Biofísica. Métodos Experimentais em Biofísica - Espectrometria de Massas - Cristalografia de Proteínas. Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

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1 2015 Dr. Walter F. de Azevedo Jr. Biofísica Métodos Experimentais em Biofísica - Espectrometria de Massas - Cristalografia de Proteínas Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr. 1

2 Espectrometria de Massas (Fundamentos) Se um objeto está movimentando-se numa dada trajetória, e submetemos esse objeto a uma força lateral (F), teremos uma mudança na sua trajetória. Consideremos o lançamento de uma bola de basquete, imagine que estamos com uma mangueira d água, e direcionamos um jato d água para a bola. Sua trajetória será alterada, devido à força transversal F exercida sobre a bola. Consideremos uma outra situação, uma bola de tênis, com a mesma velocidade (v) da bola de basquete. Se dirigirmos o mesmo jato d água para a bola de tênis, teremos um desvio da trajetória maior ainda. Estamos considerando que ambas as bolas estão com a mesma velocidade (v) e o jato d água exerce a mesma força F. R F v 2

3 Espectrometria de Massas (Fundamentos) O que podemos tirar qualitativamente desse experimento? O desvio da trajetória pode ser expresso pelo raio da curva (R) que a bola descreve ao ser submetida a uma força transversal (F). Assim, um desvio grande equivale a dizer que a bola descreve uma curva com raio menor. Olhando-se a física do sistema, temos uma bola submetida a uma aceleração centrípeta, que a coloca em uma trajetória circular, pelo menos enquanto submetida à força exercida pela água da mangueira. R bola de basquete R bola de tênis F v v F 4

4 Espectrometria de Massas (Fundamentos) A força é que leva à aceleração centrípeta, causando a trajetória circular de raio (R). A força centrípeta (F) é dada pela equação abaixo: F mv R onde R é o raio da circunferência, m a massa da bola e v a velocidade da bola. Isolando-se o raio da circunferência (R) da equação acima temos: R mv F A partir da equação do raio, vemos que para uma força e velocidade constantes, temos que o raio da circunferência (R) é proporcional à massa da bola (m). 2 2 R bola de basquete R bola de tênis F F v v 5

5 Espectrometria de Massas (Fundamentos) Olhando a equação do raio da trajetória, vemos que o termo entre parênteses é constante, o que varia é a massa da bola e, consequentemente, o raio da circunferência. R bola de basquete v R m 2 v F F A equação acima é uma forma de determinarmos a massa (m) de uma partícula a partir do raio (R) da circunferência descrita pela partícula quando submetida a uma força conhecida, como a exercida por um jato d água. R bola de tênis F v 5

6 Espectrometria de Massas (Fundamentos) Isolando-se a massa (m) da equação anterior temos: R bola de basquete m RF 2 v F v Resumindo, num experimento onde lançamos um partícula com velocidade (v) constante, sabemos a velocidade (V) e a força (F), podemos determinar a massa (m). Este é o princípio para entendermos o funcionamento de espectrômetro de massas. R bola de tênis F v 6

7 Espectrometria de Massas (Fundamentos) Quando temos uma partícula com carga q, se deslocando com velocidade v em uma região, onde temos um campo elétrico E e um campo magnético B, essa partícula fica sujeita a uma força devido aos campos elétrico e magnético, essa força (F) é chamada força de Lorentz e tem a seguinte expressão: F Eq qvb R F v Estamos considerando que o campo magnético (B) é perpendicular à velocidade da partícula, como no desenho ao lado. x B Campo magnético perpendicular ao plano do slide, x indica essa situação 7

8 Espectrometria de Massas (Fundamentos) Considerando-se somente o campo magnético B, a partícula será sujeita a uma força (F), dada pela seguinte equação: F qvb Essa força de aceleração centrípeta submete a partícula a uma aceleração radial (a), fazendo com que uma partícula de massa m e velocidade v descreva uma trajetória circular com raio R, essa força centrípeta tem a seguinte expressão: 2 F mv R Igualando-se as duas equações acima, chegamos a seguinte expressão para a massa (m) de uma partícula, com raio da trajetória (R) num campo magnético constante (B): F mv R 2 qvb m qbr v 8

9 Espectrometria de Massas (Fundamentos) Considerando que temos um campo magnético (B) constante entre os polos norte e sul de um ímã, temos uma força (F) atuando sobre uma partícula com carga positiva e velocidade v, como indicada na figura abaixo. v B F Partícula com carga positiva deslocando-se num campo magnético constante gerado por um ímã. Figura disponível em: < > Acesso em: 19 de outubro de

10 Espectrometria de Massas (Fundamentos) Muito bem, as observações anteriores servem de base para o entendimento de umas das técnicas mais usadas na análise de moléculas biológicas no século XXI, a espectrometria de massas. Esta técnica permite que as massas moleculares de amostras de proteínas, peptídeos e outras moléculas biológicas sejam determinadas com precisão, a partir do desvio que apresentam ao deslocaremse num campo magnético gerado por um eletromagneto. Ao lado temos o diagrama esquemático de um espectrômetro de massas típico. Descreveremos cada componente do equipamento nos próximos slides. Ionização amostra vaporizada Aceleração Deflexão Detecção eletromagneto Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de Para bomba de vácuo amplificador gravador de dados 10

11 Espectrometria de Massas (Ionização) A amostra (átomos ou moléculas) é vaporizada. Essa amostra vaporizada é injetada e submetida ao processo de ionização, que ocorre na câmara de ionização, mostrada abaixo. Nessa câmara temos um feixe de elétrons gerados a partir de um filamento de metal aquecido. Os elétrons são atraídos para uma placa metálica positiva, chamada armadilha de elétrons (electron trap). A amostra vaporizada, ao passar pelo feixe de elétrons, é ionizada, gerando íons positivos, ou seja, temos agora uma amostra formada em parte por partículas com carga +1. A grande maioria dos íons gerados tem carga +1, mas podemos ter íons com carga maior. Esses íons são forçados para direita pelo repelente de íons (ion repeller). A câmara de ionização é mantida num potencial elétrico de Volts, que promove a ejeção de cargas positivas. Armadilha de elétrons Repelente de íons Elétrons Amostra vaporizada Íons positivos Diagrama esquemático da câmara de ionização de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de Filamento de metal aquecido 11

12 Espectrometria de Massas (Aceleração) O feixe com as partículas da amostra sai da câmara de ionização e atravessa três fendas, como indicado na figura abaixo. As fendas aceleradoras de feixes são chamadas de lentes eletrostáticas, pois realizam o foco do feixe de íon. Essas fendas têm como função gerar um feixe de partículas estreito e permitir a aceleração das partículas carregadas da amostra vaporizada. As fendas apresentam potencial elétrico decrescente, da esquerda para direita, sendo que a fenda final apresenta um potencial elétrico de 0 volts. Tal arranjo de fendas possibilita a aceleração do feixe de partículas carregadas. Placa intermediária Placa final a 0 Volts Câmara de ionização a Volts Feixe de íons Diagrama esquemático das fendas aceleradoras de feixe de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de

13 Espectrometria de Massas (Deflexão) Ao chegar ao eletromagneto, o feixe é submetido a uma deflexão que é inversamente proporcional à massa da partícula, ou seja, partículas mais leves sofrem maiores desvios. Outra parâmetro que afeta o desvio é a carga, íons mais positivos são mais defletidos, assim se tivermos, para uma mesma massa, um íon com carga +2, esse sofrerá um desvio maior que uma partícula com mesma massa mas carga +1. Como o desvio do feixe de partículas depende da massa e da carga, é padrão combinarmos essas informações na razão m/z (massa/carga). Por exemplo, se um íon tem uma massa atômica de 12 e uma carga de +1, sua razão m/z é 12. Veja que o z é minúsculo, não confundir com Z maiúsculo, usado para representar o número atômico. Eletromagneto Feixe de íons misturados Feixe de íons C Feixe de íons A Feixe de íons B Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de

14 Espectrometria de Massas (Deflexão) No diagrama esquemático abaixo temos a indicação de três feixes de íons. Se considerarmos que todos os feixes são de partículas com carga +1, temos que o feixe A tem as partículas mais leves, seguido do feixe B, sendo o mais massivo o feixe C. Eletromagneto Feixe de íons misturados Feixe de íons C Feixe de íons A Feixe de íons B Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de

15 Espectrometria de Massas (Detecção) No diagrama visto no slide anterior, temos que só o feixe B chega ao detector de íons, os outros feixes colidem com as paredes do espectrômetro de massas e são removidos pela bomba de vácuo. Um íon do feixe B, ao chegar no detector de íons, colide com a placa metálica do detector, essa placa está ligada a um fio. O íon, que colidiu com a placa, captura um elétron da placa, tornando-se neutro (carga elétrica zero). A captura do elétron do metal, deixa uma lacuna de elétron na placa metálica, que é preenchida por um elétron do fio ligado à placa metálica. Essa corrente é detectada e amplificada. Quanto mais íons colidirem com a placa metálica do detector de íons, mais elétrons serão capturados e maior será a corrente gerada. Assim, a corrente gerada é proporcional ao número de íons que atinge o detector. Feixe de íons B Íon positivo Caixa de metal elétrons Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de Para o amplificador 15

16 Espectrometria de Massas (Detecção) Os íons do feixe A podem ser detectados diminuindo-se a intensidade do campo magnético. Já os íons do feixe C, necessitam um aumento na intensidade do campo magnético, para que possam atingir o detector de íons. Feixe de íons B Íon positivo Caixa de metal elétrons Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de Para o amplificador 16

17 Espectrometria de Massas (Detecção) A análise realizada pelo espectrômetro de massas gera um espectro de massas, que é mostrado num gráfico onde temos no eixo vertical a abundância relativa do íon e no eixo x a razão m/z. A abundância relativa é diretamente proporcional à intensidade corrente medida, assim o que temos também é uma representação da intensidade relativa das correntes medidas. Esse gráfico é chamado de espectro de massas da amostra. No caso abaixo temos uma amostra do elemento químico molibdênio. Pelo espectro vemos que o isótopo mais abundante do molibdênio é o de razão m/z igual a 98. abundância relativa Espectro de massas do molibdênio. Imagem disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de

18 Espectrometria de Massas (MALDI) Há diversos refinamentos da técnica de espectrometria de massas, especificamente com foco em cada uma das etapas do processo. Por exemplo, no método MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization), temos uma mistura da amostra a ser analisada com uma substância de baixa massa molecular, se comparada com uma proteína. Essa substância absorbe radiação ultravioleta, pois a maioria do espectrômetros de massa, que usam o método MALDI, apresentam um laser na faixa UV. A mistura amostra+substância é dissolvida em solvente orgânico e levada a uma câmara de vácuo, que leva à solidificação da mistura amostra+substância. Raio laser Íon da amostra Para o analisador de massa Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser analisada é misturada a uma substância que absorve radiação ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: < maldi.html >. Acesso em: 19 de outubro de Matriz ionizada Mistura amostra/matriz 18

19 Espectrometria de Massas (MALDI) A remoção do ar na câmara de vácuo leva à evaporação do solvente orgânico e à cristalização da mistura amostra + substância, formando o que chamamos de matriz. Essa matriz é pulverizada a partir de um feixe de laser de alta intensidade, como ilustrado abaixo. A substância absorve UV ionizando-se e transferindo parte da energia absorvida para a proteína (amostra). A amostra é levada à ionização no processo. Todos os detalhes do processo de ionização da amostra não são totalmente entendidos, mas o resultado líquido é que a amostra é levada à ionização. Raio laser Íon da amostra Para o analisador de massa Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser analisada é misturada a uma substância que absorve radiação ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: < maldi.html >. Acesso em: 19 de outubro de Matriz ionizada Mistura amostra/matriz 19

20 Espectrometria de Massas (MALDI) O diagrama abaixo ilustra os principais passos do método de MALDI aplicado na análise de um peptídeo (amostra). O peptídeo ionizado permite a análise da massa dos seus fragmentos. Espectro de massas do peptídeo Diagrama da técnica MALDI. Figura modificada da original disponível em: Acesso em: 19 de outubro de Bakhtiar R., Tse FLS. Mutagenesis (2000) 15 (5):

21 Espectrometria de Massas (TOF) A sigla TOF representa em inglês time of flight, ou seja, tempo de voo. É um método de espectrometria de massas que não usa o desvio num campo magnético (B) para determina a razão m/z de uma amostra, e sim seu tempo de voo (time of flight). O diagrama abaixo ilustra o princípio. A amostra ionizada é submetida a uma diferença de potencial (V 0 ) que acelera as partículas de massa m, essas partículas entram numa região sem campo elétrico e magnético, chamada de espaço de deriva (drift space). A diferença de potencial (V 0 ) faz com que as partículas com carga q tenham energia potencial U = qv 0, que é convertida em energia cinética (K), como indicado abaixo. 1 2 K U 1 mv 2 qv 0 2 Considerando-se que toda energia potencial U é convertida em energia cinética K, temos: mv 2 m 2 qv0 q V v

22 Espectrometria de Massas (TOF) Pela equação abaixo vemos que a razão m/z, onde z é a carga q, depende somente da velocidade da partícula (v) na região de dereviva (drift space) e do potencial (V 0 ). Considerando-se que a espaço percorrido no voo tem um comprimento x, o tempo de voo (t) da partícula será dado por: t x v onde v 2qV m 0 1/ 2 t m x 2qV 0 1/ 2 Assim, quanto maior a razão m/q da partícula, maior o tempo de voo (t). O uso concomitante dos métodos MALDI e TOF leva a um espectrômetro de massas MALDI-TOF, muito usado para o estudo de amostras biológicas como proteínas, peptídeos e ácido nucleicos. 22

23 Espectrometria de Massas (Espectro de Massas) Na análise dos espectros de massas de peptídeos, terminamos com os valores das massas dos resíduos de aminoácidos, assim, para identificar sobre qual aminoácido o pico no espectro de massa se refere, temos que fazer uso de uma tabela de massas moleculares dos resíduos de aminoácidos, como a indicada ao lado. Lembrem-se que para o C- terminal, temos que somar o peso atômico do oxigênio e do hidrogênio. Amino Acid Short Abbrev. Formula Mon. Mass (Da) Avg. Mass (Da) Alanine A Ala C 3 H 5 NO Cysteine C Cys C 3 H 5 NOS Aspartic acid D Asp C 4 H 5 NO Glutamic acid E Glu C 5 H 7 NO Phenylalanine F Phe C 9 H 9 NO Glycine G Gly C 2 H 3 NO Histidine H His C 6 H 7 N 3 O Isoleucine I Ile C 6 H 11 NO Lysine K Lys C 6 H 12 N 2 O Leucine L Leu C 6 H 11 NO Methionine M Met C 5 H 9 NOS Asparagine N Asn C 4 H 6 N 2 O Pyrrolysine O Pyl C 12 H 21 N 3 O Proline P Pro C 5 H 7 NO Glutamine Q Gln C 5 H 8 N 2 O Arginine R Arg C 6 H 12 N 4 O Serine S Ser C 3 H 5 NO Threonine T Thr C 4 H 7 NO Selenocysteine U Sec C 3 H 5 NOSe Valine V Val C 5 H 9 NO Tryptophan W Trp C 11 H 10 N 2 O Tyrosine Y Tyr C 9 H 9 NO Fonte da tabela em: < >. Acesso em: 19 de outubro de

24 Espectrometria de Massas (Espectro de Massas) Na biologia, o espectrômetro de massas MALDI-TOF pode ser usado para o sequenciamento de peptídeos, ou seja, para a determinação da sua sequência de resíduos de aminoácidos, baseado na massa precisa de cada fragmento identificado no espectro de massas, como indicado na figura abaixo. Na figura abaixo, cada pico representa a massa molecular precisa de um fragmento do peptídeo analisado. Vejamos o processo de determinação da sequência em detalhes. GVLVVAASGNSGASSISYPAR Espectro de massas de um peptídeo com 21 resíduos de aminoácidos. Imagem disponível em: < em: 19 de outubro de Keough T et al. PNAS 1999;96:

25 Espectrometria de Massas (Espectro de Massas) A análise do espectro de massas visa determinar a estrutura primária do peptídeo analisado. O primeiro pico da esquerda para direita representa o C-terminal do peptídeo. O eixo x indica a razão m/z, como estamos considerando que todos os íons têm carga +1, a massa do primeiro pico equivale a uma massa de 175 Da, próxima à massa da arginina presente num C-terminal. Assim, o C-terminal (final do peptídeo) é uma arginina. Para identificar os próximos aminoácidos, seguimos com os picos. No espectro a diferença entre cada pico consecutivo indica a massa do aminoácido. Abaixo, a seta vermelha indica que para o próximo pico temos uma diferença de 71,2 Da, ou seja, uma alanina. GVLVVAASGNSGASSISYPAR Espectro de massas de um peptídeo com 21 resíduos de aminoácidos. Imagem disponível em: < em: 19 de outubro de Keough T et al. PNAS 1999;96:

26 Espectrometria de Massas (Espectro de Massas) O segundo pico indica uma diferença de massas de 97,0 Da, uma prolina. Seguindose o processo identificamos todos os picos e temos a sequência de aminoácidos do peptídeo. Na aplicação do espectrômetro de massas para o sequenciamento de proteínas, temos que a amostra da proteína é submetida à clivagem a partir da ação de proteases, como tripsina. Os fragmentos da proteólise são purificados a partir da técnica de cromatografia líquida e injetados no espectrômetro de massas para sequenciamento. Os trechos dos peptídeos sequenciados são sobrepostos e a sequência completa da proteína é determinada. GVLVVAASGNSGASSISYPAR Espectro de massas de um peptídeo com 21 resíduos de aminoácidos. Imagem disponível em: < em: 19 de outubro de Keough T et al. PNAS 1999;96:

27 Cristalografia de Proteínas Etapas para resolução da estrutura 3D de macromoléculas biológicas por cristalografia 1. Cristalização. Nesta etapa a macromolécula é trazida a um estado de supersaturação que favorece a formação de cristais, como os mostrados acima. Os cristais de moléculas biológicas normalmente apresentam dimensões inferiores a 1 mm de comprimento em cada aresta. 5. Análise. A partir da estrutura resolvida procedemos à análise, onde relaciona-se a estrutura 3D à sua função biológica. 2. Coleta de dados de difração de raios X no LNLS. Os cristais apresentam um arranjo ordenado de moléculas, como uma pilha de tijolos ordenados. Na analogia, cada tijolo representa uma molécula. As distâncias entre os átomos são da ordem de 1 Å (0,1 nm ou m), usando-se raios X (com comprimento de onda da ordem de Å ) teremos difração. 4. Resolução da estrutura. A partir da análise do padrão de difração é possível gerar mapas de densidade eletrônica (à direita). A interpretação de tais mapas gera a estrutura 3D de molécula. 3. Interpretação do padrão de difração de raios X. A figura abaixo é o registro da difração de raios X de um cristal. Os raios X interagem com o cristal, o que produz um padrão de difração. A análise desta informação possibilita a resolução de estrutura 3D. 27

28 2009 Dr. Walter F. de Azevedo Jr Dr. Walter F. de Azevedo Jr. Cristais de Pequenas Moléculas Normalmente os cristais inorgânicos e de pequenas moléculas de uma forma geral são rígidos, transparentes e com arestas bem definidas, como os cristais de ametista e quartzo mostrados abaixo. A rigidez estrutural é reflexo das fortes interações que estabilizam o arranjo cristalino, tais como interações iônicas e ligações covalentes. Geodo de ametistas (MCT-PUCRS) Cristal de Quartzo (MCT-PUCRS) 28

29 2011 Dr. Walter F. de Azevedo Jr Dr. Walter F. de Azevedo Jr. Cristais de Pequenas Moléculas Abaixo temos exemplos de cristais inorgânicos, como os cristais de rubi, não lapidados e lapidados (foto da esquerda) e os cristais de quartzo (foto da direita). Os cristais são da coleção do Natural History Museum, London-UK (2011, 2013). 29

30 Cristais de Macromoléculas Biológicas As cristalizarmos proteínas, peptídeos e ácidos nucleicos esses apresentam-se como cristais relativamente frágeis, transparentes (na maioria) e com arestas bem definidas. Abaixo temos 3 cristais proteínas e peptídeos: enoil-redutase de Mycobacterium tuberculosis (Oliveira et al. 2006), mastoparano isolado de vespa Anterhynchium flavomarginatum micado (Delatorre et al., 2001) e uropesina (Canduri et al., 2001). Oliveira JS, Pereira JH, Canduri F, Rodrigues NC, de Souza ON, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. J. Mol. Biol. 359(3): , Delatorre, P, Olivieri, JR, Ruggiero Neto, J, Lorenzi, CC, Canduri, F, Fadel, V, Konno, K, Palma, MS, Yamane, T, De Azevedo Jr., W F. Biochim. Biophys. Acta. 1545(1-2): , Canduri, F, Teodoro, LG, Fadel, V, Lorenzi, CC, Hial, V, Gomes, RA, Neto, JR, De Azevedo Jr., WF. Acta Crystallogr. Sect. D- 30 Biol. Crystallogr. 57(11): , 2001.

31 Cristais de Macromoléculas Biológicas Cristais de proteína apresentam: 1) Fragilidade mecânica, devido às ligações que estabilizam o cristal. Nos cristais de pequenas moléculas as ligações que estabilizam o empacotamento cristalino normalmente são iônicas e covalentes, nos cristais de macromoléculas biológicas as ligações são normalmente ligações de hidrogênio. 2) Alto conteúdo de solvente. Os cristais de macromoléculas biológicas apresentam alto conteúdo de solvente, se comparados com cristais de pequenas moléculas, tal conteúdo de solvente permite que ligantes possam difundir-se pelo retículo cristalino, permitindo o estudo de complexos entre proteínas e ligantes. Cristal da proteína lisozima, com dimensões aproximadas de 1 mm x 1mm x 1mm. A proteína cristalizada apresenta-se como tijolos empilhados de forma ordenada. Podemos pensar que cada molécula de proteína é um tijolo. A fragilidade mecânica do arranjo deve-se às fracas interações intermoleculares, que estabilizam o cristal de proteína. Tais interações são normalmente ligações de hidrogênio. 31

32 Cristais de Macromoléculas Biológicas Cristais de proteína normalmente apresentam: Canais de solvente 3) Fragilidade a danos causados por radiação. A exposição de cristais de proteínas às radiações ionizantes, como raios X, leva à quebra de ligações e a geração de radicais livres no retículo cristalino, que podem quebrar as frágeis ligações de hidrogênio que estabilizam o cristal. No empacotamento das moléculas cristalizadas temos grandes canais de solventes, como mostrado ao lado. As moléculas de água, quando expostas à radiação ionizante, podem formar radicais livres, que quebram as ligações de hidrogênio envolvidas na manutenção do arranjo cristalino. Canais de solvente 32

33 Rede Cristalina Para estudos de cristalografia, faz-se necessário uma definição de cristal. Para facilitar a visualização, consideremos um cristal bidimensional. Num plano temos um conjunto de pontos (construção matemática), igualmente espaçados, cada ponto apresenta igual vizinhança, de forma que, um observador sobre um ponto qualquer olhando para uma dada direção, não conseguirá diferir ao deslocar-se para outro ponto da rede. Resumindo, os pontos são indistinguíveis, quando consideramos sua vizinhança. Esses pontos formam uma rede. Acoplando-se a cada ponto da rede, uma base de átomos (entidade física), sendo a mesma base de átomos para todos os pontos da rede, teremos uma rede cristalina, ou cristal bidimensional. + = Rede= construção matemática Base de átomos= entidade física Rede + base de átomos = cristal bidimensional 33

34 Retículo Cristalino No caso tridimensional, temos que cada ponto do espaço tem que satisfazer a condição de igual vizinhança em três dimensões. Os pontos têm que apresentar igual espaçamento, formando assim um retículo (construção matemática). Acoplando-se a cada ponto do retículo uma base de átomos (entidade física), temos um retículo cristalino, o cristal tridimensional. A base de átomos pode ser tão simples como átomos isolados ou tão complexas como um capsídeo de um vírus. Retículo= construção matemática Base de átomos= entidade física Retículo + base de átomos = Retículo cristalino 34

35 Retículo Cristalino Na figura ao lado, cada molécula está representada só com os carbonos alfa, com uma linha ligando os átomos. Tal representação simplifica a figura e dá idéia dos elementos de estrutura secundária presentes na proteína. A visão estereográfica permite ver a profundidade de figura. A figura da direita é a visão do olho direito e a da esquerda do olho esquerdo. Olhando para ambas figuras, de forma relaxada, é possível ter noção de tridimensionalidade da figura. Deixe seu nariz no centro da figura e relaxe os olhos, para visualizar em 3D. A caixa que envolve as 4 moléculas é a cela unitária. Canduri, F, Teodoro, LG, Fadel, V, Lorenzi, CC, Hial, V, Gomes, RA, Neto, JR, De Azevedo Jr., WF. Acta Crystallogr. Sect. D- 35 Biol. Crystallogr. 57(11): , 2001.

36 Cela Unitária Podemos pensar o cristal como uma pilha de tijolos ordenados. Cada tijolo encaixado noutro. Desta forma temos uma pilha bem formada e com extremidades retas. O tijolo básico que forma esta pilha é a cela unitária. Num cristal ela contém uma ou mais moléculas. A cela unitária é a menor unidade que apresenta a simetria do cristal. A partir da translação ao longo dos eixos do retículo teremos o cristal. Os eixos da cela unitária recebem o nome de a, b e c, o ângulo entre os eixos a e b é chamado, entre os eixos b e c é e por último entre a e c o ângulo. c b a α ângulo entre b e c β ângulo entre a e c γ ângulo entre a e b 36

37 Cristalização de Macromoléculas Biológicas Para cristalizarmos uma macromolécula biológica é necessário trazê-la a um estado de supersaturação. Consideremos uma proteína dissolvida em um tampão. Para que a proteína seja levada a formar cristais, é necessário que as moléculas da proteína dissolvidas na solução, sejam trazidas a uma situação onde as moléculas estejam próximas umas das outras. Para levar a proteína a tal situação, podemos aumentar sua concentração (eixo vertical), ou aumentar a concentração do sal presente na solução da proteína. O diagrama ao lado ilustra as diferentes regiões de solubilidade da proteína. 37

38 Cristalização de Macromoléculas Biológicas O processo de cristalização da proteína normalmente deve ser lento (muitas horas ou dias), ou seja, considerando-se a proteína inicialmente numa região abaixo da curva de solubilidade, devemos aumentar a concentração salina, ou da proteína, de modo a trazê-la na região de supersaturação, de forma lenta. Na região de supersaturação teremos as moléculas da proteína próximas umas das outras, o que, em casos favoráveis, promoverá o aparecimento dos primeiros núcleos cristalinos. Esses microcristais servirão de base para o crescimento de cristais maiores, adequados para experimentos de difração de raios X. 38

39 Cristalização de Macromoléculas Biológicas Para cristalizarmos proteínas, normalmente usamos o método de difusão de vapor. Uma gota de proteína é colocada sobre uma lamínula. Na gota adicionamos uma solução contendo sal, ou outro agente precipitante, como polietileno glicol (PEG). Colocamos essa lamínula sobre um poço, onde temos a solução do precipitante. Ao fecharmos esse sistema ocorrerá difusão de moléculas de água da gota para o poço, levando a proteína, em casos favoráveis, a um estado de supersaturação, que pode levar à formação dos primeiros núcleos cristalinos. 39

40 Cristalização de Macromoléculas Biológicas O aumento da solubilidade de uma macromolécula a baixa concentração salina (<0,5M) é chamada salting-in. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e aumenta a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se tratar o fenômeno é considerar o salting-in como o resultado da competição entre grupos carregados na superfície da macromolécula e os íons em solução. Na ausência de íons no solvente, a macromolécula precipita devido à atração de eletrostática entre cargas opostas em diferentes partes da macromolécula. Se os íons são adicionados à solução, esses blindam os grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade. a) b) Fenômeno de salting-in. a) Macromolécula biológica sem a presença de íons dissolvidos na solução. A atração eletrostática entre os grupos carregados em duas os mais macromoléculas causa a aglomeração e precipitação. b) Íons blindam a 40 interação eletrostática entre as macromoléculas, aumentando a solubilidade. + -

41 Cristalização de Macromoléculas Biológicas Solução do poço Sequência de eventos para a montagem de uma gota de cristalização: a) Colocase 1-2L da solução da macromolécula biológica sobre a lamínula de vidro. b) Adiciona-se 1-2L da solução do reservatório à gota com a solução da macromolécula biológica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a solução de macromolécula biológica mais a solução do reservatório. 41

42 Cristalização de Macromoléculas Biológicas Com o aumento do número de macromoléculas cristalizadas, tornou-se óbvio que muitas das condições de cristalização se assemelhavam, ou seja, havia uma concentração de resultados positivos de cristalização de macromoléculas, usando-se número limitado de precipitantes, tampões e aditivos. Isto levou à proposição de diversos métodos de cristalização (Carter & Carter, 1979), onde um número limitado de condições de cristalização eram tentados, usando-se pequenas quantidades da macromolécula (miligramas). A partir da observação dos resultados preliminares desses experimentos era possível determinar que tampão, aditivo e agente precipitante seriam os mais favoráveis e a partir daí proceder-se a sucessivos melhoramentos até se conseguir cristais adequados. Jancarik, J, & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24,

43 Cristalização de Macromoléculas Biológicas Por tentativa e erro a matriz multimensional foi simplificada eliminando-se as condições que podem ser parcialmente representadas por resultados de outras condições, a proposta original apresenta 58 condições. Comercialmente a empresa Hampton Research, (USA) simplificou o método original, e disponibiliza um kit com 50 condições de cristalização. Comercialmente há outros kits usando-se como princípio a variação de ph, força iônica e agentes precipitantes. Fonte: 43

44 Cristalização de Macromoléculas Biológicas Um dos sistemas usados para cristalização de proteínas é a placa linbro, mostrada acima. Essa placa apresenta 24 poços, que permite testarmos diversas condições de cristalização. As lamínulas são colocadas sobre cada um dos poços, e vedadas com graxa de vácuo. Fonte: 44

45 Coleta de Dados de Difração de Raios X Cristais de proteínas são frágeis, assim diversos cuidados são tomados na manipulação desses. Na coleta de dados de difração de raios X, uma forma possível de manipularmos os cristais e deixando-os saturados de solvente e inseri-los num capilar, como mostrado na figura acima. Os cristais nessa situação podem ser levados 45 para coleta de dados de difração de raios X.

46 Coleta de Dados de Difração de Raios X Uma forma alternativa de coletarmos dados, é transferir o cristal para uma solução com protetor criogênico (polietileno glicol, glicerol entre outros). Usando-se esse método, o cristal pode ser exposto a um fluxo de nitrogênio líquido e transferido para uma base metálica (cabeça goniométrica). O cristal fica pronto para a coleta de dados. As temperaturas criogênicas minimizam os dados causados pela radiação. 46

47 Coleta de Dados de Difração de Raios X Foto disponível em: < >. Acesso em: 19 de outubro de Na figura da esquerda vemos uma base de cobre usada como suporte para cristais. À direita temos um cristal inserido num laço. A exposição ao nitrogênio líquido leva à formação de um filme rígido e transparente que mantém o cristal no laço. 47

48 Difração de Raios X A cristalografia por difração de raios X, usada para resolução de estruturas de proteínas, baseia-se na interferência de ondas eletromagnéticas. As figuras ao lado mostram interferência entre ondas, temos duas ondas em fase, ondas 1 e 2, onde seus máximos e mínimos coincidem e a onda apresenta o mesmo comprimento de onda, o resultado da soma das duas é uma onda com a amplitude resultante igual à soma das amplitudes das ondas 1 e 2. No caso de interferência destrutiva, temos as ondas fora de fase, exatamente meio comprimento de onda, onde o máximo da onda 1 coincide com o mínimo da onda 2, o resultado da soma é uma onda de amplitude zero Interferência construtiva Interferência destrutiva

49 Difração de Raios X Abaixo temos uma animação que vemos interferência construtiva e destrutiva para de duas ondas. As ondas 1 e 2 são representadas acima, o resultado das duas ondas está representada na onda debaixo. Vemos quando os pico coincidem temos uma interferência construtiva, e a onda desenhada com a linha grossa, atinge o máximo. Onda 1 Onda 2 Ondas Imagem disponível em: < Acesso em: 19 de outubro de

50 Difração de Raios X Para resolver uma estrutura de macromoléculas biológicas (proteína ou ácido nucleico), a partir da difração de raios X, precisamos cristalizá-las. O cristal é um arranjo ordenado das moléculas, no caso proteínas ou ácido nucleicos. Uma forma de imaginarmos um cristal é por meio da analogia com uma pilha de tijolos, onde cada tijolo é uma molécula e a pilha ordenada de tijolos o nosso cristal. A incidência de raios X sobre um cristal gera um padrão de difração, a partir do qual podemos elucidar a estrutura tridimensional da macromolécula. Pilha ordenada de tijolos. Na nossa analogia, cada tijolo representa uma molécula. A pilha de tijolos é o cristal. Foto disponível em: < > Acesso em: 19 de outubro de

51 Difração de Raios X Considere um conjunto de planos paralelos de um cristal, como mostrado na figura abaixo, com distância interplanar (d). Incidindo sobre este conjunto de planos paralelos temos raios X de comprimento de onda. Podemos analisar a difração de raios X como se fosse resultado da reflexão dos raios X pelos planos. Para que ocorra difração, num dado ângulo, é necessário que as ondas difratadas sofram interferência construtiva. Usando-se a analogia com uma pilha de tijolos, onde cada tijolo é uma molécula cristalizada, podemos pensar que os planos paralelos são as superfícies dos tijolos, que como estão empilhados, formam planos paralelos. Raios X d d 51

52 Difração de Raios X Analisemos a diferença de caminho ótico dos feixes 1 e 2, indicados na figura. O feixe 2 percorre a distância A + B a mais que o feixe 1. Assim, para que as ondas dos feixes 1 e 2 sofram interferência construtiva, a diferença de caminho ótico entre elas deve ser um número inteiro de comprimentos de onda. 1 2 A d B d 1 2 A + B = 2.A = 2 d.sen d d.sen 52

53 Difração de Raios X A diferença de caminho ótico (2 d.sen ) tem que ser um número inteiro de comprimento de ondas (n.), onde n é inteiro, assim temos: d.sen = n. (Lei de Bragg) A d B d d n.λ 2.senθ d.sen d =1, m 53

54 Difração de Raios X Num experimento típico de difração de raios X, temos a fonte de radiação, o cristal e o detector, como mostrado no diagrama esquemático abaixo. Normalmente os ângulos de difração são expressos em relação ao feixe incidente, ou seja, 2. 2 Fonte de raios X Cristal 54

55 Filme fotográfico ou placa de imagem Difração de Raios X No caso de colocarmos um filme fotográfico para registrar a imagem de difração de raios X, como mostrado no diagrama abaixo, teremos um padrão de difração de raios X bidimensional, quanto mais distante o ponto de difração de raios X do ponto central da figura (feixe direto) maior o ângulo de espalhamento (2). A foto da direita foi girada 90 º com relação ao diagrama de esquerda. No aparato experimental o filme ou placa de imagem está perpendicular ao plano. Feixe de raios X 2 Feixe direto Cristal Filme fotográfico ou placa de imagem 55

56 Cristalização de Proteínas no Espaço Experimentos de cristalização no espaço normalmente geram cristais de melhor qualidade para estudos de difração de raios X. As condições de microgravidade do espaço, propiciam um empacotamento cristalino mais ordenado, gerando cristais que difratam à mais alta resolução. A proteína uropesina (Canduri et al., 2001) foi cristalizada em condições de microgravidade na missão STS- 95 do ônibus espacial Discovery ( Disponível em: < 9IFiQNY8mE >). Fonte: Crédito: NASA Cristal de uropepsina. 56

57 Relação com Outras Disciplinas Diversas técnicas físicas são de fundamental importância para o estudo de sistemas biológicos, entre elas a cristalografia por difração de raios X e a espectrometria de massas. Tais técnicas tem fundamentos na Física e na Química. As principais aplicações da cristalografia e da espectrometria estão relacionadas com as disciplinas de Bioquímica Estrutural e Biologia Molecular. Química Aula de hoje Biologia Molecular Bioquímica Estrutural Física 57

58 Material Adicional (Artigo Indicado) Artigo indicado Segue um artigo de revisão sobre cristalografia de proteínas: Protein crystallography in drug discovery. Canduri F, de Azevedo WF. Curr Drug Targets Dec;9(12):

59 Referências Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer- Verlag. Rhodes, G. (2000). Crystallography Made Crystal Clear. 2 nd ed.san Diego: Academic Press. Stout, G. H. & Jensen, L. H. (1989). X-Ray Structure Determination. A Practical Guide. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons. 59