasitos assexuados por um longo período, acompanhado também pela contínua produção de gametócitos. Em termos gerais, a prevalência de gametócitos em indivíduos assintomáticos segue de perto as parasitemias assexuadas, tanto por MO quanto pelas técnicas moleculares. A prevalência de gametócitos em populações da região Amazônica e os fatores associados à gametocitemia não são conhecidos e não existem estudos locais que relacionem a malária assintomática com o carreamento das formas sexuais do Plasmodium. Na área periurbana da cidade de Manaus, Amazonas, que apresenta algumas localidades endêmicas para malária, seria possível estimar a prevalência das formas sexuais e assexuais do parasita, bem como a existência de fatores associados à gametocitemia na população residente nestas áreas. A investigação sobre as lacunas de conhecimento em relação aos gametócitos, sua prevalência e fatores associados ao carreamento dessas formas pode constituir um instrumento para aumentar a capacidade de controle da malária e contribuir para a eliminação da doença.

30 14 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Estimar a prevalência e os fatores associados ao carreamento de formas sexuais de P. vivax em uma área endêmica na Amazônia Brasileira. 2.2 Objetivos Específicos Estimar a prevalência de infecção malárica por P. vivax e P. falciparum, em área periurbana de Manaus, AM; Estimar a prevalência do carreamento de formas sexuais de P. vivax e P. falciparum, global e em indivíduos assintomáticos em área periurbana de Manaus, AM; Verificar os fatores associados ao carreamento das formas sexuais de P. vivax, no total de indivíduos da área e nos indivíduos assintomáticos; Verificar o desempenho da técnica de Reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR) para detecção de formas sexuais de P. vivax, usando a técnica de MO como referência.

31 15 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Tipo de Estudo Trata-se de um estudo transversal, para determinar a prevalência de infecção por Plasmodium sp. e do carreamento de gametócitos por indivíduos residentes em área endêmica da doença. 3.2 Locais e população do estudo O Município de Manaus tem uma população estimada em habitantes, a maioria delas vivendo na zona urbana/periurbana. Neste município, o intenso processo migratório, aliado à precária vigilância epidemiológica e entomológica, resulta na transmissão ativa de malária nas áreas rurais e periurbanas. O IPA no município oscila de baixo a médio risco nas áreas rurais, e entre as zonas periurbanas, varia de sem risco a alto risco. O estudo foi realizado nas comunidades periurbanas do Brasileirinho, Ipiranga e em alguns ramais do Puraquequara, situadas na zona leste da cidade de Manaus, sendo estas áreas endêmicas para malária. No município de Manaus, são as áreas onde existe maior receptividade e vulnerabilidade de transmissão de malária, apesar da diminuição do IPA observada nos últimos anos, demonstrada na Figura 4. Figura 4. Gráfico do Índice Parasitário Anual nas localidades do estudo (77).

32 16 As localidades contam com um posto de microscopia em cada uma delas, onde é realizado o diagnóstico de malária, em período integral. As atividades de subsistência da população estão concentradas no setor agropecuário e no extrativismo. Muitas pessoas, no entanto, trabalham na cidade de Manaus e para isso vão e voltam diariamente para a sede do município. Destaca-se que nesta localidade existem diversas chácaras utilizadas para lazer e retiro religioso, para onde se desloca uma grande quantidade de pessoas de Manaus, especialmente nos finais de semana e feriados. A ocorrência de malária nessa população é comum. As comunidades não são servidas de coleta de lixo e esgoto sanitário e a água consumida é proveniente de poços ou riachos (igarapés). Em conjunto, estas áreas têm uma população estimada em cerca de habitantes, conforme censo realizado pela equipe do projeto no mês outubro de No censo foram coletadas as seguintes informações: nome do participante, data de nascimento, idade, número da residência e localização das casas dos participantes. A localização das residências foi mapeada por aparelho GPSmap765, Garmin. Figura 5. Localidades de execução do estudo em Manaus, AM. Fonte:

33 Procedimentos do estudo transversal Definições Infecção Malárica: indivíduo com resultado de gota espessa positiva ou de qpcr positivo para Plasmodium sp. Indivíduo Sintomático: aquele com resultado positivo para infecção malárica na MO ou na qpcr, com Temperatura Corporal > 37,5 C no momento da visita ou em 48hs antes. Indivíduo assintomático: aquele com resultado positivo para infecção malárica na MO ou na qpcr, porém sem febre (Temperatura Corporal < 37,5 C) durante a visita transversal ou em 48hs antes da visita Visita domiciliar e coleta de amostras Foi realizado um corte transversal, por meio de visita domiciliar, com todos os indivíduos que residem permanentemente nestas localidades e que aceitaram participar do estudo (Vide ANEXO I). O corte realizou-se em período de baixa transmissão de malária, durante a estação chuvosa. A inclusão de participantes abrangeu os diferentes ramais das comunidades, alguns mais populosos que outros, com padrão de desflorestamento diferente, com ou sem coleções de água. Três equipes foram responsáveis pela coleta/pipetagem de amostras e aplicação de questionário específico para os residentes da área. Dos participantes foi coletada uma amostra de 300µL de sangue total, por punção digital utilizando-se lanceta de alto fluxo e microtubo contendo anticoagulante (EDTA/Fluoreto de Sódio). Este volume de sangue foi distribuído em outros dois microtubos: a) o primeiro contendo 200µL de sangue total, foi utilizado para extração de DNA e determinação da infecção malárica por qpcr; e b) o segundo tubo, contendo 50µL do mesmo material, adicionado de RNAprotect, Qiagen (substância estabilizadora que permite a conservação de RNA a longo prazo), imediatamente após a coleta (detalhes no Anexo II). Este último foi utilizado

34 18 para extração de RNA e detecção e quantificação dos gametócitos por RT-qPCR. Na mesma ocasião da coleta, foi confeccionada uma gota espessa visando o diagnóstico microscópico da infecção malárica e a quantificação da parasitemia assexual e da gametocitemia. Figura 6. Fluxograma demostrando as etapas do estudo. Na visita domiciliar foi aplicado um questionário constituído de perguntas sobre identificação do participante, variáveis demográficas e socioeconômicas, presença de sinais e sintomas no momento da entrevista, utilização de medidas preventivas para malária e histórico da doença (Vide Anexo III Questionário de Corte Transversal). No momento da entrevista foi aferida a temperatura corporal, empregando-se o termômetro infravermelho Color check AC320, Incoterm.

35 19 Caso o participante apresentasse algum sintoma de malária no momento da visita do corte transversal, foi confeccionada uma lâmina de gota espessa extra, que foi examinada no Posto de Saúde local e, se confirmado o diagnóstico, o participante foi tratado de acordo com o protocolo do Ministério da Saúde (11) Diagnóstico de infecção malárica Para diagnóstico da infecção por Plasmodium sp. foram confeccionadas lâminas de gota espessa no momento da visita transversal, para realização da técnica de MO (Vide Anexo IV). Os parasitas foram contados em 200 leucócitos. Foram feitas duas leituras das lâminas, por dois microscopistas experientes. No caso de discrepância maior que 25% entre as duas leituras, uma terceira leitura foi realizada e a densidade parasitária foi determinada pela média dos resultados das leituras que apresentavam concordância. A conversão para parasitos/mm 3, foi realizada por cálculo simples, utilizando como valor de referência 6000 leucócitos/mm 3. Para o diagnóstico de infecção malárica por qpcr, foi padronizado um protocolo de extração de DNA utilizando kit FavorPrep 96-well Genomic DNA, Favorgen (conforme Anexo V). Em seguida, foi realizado um ensaio genérico para detecção de Plasmodium sp. (ensaio Qmal); caso o resultado deste ensaio fosse positivo, a amostra seguiria para o ensaio espécie-específico, para detecção da infecção por P. vivax e/ou P. falciparum, como mostrado na figura 5 (ver também ANEXO VI). Para o ensaio Qmal e dos ensaios espécie-específicos, foi padronizada uma reação de PCR em Tempo Real baseada no gene 18S rrna. Plasmídeos padrão serviram como controle positivo e como padrão para quantificação de DNA das amostras. Os valores de Ct (cycle threshold) dos plasmídeos padrão foram usados para construir uma curva padrão com que puderam ser determinados os números de cópias dos genes para cada amostra. Para validar a sensibilidade de detecção dos genes 18S rrna (gênero específicos e espécie-específicos) com plasmídeo padrão, um qpcr é realizado

36 20 para cada par de iniciadores. As diluições dos plasmídeos são: 10-2, 10-1, 0,5x10-1, 100, 0,5x10 1, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 e 10 7 cópias/µl são usadas como template. As diluições copias/µl são testadas em triplicatas, e diluições de copias/µl são testadas em quintuplicatas. A última diluição com três reações positivas foi considerado como limite de detecção (detalhes no ANEXO VI). As análises foram realizadas pelo software distribuído pelo fabricante Applied Biosystems 7500 Fast System SDS Software Determinação do carreamento de formas sexuais Foi feita quantificação de gametócitos de P. vivax e P. falciparum através das técnicas de MO e RT-qPCR, tanto de indivíduos sintomáticos como assintomáticos com infecção malárica. As lâminas de gota espessa foram revisadas para quantificação dos gametócitos em 200 leucócitos (Vide Anexo IV). A conversão para gametócitos/mm 3, foi realizada por cálculo simples, utilizando como valor de referência 6000 leucócitos/mm 3. Todas as amostras positivas no ensaio Qmal foram selecionadas para extração de RNA e posterior detecção de gametócitos por RT-qPCR (Figura 7), mas somente as amostras positivas nos ensaios espécie-específicos para P. vivax e P. falciparum foram consideradas para as análises. Para extração de RNA das amostras de sangue total dos participantes, foi utilizado o kit RNeasy Plus 96, Qiagen, seguindo protocolo especificado pelo fabricante (vide ANEXO VII). A RT-qPCR teve como alvo os genes pvs25 e pfs25, gametócito-especficos para P. vivax e P. falciparum, respectivamente. Para técnica de RT-qPCR foi utilizado o kit Taqman RNA-to-CT 1-Step, Applied Biosystems e o equipamento 7500 Fast Real Time PCR, Applied Biosystems, seguindo protocolo especificado pelo fabricante (ver ANEXO VIII). As amostras de RNA foram ainda submetidas a qpcr Qmal para verificar contaminação com DNA (Figura 7).

37 21 Figura 7. Fluxograma da Análise Molecular das amostras do estudo. N=negativo, P=positivo Para a detecção dos gametócitos de P. falciparum e P. vivax, foi padronizada uma reação de PCR em tempo real amplificando o transcrito dos genes pfs25 ou pvs25. Os dois passos necessários para a RT-qPCR são realizados em paralelo em 1 tubo/poço de placa, sendo o primeiro passo a síntese de cdna e o segundo, a amplificação em tempo real. Plasmídeos serviram como controle positivo e como padrão para quantificação de DNA das amostras. Os valores de Ct dos plasmídeos padrão foram usados para construir uma curva padrão com que puderam ser determinados os números de cópias de transcritos para cada amostra. Para validar a sensibilidade de detecção de pfs25 e pvs25 com plasmídeo padrão, um RT-qPCR é realizado para cada par de iniciadores. As diluições dos plasmídeos são: 10-2, 10-1, 0,5x10-1, 100, 0,5x10 1, 10 1, 10 2, 10 3,10 4, 10 5, 10 6 e 10 7 cópias/µl são usadas como template. As diluições copias/µl são testadas

38 22 em triplicatas, e diluições de copias/µl são testadas em quintuplicatas. A última diluição com três reações positivas é considerada como limite de detecção (detalhes no ANEXO VIII). As análises foram realizadas pelo software distribuído pelo fabricante Applied Biosystems 7500 Fast System SDS Software. 3.5 Aspectos éticos Este estudo faz parte do projeto multicêntrico denominado Epidemiologia comparativa da transmissão de P. falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, cujo centro no Brasil é a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus-AM. A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da FMT-HVD (parecer número 51536/2012) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP) pelo parecer número /2013. Todos os participantes que aceitaram participar do estudo, após a explicação da sua importância e dos seus objetivos, assinaram uma cópia do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (vide ANEXO IX) e do Termo de Assentimento, para indivíduos de 12 a 17 anos (vide ANEXO V). Para crianças menores, o termo foi assinado pelo seu representante legal. 3.6 Análise dos dados Foram obtidas as prevalências da infecão malárica e da gametocitemia globais e por diferentes localidades, sexo, faixas etárias, exposição prévia à malária, uso recente de antimalárico, febre, número de cópias do gene alvo 18S rrna. A verificação da associação entre estas variáveis com a presença de gametócitos foi realizada pelos testes do Qui-quadrado ou Fisher, por meio de uma análise univariada. Todas as variáveis com p<0,10 foram incluídas num modelo de regressão logística. O odds ratio (OR) e intervalo de confiança de 95% foram usados para estimar o risco. Um teste de Hosmer Lemeshow foi realizado para validar os modelos utilizados.

39 23 Um teste de Pearson foi realizado para verificar se existe correlação entre a parasitemia assexual e a gametocitemia. A técnica molecular foi comparada com a MO quanto acurácia para a detecção de gametócitos. Todos os testes foram realizados com um nível de significância de 5%. Os testes foram realizados com auxílio do programa SPSS 21.0.

40 24 4. RESULTADOS 4.1 Participantes Nos meses de novembro e dezembro do ano de 2012, 2127 residentes (cerca de 95% da população estimada no Censo) das comunidades do Brasilerinho, Ipiranga e Puraquequara, participaram do corte transversal. A Figura 8 demonstra a distribuição dos participantes visitados durante o estudo transversal (Figura 8). Figura 8. Mapa da localização dos participantes do corte transversal. Fonte: TransEpi, Dos 2127 incluídos, 115 foram excluídos devido a falta de informação ou de amostra (questionários sem código do participante ou com dados incompletos e amostras no coletadas para análise de DNA ou RNA). Para as análises foram considerados então, 2012 participantes. A maioria dos indivíduos é do sexo masculino, com idade maior que 16 anos, residente na comunidade do Brasileirinho, tendo como principais ocupações: ser estudante; funcionário de empresa privada ou estabelecimento comercial; dona de casa; agricultor. Quanto ao uso de medidas

41 25 preventivas para malária, 76,84% afirma usar pelo menos uma medida. 70,33% dos indivíduos afirmaram já ter tido episódio de malária; 5,37% dos participantes apresentavam febre no momento da visita ou 48hs antes (Tabela 1). Tabela 1. Características dos participantes. n % Total Sexo Homem ,49 Mulher ,51 Faixa etária < , ,19 Ocupação Agricultura ,40 Outra ,60 Episódios prévios de malária , , ,32 > ,81 Uso de antimalárico nos últimos 2 meses 196 9,74 Medidas preventivas Uso de mosquiteiro ,10 Borrifação intradomiciliar ,76 Uso de janelas teladas ,79 Uso de pelo menos uma das três 76,84 medidas 1546 Não usa nenhuma medida ,16 Comunidade Ipiranga ,85 Brasileirinho ,77 Puraquequara ,38 Sintomas Febre (temperatura>37.5 C ou nas últimas 48hs) 108 5,37

42 Prevalência de infecção malárica e de gametocitemia As prevalências de infecção malárica e de gametocitemia nos participantes do estudo foram determinadas por MO, qpcr e RT-qPCR (Tabela 2). A prevalência de infecção por Plasmodium sp., determinada pelos ensaios espécie-específicos foi 2x maior por qpcr (4,87%) quando comparada a microscopia (2,34%). O P. vivax foi a espécie mais prevalente (36/47 positivos) por MO e (87/98 positivos) por qpcr. A prevalência de infecção por P. falciparum foi a mesma por MO e por qpcr (0,55%). A prevalência de gametocitemia de P. vivax também foi 2x maior pela RTqPCR (2,14%) do que pela MO (1,04%). Cerca de metade dos indivíduos com infecção por P. vivax e quase o total de indivíduos com infecção por P. falciparum carreavam gametócitos, tanto pela microscopia quanto pela técnica molecular. Tabela 2. Prevalência de infecção malárica e de gametocitemia. Microscopia qpcr RT-qPCR 18S rdna P25 mrna Parasitemia n % n % cópias/ul n % cópias/ul Méd. Méd. Geom. Méd. Geom Geom Plasmodium sp. 47 2, ,87 P. vivax total 36 1,79 202, ,32 42, P. vivax gam 21 1,04 56, ,14 19,39 P. falciparum total 11 0,55 250, ,55 5, P. falciparum gam 9 0,45 121, ,50 204,80 PF+PV gam ,20 - N = 2012 Foram identificados ainda quatro indivíduos com RT-qPCR positiva para as duas espécies estudadas. Este dado não foi explorado por que estas amostras foram negativas nos ensaios espécie-especficos, e por causa da baixa frequência desta co-infecção. Devido ao pequeno número de indivíduos carreando P. falciparum, as análises de risco para infecção malárica e gametocitemia foram realizadas apenas para P. vivax, que teve prevalência maior e permitiu resultados com significância estatística (valor p < 0,05).

43 27 As variáveis ocupação, comunidade e medidas preventivas para malária não foram consideradas na análise de risco. A ocupação foi desconsiderada pois sofre influência direta da variável exposição. As três comunidades participantes do estudo são adjacentes, possuem características similares e mostraram semelhante prevalência de infecção (Brasileirinho, 4,98%; Ipiranga, 2,05%; Puraquequara, 4,87%). As medidas preventivas, quando associadas com infecção malárica /carreamento de gametócitos em modelo univariado, apresentaram valor p>0, Fatores associados a infecção por P. vivax Foi realizada uma análise de risco (odds ratio por análise univariada e multivariada) para determinar os fatores associados ao carreamento de P. vivax, no total de participantes e em indivíduos assintomáticos (não febris), utilizando as prevalências obtidas pela técnica de qpcr, por sua maior sensibilidade de detecção do parasita. Os principais fatores de risco para infecção foram: presença de febre, histórico de malária e uso de antimalárico nos últimos dois meses; a faixa etária mostrou associação com a infecção apenas no modelo univariado (Tabelas 3 e 4). Tabela 3. Fatores de risco para o carreamento de P. vivax Prevalência Modelo Univariado Modelos Multivariados % (n/n) OR (IC95%) p OR (IC95%) p Infecção 4,32 (87/2012) Febril 12,04 (13/108) 3,38 (1,81-6,32) <0,001 3,18 (1,70-5,98) <0,001 Não febril 3,89 (74/1904) 1,00 1,00 Sexo Homem 5,02 (53/1056) 1,00 1,00 Mulher 3,56 (34/956) 0,70 (0,45-1,08) 0,11 1,35(0,87-2,10) 0,19 Faixa etária (anos) <15 0,12 (7/801) 0,46 (0,27-0,77) 0,003 0,63(0,37-1,07) 0, ,37 (65/1211) 1,00 1,00 Histórico de Malária Não 1,01 (6/597) 1,00 1,00 Sim 2,40 (34/1415) 5,05 (2,32-11,00) <0,001 4,03(1,82-8,89) 0,001 Uso de antimalárico nos últimos 2 meses 9,74 (196/2012) 3,88 (2,37-6,37) <0,001 2,71 (1,63-4,51) <0,001 *Febril: temperatura > 37,5 C na visita ou nas últimas 48hs. p valor: obtido pelo teste qui quadrado ou Fisher.

44 28 A prevalência de infecção assintomática foi de 3,67% (74/2012), correspondendo a 85,06% (74/87) do total de carreadores de P. vivax. A prevalência de infecção dentre indivíduos não febris foi de 3,89%, sendo que em adultos jovens e adultos, a infecção foi mais prevalente, porém, sem significância estatística. Indivíduos que relataram já ter tido episódios prévios de malária e os que fizeram uso recente de antimalárico tiveram maior risco de ter infecção assintomática (Tabela 4). Tabela 4. Fatores de risco para o carreamento de P. vivax em indivíduos assintomáticos. Prevalência Modelo Univariado Modelos Multivariados % (n/n) OR (IC95%) p OR (IC95%) p Infecção 3,89 (74/1904) Sexo Homem 4,72 (47/996) 1,61 (0,10-2,62) 0,05 1,51 (0,93-2,44) 0,10 Mulher 2,97 (27/908) 1,00 1,00 Faixa etária (anos) <15 2,39 (17/710) 0,50 (0,29-0,86) 0,01 0,71 (0,40-1,25) 0, ,77 (57/1194) 1,00 1,00 Histórico de Malária Não 0,87 (5/572) 1,00 1,00 Sim 5,18 (69/1332) 5,08 (2,19-11,76 <0,0001 4,17 (1,82-10,20) 0,001 Uso de antimalárico nos últimos 2 meses 9,71 (17/175) 3,15 (1,80-5,56) <0,0001 2,32 (1,31-4,12) 0,004 p valor: obtido pelo teste qui quadrado ou Fisher. 4.4 Fatores associados ao carreamento de gametócitos de P. vivax Foi realizada uma análise de risco (odds ratio por análise univariada e multivariada) para determinar os fatores associados ao carreamento de gametócitos de P. vivax, no total de participantes e em indivíduos assintomáticos (não febris), utilizando as prevalências obtidas pela técnica de RT-qPCR, por sua maior sensibilidade de detecção do parasita. Os principais fatores de risco para presença

45 29 de gametócitos foram: presença de febre, histórico de malária, uso de antimalárico nos últimos dois meses e apresentar mais que 40 cópias de P. vivax/µl na qpcr, isto é, mais formas sanguíneas do parasita. A faixa etária maior que 15 anos apresentou maior prevalência no carreamento de gametócitos, porém isto foi significativo apenas na análise univariada (Tabela 5). Tabela 5. Fatores de risco para o carreamento de gametócitos de P. vivax Prevalência Modelo Univariado Modelos Multivariados % (n/n) OR (IC95%) p OR (IC95%) p Gametocitemia 2,14 (43/2012) Febril* 9,26 (10/108) 5,79 (2,77-12,08) <0,001 4,59 (2,14-9,84) <0,001 Não febril 1,73 (33/1904) 1,00 1,00 Sexo Homem 2,46 (26/1056) 1,00 1,00 Mulher 1,78 (17/956) 0,72 (0,39-1,33) 0,29 0,77 (0,42-1,43) 0,41 Faixa etária (anos) <15 1,25 (10/801) 1,00 1, ,73 (33/1211) 2,00 (0,98-4,10) 0,05 1,33 (0,64-2,78) 0,44 Histórico de Malária Não 0,34 (2/597) 1,00 1,00 Sim 2,90 (41/1415) 8,88 (2,14-36,82) <0,001 6,25 (1,45-26,32) 0,01 Uso de antimalárico nos últimos 2 meses 8,16 (16/196) 5,89 (3,12-11,38) <0,001 3,79 (1,96-7,32) <0,001 Pv cópias/ul ** 40 36,17 (17/47) 1,00 1,00 >40 65,00 (26/40) 3,22 (1,35-7,69) 0,007 3,22 (1,30-7,69) 0,01 *Febril: temperatura > 37,5 C na visita ou nas últimas 48hs. **N=87, qpcr PV positives p valor: obtido pelo teste qui quadrado ou Fisher. A prevalência dos indivíduos assintomáticos que carreavam gametócitos de P. vivax foi de 1,73% (33/1904), 76,74% (33/43) dos indivíduos infectados por P. vivax. Os fatores de risco para carreamento dos gametócitos em assintomáticos são: ter histórico de malária, uso de recente de antimalárico e apresentar mais que 40 cópias de P. vivax/µl na qpcr, isto é, mais formas sanguíneas do parasita. A faixa

46 30 etária maior que 15 anos e o sexo masculino apresentaram maior prevalência no carreamento de gametócitos, porém sem siginificancia estatística (Tabela 6). Tabela 6. Fatores de risco para o carreamento de gametócitos de P. vivax em indivíduos assintomáticos Prevalência Modelo Univariado Modelos Multivariados % (n/n) OR (IC95%) p OR (IC95%) p Gametocitemia 1,73 (33/1904) Sexo Homem 2,10 (21/996) 1,00 1,00 Mulher 1,32 (12/908) 0,62 (0,30-3,13) 0,19 0,66 (0,32-1,36) 0,26 Faixa etária (anos) <15 1,12 (9/801) 0,62 (0,30-1,35) 0,23 0,94 (0,43-2,04) 0, ,98 (24/1211) 1,00 1,00 Histórico de Malária Não 0,34 (2/597) 1,00 1,00 Sim 2,19 (31/1415) 6,79 (1,62-28,47) 0,002 6,67 (1,49-25,00) 0,012 Uso de antimalárico nos últimos 2 meses 5,71 (10/175) 4,50 (2,10-9,61) <0,001 3,26 (1,51-7,05) 0,003 Pv cópias/ul * 40 32,56 (14/43) 1,00 1,00 >40 61,29 (19/31) 3,23 (1,25-8,33) 0,014 3,23 (1,20-8,33) 0,02 *N=74, qpcr PV positives p valor: obtido pelo teste qui quadrado ou Fisher. 4.5 Parasitemia assexual vs Parasitemia sexual. Foi realizado um teste de Pearson para verificar a existencia de correlação entre a parasitemia assexual de P. vivax e gametocitemia, na MO e na RT-qPCR; o resultado foi uma correlação positiva entre as duas variáveis, ou seja, quanto mais parasitas assexuais (microscopia, p<0,001) ou quanto mais formas sanguíneas do parasita (qpcr, p=0,001), mais gametócitos estão presentes (Figuras 9 e 10). Nas figuras citadas, os resultados moleculares são expressos em número de cópias dos genes alvo.

47 31 Figura 9. Gráfico de correlação entre número de cópias de 18S rrna (qpcr) vs número de cópias de pvs25 (RT-qPCR). Figura 10. Gráfico de correlação entre parasitemia assexual e gametocitemia (MO).

48 Densidade parasitária de P. vivax vs faixa etária Foi feita uma comparação entre diferentes faixas etárias e a densidade de parasitas/número de cópias de 18S rrna e gametocitemia/transcritos de pvs25, a fim de avaliar se a parasitemia assexual e sexual aumenta ou diminui de acordo com a idade. Como resultado, observou-se que quanto maior a faixa etária menor a densidade parasitária e menor é a diferença entre a parasitemia assexual e sexual, isto é, a proporção de parasitas sexuais em relação ao total de parasitas é maior com o aumento da idade, tanto na MO quanto na técnica molecular (figuras 11 e 12). Figura 11. Gráfico da densidade de P. vivax (MO) nos diferentes grupos de idade Figura 12. Gráfico da densidade de P. vivax (qpcr, RT-qPCR) nos diferentes grupos de idade.

49 Padronização das Técnicas Moleculares Foram padronizados os ensaios Qmal, para detecção de Plasmodium sp. por PCR em tempo real (qpcr), tendo como alvo o gene 18S rrna. Os valores de Ct dos plasmídeos padrão foram usados para construir uma curva padrão com que pode ser determinado o números de cópia do gene para cada amostra (Figura 13). O limite de detecção do ensaio Qmal é de 1 cópia/µl. Eficiência (%) R Slope Y-intersect Figura 13. Gráfico da curva padrão do ensaio Qmal e eficiência do ensaio Qmal, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Foram padronizados também os ensaios espécie-específicos para detecção de P. vivax e de P. faciparum por PCR em tempo real (qpcr), tendo como alvo o gene 18S rrna (porções específicas para cada espécie). Os valores de Ct de plasmídeos padrão foram usados para construir uma curva padrão com que pôde ser determinado o número de cópias do gene para cada amostra (Figura 14 e 15). O limite de detecção do ensaio para P. vivax foi de 1 cópia/µl e o de P. falciparum, 3 cópias/µl.

50 34 Eficiência (%) R Slope Y-intersect Figura 14. Gráfico da curva padrão do ensaio espécie-específico para P. vivax e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Eficiência (%) R 2 1 Slope Y-intersect Figura 15. Gráfico da curva padrão do ensaio espécie-específico para P. falciparum e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Foram padronizados os ensaios gametócito-especficos para detecção de P. vivax e de P. faciparum por PCR quantitativa com transcrição reversa (RT-qPCR),

51 35 tendo como alvo os genes pvs25 e pfs25, respectivamente. Os valores de Ct de plasmídeos padrão foram usados para construir uma curva padrão com que pôde ser determinado o números de transcritos dos genes para cada amostra (Figura 16 e 17). O limite de detecção do ensaios gametócito-específico para P. vivax foi de 0,5 cópias/µl e para P. falciparum, 1 cópia/µl. Eficiência (%) R Slope Y-intersect Figura 16. Gráfico da curva padrão do ensaio gametócito-específico para P. vivax e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão. Eficiência (%) R Slope Y-intersect Figura 17. Gráfico da curva padrão do ensaio gametócito-específico para P. falciparum e eficiência do ensaio, considerando as diluições cópias/µl de plasmídeo padrão

52 36 4. Análise de acurácia dos ensaios moleculares As técnicas moleculares mostraram resultado satisfatório para detecção de P. vivax e P. falciparum e para detecção dos gametócitos das duas espécies. A sensibilidade e especifidade do ensaio específico para P. vivax foram maiores que 80%; o ensaio específico para detecção de P. falciparum demonstrou baixa sensibilidade, mas boa especificidade. Ambos os ensaios espécie-especficos mostraram baixos valores preditivos positivos (Tabela 7). Os ensaios para gametócitos de P. vivax e P. falciparum, tiveram boa sensibilidade e especificidade, mas também baixo valor preditivo positivo (Tabela 8). Tabela 7. Performance diagnóstica da qpcr para o gene 18S rrna, tendo como referência a MO. P. vivax P. falciparum n/n 95% IC n/n 95% IC Sensibilidade 88,89% 32/36 (74,68-95,59) 63,64% 7/11 (35,38-84,83) Especificidade 97,22% 1921/1976 (96,39-97,86) 99,80% 1997/2001 (99, ) Valor preditivo Positivo 36,78% 32/87 (27,41-47,27) 63,64% 7/11 (35,38-84,83) Valor preditivo Negativo 99,79% 1921/1925 (99,47-99,92) 99,80% 1997/2001 (99,49-99,92) Tabela 8. Performance diagnóstica da RT-qPCR para os genes pvs25 and pfs25, tendo como referência a MO. P. vivax P. falciparum n/n 95% IC n/n 95% IC Sensibilidade 85,71% 18/21 (65,36-95,02) 100% 9/9 (70,08-100) Especificidade 98,44% 1960/1991 (97,8-98,9) 97,60% 1955/2033 (96,84-98,19) Valor preditivo Positivo 36,73% 18/49 (24,66-50,73) 15,79% 9/57 (8,536-27,36) Valor preditivo Negativo 99,85% 1960/1963 (99,55-99,95) 100% 1955/1955 (99,8-100) O resultado da qpcr teve correlação positiva com o da MO e o da RT-qPCR também correlacionou-se com a microscopia. As figuras 18 e 19 demonstram a

53 37 correlação entre parasitemia de P. vivax (parasitas/µl) e número de cópias do gene alvo 18S rrna (n de cópias/µl), e entre gametocitema e número de transcritos de pvs25 (n de cópias/µl). Neste teste foram considerados apenas os resultados concordantes nas duas técnicas (positivos ou negativos). Figura 18. Gráfico de correlação entre parasitemia (MO) e número de cópias de 18S rrna (qpcr). Figura 19. Gráfico de correlação entre gametocitemia (MO) e número de cópias de pvs25 (RT-qPCR).

54 38 5. DISCUSSÃO Este estudo buscou estimar a prevalência de infecção por Plasmodium sp. e do carreamento de formas sexuais de P. vivax, em área endêmica durante período de baixa transmissão. Para isto, foram escolhidas três localidades adjacentes, situadas em área perirubana de Manaus-AM, a fim de identificar os portadores de Plasmodium sp. e gametócitos, bem como a identificação de fatores associados à infecção malárica e ao carreamento de gametócitos, utilizando a técnica de MO (padrão ouro para diagnóstico de malária) e técnicas moleculares para detecção do parasita (qpcr) e de gametócitos (RT-qPCR). A identificação dos carreadores de Plasmodium sp. em populações de áreas endêmicas é de grande importância para ações de controle da malária, incluindo o tratamento de indivíduos assintomáticos (com baixas parasitemias), que contribuem para transmissão da doença. A prevalência de infecção por Plasmodium sp. foi de 2,34% pela MO e 4,87% pela qpcr, sendo o P. vivax a espécie mais prevalente (4,32%). Estes valores de prevalência são inferiores aos encontrados em outros estudos transversais realizados na Amazônia Brasileira, como, por exemplo, os realizados em comunidades ribeirinhas e áreas periurbanas da cidade de Porto Velho (próximas ao Rio Madeira, no estado de Rondônia) e Barcelos (em áreas do Rio Negro, no estado do Amazonas) (37, 38, 78) e em assentamento rural na Amazônia Brasileira (79) que demonstraram prevalência de infecção entre 5 e 20%, utlizando PCR para o diagnóstico. Este baixo valor de prevalência, comparado a outros estudos, ocorreu provavelmente devido ao período de realização deste corte transversal, considerado de baixa transmissão de malária, observando-se que, mesmo em áreas ou períodos de baixa endemicidade, a população pode ser capaz de manter a infecção e sua transmissibilidade, ainda que os níveis de parasitemia apresentados sejam baixos. A infecção malárica foi mais prevalente em indivíduos de grupos de idade mais velha, do sexo masculino, e em indivíduos com histórico prévio de malária. No contexto da região estudada, estas características correspondem aos agricultores, piscicultores, donos de estabelecimentos comerciais e funcionários de fábricas que

55 39 funcionam nas comunidade, ou seja, indivíduos que tem maior nível de exposição ao vetor nos horários mais propícios de adquirir a infecção. A prevalência do carreamento de gametócitos de P. vivax foi de 2,14% pela RT-qPCR, o que correspondeu a aproximadamente 50% do total de carreadores deste parasita (43/87). Esta proporção é inferior a encontrada em estudos recentes realizados em assentamento rural no Amazonas (42/44, 94,4% e 25/27, 92,6%) (79). Nos estudos realizados em Papua Nova Guiné, área de alta transmissão de malária, a proporção de carreadores foi 38% (46/121) e 48.9% (132/270) (80, 81). Em área de ocorrência sazonal de malária (média transmissão) na Tailândia, a proporção encontrada foi de 84.3% (415/492) (82). A técnica de RT-qPCR demonstrou maior sensibilidade que a MO, detectando gametocitemia submicroscópia nos indivíduos e identificando assim os reservatórios do parasita na população. A prevalência de infecção assintomática por P. vivax (indivíduos não febris) foi de 3,67% (74/2012), correspondendo a 85,06% (74/87) do total de carreadores de P. vivax. Outros estudos realizados em áreas endêmicas na região amazônica, também demonstraram uma alta porcentagem de indivíduos assintomáticos, cerca de 20% em relação ao total de carreadores, geralmente detectáveis apenas pela qpcr (17, 37, 83-85). Essa alta porcentagem de infecção assintomática é concordante com os baixos valores de densidade parasitária encontrados em nosso estudo, para P. vivax a média foi de 202,06 parasitas/µl e para gametocitemia de vivax foi de 250,84 parasitas/µl. Identificar os portadores assintomáticos de Plasmodium sp. é importante porque, apesar das baixas densidades parasitárias apresentadas, estes indivíduos possuem gametócitos maduros circulantes, que podem infectar o vetor e manter o ciclo de transmissão (56, 58, 70, 76). Os principais fatores associados à infecção por P. vivax identificados neste estudo foram: presença de febre, histórico de malária e uso de antimalárico nos últimos dois meses. Na população estudada, estar febril é um excelente indicativo de infecção malárica, em meio a outras doenças febris de ocorrência nesta área (principalmente decorrentes de infecções virais), apesar da baixa prevalência de infecção, baixas parasitemias e da alta porcentagem de carreadores assintomáticos.

56 40 A ocorrência de episódios prévios de malária na maior parte da população estudada deve-se provavelmente a maior exposição destas pessoas a infecção, já que residem em área endêmica; uma justificativa para o maior risco de infecção (OR=4,03; IC95%= 1,82-8,89) nesses indivíduos seria a presença de uma parasitemia residual decorrente de recaídas ou re-infecções, que na maioria das vezes não evoluem para doença clínica devido a imunidade adquirida por essa população exposta ao parasita, como apontam estudos anteriores na região Amazônica (17, 37, 83-85). O maior risco de infecção em indivíduos que fizeram uso recente de medicação antimalárica (OR=2,71; IC95%= 1,63-4,51) demonstra a existência de uma parasitemia pós-tratamento, possivelmente causada por recaídas ou reinfecções, e que, se não diagnosticadas, independente da presença de sintomas, pode se manter durante muito tempo, tornando estes indivíduos reservatórios de infecção para os vetores. Considerando apenas os indivíduos assintomáticos (não febris), os fatores de risco encontrados foram os mesmos do total da população, ter histórico de malária (OR= 4,17; IC95%= 1,82-10,20) e ter feito uso recente de medicamento antimalárico (OR=2,32; IC95%= 1,31-4,12). Pelas razões já mencionadas anteriomente, esses indivíduos carream P. vivax em baixas densidades parasitárias, sem manifestações clínicas, contribuindo para manutenção da endemia na área periurbana estudada. As faixas etárias mais jovens apresentavam menor risco de infecção (OR=0,46; IC95%= 0,27-0,77) e de infecção assintomática (OR=0,50; IC95%= 0,29-0,86), concordando com outros estudos realizados nos estados do Acre e Rondônia (83, 85). Este achado não condiz com estudos realizados no sudeste asiático e na África, onde a ocorrência de infecção é maior entre crianças (29-31). Outro estudo recente realizado em assentamento rural no estado do Amazonas, demonstrou que a faixa etária mais jovem foi um fator protetor para infecção por P. vivax em análise univariada, mas não no modelo multivariado, apontando que a idade não é, por si só, um fator de risco para infecção malárica (79). A maior ocorrência de infecção em adultos se deve à ocupação e ao maior nível de exposição dos indivíduos ao vetor,

57 41 quando comparados a estudantes e crianças pequenas, que não se envolvem em atividades de agricultura/piscicultura. Os principais fatores de risco para presença de gametócitos de P. vivax são: presença de febre, histórico de malária, uso de antimalárico nos últimos dois meses e apresentar mais que 40 cópias de P. vivax/µl na qpcr, isto é, maior quantidade de formas sanguíneas do parasita. Histórico de malária (OR= 6,25; IC95%= 1,45-26,32) e o uso recente de antimalárico (OR= 3,26; IC95%= 1,51-7,05) estão associados à presença de gametócitos possivelmente porque estes indivíduos apresentam parasitemia submicroscópica crônica decorrente de recaídas/reinfecções e porque, apesar das baixas parasitemias, ocorre a formação constante de gametócitos viáveis, permitindo a transmissão do parasita. Uma maior quantidade de estágios sanguíneos de P. vivax está associado com carreamento de gametócitos (OR= 3,22; IC95%= 1,30-7,69), pois reflete a quantidade de formas assexuais do parasita (que correspondente a maioria dos estágios sanguíneos). Isto está em concordância com o resultado encontrado nos teste de correlação entre parasitemia assexual e sexual, que mostraram correlação positiva entre número de cópias de 18S rrna e número de cópias de pvs25. Estudos anteriores mostraram associação entre parasitemia assexual e gametocitemia (13, 62, 68). Nosso resultado demonstra que as pessoas febris tem 4 vezes mais chances de portar gametócitos de P. vivax, dentre todos os indivíduos febris nas comunidades (OR= 4,59; IC95%= 2,14-9,84). A presença de febre então mostrou ser bom indicador do carreamento de gametócitos nas localidades estudadas, em período de baixa transmissão, apesar das baixas densidades de gametócitos e da maior prevalência de gametocitemia em assintomáticos. Estudo realizado por Mackenzie e colaboradores, em infectados por P. vivax, demonstrou que pacientes com gametócitos tinham febre e parasitemia superiores aos pacientes sem gametocitemia (86). Foi observado que a faixa etária mais jovem está protegida contra o carreamento de gametócitos (OR= 2,00; IC95%= 0,98-4,10, análise univariada).

58 42 Este achado pode ser explicado pelo menor grau de exposição de estudantes e crianças pequenas aos horários de pico de transmissão. No contexto africano, faixas etárias mais jovens eram associadas a maior porcentagem e densidade de gametócitos (87). Posteriormente, estudos apontaram que em áreas de baixa transmissão, grupos etários aparentemente não estão associados a prevalência de gametócitos (57, 69). Um estudo realizado em Burkina Faso aponta que adultos assintomáticos para P. falciparum, por possuirem a infecção por um longo período, tem mais tempo para desenvolver gametócitos do que as crianças (que manifestam sintomas mais rapidamente, pois ainda não desenvolveram a imunidade clínica) e que logo recebem tratamento (88). Os fatores de risco para carreamento dos gametócitos em assintomáticos são: ter histórico de malária, uso de recente de antimalárico e apresentar mais que 40 cópias de P. vivax/µl na qpcr, isto é, mais formas sanguíneas do parasita. Assim como a presença de infecção de P. vivax, o histórico de malária (OR= 6,67; IC95%= 1,49-25,00) e o uso recente de antimalárico (OR= 3,26; IC95%= 1,51-7,05) estão associados a gametocitemia devido ao fato de os indivíduos apresentarem parasitemia residual subpatente, decorrente de recaídas/re-infecções. Apesar das baixas parasitemias, ocorre a formação constante de gametócitos viáveis, que mesmo em densidades menores, são capazes de infectar os mosquitos vetores (58, 70, 72, 76). Os indivíduos assintomáticos com maior quantidade de formas sanguíneas de P. vivax (maior número de cópias de 18S rrna), que correspondem, em sua maioria, às formas assexuais do parasita, também apresentaram maior risco de carrear gametócitos (OR=3,23; IC95%= 1,20-8,33). Estudos anteriores mostraram associação entre parasitemia assexual e gametocitemia na infecção por P. vivax (13, 62, 68). Estudo recente realizado na Tailândia e Indonésia, também aponta como fator de risco para gametocitemia uma maior parasitemia assexual (82). Foi encontrada uma correlação positiva entre parasitemia assexual e sexual, demonstrada pela MO (R 2 = 0,138), qpcr e RT-qPCR (R 2 = 0,550). Este resultado indica que, quanto maior a parasitemia assexual, maior a quantidade de

59 43 gametócitos, indicando que os carreadores de altas parasitemias seriam os mais propensos a transmitir a infecção. A partir de uma comparação feita entre diferentes faixas etárias e a densidade de parasitas/transcritos de 18S rrna e gametocitemia/transcritos de pvs25, observou-se que a proporção de parasitas sexuais em relação ao total de parasitas é maior com o aumento da idade. A parasitemia assexual diminuiu com a idade, corroborando com estudos realizado em Burkina Faso, em período de baixa e alta transmissão, que apontam que a relação entre idade e gametocitemia depende da densidade de parasitas assexuais e onde, observou-se que com o aumento da idade, aumentam as chances de se encontrar apenas parasitas sexuais (56, 88). Estudo prévio indica que a produção de gametócitos é favorecida quando o crescimento assexual está limitado, como por exemplo, em grupos de idade mais velha, que adquirem imunidade clínica e anti-parasita (89). Os ensaios moleculares padronizados para detecção de P. vivax e P. falciparum (espécie-específico e de gametócitos) mostraram boa sensibilidade e especificidade, com eficiência maior que 90%. Devido à baixa prevalência de infecção, o valor preditivo positivo dos ensaios foi baixo. Estes resultados são semelhantes aos de dois outros estudos realizados em Papua Nova Guiné, que utilizaram os mesmos ensaios e que também demonstraram bons parâmetros de acurácia, revelando uma prevalência de 38,4% de infecção por P. vivax nesta região, valor três vezes maior que o detectado pela MO (16,3%) e 12,8% de prevalência de infecção pela qpcr, contra 7,6% pela MO (80, 81). Apesar da diferença de sensibilidade entre as técnicas de MO e de biologia molecular, houve correlação positiva entre os valores de parasitemia vs número de cópias de 18S rrna (R 2 = 0,343), e de gametocitemia vs número de cópias de pvs25 (R 2 = 0,336), demonstrando concordância de ambas as técnicas na detecção e na quantidade de parasitas entre os indivíduos portadores de infecção. As técnicas padronizadas neste estudo constituem ferramentas importantes para o diagnóstico de infecção malárica em áreas endêmicas, especialmente o ensaio genérico Qmal, que servirá como técnica de screening para detecção do

60 44 parasita em um único experimento, diminuindo assim os custos que seriam atribuídos ao diagnóstico espécie-específico de toda uma população. Diante do exposto, ressalta-se a importância dos estudos de base populacional em áreas endêmicas para malária na região da Amazônia Brasileira, a fim de obter dados de prevalência e incidencia de infecção, verificar os fatores que influenciam no carreamento de P. vivax e P. falciparum e identificar indivíduos portadores das formas transmissíveis do parasita, os gametócitos. Nosso trabalho foi o primeiro a estimar a prevalência do carreamento de gametócitos na área periurbana de Manaus, utilizando uma técnica molecular, mais sensível que o método padrão ouro utilizado para diagnóstico da infecção malárica, identificando assim os reservatórios submicroscópicos e assintomáticos do parasita. É essencial a continuidade deste trabalho de forma longitudinal, a fim de determinar a incidência de infecção e, com mais precisão, entender a dinamica de transmissão da malária nestas localidades.

61 45 6. CONCLUSÃO A prevalência de infecção malárica por P. vivax foi de 4,32% e de P. falciparum, 0,55%, nas comunidades estudadadas, em período de baixa transmissão de malária. A prevalência de infecção assintomática correspondeu a 85,06% do total de carreadores de P. vivax, demonstrando que mesmo baixas parasitemias e a infecção submicroscópica são suficientes para manter a endemia na área. A prevalência do carreamento de formas sexuais de P. vivax e P. falciparum, foi de 2,14% e 0,50%, respectivamente. Mais da metade dos infectados por P. vivax carreavam gametócitos, sendo estes indivíduos potenciais transmissores do parasita para o vetor anofelino. Os fatores associados ao carreamento das formas sexuais de P. vivax, foram febre, histórico de malária, o uso recente de medicamento antimalárico e maior quantidade de estágios sanguíneos do parasita, no total de indivíduos da área e nos indivíduos assintomáticos. A presença de também foi um fator de risco para carreamento de gametócitos. O carreamento de P. vivax e de suas formas sexuais foi menos prevalente na faixa etária mais jovem. As técnicas moleculares qpcr e RT-qPCR mostraram bom resultados de acurácia, sendo duas vezes mais sensíveis que a MO para diagnóstico de infecção malárica e de gametocitemia. O ensaio genérico Qmal se mostrou bastante eficaz para detectar infecção por Plasmodium sp. e constitui importante ferramenta para detecção rápida da infecção. São necessários estudos longitudinais nas comunidades periurbanas de Manaus para determinar a incidência de infecção malárica e com mais precisão, os fatores de risco para o carreamento de formas sexuais de P. vivax.

62 46 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. WHO. World Malaria Report WHO. World Malaria Report WHO. World Malaria Report Silva LH. O desafio da malária: o caso brasileiro e o que se pode esperar dos progressos da era genômica. Ciência e Saúde Coletiva. 2002;7(1): Organization WH. Guidelines for the treatment of malaria. Geneva Saúde Md. Dados epidemiológicos de malária, por estado: Amazônia Legal, janeiro a dezembro de 2010 e In: SAÚDE SDVE, editor Martins-Campos KM, Pinheiro WD, Vitor-Silva S, Siqueira AM, Melo GC, Rodrigues IC, et al. Integrated vector management targeting Anopheles darlingi populations decreases malaria incidence in an unstable transmission area, in the rural Brazilian Amazon. Malar J. 2012;11:351. Epub 2012/10/ Saraiva M, Amorim RD, Moura MA, Martinez-Espinosa FE, Barbosa M. [Urban expansion and spatial distribution of malaria in the municipality of Manaus, State of Amazonas]. Rev Soc Bras Med Trop. 2009;42(5): Epub 2009/12/08. Expansao urbana e distribuicao espacial da malaria no municipio de Manaus, Estado do Amazonas. 9. Saúde OP-ad. Malária nas Américas, de acordo com o IPA, Oliveira-Ferreira J, Lacerda MV, Brasil P, Ladislau JL, Tauil PL, Daniel-Ribeiro CT. Malaria in Brazil: an overview. Malar J. 2010;9:115. Epub 2010/05/ Neves D. Parasitologia Humana. 11 ed. São Paulo Neves DP. Parasitologia Dinâmica. 2 ed. São Paulo Bousema T, Drakeley C. Epidemiology and infectivity of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax gametocytes in relation to malaria control and elimination. Clin Microbiol Rev. 2011;24(2): Epub 2011/04/ Hawking F, Wilson ME, Gammage K. Evidence for cyclic development and short-lived maturity in the gametocytes of Plasmodium falciparum. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1971;65(5): Epub 1971/01/ Pessoa S. B. MAV. Parasitologia médica. 12 ed. Rio de Janeiro Coura JR. Dinâmica das doenças infecciosas e parasitárias. Rio de Janeiro2005.

63 Alves FP, Durlacher RR, Menezes MJ, Krieger H, Silva LH, Camargo EP. High prevalence of asymptomatic Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum infections in native Amazonian populations. Am J Trop Med Hyg. 2002;66(6): Epub 2002/09/ Chandramohan D, Jaffar S, Greenwood B. Use of clinical algorithms for diagnosing malaria. Trop Med Int Health. 2002;7(1): Epub 2002/02/ Genton B, Smith T, Baea K, Narara A, al-yaman F, Beck HP, et al. Malaria: how useful are clinical criteria for improving the diagnosis in a highly endemic area? Trans R Soc Trop Med Hyg. 1994;88(5): Epub 1994/09/ Schellenberg JR, Smith T, Alonso PL, Hayes RJ. What is clinical malaria? Finding case definitions for field research in highly endemic areas. Parasitol Today. 1994;10(11): Epub 1994/01/ Kirchgatter K, Del Portillo HA. Clinical and molecular aspects of severe malaria. Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 2005;77(3): Epub 2005/08/ Alexandre MA, Ferreira CO, Siqueira AM, Magalhaes BL, Mourao MP, Lacerda MV, et al. Severe Plasmodium vivax malaria, Brazilian Amazon. Emerg Infect Dis. 2010;16(10): Epub 2010/09/ Carvalho BO, Lopes SC, Nogueira PA, Orlandi PP, Bargieri DY, Blanco YC, et al. On the cytoadhesion of Plasmodium vivax-infected erythrocytes. The Journal of infectious diseases. 2010;202(4): Epub 2010/07/ Kochar DK, Tanwar GS, Khatri PC, Kochar SK, Sengar GS, Gupta A, et al. Clinical features of children hospitalized with malaria--a study from Bikaner, northwest India. Am J Trop Med Hyg. 2010;83(5): Epub 2010/11/ Siqueira AM, Alexandre MA, Mourao MP, Santos VS, Nagahashi-Marie SK, Alecrim MG, et al. Severe rhabdomyolysis caused by Plasmodium vivax malaria in the Brazilian Amazon. Am J Trop Med Hyg. 2010;83(2): Epub 2010/08/ Tjitra E, Anstey NM, Sugiarto P, Warikar N, Kenangalem E, Karyana M, et al. Multidrug-resistant Plasmodium vivax associated with severe and fatal malaria: a prospective study in Papua, Indonesia. PLoS Med. 2008;5(6):e128. Epub 2008/06/ Roper MH, Torres RS, Goicochea CG, Andersen EM, Guarda JS, Calampa C, et al. The epidemiology of malaria in an epidemic area of the Peruvian Amazon. Am J Trop Med Hyg. 2000;62(2): Epub 2000/05/ Bottius E, Guanzirolli A, Trape JF, Rogier C, Konate L, Druilhe P. Malaria: even more chronic in nature than previously thought; evidence for subpatent parasitaemia detectable by the polymerase chain reaction. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1996;90(1):15-9. Epub 1996/01/ Rogier C, Trape JF. Malaria attacks in children exposed to high transmission: who is protected? Trans R Soc Trop Med Hyg. 1993;87(3): Epub 1993/05/01.

64 Bloland PB, Boriga DA, Ruebush TK, McCormick JB, Roberts JM, Oloo AJ, et al. Longitudinal cohort study of the epidemiology of malaria infections in an area of intense malaria transmission II. Descriptive epidemiology of malaria infection and disease among children. Am J Trop Med Hyg. 1999;60(4): Epub 1999/05/ Roper C, Elhassan IM, Hviid L, Giha H, Richardson W, Babiker H, et al. Detection of very low level Plasmodium falciparum infections using the nested polymerase chain reaction and a reassessment of the epidemiology of unstable malaria in Sudan. Am J Trop Med Hyg. 1996;54(4): Epub 1996/04/ Alves FP, Gil LH, Marrelli MT, Ribolla PE, Camargo EP, Da Silva LH. Asymptomatic carriers of Plasmodium spp. as infection source for malaria vector mosquitoes in the Brazilian Amazon. J Med Entomol. 2005;42(5): Epub 2005/12/ Branch O, Casapia WM, Gamboa DV, Hernandez JN, Alava FF, Roncal N, et al. Clustered local transmission and asymptomatic Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax malaria infections in a recently emerged, hypoendemic Peruvian Amazon community. Malar J. 2005;4:27. Epub 2005/06/ Cerutti C, Jr., Boulos M, Coutinho AF, Hatab Mdo C, Falqueto A, Rezende HR, et al. Epidemiologic aspects of the malaria transmission cycle in an area of very low incidence in Brazil. Malar J. 2007;6:33. Epub 2007/03/ Cucunuba ZM, Guerra AP, Rahirant SJ, Rivera JA, Cortes LJ, Nicholls RS. Asymptomatic Plasmodium spp. infection in Tierralta, Colombia. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2008;103(7): Epub 2008/12/ Harris I, Sharrock WW, Bain LM, Gray KA, Bobogare A, Boaz L, et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar J. 2010;9:254. Epub 2010/09/ Suarez-Mutis MC, Cuervo P, Leoratti FM, Moraes-Avila SL, Ferreira AW, Fernandes O, et al. Cross sectional study reveals a high percentage of asymptomatic Plasmodium vivax infection in the Amazon Rio Negro area, Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2007;49(3): Epub 2007/07/ Tada MS, Marques RP, Mesquita E, Dalla Martha RC, Rodrigues JA, Costa JD, et al. Urban malaria in the Brazilian Western Amazon Region I: high prevalence of asymptomatic carriers in an urban riverside district is associated with a high level of clinical malaria. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2007;102(3): Epub 2007/06/ Bereczky S, Liljander A, Rooth I, Faraja L, Granath F, Montgomery SM, et al. Multiclonal asymptomatic Plasmodium falciparum infections predict a reduced risk of malaria disease in a Tanzanian population. Microbes Infect. 2007;9(1): Epub 2006/12/ Males S, Gaye O, Garcia A. Long-term asymptomatic carriage of Plasmodium falciparum protects from malaria attacks: a prospective study among Senegalese children. Clin Infect Dis. 2008;46(4): Epub 2008/01/18.

65 da Silva-Nunes M, Moreno M, Conn JE, Gamboa D, Abeles S, Vinetz JM, et al. Amazonian malaria: asymptomatic human reservoirs, diagnostic challenges, environmentally driven changes in mosquito vector populations, and the mandate for sustainable control strategies. Acta Trop. 2012;121(3): Epub 2011/10/ de Mast Q, Syafruddin D, Keijmel S, Riekerink TO, Deky O, Asih PB, et al. Increased serum hepcidin and alterations in blood iron parameters associated with asymptomatic P. falciparum and P. vivax malaria. Haematologica. 2010;95(7): Epub 2010/02/ Laishram DD, Sutton PL, Nanda N, Sharma VL, Sobti RC, Carlton JM, et al. The complexities of malaria disease manifestations with a focus on asymptomatic malaria. Malar J. 2012;11:29. Epub 2012/02/ Leoratti FM, Durlacher RR, Lacerda MV, Alecrim MG, Ferreira AW, Sanchez MC, et al. Pattern of humoral immune response to Plasmodium falciparum blood stages in individuals presenting different clinical expressions of malaria. Malar J. 2008;7:186. Epub 2008/09/ Carter R, Mendis KN, Roberts D. Spatial targeting of interventions against malaria. Bull World Health Organ. 2000;78(12): Epub 2001/02/ Lasonder E, Ishihama Y, Andersen JS, Vermunt AM, Pain A, Sauerwein RW, et al. Analysis of the Plasmodium falciparum proteome by high-accuracy mass spectrometry. Nature. 2002;419(6906): Epub 2002/10/ Young JA, Fivelman QL, Blair PL, de la Vega P, Le Roch KG, Zhou Y, et al. The Plasmodium falciparum sexual development transcriptome: a microarray analysis using ontology-based pattern identification. Mol Biochem Parasitol. 2005;143(1): Epub 2005/07/ Eichner M, Diebner HH, Molineaux L, Collins WE, Jeffery GM, Dietz K. Genesis, sequestration and survival of Plasmodium falciparum gametocytes: parameter estimates from fitting a model to malariatherapy data. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2001;95(5): Epub 2001/11/ Carter RG, PM Gametocytes. Edinburgh: Churchill Livingstone; p Abdel-Wahab A, Abdel-Muhsin AM, Ali E, Suleiman S, Ahmed S, Walliker D, et al. Dynamics of gametocytes among Plasmodium falciparum clones in natural infections in an area of highly seasonal transmission. The Journal of infectious diseases. 2002;185(12): Epub 2002/06/ Babiker HA, Schneider P. Application of molecular methods for monitoring transmission stages of malaria parasites. Biomed Mater. 2008;3(3): Epub 2008/08/ Babiker HA, Schneider P, Reece SE. Gametocytes: insights gained during a decade of molecular monitoring. Trends Parasitol. 2008;24(11): Epub 2008/09/20.

66 Beurskens M, Mens P, Schallig H, Syafruddin D, Asih PB, Hermsen R, et al. Quantitative determination of Plasmodium vivax gametocytes by real-time quantitative nucleic acid sequence-based amplification in clinical samples. Am J Trop Med Hyg. 2009;81(2): Epub 2009/07/ Schneider P, Bousema T, Omar S, Gouagna L, Sawa P, Schallig H, et al. (Sub)microscopic Plasmodium falciparum gametocytaemia in Kenyan children after treatment with sulphadoxine-pyrimethamine monotherapy or in combination with artesunate. Int J Parasitol. 2006;36(4): Epub 2006/02/ Bousema JT, Gouagna LC, Drakeley CJ, Meutstege AM, Okech BA, Akim IN, et al. Plasmodium falciparum gametocyte carriage in asymptomatic children in western Kenya. Malar J. 2004;3:18. Epub 2004/06/ Ouedraogo AL, Schneider P, de Kruijf M, Nebie I, Verhave JP, Cuzin-Ouattara N, et al. Age-dependent distribution of Plasmodium falciparum gametocytes quantified by Pfs25 real-time QT-NASBA in a cross-sectional study in Burkina Faso. Am J Trop Med Hyg. 2007;76(4): Epub 2007/04/ Shekalaghe SA, Bousema JT, Kunei KK, Lushino P, Masokoto A, Wolters LR, et al. Submicroscopic Plasmodium falciparum gametocyte carriage is common in an area of low and seasonal transmission in Tanzania. Trop Med Int Health. 2007;12(4): Epub 2007/04/ Gamage-Mendis AC, Rajakaruna J, Carter R, Mendis KN. Infectious reservoir of Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum malaria in an endemic region of Sri Lanka. Am J Trop Med Hyg. 1991;45(4): Epub 1991/10/ Pukrittayakamee S, Imwong M, Singhasivanon P, Stepniewska K, Day NJ, White NJ. Effects of different antimalarial drugs on gametocyte carriage in P. vivax malaria. Am J Trop Med Hyg. 2008;79(3): Epub 2008/09/ Sattabongkot J, Maneechai N, Rosenberg R. Plasmodium vivax: gametocyte infectivity of naturally infected Thai adults. Parasitology. 1991;102 Pt 1: Epub 1991/02/ Price R, Nosten F, Simpson JA, Luxemburger C, Phaipun L, ter Kuile F, et al. Risk factors for gametocyte carriage in uncomplicated falciparum malaria. Am J Trop Med Hyg. 1999;60(6): Epub 1999/07/ Nacher M, Silachamroon U, Singhasivanon P, Wilairatana P, Phumratanaprapin W, Fontanet A, et al. Risk factors for Plasmodium vivax gametocyte carriage in Thailand. Am J Trop Med Hyg. 2004;71(6): Epub 2005/01/ Nacher M, Singhasivanon P, Silachamroon U, Treeprasertsuk S, Tosukhowong T, Vannaphan S, et al. Decreased hemoglobin concentrations, hyperparasitemia, and severe malaria are associated with increased Plasmodium falciparum gametocyte carriage. J Parasitol. 2002;88(1): Epub 2002/06/11.

67 von Seidlein L, Drakeley C, Greenwood B, Walraven G, Targett G. Risk factors for gametocyte carriage in Gambian children. Am J Trop Med Hyg. 2001;65(5): Epub 2001/11/ Stepniewska K, Price RN, Sutherland CJ, Drakeley CJ, von Seidlein L, Nosten F, et al. Plasmodium falciparum gametocyte dynamics in areas of different malaria endemicity. Malar J. 2008;7:249. Epub 2008/12/ Gbotosho GO, Sowunmi A, Okuboyejo TM, Happi CT, Michael OS, Folarin OA, et al. Plasmodium falciparum gametocyte carriage, emergence, clearance and population sex ratios in anaemic and non-anaemic malarious children. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2011;106(5): Epub 2011/09/ Roberts CH, Armstrong M, Zatyka E, Boadi S, Warren S, Chiodini PL, et al. Gametocyte carriage in Plasmodium falciparum-infected travellers. Malar J. 2013;12(1):31. Epub 2013/01/ Huh AJ, Kwak YG, Kim ES, Lee KS, Yeom JS, Cho YK, et al. Parasitemia characteristics of Plasmodium vivax malaria patients in the Republic of Korea. J Korean Med Sci. 2011;26(1):42-6. Epub 2011/01/ Graves PM, Burkot TR, Carter R, Cattani JA, Lagog M, Parker J, et al. Measurement of malarial infectivity of human populations to mosquitoes in the Madang area, Papua, New Guinea. Parasitology. 1988;96 ( Pt 2): Epub 1988/04/ Schneider P, Bousema JT, Gouagna LC, Otieno S, van de Vegte-Bolmer M, Omar SA, et al. Submicroscopic Plasmodium falciparum gametocyte densities frequently result in mosquito infection. Am J Trop Med Hyg. 2007;76(3): Epub 2007/03/ Coleman RE, Kumpitak C, Ponlawat A, Maneechai N, Phunkitchar V, Rachapaew N, et al. Infectivity of asymptomatic Plasmodium-infected human populations to Anopheles dirus mosquitoes in western Thailand. J Med Entomol. 2004;41(2): Epub 2004/04/ Ouedraogo AL, Bousema T, Schneider P, de Vlas SJ, Ilboudo-Sanogo E, Cuzin-Ouattara N, et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS One. 2009;4(12):e8410. Epub 2009/12/ Hallett RL, Dunyo S, Ord R, Jawara M, Pinder M, Randall A, et al. Chloroquine/sulphadoxine-pyrimethamine for gambian children with malaria: transmission to mosquitoes of multidrug-resistant Plasmodium falciparum. PLoS Clin Trials. 2006;1(3):e15. Epub 2006/07/ Lensen A, Bril A, van de Vegte M, van Gemert GJ, Eling W, Sauerwein R. Plasmodium falciparum: infectivity of cultured, synchronized gametocytes to mosquitoes. Exp Parasitol. 1999;91(1): Epub 1999/01/ Smalley ME, Sinden RE. Plasmodium falciparum gametocytes: their longevity and infectivity. Parasitology. 1977;74(1):1-8. Epub 1977/02/01.

68 Bharti AR, Chuquiyauri R, Brouwer KC, Stancil J, Lin J, Llanos-Cuentas A, et al. Experimental infection of the neotropical malaria vector Anopheles darlingi by human patient-derived Plasmodium vivax in the Peruvian Amazon. Am J Trop Med Hyg. 2006;75(4): Epub 2006/10/ Saúde Md. IPA da cidade de Manaus-AM e áreas periurbanas. In: Saúde SdVe, editor Katsuragawa TH, Gil LH, Tada MS, de Almeida e Silva A, Costa JD, Araujo Mda S, et al. The dynamics of transmission and spatial distribution of malaria in riverside areas of Porto Velho, Rondonia, in the Amazon region of Brazil. PLoS One. 2010;5(2):e9245. Epub 2010/02/ Barbosa S, Gozze AB, Lima NF, Batista CL, Bastos Mda S, Nicolete VC, et al. Epidemiology of Disappearing Plasmodium vivax Malaria: A Case Study in Rural Amazonia. PLoS neglected tropical diseases. 2014;8(8):e3109. Epub 2014/08/ Wampfler R, Mwingira F, Javati S, Robinson L, Betuela I, Siba P, et al. Strategies for detection of Plasmodium species gametocytes. PLoS One. 2013;8(9):e Epub 2013/12/ C. K. High blood-stage parasitemia and age are the main determinants of Plasmodium falciparum and P. vivax gametocyte prevalence in Papua New Guinea Douglas NM, Simpson JA, Phyo AP, Siswantoro H, Hasugian AR, Kenangalem E, et al. Gametocyte dynamics and the role of drugs in reducing the transmission potential of Plasmodium vivax. The Journal of infectious diseases. 2013;208(5): Epub 2013/06/ da Silva NS, da Silva-Nunes M, Malafronte RS, Menezes MJ, D'Arcadia RR, Komatsu NT, et al. Epidemiology and control of frontier malaria in Brazil: lessons from community-based studies in rural Amazonia. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2010;104(5): Epub 2010/01/ da Silva-Nunes M, Codeco CT, Malafronte RS, da Silva NS, Juncansen C, Muniz PT, et al. Malaria on the Amazonian frontier: transmission dynamics, risk factors, spatial distribution, and prospects for control. Am J Trop Med Hyg. 2008;79(4): Epub 2008/10/ Ladeia-Andrade S, Ferreira MU, de Carvalho ME, Curado I, Coura JR. Agedependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the Amazon Basin of Brazil. Am J Trop Med Hyg. 2009;80(3): Epub 2009/03/ McKenzie FE, Jeffery GM, Collins WE. Gametocytemia and fever in human malaria infections. J Parasitol. 2007;93(3): Epub 2007/07/ Muirhead-Thomson RC. Low gametocyte thresholds of infection of Anopheles with Plasmodium falciparum; a significant factor in malaria epidemiology. British medical journal. 1954;1(4853): Epub 1954/01/09.

69 Ouedraogo AL, Bousema T, de Vlas SJ, Cuzin-Ouattara N, Verhave JP, Drakeley C, et al. The plasticity of Plasmodium falciparum gametocytaemia in relation to age in Burkina Faso. Malar J. 2010;9:281. Epub 2010/10/ Buckling AG, Taylor LH, Carlton JM, Read AF. Adaptive changes in Plasmodium transmission strategies following chloroquine chemotherapy. Proceedings Biological sciences / The Royal Society. 1997;264(1381): Epub 1997/04/22.

70 54 8. ANEXOS Anexo I - POP_MAL_TC_004_v01D_PT (Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho, Ipiranga e Puraquequara, Manaus/AM). Anexo II - POP_MAL_TC_005_v01D_PT (Procedimento para Coleta de amostras de sangue para Detecção de DNA e RNA de Plasmodium, em estudos de campo). Anexo III - POP_MAL_TC_004_A01_v02_PT (Questionário de Corte transversal). Anexo IV - POP_MAL_LB_001_v02_PT (Preparo e leitura de lâminas para detecção de Plasmodium spp.). Anexo V - POP_MAL_LB_018_v01D_PT (Procedimento para Extração de DNA em placa, utilizando Favor prep 96-well genomic DNA kit (FAVORGEN)). Anexo VI POP_MAL_LB_021_v01D_PT (Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de DNA de plasmódio (qpcr)). Anexo VII - POP_MAL_LB_019_v01D_PT (Procedimento para Extração de RNA em placa utilizando kit RNeasy Plus 96, da Qiagen ). Anexo VIII - POP_MAL_LB_020_v01D_PT (Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de RNA de pfs25 e pvs25 de plasmódio (RT-qPCR)). Anexo IX Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Anexo X Termo de Assentimento.

71 POP_MAL_TC_004_v01D_PT Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária Código POP Título Idioma da versão original Elaborado por: Anne Cristine Gomes de Almeida POP_MAL_TC_004_v01D_PT Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho, Ipiranga e Puraquequara, Manaus/AM. PORTUGUÊS Revisado por: Wuelton Marcelo Monteiro Aprovado por: Monica Regina Farias Costa Data de aplicação: 12/11/2012 Data da próxima revisão: Data & assinatura Data & assinatura Data & assinatura Emenda Razão da emenda 1. OBJETIVOS Descrever os procedimentos para conduzir o seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, a ser realizado nas Comunidades do Brasileirinho, Ipiranga e Puraquequara, Manaus/Amazonas. 2. DEFINIÇÕES Não se aplica. 3. APLICÁVEL A Atividades do seguimento. 4. RESPONSABILIDADES Todo pessoal envolvido na condução do seguimento dos participantes. 5. POP'S RELACIONADOS Procedimento para Coleta de amostras de sangue para Detecção de DNA e RNA de Plasmodium, em estudos de campo (versão atual do POP_MAL_TC_005). 6. PROCEDIMENTOS O estudo epidemiológico da malaria será conduzido nas Comunidades do Brasileirinho, Ipiranga e Puraquequara (Manaus, Estado do Amazonas). Os participantes do estudo serão seguidos através das seguintes atividades: 2 visitas de corte transversal, com espaço de 12 meses entre cada visita; Visitas do Estudo de Coorte, mensalmente, durante 48 semanas;

72 Detecção passiva de casos. 6.1 Visitas de corte transversal Todos os participantes que assinaram o termo de consentimento para entrar no estudo participarão do Corte transversal; O corte transversal terá uma duração aproximada de entre 4 e 8 semanas; No dia da visita os participantes serão visitados em casa e será preenchido o Questionário de Corte transversal (versão atual do POP_MAL_TC_004_A01), constituído de perguntas sobre identificação do indivíduo participante, além de perguntas sobre a utilização de medidas preventivas para malária e sobre histórico da doença nos participantes. Uma amostra de sangue será coletada (segundo versão atual do POP_MAL_TC_005) do participante, para a realização dos seguintes itens: 1 lâmina para gota espessa; 1mL em tubo contendo EDTA, para extração de DNA e RNA; Para identificar as lâminas e as amostras, será usada etiqueta com código de barras e numeração correspondente ao participante. Os criotubos serão mantidos entre 4-8 C durante o dia; A lâminas e o criotubos serão enviados a FMT-HVD, diariamente; As lâminas serão lidas para determinar parasitemia (segundo a versão atual do POP_MAL_LB_001). Os criotubos serão transportados a FMT-HVD em caixa de isopor com gelo, para posterior processamento e armazenamento. Caso o paciente apresente algum sintoma de malária no momento da visita de corte transversal, será coletada uma lâmina extra e feita a leitura da mesma no posto de saúde das Comunidades. Se o diagnóstico de Malária for confirmado pela Gota Espessa, o participante será tratado de acordo com as guias nacionais de tratamento antimalárico. 6.2 Visitas do Estudo de Coorte (Cortes transversais mensais) O estudo de coorte será feito a partir da data da assinatura do termo de consentimento, com indivíduos selecionados a partir do Corte Transversal; A coorte incluirá todos os participantes que receberem a visita domiciliar do agente de busca ativa; Os participantes serão seguidos por um total de 48 semanas para que sejam monitoradas as taxas de incidência de malária; Os participantes serão investigados quanto à presença de infecção por Plasmodium pela detecção ativa de malária a cada 4 semanas; Em cada visita, deverá ser preenchido o Questionário de Coorte (Questionário da Coorte 1º visita - versão atual do POP_MAL_TC_004_A02 ou Questionário da Coorte 2º a 12º visita - versão atual do POP_MAL_TC_004_A03) para cada participante; Será coletado do participante 1mL de sangue total em tubo contendo EDTA, para extração de DNA e RNA (segundo versão atual do POP_MAL_TC_005) Os criotubos serão mantidos entre 4-8 C durante o dia. Para identificar as amostras, será usada etiqueta com código de barras e numeração correspondente ao participante; As amostras de sangue serão transportadas a FMT-HVD, em caixa de isopor com gelo, para posterior processamento e armazenamento. Caso o paciente apresente algum sintoma de malária no momento das visitas de coorte, será coletada uma lâmina e feita a leitura da mesma no posto de saúde das Comunidades. Se o diagnóstico de Malária for confirmado pela Gota Espessa, o participante será tratado de acordo com as guias nacionais de tratamento antimalárico. 6.3 Detecção Passiva de Casos A detecção passiva de casos será realizada quanto o paciente apresentar algum episódio febril e procurar o posto de saúde das comunidades, entre o período dos cortes mensais (Coorte). Ao procurar o posto de saúde, o participante deverá apresentar o seu Cartão de Identificação do estudo (versão atual do POP_MAL_TC_004_A05);

73 Deverá ser preenchido o Questionário de Detecção Passiva de Casos (versão atual do POP_MAL_TC_004_A04) para este participante; Deverá ser coletado (segundo versão atual do POP_MAL_TC_005): Amostra de sangue para confecção de lâmina de Gota Espessa (leitura feita no Posto de Saúde local); 1mL de sangue total em tubo contendo EDTA, para extração de DNA e RNA; Para identificar as amostras, será usada etiqueta com código de barras e numeração correspondente ao participante. Os criotubos serão mantidos entre 4-8 C durante o dia; Os criotubos serão enviados a FMT-HVD, diariamente, transportados em caixa de isopor com gelo. Se o diagnóstico de Malária for confirmado pela Gota Espessa, o participante será tratado de acordo com as guias nacionais de tratamento antimalárico. 7. REFERÊNCIAS Nao se aplica. 8. REGISTRO DOS ANEXOS TÍTULO DO ANEXO Anexo 1: Questionário de Corte transversal Anexo 2: Questionário da Coorte 1º visita Anexo 3: Questionário da Coorte 2º a 12º visita Anexo 4: Questionário de Detecção Passiva de Casos Anexo 5: Cartão de Identificação do Participante NOME DO ANEXO: CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma): POP_MAL_TC_004_A01_v02_PT POP_MAL_TC_004_A02_v01_PT POP_MAL_TC_004_A03_v01_PT POP_MAL_TC_004_A04_v01_PT POP_MAL_TC_004_A05_v01_PT CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) Novo Revisão Tradução Criado por: Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura

74 POP_MAL_TC_005_v01D_PT Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária Código POP POP_MAL_TC_005_v01D_PT Título Idioma da versão original Elaborado por: nne ristine Gomes de lmeida ndrea hn Procedimento para Coleta de amostras de sangue para Detecção de DNA e RNA de Plasmodium, em estudos de campo. PORTUGUÊS Revisado por: Wuelton Marcelo Monteiro Aprovado por: Monica Regina Farias Costa Data de aplicação: 12/11/2012 Data da próxima revisão: Data & assinatura Data & assinatura Data & assinatura Emenda Razão da emenda 1. OBJETIVOS Descrever o procedimento para coleta de amostras de sangue para Detecção Molecular de DNA e RNA de Plasmodium. 2. DEFINIÇÕES Não se aplica. 3. APLICÁVEL A Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa. 4. RESPONSABILIDADES Pessoal encarregado da coleta das amostras de pesquisa; Equipe do laboratório de biologia molecular. 5. POP'S RELACIONADOS Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio (versão atual do POP_MAL_LB_002); Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de sangue total, utilizando o QIAmp DNA kit (Qiagen ) (versão atual do POP_MAL_LB_003); Procedimento para Extração de DNA em placa utilizando Favor prep 96-well genomic DNA kit (FAVORGEN) (versão atual do POP_MAL_LB_018); Procedimento para Extração de RNA em placa utilizando kit RNeasy Plus 96, da Qiagen (versão atual do POP_MAL_LB_019); Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de RNA de pfs25 e pvs25 de (RTqPCR) (versão atual do POP_MAL_LB_020).

75 Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho, Ipiranga e Puraquequara, Manaus/AM (versão atual do POP_MAL_TC_004). 6. PROCEDIMENTOS 6.1 Recursos necessários Materiais 1. Tubos microtainer contendo anticoagulante (EDTA/Fluoreto) 2. Lanceta microtainer 3. Papel de filtro 4. Álcool a 70% 5. Algodão 6. Gaze estéril 7. Luvas de látex/ sem pó 8. Sacola para lixo biohazard 9. Recipiente perfurocortantes 10. Caixa térmica com gelox 11. Criobox 12. Lâminas 13. Crioetiquetas autocolantes 14. Lápis 15. Esferográfica 16. Marcador de texto permanente 17. Questionário de Corte transversal 18. Pipetas µl e µl 19. Ponteiras µ 6.2 Assepsia do Local da Coleta Para coleta de sangue o indivíduo deve estar sentado ou deitado; Calçar luvas de látex descartáveis; Identificar o tubo ou papel de filtro com o código do indivíduo. Deve-se limpar vigorosamente a pele do local de punção (parte lateral do dedo médio ou anelar, ou em lactentes, o dedo grande do pé ou calcanhar) com algodão embebido em álcool a 70%; Nota: não realizar a coleta no dedo mínimo, evitando assim a injúria óssea. Deixar secar o local de punção (desinfecção eficiente e prevenção de hemólise). 6.3 Coleta de sangue para extração de DNA/RNA em criotubo 1. Após assepssia, remover a tampa protetora da lanceta microtainer; 2. Posicionar a lanceta contra o local de punção e pressionar. Não retirar a lanceta até que o clique característico seja ouvido; 3. Remover a lanceta e descartar adequadamente; 4. Aplicar pressão intermitente próximo ao local da punção. Manter o braço estendido para baixo até adquirir a quantidade de sangue necessária; 5. Não fazer movimentos semelhantes a ordenha, evitando assim a hemólise ou contaminação da amostra por fluido tecidual. 6. Descartar a primeira gota de sangue com gaze estéril; 7. Virar a palma da mão do indivíduo para baixo; 8. Posicionar a boca do tubo microtainer diretamente no local de punção. Aplicar pressão intermitente ao longo do dedo até o sítio puncionado, para melhorar o fluxo de sangue e encher o tubo; 9. Encher o tubo com aproximadamente µl de sangue e fechá-lo firmemente. Homogeneizar bem o conteúdo do tubo (inverter ~20X);

76 10. Preparar uma lâmina com duas gotas espessas. Limpar adequadamente a lâmina extensora com água. 11. Limpar o local puncionado com algodão estéril e, se necessário, pressioná-lo; 12. Guardar o tubo microtainer em Box apropriado, mantido entre 4-8 C; 13. Preencher o diário de campo (código da amostra, data, volume das amostras, observações). 6.4 Coleta de sangue para extração de DNA/RNA em papel de filtro 1. Dever ser utilizado o mesmo procedimento para coleta descrito acima, até o passo 6; 2. Deve-se posicionar o papel de filtro diretamente no local de punção. Aplicar pressão intermitente ao longo do dedo até o sítio puncionado, para melhorar o fluxo de sangue e até obter a quantidade desejada (2 círculos de ~50 µl) de sangue embebido no papel de filtro; 3. Limpar o local puncionado com algodão estéril e, se necessário, pressioná-lo; 4. Guardar o papel de filtro embrulhado em papel alumínio. 6.5 Armazenamento e Transporte das amostras As amostras de sangue coletadas em criotubo devem ser transportadas diariamente, em caixa de isopor com gelo (4-8 ºC), ao laboratório de Biologia Molecular da Gerência de Malária, da FMT-HVD para processamento (Extração de DNA/ RNA) ou para armazenamento em longo prazo. O sangue coletado em tubo microtainer para extração de DNA e RNA deverá ser processado conforme o item 6.6. As amostras de sangue coletadas em papel de filtro devem ser transportadas diariamente, em temperatura ambiente, ao laboratório de Biologia Molecular, da Gerência de Malária, da FMT-HVD para processamento (Extração de DNA/ RNA) ou para armazenamento em longo prazo. O papel de filtro deve secar até o dia seguinte (ou por várias horas); uma parte do papel de filtro ficará dentro de envelope plástico com esferas de Sílica, a -80 C, e a outra ficará em Trizol a -80 C. Para detecção de RNA, o sangue em papel de filtro deve ser processado o mais brevemente possível. 6.6 Processamento das amostras de sangue utilizando RNAprotect 1. O criobox levado para o campo deve conter, para cada amostra coletada em tubo microtainer, os seguintes tubos eppendorfs, previamente identificados com etiqueta de código de barras: Tubo 1 - Um tubo contendo alíquota de 250 µl de RNAprotect; Tubo 2 - Um tubo para armazenamento do Pellet; Tubo 3 - Um tubo eppendorf que ficará vazio, para posterior armazenamento do Plasma. 2. Logo após a coleta da amostra de sangue, adicionar 50µL da mesma ao Tubo 1. Homogeneizar o conteúdo do tubo com a pipeta; 3. Transferir 200µl do sangue coletado ao Tubo 2; 4. Fechar o criobox e mantê-lo a 4 C, até a próxima coleta de sangue; 5. No laboratório deve-se armazenar o Tubo 1 em criobox identificado, em freezer; 6. No laboratório deve-se centrifugar o Tubo 2, para separação de plasma e pellet, a 5000rpm, por 10min, em temperatura ambiente; 7. Após centrifugação, aliquotar o plasma ao tubo 3. Armazenar imediatamente o tubo criobox identificado, em freezer; 8. Em seguida, armazenar imediatamente o pellet em criobox identificado, em freezer; 9. Preencher diário de laboratório, registrando observações de coagulação ou hemólise do sangue; 10. Tratamento do papel de filtro: Deixar secar até o próximo dia; Cortar um dos 2 círculos em círculos menores; Guardar em 300µl de Trizol, em tubo Eppendorf a -20 C ou -80 C; O resto do papel de filtro será embrulhado em papel alumínio e guardado em envelope plástico com esferas de Sílica a -20 C ou -80 C.

77 11. Limpar as pipetas utilizadas, a bancada e a centrífuga com álcool a 70%. 6.7 Biossegurança Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1) 7. REFERÊNCIAS 1. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; BRASIL: Ministério da Saúde. Manual de diagnóstico laboratorial da malária. Brasilia: Secretaria de Vigilância em Saúde, Waltmann A. STANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP). Obtaining Fingerprick Blood Samples. Version 1, Jan Waltmann A. STANDARD OPERATING PROCEDURE (SOP). Processing of Fingerprick Blood specimens. Version 1, Jan REGISTRO DOS ANEXOS TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma): NOME DO ANEXO: CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) Novo Revisão Tradução Criado por: Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura

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79 POP_MAL_LB_001_v02_PT Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária Código POP Título Idioma da versão original Elaborado por: André M. Siqueira; Camila Menezes Anne Cristine Gomes de Almeida POP_MAL_LB_001_v02_PT Preparo e leitura de lâminas para detecção de Plasmodium spp. PORTUGUÊS Revisado por: Gisely Cardoso de melo Aprovado por: Monica Regina Farias Costa Data de aplicação: 12/11/2012 Data da próxima revisão: Data & assinatura Data & assinatura Data & assinatura Emenda V02 Razão da emenda Inserção do projeto Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné na aplicabilidade do POP e em POPs relacionados. 1. OBJETIVOS Descrever os procedimentos para preparo, coloração, leitura e registro de resultado de lâminas para detecção de Plasmodium spp. utilizando gota espessa. 2. DEFINIÇÕES Não se aplica. 3. APLICÁVEL A Todas as lâminas coletadas para detecção de Plasmodium spp. durante o estudos PregV x, Epidemiologia da Malária no Município do areiro, mazonas, aracterização línica da Malária omplicada por Plasmodium vivax e Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné. 4. RESPONSABILIDADES Pessoal encarregado da coleta das amostras, técnicos e microscopistas, chefia do laboratório. 5. POP'S RELACIONADOS Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia da Malária no Município do areiro, mazonas (versão atual do POP_MAL_TC_002); Triagem e seguimento dos pacientes no estudo de malária grave por Plasmodium vivax (versão atual do POP_MAL_HO_001); Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho, Ipiranga e Puraquequara, Manaus/AM (versão atual do POP_MAL_TC_004).

80 6. PROCEDIMENTOS 6.1 Coleta e identificação das amostras A depender do protocolo do estudo, em cada local (campo, unidade básica de saúde ou hospital) serão coletadas: duas gotas espessas por indivíduo; ou quatro lâminas por pessoa - duas com duas gotas espessas na mesma lâmina e duas com esfregaço. Após limpar a polpa do dedo anelar com algodão embebido em álcool a 70%. Fazer a punção digital com lanceta estéril. Comprimir o dedo suavemente; Duas gotas espessas serão preparadas na mesma lâmina, alternativamente a uma gota espessa e um esfregaço. Confeccionar uma gota espessa homogênea de 1,5 x 1,0 cm na lâmina de vidro; Uma etiqueta de identificação, contendo código de barras e números únicos, será colada na margem da lâmina, como segue: Os três formulários seguintes serão preenchidos no momento da coleta da lâmina no hospital, na unidade básica de saúde ou no campo: Uma Ficha de amostras de laboratório; Cada estudo tem uma diferente Ficha de amostras de laboratório, onde os tipos de amostras coletadas de cada estudo são especificados; Uma etiqueta de identificação de amostra será pregada e o nome o número de identificação no estudo de cada paciente será preenchido. Um formulário de Resultado da primeira leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A01 ou POP_MAL_LB_001_A03) e de Resultado da segunda leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A02) Uma etiqueta de identificação será colada em cada formulário, que também será preenchido com nome e número de identificação permanente (NIP) do paciente no estudo, além da data de coleta da lâmina. 6.2 Recepção de amostras no laboratório As lâminas serão levadas inicialmente para o laboratório mais próximo ao local da coleta (campo, unidade básica de saúde ou hospital) onde serão devidamente coradas (seção 6.3) e será realizada a leitura rápida. Para leitura de densidade parasitária, as lâminas serão enviadas ao laboratório da Gerência de Malária acompanhadas de: Uma Ficha de amostras de laboratório para cada paciente, acompanhada de: Um formulário de Resultado da primeira leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A01 ou POP_MAL_LB_001_A03) e um de Resultado da segunda leitura de lâmina (versão atual do POP_MAL_LB_001_A02) para cada paciente Quando as amostras chegarem ao laboratório, a pessoa encarregada da recepção checará se todas as amostras registradas na Ficha de amostras de laboratório foram entregues. A Ficha de amostras de laboratório será preenchida no local da coleta em ordem de data.

81 Após a recepção, caso não sejam realizada a leitura da densidade parasitária no mesmo momento da chegada, estas serão armazenadas conforme procedimento descrito na seção Coloração Reagentes Azul de metileno fosfatado Solução alcoólica de Giemsa estoque Solução alcoólica de Giemsa diluída 1:10 Água tamponada Preparação Azul de metileno fosfatado Azul de metileno medicinal em pó 16H18ClN3S 200mg Fosfato de sódio monobásico NaH2PO4 600mg Fosfato de potássio bibásico K2HPO4 200mg Água destilada H2O 250mL Filtrar para retirar as impurezas Solução alcoólica de Giemsa estoque Corante Giemsa em pó C14H14ClN3S 750mg Álcool metílico PA CH3OH 65mL Glicerina PA CH2(OH)CH(OH)CH2OH 35mL Agitar bem (várias vezes por dia) em garrafa contendo pérolas de vidro. Manter o recipiente tampado em forma de estoque. Filtrar quando necessário Solução alcoólica de Giemsa diluída 1:10 Solução alcoólica de Giemsa estoque Água tamponada 1 gota 1mL Água tamponada Fosfato bibásico de sódio Na2HPO4 6g Fosfato monobásico de potássio KH2PO4 4g Misturar em gral de porcelana. Diluir 1 g da mistura em 1000 ml de água destilada Armazenamento dos reagentes Os reagentes utilizados nesse procedimento devem ser armazenados em temperatura ambiente Procedimento 1ª fase: Desemoglobinização pela solução hipotônica de azul de metileno. Aplicar a solução de azul de metileno fosfatado sobre a gota espessa de sangue, por dois segundos. Enxaguar a lâmina com água tamponada (sem jato forte). 2ª fase: Coloração pela solução de Giemsa para coloração da gota espessa. As lâminas devem ser coradas dentro de 72 horas com uma solução de Giemsa a 10% com água tamponada. Colocar a lâmina com o lado da gota voltada para a superfície da placa de coloração.

82 Preparar uma solução de Giemsa na proporção de uma gota de corante para 1ml (1 gota) de água tamponada. Homogeneizar Aplicar esta solução na placa côncava de coloração, sob a lâmina invertida. Deixar corar por 10 minutos. Enxaguar com água tamponada (sem jato forte). Secar ao calor suave ou sob ventilação. 3ª fase: Coloração do esfregaço método de Giemsa Fixar o esfregaço com álcool metílico por um minuto. Deixar secar. Colocar a lâmina invertida sobre a placa de coloração. Despejar a diluição do corante de Giemsa na proporção de uma gota do corante para 1ml de água tamponada. Deixar corar por 20 a 30 minutos. Enxaguar com jato forte de água tamponada. Secar ao calor suave ou sob ventilação. 4ª fase: Montagem das lâminas (no caso de a leitura da densidade parasitária não for realizada no mesmo dia da coloração, realizar a montagem, como segue): Pingar duas a três gotas de Entelan em cada lâmina. Colocar uma lamínula sobre as gotas. Deixar secar sob temperatura ambiente. 6.4 Controle de qualidade da coloração de lâminas A solução de Giemsa deve ser controlada antes do uso. Isto é realizado preparando a solução de Giemsa 1:10 que será usada e corando uma lâmina sabidamente positiva. Não deve haver coloração das hemácias. Cada nova preparação de Giemsa deve ser submetida a controle de qualidade. O tampão de ph deve ser checado utilizando phmetro ou fita, estando o ph a 7,2. O ph deve ser ajustado se necessário. O tampão deve ser analisado ao menos duas vezes por semana se for preparado em grandes quantidades. 6.5 Leitura Antes do início da contagem, o equivalente a 0.25 Ml de sangue (aproximadamente 100 campos utilizando uma ocular de 10X e uma objetiva de 100X) deverá ser examinado para determinar a espécie do parasito e estágios que possam estar presentes. Coloque uma gota de óleo de imersão sobre a lamínula. Ligue o microscópio. Cheque a presença de ocular de 10X. Com o condensador elevado, a lâmina corada é colocada no suporte e a fonte de luz é ajustada visibilizando pela ocular e pela objetiva de 100X. Ao mover lentamente a objetiva de imersão, uma camada de óleo será formada entre a lâmina e a lente. O ajuste fino é usado para focar o campo; a lente não deve tocar a lâmina. O exame microscópico deve ser sistemático e padronizado. Ele deve iniciar pela extremidade esquerda da lâmina. A leitura é iniciada da periferia do campo e termina no centro. Quando o campo está lido, move-se a lâmina longitudinalmente para examinar os campos adjacentes. Move-se a lâmina verticalmente para que outra fileira/largura seja lida. Há cerca de 100 campos em um eixo de 2 cm da lâmina; No início será realizada a leitura rápida das lâminas para guiar o tratamento e, após, será feita a quantificação da densidade parasitária para determinar o resultado final Leitura rápida As lâminas serão lidas imediatamente após a coleta para guiar o tratamento. Tal leitura será realizada tanto no posto de saúde / hospital, quanto para as lâminas que sejam levadas diretamente para o laboratório.

83 A leitura rápida será realizada conforme a prática padrão em cada centro. Os resultados da leitura rápida serão transcritos no formulário apropriado de cada estudo (versões atuais de POP_MAL_TC_002_A01, POP_MAL_TC_002_A02, POP_MAL_HO_002_A01, POP_MAL_HO_002_A02) Leitura da densidade parasitária: parasitos por µl. Uma vez coradas, as lâminas serão colocadas em caixas e distribuídas com o formulário de primeira leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01 ou POP_MAL_LB_001_A03) ao microscopista que realizará a primeira leitura. Para contagem de parasitos e leucócitos separadamente, dois contadores devem ser usados, um para as formas assexuadas do parasito e outro para os leucócitos. Caso detecte-se infecção mista, outro contador deverá ser utilizado para a contagem de formas da outra espécie. Determinando uma lâmina como negativa: O microscopista irá ler a lâmina até que 200 campos tenham sido contados. A lâmina apenas será determinada negativa quando nenhum parasito for encontrado em 200 campos. Caso sejam vistas formas assexuadas de Plasmodium spp: O microscopista contará parasitos até que o número de 200 leucócitos ou 500 parasitos seja alcançado. Caso o microscopista já tenha contado 200 leucócitos ou mais quando o primeiro parasito for visto, a leitura será interrompida. A contagem de parasitos ou leucócitos não será interrompida até que o campo inteiro seja lido. Este método será usado tanto para infecções únicas ou mistas por Plasmodium. No segundo caso, os parasitos de cada espécie deverão ser contados separadamente. A contagem parasitária em relação à contagem de leucócitos pode ser convertida a parasitos por µl usando a seguinte fórmula matemática: Nº de parasitos X 6000 / Nº de leucócitos = parasitos por µl Está fórmula será calculada para cada espécie de parasito encontrada. Caso o número de leucócitos para cada participante seja conhecido ( ex: estudo de malária vivax grave), a densidade pode ser calculada mais precisamente com a seguinte fórmula: Nº de parasitos X Nº de leucócitos / Nº de leucócitos = parasitos por µl Contagem de formas sexuais As lâminas de Gota espessa serão revisadas para quantificação dos gametócitos em 100 leucócitos. A conversão para gametócitos/µl é realizada por cálculo simples, utilizando como valor de referência 6000 leucócitos/mm 3 ou o número total de leucocitos do paciente (obtido pelo Hemograma). Nº de gametócitos X Nº de leucócitos (totais ou 6000) / 100 = gametócitos por µl Este procedimento é semelhante aos métodos diagnósticos preconizados pelas diretrizes do CLSI do CDC (contagem superior a 500 parasitos ou 1000 leucócitos) e também similar às diretrizes da OMS (que para densidades < 10 parasitos por 200 leucócitos propõe contar acima de 500 leucócitos, mas que para densidades superiores a 10 parasitos por 200 leucócitos propõe parar a contagem ao atingir 200 leucócitos). Após a primeira leitura, as lâminas serão mantidas na mesma ordem na bandeja ou caixa para serem lidas posteriormente por outro microscopista. As lâminas serão entregues conjuntamente com o formulário de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02) ao microscopista que realizará a segunda leitura, assegurando-se que não seja a mesma pessoa que realizou a primeira leitura e que esta pessoa não tenha acesso aos resultados no formulário de primeira leitura de lâmina.

84 6.6 Registro dos resultados O microscopista registrará os resultados da leitura em µl nos formulários de primeira e segunda leitura de lâmina. A primeira seção do formulário, incluindo a etiqueta de identificação da amostra, já haverá sido preenchida no momento da coleta da amostra. A seção de Resultados será preenchida pelo microscopista com a seguinte informação: Caso a lâmina for negativa, o número de campos examinados será registrado (deve ser 200) e o número de parasitos deverá ser 0 para todas as espécies. Caso a lâmina for positiva, o número de leucócitos contados e o número de formas assexuadas de parasitos contados para cada espécie deverão ser registrados. O número de gametócitos para cada espécie também deverá ser registrado. Caso a lâmina não possa ser lida, o motivo deverá ser registrado (não encontrada, quebrada, má qualidade). O microscopista assinará e datará o formulário com a data da leitura e registrará seu código do estudo. O microscopista que realizar a primeira leitura registrará os resultados no formulário de primeira leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01 ou POP_MAL_LB_001_A03) e o que realizar a segunda leitura registrará os resultados no formulário de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02). Os formulários Resultado de primeira leitura e Resultado de segunda leitura serão enviados diariamente ao centro de registro de dados para serem inseridos. 7. CÁLCULO DA DENSIDADE PARASITÁRIA E CONTROLE DE QUALIDADE INTERNA Todas as lâminas serão lidas duas vezes independentemente e os resultados registrados em diferentes formulários de resultados de leitura de lâmina (primeira e segunda leituras), que serão inseridos nas bases de dados. As lâminas que NÃO caírem nos seguintes critérios deverão ser lidas uma terceira vez: Ambas as lâminas positivas, tendo ambas as leituras > 400 parasitos por µl e a proporção de densidades de ambas as leituras (maior contagem / menor contagem) < 2. Ambas as lâminas positivas e uma ou ambas tem contagem < 400 parasitos por µl e a maior contagem é menos que um log 10 superior à menor contagem. Ambas as lâminas negativas. Um programa de computador gerará uma lista com as lâminas que devem ser lidas uma terceira vez, baseado na proporção das densidades das duas primeiras leituras. No centro de dados o programa produzirá impresso que será a ficha de Resultado de terceira leitura de lâmina e incluirá o número de identificação de amostra, o número de identificação permanente, a posição na caixa e os códigos dos microscopistas que realizaram a primeira e segunda leituras. No laboratório a lâmina será retirada da posição na caixa correspondente e será lida a terceira vez por um microscopista. O microscopista que realiza a terceira leitura registrará os resultados no impresso, que será então devolvido ao centro de dados e inserido nas bases de dados. O resultado definitivo (após a segunda leitura no caso de concordância ou após a terceira leitura caso não haja concordância entre as duas primeiras) será calculado por um programa de computador e levará em conta os seguintes critérios: Caso ambas as leituras sejam negativas, o resultado final será negativo. Caso as duas lâminas sejam positivas e haja concordância, o resultado final será a média geométrica das duas leituras. Caso uma leitura seja positiva e a outra negativa e a terceira leitura seja positiva, o resultado final será a média geométrica das duas densidades positivas. Caso a terceira leitura seja negativa, o resultado final será negativo. Caso as três leituras sejam positivas, o resultado final será a média geométrica das duas leituras com densidades mais próximas. Todos os resultados de leituras de lâminas serão armazenados pelos investigadores. 8. ARMAZENAMENTO DAS LÂMINAS

85 As lâminas serão levadas a um(a) técnico(a) de laboratório designado(a). Este deverá conferir conjuntamente com o investigador que as trouxe a presença das lâminas e o correto preenchimento dos formulários correspondentes. No caso de a lâmina não haver sido montada com o Entelan após a coloração, tal procedimento deverá ser realizado, após a leitura do segundo microscopista para que a lâmina seja armazenada. Em seguida as lâminas deverão ser armazenadas nas caixas apropriadas, sendo o local de cada lâmina registrado nos formulários de Resultado de primeira leitura de lâmina e Resultado de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A01 ou POP_MAL_LB_001_A03 e POP_MAL_LB_001_A02). As caixas serão numeradas à medida que forem preenchidas. As datas das lâminas que ocuparem a primeira e a última posição em cada caixa deverão estar escritas no exterior da caixa. A partir do registro da posição das lâminas nas caixas, o microscopista retirará as lâminas à medida que realizar as leituras de densidade parasitária. O segundo microscopista deverá atentar para o número da caixa e a posição da lâmina detalhados na ficha de Resultado de segunda leitura de lâmina (versão atual de POP_MAL_LB_001_A02) para recolocar a lâmina na posição correta após a leitura. Caso uma terceira leitura seja necessária, a lâmina será retirada da caixa e colocada novamente na mesma posição quando a terceira leitura for encerrada. As duplicatas das lâminas serão mantidas em uma caixa de lâminas distinta e armazenadas no laboratório, sendo usadas apenas no caso de perda ou quebra da primeira lâmina. As datas das lâminas que ocuparem a primeira e a última posição em cada caixa deverão estar escritas no exterior da caixa. As caixas de armazenamento devem ser mantidas num local trancado no laboratório, sob condições apropriadas de temperatura e umidade e protegidas de luz direta. 9. REFERÊNCIAS WHO manual for malaria diagnostic in developing countries. Diagnoses and management of severe falciparum malaria. WHO/CDS/CPE/SMT/ Diagnostic procedures for blood specimens. Diagnostic for Parasitic Diseases, CDC, Atlanta. Manual de diagnóstico laboratorial da malária. Brasília: Secretaria de Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde; REGISTRO DOS ANEXOS TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma): Título do Anexo 1: Resultado de primeira leitura de lâmina Título do Anexo 2: Resultado de segunda leitura de lâmina Título do Anexo 3: Resultado de leitura de lâmina POP_MAL_LB_001_A01_v02_PT POP_MAL_LB_001_A02_v02_PT POP_MAL_LB_001_A03_v02_PT NOME DO ANEXO: Resultado de primeira leitura de lâmina CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) POP_MAL_LB_001_A01_v02_PT Novo Revisão Tradução X Justificativa Acrescida opção 9 (não se aplica) ao item 9 ajuste do formato de data. Criado por: Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura NOME DO ANEXO: Resultado de segunda leitura de lâmina CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) POP_MAL_LB_001_A02_v02_PT Novo Revisão Tradução X Justificativa crescida opção 9 (não se aplica) ao item 9 ajuste do formato de data. Criado por: Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura

86 POP_MAL_LB_018_v01D_PT Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária Código POP POP_MAL_LB_018_v01D_PT Título Idioma da versão original Elaborado por: Andrea Kühn; Anne Cristine Gomes de Almeida. Procedimento para Extração de DNA em placa, utilizando FavorPrep 96-well genomic DNA kit (FAVORGEN). PORTUGUÊS Revisado por: Andrea Kühn Aprovado por: Mônica Costa Data de aplicação: 01/01/2013 Data da próxima revisão: Período de execução deste procedimento: ~ 6hs Data & assinatura Data & assinatura Data & assinatura Emenda Razão da emenda 1. OBJETIVOS Descrever o procedimento extração de DNA em placa, utilizando kit FavorPrep 96-well genomic DNA, da Favorgen. 2. DEFINIÇÕES Não se aplica. 3. APLICÁVEL A Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa. 4. RESPONSABILIDADES Equipe do laboratório de biologia molecular envolvida na realização de procedimento de Extração de DNA. 5. POP'S RELACIONADOS Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho e Ipiranga, Manaus/AM (versão atual do POP_MAL_TC_004). Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de plasmódio (versão atual do POP_MAL_LB_002). Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de DNA de plasmódio (qpcr) (versão atual do POP_MAL_LB_021).

87 6. PROCEDIMENTOS 6.1 Recursos necessários Materiais Kit FavorPrep 96-well genomic DNA (FADWE 002, Marca: Favorgen) Placa 96-Well PCR com tampas em tiras Filme adesivo Placa 96-well 2.0 ml Etanol absoluto (96-100%) pipeta multicanal, distancia das canais ajustável, µl (Modelo: Rainin LA6-1200XLS, Marca: Mettler Toledo) pipeta multicanal, µl dispensador com combitips de 0,5 ml, 5 ml e 25 ml (Eppendorf) ponteiras de 100 ul ou 200 ul e 1000ul com filtro gelo Reservatórios de reagentes Equipamentos Centrífuga com capacidade mínima de 5000 x g (SIGMA 4-16KS) Banho-maria 60 C Soluções para preparo Tampão W1 Adicionar 35 ml de etanol %, no primeiro uso, marcar que etanol foi adicionado; Tampão de Lavagem (Washing buffer) - Adicionar 200 ml de etanol %, no primeiro uso, marcar que etanol foi adicionado; Proteinase K - Adicionar ddh2o, para uma concentração de 10mg/mL: 225mg 22,5ml. Após preparada, preparar aliquotas de 2 ml, armazenar a -20 C. 6.2 Extração de DNA em placa Procedimentos iniciais procurar código da placa atual (p.ex. Coorte_DNA_01) ligar incubadora ou banho-maria a 60 C; limpar bancada com água e detergente; verificar se a proteinase K e os tampões estão prontos para o uso; caso tenha formado um precipitado no tampão FATG2, dissolver por incubação a 60 C; descongelar proteinase K (2 ml por placa), guardar em gelo Extração transferir tubo Eppendorf ao rack para 96 tubos, em ordem do criobox; controle negativo: 1-2 tubos Eppendorf com 100 µl de PBS por placa. IMPORTANTE: Deixar os tubos Eppendorf na mesma ordem o tempo todo, não descartar os tubos; documentar no computador/ livro de protocolo a ordem dos tubos logo após a extração (ou durante o procedimento, caso tenha tempo); cuidado com o dispensador e a pipeta multicanal (evitar contaminação, não molhar a borda do poços)

88 usar ponteiras com filtro Lise Celular deixar as amostras à temperatura ambiente; verificar quantidade (volume do pellet); adicionar PBS a cada tubo Eppendorf (volume final 200 µl), resuspender; adicionar 20 µl de proteinase K a cada poço da placa 96 poços 2 ml (nova placa, dispensador, combitip 0,5 ml); marcar o número da placa; adicionar 200 µl de tampão FATG2 a cada tubo Eppendorf com a pipeta multicanal ajustavel, homogeneizar bem (resuspender 5-10 vezes, não pipetar muito rápido, liquido pode pingar) e transferir à placa dos poços profundos, depois misturar novamente (1-2 vezes) selar a placa com filme adesiva (vem com o kit); Centrifugar brevemente (spin) a 3000 rpm; incubar a 60 C por 30 min; centrifugar brevemente (spin). Add PBS and FATG2 buffer to tubes Add Proteinase K to plate Transfer resuspended blood pellet to plate, mix DNA Binding colocar a placa de ligação de DNA em cima da outro placa de poços profundos (usada, autoclavada); marcar o número da placa de ligação de DNA e S-Block; retirar a folha adesiva com cuidado; adicionar 200 µl de etanol 100% (pipeta multicanal, ajustavel), misturar imediatamente por pipetagem 5 vezes, depois ajustar o volume para 800 ul, misturar mais 5 vezes com cuidado (risco de contaminaçao se é pipetando muito rápido); tansferir, com cuidado, as amostras (620 µl) à placa de ligação de DNA; selar com folha adesiva nova; centrifugar a xg (5700 rpm) por 5 min; Aquecer o tampão de eluição (Elution buffer) a 60 C; descartar o filtrado, secar a placa de lavagem com toalha de papel, colocar novamente a placa de ligação de DNA. Transfer samples to DNA binding column plate

89 6.2.5 Lavagem adicionar 300 µl de tampão W1 a cada poço (dispensador, Combitip 5 ml); centrifugar a xg (5700 rpm) por 5 min; descartar o filtrado, secar a placa com papel toalha, colocar novamente a placa de ligação de DNA; adicionar 750 µl de tampão de lavagem (Wash Buffer) a cada poço (dispensador, Combitip 25ml, tem que colocar primeiro o adaptador em cima do Combitip, depois insertar adaptador com combitip no dispensador); centrifugar a xg (5700 rpm) por 5 min; Descartar o filtrado, secar a placa, colocar placa de ligação de DNA, sem a folha adesiva; centrifugar a xg (5700 rpm) por 15 min para secar o álcool Eluição do DNA colocar uma placa de 96 poços de PCR (vem com o kit) sobre uma nova placa (usada, autoclavada) de poços profundos; marcar o número da placa; colocar a placa de ligação de DNA sobre a placa de 96 poços; adicionar 100 µl de tampão de eluição (aquecido) em cima de cada membrana de cada poço (dispensador, ponteira de 500 ul); incubar por 3 min; centrifugar a xg (5700 rpm) por 5 min; repetir eluição com mais 100 µl de tampão de eluição (Elution buffer) (aquecido, incubaçao de 3 min também) Armazenamento resuspender o eluido com ciudado, transferir 100 µl para nova placa de PCR de 96 poços (não vem com o kit) (multicanal de 12 canais, ponteiras de 100 ou 200 ul com filtro); transferir fila H da placa de eluição para a próxima fila vazia da placa das filas H (primeiro da placa A, depois da placa B); marcar as placas: Coorte_DNA_91A_ (= Placa de Eluição freezer -80º) Coorte_DNA_91B_ (=Placa de PCR qpcr, geladeira) Coorte_DNA_XXXH_Data1 Data2 (= Placas das filas H qpcr, geladeira) vedar as placas com strips (placa B e H) ou folha adesiva (placa A ). Após a extração limpar a bancada com água e detergente;

90 limpar as placas de lavagem (deixar de molho em agua/detergente/naocl. IMPORTANTE: Escanear códigos das amostras, backup do arquivo. 6.3 Biossegurança e descarte de resíduos Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1). Os resíduos serão descartados de acordo com as normas da Gerência de Malária. 7. REFERÊNCIAS 1. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; SOP DN Extraction (Favorgen) from Red ell Pellets, elaborado por eline Barnadas (PNG-IMR) and Andreea Waltmann (WEHI). 3. FavorPrep 96-well Genomic DNA Kit User Manual, Favorgen. 8. REGISTRO DOS ANEXOS TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma): NOME DO ANEXO: CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) Novo Revisão Tradução Criado por: Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura A versão atual deste POP foi traduzida a e a versão traduzida entra em efeito em / /. dd mm aa Assinatura do responsável:

91 POP_MAL_LB_021_v01D_PT Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária Código POP POP_MAL_LB_021_v01D_PT Título Idioma da versão original Elaborado por: Anne Cristine Gomes de Almeida; Andrea Kühn. Data & assinatura Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de DNA de plasmódio (qpcr). PORTUGUÊS Revisado por: Andrea Kühn Data & assinatura Aprovado por: Mônica Costa Data & assinatura Data de aplicação: 01/01/2013 Data da próxima revisão: Período de execução deste procedimento: 1h - preparo da reação; ~2hs - tempo de corrida em sistema 7500 Fast. Emenda Razão da emenda 1. OBJETIVOS Descrever o procedimento de realização de PCR em tempo real para detecção de DNA de plasmódio (qpcr). 2. DEFINIÇÕES PCR: a reação em cadeia da polimerase é definida como uma técnica molecular que permite a amplificação de pequenas quantidades de um DNA específico a partir de um molde do DNA, usando uma reação enzimática simples, sem um organismo vivo. O limiar de detecção da técnica é muito superior ao da gota espessa (técnica padrão utilizada no diagnóstico rotineiro da malária): cerca de 0,004 parasitos/ml. PCR Tempo Real (qpcr): Variação da técnica de PCR para detecção de sinal fluorescente permitindo a quantificação de ácidos nucléicos em tempo real, assim como a detecção qualitativa de seqüências de ácidos nucléicos utilizando análises de curvas de dissociação ou por meio de sondas marcadas. Não requer tratamento pós-pcr para visualização do resultado. Iniciador (primer): uma pequena sequência de DNA ou RNA a partir da qual pode começar a replicação do DNA. 3. APLICÁVEL A Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa clínica; Todos os laboratórios e ou grupos de pesquisa que constituem REDIMA (Rede Amazônica da Dinâmica de Infecção Experimental com Malária) 4. RESPONSABILIDADES Equipe do laboratório de biologia molecular envolvida na realização da PCR em tempo real. 5. POP'S RELACIONADOS Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir da cabeça e/ou tórax dos mosquitos. (versão atual de POP_MAL_LB_004);

92 Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho e Ipiranga, Manaus/AM (versão atual do POP_MAL_TC_004); Procedimento para Extração de DNA em placa utilizando Favor prep 96-well genomic DNA kit (FAVORGEN) (versão atual do POP_MAL_LB_018); Procedimento para extração de DNA de Plasmodium spp. a partir de sangue total, utilizando o QIAmp DNA kit (Qiagen ) (versão atual do POP_MAL_LB_003). 6. PROCEDIMENTOS 6.1 Recursos necessários Amostra DNA obtido por extração, conforme POP_MAL_LB_018, POP_MAL_LB_004, POP_MAL_LB_003 ou outro método: A partir da cabeça de mosquitos anofelinos, para detecção de esporozoítos; A partir de sangue total (formas sexuadas e assexuadas) Materiais 1. Pipetas automáticas de 10 µl, 100 µl e 1000 µl 2. Ponteiras com filtro para pipetas automáticas 3. Pipeta multicanal 0,5 10 µl 4. Multipipetador 5. Ponteiras para multipipetador (0,5 ml) 6. Tubos de 1,5 e 2,0 ml 7. Microplacas de 0,1mL, com 96 poços, para sistema de PCR em Tempo Real 8. Filme óptico para vedar as microplacas Equipamentos 1. Vortex 2. Centrífuga 3. Sistema de PCR em Tempo Real 7500 Fast Applied Biosystems Reagentes Reagente Fabricante n referência Armazenamento TaqMan GeneExpression MasterMix TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems Applied Biosystems C C Sondas (Taqman Probe) Life Technologies alíquota usada: 2-8 C; estoque: -20 C Iniciadores (primers) da reação IDT Integrated DNA Technologies - alíquota usada: 2-8 C; estoques (100 µm): -20 C Água MiliQ - - Temperatura ambiente Tampão TE (diluição de Ambion AM9849 Temperatura ambiente iniciadores) Tween 20 (diluição de Sigma-Aldrich P1379 Temperatura ambiente iniciadores)

93 Iniciadores (5 3 ): Plasmodium spec. ( QM L ) QMAL-for: TTA GAT TGC TTC CTT CAG TRC CTT ATG* QMAL-rev: TGT TGA GTC AAA TTA AGC CGC AA * Oligonucleotídeo contendo oscilação (R=A/G) Plasmodium vivax VIVAX-for: GCT TTG TAA TTG GAA TGA TGG GAA T VIVAX-rev: ATG CGC ACA AAG TCG ATA CGA AG Plasmodium falciparum FALC-for: TAT TGC TTT TGA GAG GTT TTG TTA CTT TG FALC-revMAO: TAT TCC ATG CTG TAG TAT TCA AAC ACA A Sondas (5 3 ): QMAL-probe: 6FAM TCA ATT CTT TTA ACT TTC TCG CTT GCG CGA BHQ1 VIVAX-probeMGB: VIC AGC AAC GCT TCT AGC TTA MGB NFQ FALC-probeMGB: 6FAM ACG GGT AGT CAT GAT TGA GTT MGB NFQ As diluições de iniciadores são preparadas com tampão TE (comprado); após a adição do TE, deixar incubar a solução por 5 min, em seguida vortexar e centrifugar. Preparar alíquotas com volume e concentração menor, suficiente para uma placa (utilizando água de injeção). Plasmídeos: Os plasmídeos contêm o fragmento do gene que será amplificado. Três diluições são usadas: 10 2, 10 4 e 10 6 cópias/ µl. As diluições de plasmídeos são preparadas com tampão TE mais Tween (concentração final de Tween 0,01%) com um volume final de plasmídeo é de 1 ml. A partir destes diluções, devem ser preparadas alíquotas menores para uso (armazenadas a 2-8 C) e para estoque (armazenadas a -20 C). 6.2 PCR em Tempo Real Para a detecção dos principais parasitos da malária que infectam humanos, foi padronizada uma reação de PCR em Tempo Real baseada no gene 18S rrna (1,3). Os plasmídeos servem como controle positivo e como padrão para quantificação de DNA das amostras. Usando os plasmídeos é possível comparar a quantidade de DNA das amostras de várias placas Reação de PCR em Tempo Real (qpcr) Mastermix QMAL (para 96 poços) Concentração 1x 110x GeneEx Buffer 2x 6 µl 660 µl Primer for + 10 µm 1 µl 110 µl rev Probe 10 µm 0,5 µl 55 µl Aqua MiliQ - 0,5 µl 55 µl Subtotal 8 µl 1100 µl DNA /plasmidos 4 µl TOTAL 12 µl Mastermix P. vivax (para 96 poços) Concentração 1x 110x GeneEx Buffer 2x 6 µl 660 µl Primer for + 10 µm 0,72 µl 79,2 µl rev Probe 10 µm 0,5 µl 55 µl Aqua MiliQ - 0,78 µl 85,8 µl subtotal 8 µl 1100 µl DNA /plasmidos 4 µl TOTAL 12 µl

94 Mastermix P. falciparum (para 96 poços) Concentração 1x 110x Universal Master 2x 6 µl 660 µl Mix Primer for + rev 10 µm 0,72 µl 79,2 µl Probe 10 µm 0,3 µl 33 µl Aqua MiliQ - 0,98 µl 107,8 µl subtotal 8 µl 1100 µl DNA /plasmidos 4 µl TOTAL 12 µl Condições de amplificação Etapa Temp. Tempo (min) Modo de corrida: Standard 7500 Ciclos 1 50 C 2: C 10: C 0:15 58 C 1:00 45 O mastermix é preparado e distribuído na placa na área apropriada (template-free). Antes de abrir algum tubo, deve-se vortexar e centrifugar. Pipetar na placa o DNA genômico e o DNA do plasmídeo em área apropriada (sala de PCR em Tempo Real). Depois de adicionar todos os reagentes, vedar a placa, centrifugar e limpar a placa e o adesivo óptico com cuidado. Não usar luvas com talco! Em cada placa, são pipetados três controles negativos (mastermix com mqh 2 O em lugar de DNA) e três vezes cada diluição de plasmídeos padrão A B C D E F G H N N N N Amostras Controle plasmidial Controle negativo As análises são realizadas pelo software distribuído pelo fabricante pplied Biosystems 7500 Fast System SDS Software (ver Manual 7500 Fast Real-Time (TransEPI) ). Os valores de CT dos plasmídeos padrão são usados para construir uma curva padrão com que podem ser determinados os números de cópias dos genes para cada amostra. Para validar a sensibilidade de detecção dos genes 18S rrna (gênero específicos e espécie-específicos) com plasmídeo padrão, um qpcr é realizado para cada par de iniciadores. As diluições dos plasmídeos são: 10-2, 10-1, 0,5x10-1, 100, 0,5x10 1, 10 1, 10 2, 10 3,10 4, 10 5, 10 6 e 10 7 cópias/µl são usadas como template. As diluições copias/µl são testadas em triplicatas, e diluições de copias/µl são testadas em quintuplicatas. A última diluição com três reações positivas é considerado como limite de detecção. 6.3 Restrições e limitações do procedimento Como se faz a amplificação de DNA, a técnica não permite distinguir as diferentes formas biológicas do parasito (trofozoíto, esquizonte, merozoíto ou gametócito). Existe a possibilidade de contaminação da reação no momento da extração do DNA e no momento do preparo da reação do PCR, devido à sensibilidade de amplificação da técnica.

95 6.4 Biossegurança e descarte de resíduos Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (3). Os resíduos serão descartados de acordo com as normas da Gerência de Malária: ponteiras usadas para pipetar DNA ou plasmídeos, alíquotas de plasmídeos e placas contendo plasmídeos devem ser descartadas em recipiente plástico e posteriormente autoclavadas; restos de reagentes e ponteiras usadas para reagentes são desprezadas em Descartech da área apropriada. 6.5 Registro de dados cru e analise de dados O arquivo gerado pelo sistema de PCR em tempo real e o arquivo de Excel exportado deste arquivo são salvos com data do experimento e com referencia às amostras usadas. O resultado da PCR será preenchido pelo responsável do procedimento em uma planilha específica, num arquivo separado. 7 REFERÊNCIAS 1. De Monbrison F, Angei C, Staal A, Kaiser K, Picot S. Simultaneous identification of the four human Plasmodium species and quantification of Plasmodium DNA load in human blood by real-time polymerase chain reaction. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg (2003) 97: Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; Rosanas-Urgell A, Mueller D, Betuela I, Barnadas C, Iga J, Zimmerman PA, del Portillo HA, Siba P, Mueller I, Felger I. Comparison of diagnostic methods for the detection and quantification of the four sympatric Plasmodium species in field samples from Papua New Guinea. Malar J. (2010) 9: REGISTRO DOS ANEXOS TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma): NOME DO ANEXO: CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) Novo Justificativa Criado por: Revisão Tradução Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura A versão atual deste POP foi traduzida a e a versão traduzida entra em efeito em / /. dd mm aa Assinatura do responsável:

96 POP_MAL_LB_019_v01D_PT Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária Código POP POP_MAL_LB_019_v01D_PT Título Idioma da versão original Elaborado por: Andrea Kühn; Anne Cristine Gomes de Almeida. Procedimento para Extração de RNA em placa utilizando kit RNeasy Plus 96, da QIAGEN. PORTUGUÊS Revisado por: Andrea Kühn Aprovado por: Mônica Costa Data de aplicação: 01/01/2013 Data da próxima revisão: Período de execução deste procedimento: ~ 6hs Data & assinatura Data & assinatura Data & assinatura Emenda Razão da emenda 1. OBJETIVOS Descrever o procedimento extração de RNA em placa, utilizando kit RNeasy Plus 96, da QIAGEN. 2. DEFINIÇÕES Não se aplica. 3. APLICÁVEL A Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa. 4. RESPONSABILIDADES Equipe do laboratório de biologia molecular envolvida na realização de procedimento de Extração de RNA. 5. POP'S RELACIONADOS Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho e Ipiranga, Manaus/AM (versão atual do POP_MAL_TC_004). Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de RNA de pfs25 e pvs25 de plasmódio (RT-qPCR) (versão atual do POP_MAL_LB_020).

97 6. PROCEDIMENTOS 6.1 Recursos necessários Materiais RNeasy Plus96 Kit (74192, QIAGEN) RNase-Free DNase Set (79254, QIAGEN) Tampao RDD adicional (além do Tampao fornecido com DNase Set) AirPore Tape Sheet adicional (além da folha adesiva fornecido com o RNeasy Plus96 Kit) Bandeja com Microtubos em cadeia (19560, QIAGEN) Tampas para microtubos (19566, QIAGEN) dispensador com combitips de 0,5 ml e 25 ml (Eppendorf) pipeta multicanal, distancia das canais ajustável, µl (Modelo: Rainin LA6-1200XLS, Marca: Mettler Toledo) pipeta multicanal, µl Bandejas para tubos Eppendorf Etanol 70% preparado com DEPC-H 2 O Seringa de 1 ml com agulha Tubo falcon de 15ml Ponteiras com filtro de 100 ou 200 µl e de 1000 µl RNase Away ( , Ambion) 14.3 M 2-mercaptoetanol gelo jaleco descartável, touca, mascara Reservatórios de reagentes Placa 96-Well PCR com tampas em tiras Equipamentos Centrífuga com capacidade mínima de 5000 x g (SIGMA 4-16KS) Agitador 6.2 Extração de RNA em placa Procedimentos iniciais limpar bancada e pipetas com RNase Away, em seguida com água destilada usar touca e jaleco descartável, trabalhando com duas pessoas: mascara preparar DNase (ver 6.2.3) adicionar etanol ao tampão RPE antes do primeiro uso adicionar 50 µl de 2-mercaptoetanol a 50 ml de tampão RLT (mistura pode ser guardado em temperatura ambiente por 1 mês) Extração do RNA Passo 1 - Dar "spin" nos tubos antes de iniciar o procedimento; - Transferir 300 μl amostra de sangue guardado em RNAprotect para o rack com os microtubos (QIAGEN), utilizando pipeta multicanal ajustavel; - Vedar os tubos com as tampas para microtubos; - Centrifugar a 6000 rpm (~5600 x g) por 10 min; - Remover completamente o sobrenadante por pipetagem (ou 250 μl, caso o pellet não esteja visivel); - Adicionar 300 μl Buffer RLT Plus em cada tubo com a pipeta multicanal; - Vedar os tubos com as tampas para microtubos; - Homogeneizar os lisados a 1000 rpm, durante 1 minuto, em um agitador;

98 Passo 2 - colocar a placa de eliminação de gdna de 96 poços em um novo S-Block; - marcar a placa para posterior identificação; - transferir os lisados da etapa 1 para os poços da placa de eliminação de gdna de 96, utilizando uma pipeta multicanal com ponteira com filtro; - selar a placa de eliminação de gdna de 96 poços com uma folha de fita AirPore - centrifugar a S-Block e a placa de gdna de 96 poços a 6000 rpm (~5600 x g) por 4 min at C ( - descartar a placa de gdna e guardar o filtrado S- Block Flow through # Passo 3 - Colocar uma placa RNeasy 96 em cima de um S-Block (nova ou reutilizada); - Marcar a placa para posterior identificação. S- Block RNeasy 96 plate + Passo 4 - adicionar 1 volume = 300 μl de 70% etanol em cada poço da S-Block contendo filtrado do passo 2, utilizando uma pipeta multicanal e ponteiras com filtro; - misturar bem por pipetagem 3 vezes ou mais vezes; - transferir 600 µl das amostras para a placa RNeasy 96; - selar a placa RNeasy com fita adesiva de AirPore; - centrifugar a S-Block e a placa RNeasy 96 a 6000 rpm (~5600 x g) por 4 min a C Passo 5 - Digestão em coluna do DNA e primeira lavagem: - esvaziar o S-Block e retire a fita AirPore; - adicionar 350 μl tampão RW1 em cada poço da placa RNeasy (pipeta multicanal) e selar a placa com uma nova fita AirPore; - preparar mix incubação RNase-Free DNAse (ver 6.1.4); - centrifugar a 6000 rpm (~5600 x g) por 4 min a C; - remover a fita AirPore, esvaziar o S-Block e reutilizá-lo; - pipetar 80 μl do mix incubação RNase-Free DNAse diretamente sobre a membrana em cada poço da placa Rneasy (dispensador); - selar a placa com uma nova fita AirPore; waste - incubar a temperatura ambiente por 15 minutos; - remover a fita AirPore; - adicionar 350 μl tampão RW1 em cada poço; - selar a placa com uma fita nova AirPore; - incubar a temperatura ambiente por 5 minutos; - centrifugar a 6000 rpm (~5600 x g) por 4 min a C waste

99 Passo 6 - esvaziar o S-Block e remover a fita AirPore; - adicionar 800 μl tampão RPE em cada poço da placa RNeasy 96 com a pipeta multicanal; e selar a placa com uma nova fita AirPore; - centrifugar a 6000 rpm (~5600 x g) por 4 min a C - esvaziar o S-Block e remover a fita AirPore; - adicionar 800 μl tampão RPE em cada poço da placa RNeasy 96 plate com a pipeta multicanal; e selar a placa com nova fita AirPore; - centrifugar a 6000 rpm (~5600 x g) por 4 min a C; - esvaziar o S-Block e remover a fita AirPore; - centrifugar a 6000 rpm (~5600 x g) por 3 min a C; para secar as membranas. Passo 7 - colocar a placa RNeasy 96 em cima de um rack de microtubos de eluição e marcar a placa para posterior identificação: Coorte_RNA_numero da placa_ data (= placa ) - adicionar 50 μl de água RNase-free em cada poço; - selar a placa com uma fita nova de AirPore; - incubar por 1 min a temperatura ambiente (15 25 C); - centrifugar a 6000 rpm (~5600 x g) por 4 min a C para eluir o RNA. On-column DNA digestion Add μl RNase-free water Elution Microtubes CL in rack Passo8 - marcar a placa B (placa de P R de 96 poços (Coorte_RNA_numero da placa_ data) transferir 25 μl de RN purificado na placa B, selar com tampas em tira e armazenar a -20 C; - selar os microtubos de eluição com tampas e estocar a -80 C para back up. RNAextr_# RNAextr_# Preparação do mix de incubação RNase-Free DNAse 1) DNase Adicionar 833 µl de água livre de RNase (fornecido pelo kit) ao frasco de DNase, utilizando agulha e seringa; inverter o frasco para dissolver a DNase; Manter em gelo até o uso; ou alíquotar e congelar, se não for usar no mesmo dia. 2) Mix de incubação DNase Preparar imediatamente antes do uso Pipetar 1,05 ml de DNase e transferir para um Falcon de 15ml, contendo 7,35 ml de tampão RDD; Manter em gelo até o uso. Adicionar 80 μl do Mix DNase RDD a cada poço, durante o passo 5 da extração de RNA Limpeza de S-blocks e reservatórios de reagentes Novos S-Blocks devem ser utilizados para recolher o fluxo através da placa gdna eliminator (o filtrado contém o RNA). Após o uso, os S-Blocks podem ser limpos e reutilizados para a coleta do filtrado das placas RNeasy. Lavar os S-blocks com água corrente da torneira; Incubar, durante 2 horas ou durante a noite em NaOH 0,1 M, EDTA 1 mm Lavar com água destilada;

100 Secar a 50 C. Nota: S-Blocks usados contêm quantidades residuais de tampão RLT Plus ou tampão e RW1 e não devem ser limpos com água sanitária. 6.3 Biossegurança e descarte de resíduos Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (1). Os resíduos serão descartados de acordo com as normas da Gerência de Malária. 7. REFERÊNCIAS 1. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia. Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde; RNeasy Plus96 Handbook, QIAGEN. 3. Protocol RNase-Free DNase for optional DNase treatment on RNeasy 96 plates2, QIAGEN 8. registro dos anexos TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma): NOME DO ANEXO: CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) Novo Revisão Tradução Criado por: Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura A versão atual deste POP foi traduzida a e a versão traduzida entra em efeito em / /. Assinatura do responsável:

101 POP_MAL_LB_020_v01D_PT Procedimento Operacional Padrão Gerência de Malária Código POP POP_MAL_LB_020_v01D_PT Título Idioma da versão original Elaborado por: Gisely Cardoso de Melo; Anne Cristine Gomes de Almeida; Andrea Kühn Data & assinatura Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de RNA de pfs25 e pvs25 de plasmódio (RT-qPCR). PORTUGUÊS Revisado por: Andrea Kühn Data & assinatura Aprovado por: Mônica Costa Data & assinatura Data de aplicação: 01/01/2013 Data da próxima revisão: Período de execução deste procedimento: 1h - preparo da reação; ~2hs - tempo de corrida em sistema 7500 Fast Emenda Razão da emenda 1. OBJETIVOS Descrever o procedimento de realização de PCR em tempo real para detecção de gametocitos de Plasmodium vivax e Plasmodium falciparum pelos mrnas de pvs25 e pfs25 respectivamente (RT-qPCR, reverse transcriptase PCR quantitativo). 2. DEFINIÇÕES PCR: a reação em cadeia da polimerase é definida como uma técnica molecular que permite a amplificação de pequenas quantidades de um DNA específico a partir de um molde do DNA, usando uma reação enzimática simples, sem um organismo vivo. O limiar de detecção da técnica é muito superior ao da gota espessa (técnica padrão utilizada no diagnóstico rotineiro da malária). PCR Tempo Real (PCR TR): Variação da técnica de PCR para detecção de sinal fluorescente permitindo a quantificação de ácidos nucléicos em tempo real, assim como a detecção qualitativa de seqüências de ácidos nucléicos utilizando análises de curvas de dissociação ou por meio de sondas marcadas. Não requer tratamento pós-pcr para visualização do resultado. Iniciador (primer): uma pequena seqüência de DNA ou RNA a partir da qual pode começar a replicação do DNA. 3. APLICÁVEL A Análise no laboratório de biologia molecular de amostras relacionadas à pesquisa clínica; Todos os laboratórios e os grupos de pesquisa que constituem REDIMA (Rede Amazônica da Dinâmica de Infecção Experimental com Malária) 4. RESPONSABILIDADES Equipe do laboratório de biologia molecular envolvida na realização da PCR em tempo real.

102 5. POP'S RELACIONADOS Procedimento para o Seguimento dos participantes no estudo Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné, nas comunidades do Brasileirinho e Ipiranga, Manaus/AM (versão atual do POP_MAL_TC_005). Procedimento para realização de PCR em tempo real para detecção de DNA de plasmódio (qpcr) (versão atual do POP_MAL_LB_021) Procedimento para Extração de RNA em placa utilizando kit RNeasy Plus 96, da Qiagen (versão atual do POP_MAL_LB_019) Procedimento para extração de RNA utilizando Trizol (versão atual do POP_MAL_LB_009). 6. PROCEDIMENTOS 6.1 Recursos necessários Amostra: RNA, obtido por extração (conforme POP_MAL_LB_019, POP_MAL_LB_009 ou outro método de extração), a partir de sangue total Materiais 9. Pipetas automáticas de 10 µl, 100 µl e 1000 µl 10. Ponteiras com filtro para pipetas automáticas 11. Pipeta multicanal 0,5 10 µl 12. Multipipetador 13. Ponteiras para multipipetador (0,5 ml) 14. Tubos de 1,5 ml 15. Microplacas de 0,1mL, com 96 poços, para sistema de PCR em Tempo Real 16. Adesivo óptico para vedar as microplacas Equipamentos 4. Vortex 5. Microcentrífuga 6. Sistema de PCR em Tempo Real 7500 Fast Applied Biosystems Reagentes Reagente Fabricante n referência Armazenamento TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit: TaqMan RT-PCR Mix (2x) TaqMan RT Enzyme Mix (40x) Applied Biosystems Envio do kit: -20 C, Apos chegada: 2-8 C -20 C Sondas (Taqman Probe) IDT - alíquota usada: 2-8 C, estoque : - 20 C Iniciadores (primers) da reação IDT Integrated DNA Technologies - alíquota usada: 2-8 C, estoques (100 µm): -20 C Água MiliQ - - Temperatura ambiente Tampão TE (diluição de iniciadores) Tween 20 (diluição de iniciadores) Iniciadores (5 3 ): Pfs25-for: GAA ATC CCG TTT CAT ACG CTT G Pfs25-rev: AGT TTT AAC AGG ATT GCT TGT ATC TAA Pvs25-for: ACA CTT GTG TGC TTG ATG TAT GTC Pvs25-rev: ACT TTG CCA ATA GCA CAT GAG CAA Ambion AM9849 Temperatura ambiente Sigma-Aldrich P1379 Temperatura ambiente

103 Sondas (5 3 ): Pfs25-probe: HEX TGT AAG AAT GTA ACT TGT GGT AAC GGT- BHQ1 Pvs25-probe: 6FAM TGC ATT GTT GAG TAC CTC TCG GAA- BHQ1 As diluições de iniciadores são preparadas com tampão TE (comprado); após a adição do TE, deixar incubar a solução por 5 min, em seguida vortexar e centrifugar. Preparar alíquotas com volume e concentração menor, suficiente para uma placa (utilizando água de injeção). Plasmídeos: Os plasmídeos contêm o fragmento do gene que será amplificado. Três diluições são usadas: 10 2, 10 4 e 10 6 cópias/ µl. As diluições de plasmídeos são preparadas com tampão TE mais Tween (concentração final de Tween 0,01%) com um volume final de plasmídeo é de 1 ml. A partir destes diluções, devem ser preparadas alíquotas menores para uso (armazenadas a 2-8 C) e para estoque (armazenadas a -20 C). 6.2 Reação da transcriptase reversa e PCR em Tempo Real (RT-qPCR) Para a detecção dos gametócitos de P. falciparum e P. vivax, foi padronizada uma reação de PCR em Tempo Real amplificando o transcrito dos genes pfs25 ou pvs25 (1, 2). O dois passos necessários para a RT-qPCR são realizados em paralelo em 1 tubo/poço, sendo o primeiro passo a síntese de cdna e o segundo, a amplificação em tempo real. Os Plasmídeos servem como controle positivo e como padrão para quantificação de DNA das amostras. Usando os plasmídeos é possível comparar a quantidade de DNA das amostras de várias placas Reação de PCR em Tempo Real (RT-qPCR) Mastermix (para 96 poços) Concentr. 1x 110x TaqMan RT-PCR Mix 2x 6 µl 660 µl Primer for + rev 10 µm 1 µl 110 µl Probe 10 µm 0,5 µl 55 µl RT Enzyme Mix 40x 0,3 l 33 µl Aqua MiliQ - 0,2 µl 22 µl Subtotal 8 µl 880 µl Condições de amplificação Passo Temp. Tempo (min) Ciclos 1 48 C 15: C 10: C 0:15 58 C 1:00 45 Modo de corrida: Standard 7500 DNA /plasmídeos 4 µl TOTAL 12 µl Todo o procedimento deve ser feito em gelo! O mastermix é preparado e distribuído na placa na área apropriada (template-free). Antes de abrir algum tubo, deve-se vortexar (exceto a enzima) e centrifugar. Pipetar na placa o DNA genômico e o DNA do plasmídeo em área apropriada (sala de PCR em Tempo Real). Depois de adicionar todos os reagentes, vedar a placa, centrifugar e limpar a placa e o adesivo óptico com cuidado. Não usar luvas com talco! Em cada placa, são pipetados três controles negativos (mastermix com mqh 2 O em lugar de DNA) e três vezes cada diluição de plasmídeos padrão. A B C D E

104 F G H N N N N Amostras Plasmídeo padrão Controle negativo As análises são realizadas pelo software distribuído pelo fabricante pplied Biosystems 7500 Fast System SDS Software (ver Manual 7500 Fast Real-Time (TransEPI) ). Os valores de CT dos plasmídeos padrão são usados para construir uma curva padrão com que podem ser determinados os números de cópias de transcritos para cada amostra. Para validar a sensibilidade de detecção de pfs25 e pvs25 com plasmídeo padrão, um RT-qPCR é realizado para cada par de iniciadores. As diluições dos plasmídeos são: 10-2, 10-1, 0,5x10-1, 100, 0,5x10 1, 10 1, 10 2, 10 3,10 4, 10 5, 10 6 e 10 7 cópias/µl são usadas como template. As diluições copias/µl são testadas em triplicatas, e diluições de copias/µl são testadas em quintuplicatas. A última diluição com três reações positivas é considerada como limite de detecção. Todas as amostras de RNA são também examinadas com qpcr, usando iniciadores específicos para o gênero de Plasmodium ssp., conforme versão atual do POP_MAL_LB_021, para verificar a presença de DNA gênomico. Amostras que contêm DNA genômico serão tratadas com DNase uma segunda vez. 6.3 Biossegurança e descarte de resíduos Todo o procedimento deve se realizar sob condições de biossegurança (3). Os resíduos serão descartados de acordo com as normas da Gerência de Malária: ponteiras usadas para pipetar DNA ou plasmídeos, alíquotas de plasmídeos e placas contendo plasmídeos devem ser descartadas em recipiente plástico e posteriormente autoclavadas; restos de reagentes e ponteiras usadas para reagentes são desprezadas em Descartech da área apropriada. 6.4 Registro de dados cru e analise de dados O arquivo gerado pelo sistema de PCR em tempo real e o arquivo de Excel exportado deste arquivo são salvos com data do experimento e com referencia às amostras usadas. O resultado da PCR será preenchido pelo responsável do procedimento em uma planilha específica, num arquivo separado. 7. REFERÊNCIAS 4. Wampfler R, Mwingira F, Javati S, Robinson L, Betuela I, Siba P, Beck HP, Mueller I, Felger I. (2013) Strategies for detection of Plasmodium species gametocytes. PLoS One Sep 27;8(9):e Protocolo de deteção de pfs25 e pvs25 (laboratorio Ingrid Felger, Basel) 6. Richmond JY, Mckinney RW. Biossegurança em laboratórios biomédicos e de microbiologia. (2001) Brasília: Ministério da Saúde: Fundação Nacional de Saúde. 8. REGISTRO DOS ANEXOS TÍTULO DO ANEXO CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma): NOME DO ANEXO: CÓDIGO DO ANEXO (Incluindo versão/idioma) Novo Revisão Tradução Criado por: Data e assinatura Aprovado por: Data e assinatura

105 A versão atual deste POP foi traduzida a e a versão traduzida entra em efeito em / /. dd mm aa Assinatura do responsável:

106 Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) está estudando a malária em algumas pessoas que moram nas Comunidade do Brasileirinho e Ipiranga, em Manaus. Os pesquisadores querem entender melhor como o parasita da malária é transmitido das pessoas para os mosquitos. Quando um mosquito pica uma pessoa com malária os parasitas que estão no sangue desta pessoa passam para o mosquito, e dessa forma o mosquito se torna capaz de passar a malária para outras pessoas, espalhando a doença. Para nos ajudar a entender melhor esse processo, precisamos estudar mais ou menos 2000 pessoas, de todas as idades. Por isso, pedimos que você participe deste estudo. Este é um estudo sobre transmissão da malária em toda a população das Comunidade do Brasileirinho e Ipiranga, que deve durar por volta de 2 (dois) anos. Você não vai precisar fazer nada de especial para participar do projeto. Você vai fazer os exames e vai receber o tratamento gratuito de malária se tiver a doença. Um grupo de pessoas treinadas pela equipe de pesquisadores permanecerá na área do estudo a fim de realizar o diagnóstico de malária de maneira mais rápida. Se você aceitar participar do estudo, será colhida uma amostra de sangue do dedo para realizar uma lâmina para o diagnóstico de malária, para a realização de testes mais específicos e para saber a quantidade de parasitas no sangue, tanto de pessoas com sintomas quanto de pessoas sem sintomas da malária. Portanto, nós queremos sua permissão para testar seu sangue para malária. Para coletar a amostra de sangue do dedo, você poderá sentir um pouco de dor, mas que deve parar dentro de alguns minutos. Se a limpeza do dedo não for correta, pode haver uma infecção, mas isto é muito raro e se acontecer será acompanhada por nossa equipe de trabalho. Não há outro risco em participar desse estudo. Se ocorrer qualquer dano ou prejuízo à sua saúde em decorrência deste projeto, você terá direito à indenização. O principal benefício em participar desse estudo é o recebimento de mais informações sobre a transmissão da malária, para melhorar o seu diagnóstico e tratamento, além de buscar novas formas para o controle dessa doença. Com o diagnóstico e melhor entendimento de como a doença é transmitida, é possível que haja uma diminuição do número de casos de malária na sua comunidade. Entretanto, você não receberá nenhum incentivo financeiro. Se tiver algum prejuízo em participar desta pesquisa, converse com um de nossos pesquisadores para que ele possa lhe ajudar. Se você concordar em participar, todas as informações coletadas serão confidenciais. Todo o material será guardado com um número-código, sem colocar seu nome. Seu nome nunca será usado em público. Se em qualquer momento você quiser se retirar do estudo, você poderá fazer isso, e mesmo assim terá direito ao diagnóstico e ao tratamento da malária, por nossa equipe.

107 Contatos Se você tiver alguma pergunta ou dúvida sobre esse estudo, procure um de nossos pesquisadores no Careiro para que eles possam tirar sua dúvida. Você poderá também fazer contato com o Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda, responsável pelo projeto, na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, em Manaus (Av. Pedro Teixeira, 25) ou pelo telefone (92) O Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado também poderá prestar esclarecimentos ou receber qualquer reclamação a respeito desta pesquisa, em Manaus (Av. Pedro Teixeira, 25) ou pelo telefone (92) Você ficará com este termo de consentimento assinado e outra cópia será arquivada pelos pesquisadores. Eu,..., entendi tudo sobre o estudo de Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné e autorizo a minha participação no estudo. Nome do menor (se o consentimento for para um menor)... Assinatura do voluntário (ou responsável)... Data:.. /.. /.. Endereço: Telefone: (...) Polegar direito Assinatura do pesquisador que conversou com o voluntário. Data:.. /.. /...

108 Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné TERMO DE ASSENTIMENTO Você está sendo convidado(a) como voluntário(a) a participar da pesquisa Epidemiologia comparativa da transmissão de Plasmodium falciparum e P. vivax no Brasil, Tailândia e Papua Nova Guiné. Neste estudo queremos entender melhor como o parasita da malária é transmitido das pessoas para os mosquitos. Quando um mosquito pica uma pessoa com malária os parasitas que estão no sangue desta pessoa passam para o mosquito, e dessa forma o mosquito se torna capaz de passar a malária para outras pessoas, espalhando a doença. Para nos ajudar a entender melhor esse processo, precisamos estudar cerca de 2000 pessoas com malária de todas as idades. Por isso pedimos que você participe deste estudo. Picada do mosquito Mosquito da malária Ser humano Parasita no sangue Pessoa com Malária Pessoa saudável Se você aceitar participar do estudo, será colhida uma amostra de sangue do dedo tanto de pessoas com sintomas quanto de pessoas sem sintomas da malária. Você não vai precisar fazer nada de especial para participar do projeto. Você vai fazer os exames e vai receber o tratamento gratuito de malária se tiver a doença seguindo o protocolo do Ministério da Saúde, aqui na própria comunidade onde você vive. Dessa forma, se você apresentar sintomas será encaminhado ao Posto de Malária da comunidade. No Posto, será realizado o exame e você receberá o medicamento, como já é feito na rotina. Para coletar a amostra de sangue do dedo você poderá sentir um pouco de dor, mas que deve parar dentro de alguns minutos. Se a limpeza do dedo não for correta, pode haver uma infecção, mas isto é muito raro e se acontecer será acompanhada por nossa equipe de trabalho. volume de sangue coletado é pequeno e não representa risco para a sa de, mesmo das crianças. Coleta de sangue

109 p s a agulha ser retirada, o sangramento será contido com algodão e band-aid. e a agulha atravessar o vaso, há um risco de sangramento local que pode resultar numa pequena mancha ro a. Entre em contato com os responsáveis do estudo em caso de in ecção no dedo onde oi eita a coleta de sangue. Nestes casos, se necessário, você receberá tratamento. A coleta de sangue será feita por pessoa com treinamento e experiência, inclusive com crianças, para diminuir qualquer desconforto. participação neste estudo não levará a riscos uturos para a saúde. Apesar disso, você tem o direito a ressarcimento ou indenização no caso de quaisquer danos produzidos pela pesquisa. Se você concordar, o restante desse material que não foi utilizado nos exames será armazenado na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, na Gerência de Malária, num freezer a -80 o C, para estudos futuros sobre a malária. As amostras permanecerão armazenadas por 5 anos. Depois desse período, as amostras não poderão mais ser utilizadas e serão descartadas. Lembramos que estas amostras armazenadas só serão utilizadas no futuro se você concordar e caso o projeto seja aprovado pelo Comitê de Ética. Tubo com sangue H. Tropical Freezer -80 o C Portanto, nós queremos sua permissão para testar seu sangue para malária e guardar o sangue que sobrar para poder fazer algum outro estudo no futuro, relacionado à malária. O material deverá ficar guardado sem nenhuma identificação pessoal na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (Hospital Tropical), em Manaus, sob a responsabilidade do Dr. Marcus Vinicius Guimarães de Lacerda. Todo o material será guardado com um código, sem colocar seu nome. Seu nome nunca será usado em público. Se em qualquer momento você quiser sua amostra seja retirada do nosso repositório, seu pedido será atendido. O principal benefício em participar desse estudo é o recebimento de mais informações sobre a transmissão da malária, para melhorar o seu diagnóstico e tratamento, além de buscar novas formas para o controle dessa doença. Com o diagnóstico e melhor entendimento de como a doença é transmitida, é possível que haja uma diminuição do número de casos de malária em nossa região. Entretanto, você não receberá nenhum incentivo financeiro. Se tiver algum prejuízo em participar desta pesquisa, converse com um de nossos pesquisadores para que ele possa lhe ajudar. Se em qualquer momento você quiser se retirar do estudo, você poderá fazer isso, e mesmo assim terá direito ao diagnóstico e ao tratamento da malária. Participando do estudo você e seus pais ou responsáveis não precisarão gastar nada com transporte e alimentação, pois todos os procedimentos do estudo, como a aplicação dos questionários e coleta das amostras biológicas, serão feitas na sua casa, em visitas realizadas pela equipe de pesquisa.

110 Atividades a serem realizadas na visita: Aplicação de Termo de Consentimento e Questionário Coleta de Sangue Contribuição para o estudo Para participar deste estudo, o responsável por você deverá autorizar e assinar um termo de consentimento. Você não terá nenhum custo, nem receberá qualquer vantagem financeira. Você será esclarecido(a) em qualquer aspecto que desejar e estará livre para participar ou recusar-se. O responsável por você poderá retirar o consentimento ou interromper a sua participação a qualquer momento. A sua participação é voluntária e a recusa em participar não acarretará qualquer penalidade ou modificação na forma em que é atendido(a) pelo pesquisador que irá tratar a sua identidade com padrões profissionais de sigilo. Você não será identificado em nenhuma publicação. Os resultados estarão à sua disposição quando finalizada. Seu nome ou o material que indique sua participação não será liberado sem a permissão do responsável por você. Este termo de assentimento encontra-se impresso em duas vias, sendo que uma cópia será arquivada pelo pesquisador responsável, e a outra será fornecida a você. Eu,, portador(a) do documento de Identidade (se já tiver documento), fui informado(a) dos objetivos do presente estudo de maneira clara e detalhada e esclareci minhas dúvidas. Sei que a qualquer momento poderei solicitar novas informações, e o meu responsável poderá modificar a decisão de participar se assim o desejar. Tendo o consentimento do meu responsável já assinado, declaro que concordo em participar desse estudo. Recebi uma cópia deste termo assentimento e me foi dada a oportunidade de ler e esclarecer as minhas dúvidas. Nome do menor (se o consentimento for para um menor)... Assinatura do voluntário (ou responsável)... Data:.. /.. /.. Endereço: Telefone: (...)