UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS FCA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS PESQUEIRAS DEPESCA CURSO DE ENGENHARIA DE PESCA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS FCA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS PESQUEIRAS DEPESCA CURSO DE ENGENHARIA DE PESCA RESPOSTAS SECUNDÁRIAS AO ESTRESSE EM ALEVINOS DE TAMBAQUI (Colossoma macropomum) SUBMETIDOS A DIFERENTES DENSIDADES DE ESTOCAGEM DURANTE A RECRIA EM VIVEIROS ESCAVADOS. TALÍSIA PEREIRA MARTINS MANAUS AM 2010

2 ii UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS FCA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS PESQUEIRAS DEPESCA CURSO DE ENGENHARIA DE PESCA RESPOSTAS SECUNDÁRIAS AO ESTRESSE EM ALEVINOS DE TAMBAQUI (Colossoma macropomum) SUBMETIDOS A DIFERENTES DENSIDADES DE ESTOCAGEM DURANTE A RECRIA EM VIVEIROS ESCAVADOS. Monografia apresentada ao Departamento de Ciências Pesqueiras, como requisito para obtenção do título de Engenheiro de Pesca da Faculdade de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Amazonas no segundo semestre de MANAUS AM 2010

3 iii UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS FCA DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS PESQUEIRAS DEPESCA CURSO DE ENGENHARIA DE PESCA RESPOSTAS SECUNDÁRIAS AO ESTRESSE EM ALEVINOS DE TAMBAQUI (Colossoma macropomum) SUBMETIDOS A DIFERENTES DENSIDADES DE ESTOCAGEM DURANTE A RECRIA EM VIVEIROS ESCAVADOS. Talísia Pereira Martins Aluna Profa Dra Christiane Patrícia Feitosa de Oliveira Orientadora MANAUS AM 2010

4 iv UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS - UFAM FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS - FCA DEPARTAMENTOS DE CIÊNCIAS PESQUEIRAS - DEPESCA CURSO DE ENGENHARIA DE PESCA Dra Christiane Patrícia Feitosa de Oliveira Orientadora e Examinadora Universidade Federal do Amazonas Dra Katherine López Vásquez Examinadora Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia MSc Alzira Miranda de Oliveira Examinadora Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Dra Andréa Belém Costa Chefe do Departamento de Ciências Pesqueiras Dr. Pedro Roberto de Oliveira Coordenador do Curso de Engenharia de Pesca MSc Álvaro Carvalho de Lima Coordenador de Estágio e Monografia MANAUS AM 2010

5 v DEDICATÓRIA Dedico este trabalho... A Deus, pois sem Ele nada disso seria possível A meus pais, Adnelson e Ana Lúcia, e a minha irmã Thauane pela confiança depositada Ao meu namorado Jânderson Garcez

6 vi AGRADECIMENTOS A Deus, por esta vitória concedida, pelas bênçãos recebidas, por ter me dado saúde, força e coragem para não desistir. A ti Senhor, toda a honra e toda a glória. Aos meus pais Adnelson e Ana Lúcia, minha irmã Thauane, meus avós, tios e primos, por acreditarem em mim e pelo apoio durante esses 5 anos de graduação. Ao meu namorado Jânderson Garcez pelo incentivo, compreensão, paciência e principalmente pelo seu amor nos últimos 4 anos. À minha orientadora, Dra Christiane Patrícia Feitosa de Oliveira, pela confiança, pelos ensinamentos no decorrer deste trabalho, incentivo, dedicação, empenho e momentos divertidos. À Karla Eduarda com quem compartilhei muitos momentos de alegria e de tristeza. Obrigada pela amizade, pelos conselhos, pelas opiniões diferentes das minhas, pelas aventuras, por ter estado ao meu lado durante todo o período da graduação. À Gel Costa pelos momentos engraçados, companhia, por me aturar por tanto tempo. Obrigada principalmente pela amizade. À minha turma de engenharia de pesca de 2006: Adriana Pontes, Andrio Marques, Caroline Campos, Diogo Campos, Ellan Paes, Gelcirene Costa, Karla Eduarda, Lorenzo Barroco, Naura Keth, Samir Bressane, Sandrelly Inomata e Vanessa Braga. Obrigada pelo convívio, companheirismo e gargalhadas durante a graduação. Aos meus amigos de curso e futuros colegas de profissão: Aline Telles, Marcelo Pontes, Fabrício Sousa, Jesaías Ismael, Tatiane Silva, Iurych Bussons, Kamila Santos e Rafael Vicente. A vocês que me ajudaram de alguma forma na faculdade, muito obrigada. Aos meus amigos pés-de-pincha: Prof Paulo Andrade, Anndson Brelaz (Canguru), Wander Rodrigues (Piraíba), Carlos Almeida, Hugo Ricardo, Hellen Medeiros. Obrigada pela companhia durante as viagens. Aprendi muito com vocês. À Joelly-Anna e Aliny Gama pela amizade, apoio e incentivo. À Márcia, Vivianne e Celiane Costa pela ajuda nas coletas da monografia. À Patricia Maciel, Sarah Ragonha e Elizabeth Gusmão Affonso pelos ensinamentos.

7 vii Ao Dr Adalberto Luis Val que cedeu as dependências do Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular no INPA para as análises de glicogênio. À Prof Marle pelo incentivo e apoio. Ao Prof Esner Magalhães pelo auxílio nas instalações na fazenda experimental da Ufam. À todos os professores que ministraram disciplinas na graduação, em especial aos do DEPESCA que contribuíram para a minha formação profissional. À todos aqueles que tornaram possível esta conquista, obrigada.

8 viii RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar as respostas secundárias ao estresse de tambaqui (Colossoma macropomum) submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados. Para isso, foram utilizados 3 tratamentos: T1 (10 peixes/m 2 ), T2 (15 peixes/m 2 ) e T3 (20 peixes/m 2 ). Os peixes foram distribuídos em 9 viveiros escavados de 36 m 2 cada. Foram monitorados os parâmetros físicos e químicos da qualidade da água a fim de que estas variáveis não interferissem no desempenho do experimento. Após 15, 30 e 45 dias de cultivo, foram coletados 5 peixes de cada unidade experimental para realização de biometria para avaliação de índices corporais, coleta sanguínea para análise de glicose e coleta de fígado e de músculo para determinação do glicogênio. Os valores médios dos parâmetros físicos e químicos da água não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos durante o período experimental indicando que a densidade de estocagem não comprometeu a qualidade da água nos viveiros para todas as densidades avaliadas neste trabalho. Foram observadas diferenças significativas no peso aos 30 e 45 dias de cultivo, entretanto os valores do comprimento não foram diferentes estatisticamente ao final dos 45 dias de cultivo. Os níveis de glicose permaneceram constantes e elevados em 15 e 30 dias, provavelmente como resposta aos peixes à adaptação as densidades de estocagem. Aos 45 dias, os níveis de glicose reduziram, porém o tratamento de maior densidade apresentou valores maiores de glicose indicando uma resposta de estresse. Os demais parâmetros avaliados não apresentaram diferenças estatísticas. Diante dos resultados obtidos neste trabalho, sugere-se que para recria de tambaqui seja utilizada a densidade de 15 peixes/m 2 visto que nesta densidade os peixes não apresentaram nenhum resultado fisiológico extremo para a espécie. Palavras-chave: estresse, tambaqui, recria.

9 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1. Valores médios do fator de condição (K) de alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados. Média ± erro padrão...25 Figura 2. Valores médios do índice hepatosomático (IHS) de alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados. Letras minúsculas indicam difeenças entre os tratamentos no mesmo tempo. Média ± erro padrão...26 Figura 3. Glicose sanguínea de alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados. Letras minúsculas indicam difeenças entre os tratamentos no mesmo tempo. Média ± erro padrão...28 Figura 4. Glicogênio hepático em tambaqui (Colossoma macropomum) submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados.média ± erro padrão...30 Figura 5. Glicogênio muscular em tambaqui (Colossoma macropomum) submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados.média ± erro padrão...30

10 x LISTA DE TABELAS Tabela 1. Oxigênio dissolvido (OD), temperatura (T), ph e condutividade elétrica (CE) da água de cultivo de tambaqui (C. macropomum) nos diferentes tratamentos : T1 = 10 peixes/m 2 ; T2 = 15 peixes/m 2 e T3 = 20 peixes/m 2. Asteriscos indicam diferenças entre os períodos do dia...23 Tabela 2. Nitrito (NO - 2 ), nitrato (NO - 3 ), amônia (NH 3 +NH - 4 ), alcalinidade total (AT) e gás carbônico (CO 2 ) da água de cultivo de tambaqui (C. macropomum) nos diferentes tratamentos : T1 = 10 peixes/m 2 ; T2 = 15 peixes/m 2 e T3 = 20 peixes/m Tabela 3. Valores médios de peso e comprimento de tambaqui (C. macropomum) no início do experimento, aos 15, 30 e 45 dias de cultivo nos diferentes tratamentos: T1 = 10 peixes/m 2 ; T2 = 15 peixes/m 2 e T3 = 20 peixes/m 2. Letras minúsculas indicam difeenças entre os tratamentos no mesmo tempo...24

11 xi SUMÁRIO 1. Introdução Objetivos Objetivo Geral Objetivos Específicos Revisão de Literatura Material e métodos Delineamento experimental Coleta e análise de água Biometria dos peixes Coleta de amostras biológicas Avaliações biométricas Determinações bioquímicas Determinação da glicose sanguínea Determinação do glicogênio no fígado e no músculo Análise estatística Resultados e Discussão Conclusão Referências Bibliográficas... 32

12 12 1 Introdução O estresse é uma resposta comum em sistemas onde há regimes de confinamento, como nas pisciculturas. Nestas condições, os peixes ficam expostos a diversos estressores, que podem ser provenientes das alterações na qualidade da água, do manejo empregado, interações biológicas entre peixes e microorganismos e altas densidades populacionais (WEDEMEYER, 1996). O estresse, de modo geral, pode ser definido como um conjunto de respostas do organismo animal na tentativa de se adaptar à uma nova situação. As respostas ao estresse são divididas em primárias, secundárias e terciárias (WEDEMEYER, 1996; URBINATI e CARNEIRO, 2004). As respostas primárias são caracterizadas pelo aumento de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) e corticosteróides (cortisol) no plasma sanguíneo. As respostas secundárias compreendem as alterações da glicemia, do acúmulo de ácido lático muscular, da quebra do glicogênio hepático e muscular e modificações no número de eritrócitos e leucócitos. As respostas terciárias compreendem o desempenho produtivo e reprodutivo e comprometem a resistência dos peixes às doenças (WENDELAAR-BONGA, 1997). Em sistemas intensivos de cultivo, várias são as práticas de manejo consideradas estressantes, dentre elas, a densidade de estocagem, é uma fonte de estresse que influencia diretamente a capacidade produtiva de um cultivo. A determinação da densidade de estocagem ideal é um dos requisitos básicos para o desenvolvimento de um pacote de produção para uma espécie. A densidade de estocagem tem efeito na sobrevivência e no crescimento, sendo uma possível causa do fracasso na produção final de peixes (JOBLING, 1994). Segundo Baldisserotto (2002), o crescimento e a sobrevivência de algumas espécies de peixes podem ser melhores em baixas densidades de estocagem, porém pode ocorrer um sub-aproveitamento do espaço disponível para o cultivo. Por outro lado, uma alta densidade pode causar grande mortalidade e redução do crescimento, uma vez que a decomposição do excesso de alimento e os resíduos nitrogenados podem prejudicar a qualidade da água (JOBLING, 1994; BALDISSEROTTO, 2002), que junto com o aumento da densidade podem ocasionar estresse e doenças (IGUCHI et al., 2003).

13 13 A determinação da densidade de estocagem visa definir níveis ótimos de produtividade por área (BRANDÃO et al., 2004). Segundo Gomes e Schlindwein (2000) são amplos os fatores de produção afetados por não se ter um controle de densidade de peixes, essencial para uma ótima exploração e rápida expansão da piscicultura. Uma densidade de estocagem ótima é representada pela maior quantidade de peixes produzida por área ou volume de um tanque. Produção eficiente não está necessariamente relacionada ao peso máximo que pode ser produzido, mas sim o peso que poderá ser atingido com uma baixa conversão alimentar, num período curto e com um peso final aceito pelo mercado consumidor (SCHIMITTOU, 1997). Aumentos na densidade de estocagem proporcionam aumentos na biomassa total, porém o peso individual tende a diminuir. Contudo, a homogeneidade de peso entre os peixes aumenta à medida que se eleva a densidade de estocagem (WATANABE et al., 1996). Altas densidades de estocagem proporcionam maiores produções e, conseqüentemente maior retorno sobre os investimentos em estruturas e equipamentos. É importante determinar uma taxa de estocagem que assegure a sobrevivência dos peixes, encurte o período de engorda e que ocorra um bom aproveitamento dos viveiros. É necessário também desenvolver um pacote de produção direcionado para a recria do tambaqui (fase de engorda de um juvenil (ou alevinão) de 2-5 cm até atingir cm) em sistemas de viveiros escavados. O tambaqui (C. macropomum) é a espécie mais cultivada na região amazônica (IBAMA, 2007; FILHO, 2007). Pertence à Classe Actinopterygii, Ordem Characiformes, Família Characidae e Subfamília Serrasalminae e distribui-se nas bacias dos rios Orinoco e Amazonas. Muitos aspectos relacionados à sua biologia e produção em diferentes condições de cultivo já foram estudados (VAL e HONCZARYCK, 1995; ARAÚJO-LIMA e GOULDING, 1998; BALDISSEROTTO e GOMES, 2005), podendo ser destacados alguns destes: a alta plasticidade em adaptar-se a alterações ambientais; possuir hábito alimentar diversificado, alimentando-se basicamente de frutos e sementes na natureza e, em cativeiro, aceitar bem a ração, além de aproveitar fontes disponíveis nos viveiros como o plâncton; a boa conversão alimentar e o rápido crescimento (VAL e HONCZARYCK, 1995; ARAÚJO-LIMA e GOULDING, 1998;

14 14 KUBITZA, 2004). Estas características tornam a espécie altamente promissora para o cultivo intensivo, incluindo altas densidades de estocagem. 2 Objetivos 2.1 Objetivo Geral Avaliar o efeito das diferentes densidades de estocagem sobre as respostas de estresse em alevinos de tambaqui (C. macropomum) durante a recria em viveiros escavados. 2.2 Objetivos Específicos a) Avaliar respostas metabólicas, como a glicemia e glicogênio hepático e muscular, dos alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem; b) Avaliar índices de condição corporal dos alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem.

15 15 3 Revisão de Literatura O ambiente aquático é extremamente dinâmico com mudanças rápidas ou extremas na concentração de oxigênio dissolvido, temperatura da água e no ph. Os animais que vivem nesse ambiente enfrentam essas e outras alterações, que podem ocasionar estresse e reduzir a habilidade na manutenção da homeostase. Assim temos agentes estressores de natureza química, como por exemplo, variação na concentração de oxigênio dissolvido; concentração elevada de amônia e nitrito, decorrente da degradação da matéria orgânica (COSTA et al., 2004); presença de poluentes orgânicos e inorgânicos além daqueles de natureza física, como manuseio, alta densidade populacional, confinamento, captura ou transporte (URBINATI et al., 2004), redução do nível de água dos corpos d água e elevação da temperatura, caracterizados pelo período de estiagem em regiões tropicais e subtropicais. Os fatores estressantes tem sido a principal causa das perdas de lucro na piscicultura, pois afetam o metabolismo e, consequentemente, o crescimento dos peixes. Quando o peixe é exposto a um agente estressor ocorre a ativação de dois eixos neuroendócrinos: o eixo hipotálamo (sistema nervoso simpático) - células cromafins, que resulta na liberação das catecolaminas (adrenalina e noradrenalina) como produtos finais e o eixo hipotálamo-hipófise-interrenal, que libera os corticosteróides (cortisol e cortisona), que caracterizam as respostas primárias de estresse (TAVARES-DIAS et al., 2009). As respostas secundárias compreendem efeitos fisiológicos associados ao estresse e mediados por estes hormônios. Destacam-se a hiperglicemia, alterações nas concentrações de íons no sangue, aumento do conteúdo de água do tecido, quebra do glicogênio hepático e muscular, aumento da taxa metabólica e alterações hematológicas, entre outras (MAZEAUD et al., 1977; WENDELAAR-BONGA, 1997). As respostas terciárias afetam o animal e a população como um todo, comprometendo o crescimento, a resistência a doenças e o sucesso reprodutivo (WENDELAAR-BONGA, 1997; URBINATI e CARNEIRO, 2004). A glicose é um bom indicador de distúrbios fisiológicos resultantes de diferentes tipos de estressores, por ser a principal fonte de energia utilizada pelos peixes para suportar situações desfavoráveis (MORGAN e IWAMA, 1997). Segundo Procarione et

16 16 al. (1999), densidades de estocagem extremas causam um aumento na glicose sangüínea e, conseqüente diminuição no crescimento, pois a energia destinada ao crescimento é desviada para compensar a situação desfavorável. Na tentativa do organismo se adaptar às condições desfavoráveis, os peixes, geralmente utilizam suas reservas de glicogênio hepático por meio de glicogenólise, disponibilizando maior quantidade de energia (IWAMA et al., 2004). O glicogênio é uma das muitas formas de armazenamento da energia consumida como alimento pelo peixe. O glicogênio é encontrado em grande quantidade no fígado e no músculo dos peixes. Embora o tecido muscular de peixes carnívoros, como a truta arco-íris, possa concentrar cerca de 6% a mais glicogênio que o fígado, as quantidades totais de glicogênio muscular ou hepático podem ser consideradas iguais (Steffens, 1989). Como consequência de uma intensa atividade física, as reservas de glicogênio no músculo e fígado dos peixes podem diminuir em poucos minutos, sendo restabelecidas somente 24 horas após terem sido consumidas. Nagai e Ikeda (1971) mostraram que períodos de restrição alimentar superiores a 164 dias não resultam em uma queda significativa na reserva de glicogênio muscular da carpa comum, embora estes peixes tenham mostrado uma redução de 75% na reserva de glicogênio tecidual hepático após 100 dias de restrição alimentar. Isto mostra que estes peixes iniciam a utilização das reservas de glicogênio do corpo a partir do glicogênio tecidual hepático. O glicogênio hepático é considerado um estoque emergencial de energia prontamente utilizável nos primeiros momentos de situações críticas de estresse. O fator de condição tem sido utilizado como indicador estrutural de resposta secundária de estresse (OBA et al, 2009). É um indicador quantitativo do grau de higidez ou do bem estar do peixe (LE CREN, 1951; FROESE, 2006). O fator de condição pode ser usado para avaliar as diferentes condições de alimentação em espécies distintas e as interferências da densidade populacional, do clima e de outras condições ambientais (GOMIERO e BRAGA, 2003; FROESE, 2006). Portanto, vários estudos indicam que o fator de condição pode ser considerado um índice corporal que reflete as interações entre o peixe e os fatores bióticos e abióticos que o cercam. Da mesma forma, o índice hepatossomático (IHS) também tem sido utilizado como índice

17 17 corporal (TAVARES-DIAS et al, 2008). A determinação dos valores padrão do IHS é de grande importância para compreensão dos distúrbios que podem ocorrer durante condições ambientais adversas (RANZANI-PAIVA e TAVARES-DIAS, 2002). Reduções na IHS também podem estar associadas à utilização de reservas energéticas, necessários para a manutenção da homeostasia (TAVARES-DIAS et al., 2000; RANZANI-PAIVA e TAVARES-DIAS, 2002).

18 18 4 Materiais e Métodos 4.1 Delineamento Experimental Os alevinos de tambaqui (1,76±0,31 g e 3,06±0,14 cm) foram adquiridos da Estação de Piscicultura de Balbina e transportados para a Estação de Aquicultura da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Amazonas, localizada no KM 38 da BR 174. Os peixes foram distribuídos em 9 viveiros de terra de 36m 2 cada. Foram utilizados três tratamentos com três repetições cada, sendo eles: T1 = 10 peixes/m 2 ; T2 = 15 peixes/m 2 e T3 = 20 peixes/m 2 em um delineamento experimental inteiramente casualizado. O experimento teve duração de 45 dias e durante este período, os alevinos foram alimentados diariamente com ração comercial duas vezes ao dia. Após 15, 30 e 45 dias foram coletadas as amostras biológicas para posterior análise. 4.2 Coleta e análise da qualidade da água Durante todo o período experimental foram monitorados os parâmetros físicoquímicos da água. A concentração de oxigênio dissolvido, condutividade elétrica, temperatura e ph foram medidas diariamente às 8:00 h e 17:00 h. As análises de nitrito, nitrato, amônia, gás carbônico, alcalinidade foram realizadas semanalmente. O oxigênio dissolvido foi determinado através de medidor digital multiparamétrico da marca YSI modelo HEXIS. A condutividade elétrica foi determinada através de aparelho digital. Os valores de temperatura e ph foram determinados através de phmetro digital da marca YSI F1100. As concentrações de nitrito, nitrato, amônio, fósforo, gâs carbônico, alcalinidade e dureza foram determinadas a partir de protocolos específicos, com auxílio de um fotocolorímetro Alfakit. 4.3 Biometria dos peixes Após 15, 30 e 45 dias de experimento foram amostrados de 5 exemplares de tambaqui de cada unidade experimental, totalizando 15 indivíduos para cada tratamento. Para isso os peixes foram anestesiados com eugenol 50 mg L -1 e o peso e o comprimento padrão foram mensurados. Os peixes que foram retirados foram

19 19 substituídos por outros exemplares de tambaqui biometricamente semelhantes para manutenção da densidade inicial. 4.4 Coleta de amostras biológicas O sangue foi coletado por punção da veia caudal utilizando seringas heparinizadas. As amostras de sangue foram destinadas às análises de glicose sanguínea. Posteriormente os peixes foram sacrificados por secção medular e amostras de fígado e músculo branco foram coletadas para determinação do glicogênio hepático e muscular. 4.5 Avaliações biométricas A partir desses dados biométricos foram determinados: a) Fator de condição relativo (Kn) através da seguinte fórmula : W = a.l b, onde : W = peso total ; L = comprimento total e ; a e b = transformação logarítmica dos valores da curva da relação peso total/comprimento total a) Índice hepatosomático (IHS) adquirido pela fórmula: IHS = Peso do fígado/peso corporal x Determinações bioquímicas Determinação da glicose sanguínea A glicose sanguínea foi determinada com auxílio de um medidor de glicose digital Accu-Chek Active com intervalo de medição de mg/dl (0,6-33,3 mmol/l). Os resultados foram obtidos com tiras-teste e corresponderam à concentração de glicose sanguínea.

20 Determinação do glicogênio no fígado e músculo Para determinação do glicogênio hépatico e muscular amostras de fígado e músculo, aproximadamente 50 mg e 100 mg, respectivamente, foram homogeneizadas em um macerador de teflon com 2 ml de uma solução de citrato de sódio 100 mm ajustada a ph 5,0. Logo após a homogeneização, a amostra foi incubada a 100 C durante 10 min em banho-maria, sendo em seguida centrifugada durante 15 minutos a 8000 g. Duas amostras de 500 μl foram retiradas do sobrenadante, uma delas foi tratada com 100 μl da enzima α-amiloglucosidase e a outra com o mesmo volume de água destilada. Ao mesmo tempo, um padrão de glicogênio (500 μl de uma solução 1 mg/ml) também foi tratado com a enzima α-amiloglucosidase e outro padrão de glicogênio recebeu o mesmo volume de água destilada. As amostras e os padrões foram então incubados durante 2,5 h a 55 C. Ao final da incubação foi feita nova centrifugação a 8000g durante 30 min. A determinação do conteúdo de glicose da amostra tratada com α- amiloglucosidase, da amostra não tratada com α-amiloglucosidase, do padrão de glicogênio tratado com α-amiloglucosidase e do padrão de glicogênio não tratado com α-amiloglucosidase, foi realizada de acordo com o protocolo e kit Glucox 500. As amostras foram lidas em espectrofotometro de placa, Espectra Max Plus, em 510nm. As concentrações teciduais de glicogênio (μg/mg) foram calculadas utilizando-se a seguinte fórmula: (ABS AT - ABS A) x1x 111 Glicogênio = ABS P (ABS PGT - ABS PG) x100 x P Onde: ABS P ABS A= absorbância da amostra não tratada com a enzima α-amiloglucosidase ABS P= absorbância do padrão de glicose

21 21 P= peso da amostra 1= volume de citrato de sódio utilizado para homogeneização da amostra 111= peso molecular do glicogênio ABS AT= absorbância da amostra tratada com a enzima α-amiloglucosidase ABS PGT= absorbância do padrão de glicogênio tratado com a enzima α-amiloglucosidase ABS PG= absorbância do padrão de glicogênio não tratado com a enzima α- amiloglucosidase 4.7 Análise estatística Os resultados estão apresentados como média e erro padrão da média. Os resultados obtidos para cada tratamento foram comparados utilizando One-way Anova, seguido de teste de comparação múltipla de Tukey. O nível de significância admitido foi p<0,05. Os dados foram analisados utilizando o software Sigmastat 3.5.

22 22 5. Resultados e Discussão Os resultados dos parâmetros físicos e químicos da água estão demonstrados nas tabelas 1 e 2. Os valores médios de oxigênio dissolvido, temperatura, ph e condutividade elétrica não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos, porém foram observados menores valores destas variáveis no período da manhã quando comparados com o período da tarde. Com excessão dos valores de ph que se mostraram moderadamente elevados em todos os tratamentos aqui testados todas as outras variaveis avaliadas estão dentro do intervalo indicado para criação do tambaqui (KUBTIZA, 2003). Portanto, mesmo estando acima do esperado, o ph, não deve ter causado um efeito negativo a ponto de interferir na avaliação dos resultados obtidos. Os valores médios de nitrito, nitrato, amônia, alcalinidade e gás carbônico não apresentaram diferenças significativas, permanecendo dentro das condições adequadas para o cultivo de peixes tropicais (KUBTIZA, 2003 ; ARANA, 2005). Em experimentos, é comum o monitoramento dos parâmetros físicos e químicos da água de cada unidade experimental para evitar alterações que interfiram na qualidade do experimento e que influenciem nos resultados (OLIVEIRA, 2008). A densidade de estocagem não comprometeu a qualidade da água nos viveiros para todas as densidades avaliadas neste trabalho. O esperado é que tanques escavados que apresentem as maiores densidades de estocagem apresentem um redução na qualidade da água, fato este, que não ocorreu durante os 45 dias de experimento. O mesmo padrão foi observado por Oliveira et al (2007) testando densidades de estocagem de 33, 43 e 53 alevinos/m 2 para o tambaqui onde observaram que as variáveis hidrológicas monitoradas permaneceram dentro dos padrões adequados para o bom desenvolvimento do tambaqui cultivado em tanques fertilizados e não foram prejudicadas com o aumento do adensamento.

23 23 Tabela 1. Oxigênio dissolvido (OD), temperatura (T), ph e condutividade elétrica (CE) da água de cultivo de tambaqui (C. macropomum) nos diferentes tratamentos : T1 = 10 peixes/m 2 ; T2 = 15 peixes/m 2 e T3 = 20 peixes/m 2. Asteriscos indicam diferenças entre os períodos do dia. Tratamentos Parâmetros T1 T2 T3 manhã tarde manhã tarde manhã Tarde OD (mg/l) 4,4±0,1 8,6±0,2* 4,5±0,1 9,1±0,2* 4,3±0,4 9,3±0,6* T (⁰C) 29,9±0,1 33,1±0,3* 29,8±0,1 33,4±0,2* 29,7±0,1 33,3±0,2* ph 8,1±0,1 9,3±0,1* 8,2±0,1 9,8±0,4* 8,1±0,1 9,4±0,1* CE (µs/cm) 42,9±1,2 47,6±1,9* 40,2±0,9 46,7±1,5* 45,6±1,1 50,6±1,9* Valores expressos em média ± erro padrão. Tabela 2. Nitrito (NO 2 - ), nitrato (NO 3 - ), amônia (NH 3 +NH 4 - ), alcalinidade total (AT) e gás carbônico (CO 2 ) da água de cultivo de tambaqui (C. macropomum) nos diferentes tratamentos : T1 = 10 peixes/m 2 ; T2 = 15 peixes/m 2 e T3 = 20 peixes/m 2. Parâmetros Tratamentos T1 T2 T3 - NO 2 (mg/l) 0.01±0.00 0,01±0,00 0,01±0,00 NO - 3 (mg/l) 0,12±0,02 0,07±0,01 0,09±0,02 NH 3 +NH - 4 (mg/l) 0,01±0,01 0,00±0,00 0,00±0,00 AT (mg/l de CaCO 3 ) 10,71±1,56 12,46±2,15 13,69±2,67 CO 2 (mg/l) 8,00±1,03 6,57±0,57 8,25±1,71 Valores expressos em média ± erro padrão. Os valores médios de peso total e comprimento padrão estão apresentados na tabela 3. O peso médio apresentou diferença significativa entre as densidades aos 30 e 45 dias de cultivo com valores maiores no T1 e menores no T3. O comprimento padrão também apresentou diferença aos 15 e 30 dias em todos os tratamentos testados, sendo que, aos 45 dias em nenhuma das densidades não foram observadas diferenças no tamanho dos animais. Diantes destes resultados e considerando que a densidade de estocagem ideal visa obter maior produtividade por unidade de área sem grandes prejuízos aos peixes, recomenda-se a densidade de 15 peixes/m 2.

24 24 Tabela 3. Valores médios de peso e comprimento de tambaqui (C. macropomum) no início do experimento, aos 15, 30 e 45 dias de cultivo nos diferentes tratamentos: T1 = 10 peixes/m 2 ; T2 = 15 peixes/m 2 e T3 = 20 peixes/m 2. Letras minúsculas indicam difeenças entre os tratamentos no mesmo tempo. Inicio 15 dias 30 dias 45 dias Tratamentos peso comp peso comp peso comp peso comp T1 1,9±0,1 2,5±0,1 a 8,1±0,4 a 6±0,1 a 13,9±0,1 a 7,5±0,2 a 30,5±1,8 a 9,6±0,2 T2 1,2±0,03 3,2±0,03 ab 6,4±0,4 b 5,6±0,1 b 10,8±0,8 b 6,9±0,2 b 26,6±0,9 b 9,4±0,2 T3 2,2±0,8 3,5±0,3 b 7,1±0,3 ab 5,8±0,1 ab 8,3±0,6 c 6,3±0,2 c 22,4±1,3 c 8,6±0,2 Valores expressos em média ± erro padrão. O fator de condição relativo (Kn) é uma medida quantitativa do bem-estar do peixe, podendo fornecer uma possível relação da sua condição corporal e/ou seu estado fisiológico com o meio em que vive (GOMIERO e BRAGA 2003). Neste trabalho, o fator de condição não apresentou diferenças significativas ao longo de todo o período experimental independente do tratamento testado, o que indica que nos primeiros 45 dias da fase de recria do tambaqui, a densidade de estocagem não comprometeu o bem estar físico dos peixes (figura 1). Resultado semelhante foi observado por Cavero et al (2003) onde o fator de condição não apresentou diferenças significativas entre as densidades testadas (15, 20 e 25 peixes/m 3 ) para juvenis de pirarucu (Arapaima gigas) em tanques-rede indicando que a condição dos peixes em todos os tratamentos era a mesma.

25 25 1,10 1,05 Kn 1,00 0,95 0, Dias 10 peixes/m 2 15 peixes/m 2 20 peixes/m 2 Figura 1. Valores médios do fator de condição (K) de alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados. Média ± erro padrão. Diversos estudos tem sido realizados nas mais diversas condições ambientais em diferentes espécies de peixes utilizando o índice hepatosomático para quantificação dos níveis de estoque de energia em peixes (Heidinger e Crawford,1977; Bidinoto et al., 1997). Nesse trabalho, o índice hepatosomático apresentou valores maiores para o tratamento de menor densidade de estocagem (T1) nos três períodos de coleta, porém não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos aos 15 e 45 dias (figura 2). Aos 30 dias, os valores de IHS foram maiores na menor densidade de estocagem testada em relação aos outros tratamentos, indicando que esses animais apresentavam maiores estoques de energia. No entanto, essa condição foi restabelecida após 45 dias de cultivo. O IHS apresentou valores médios altos para tambaqui (C. macropomum) durante a recria em comparação aos valores de IHS encontrados por TAVARES-DIAS et al (2008) em juvenis de C. macropomum e B. amazonicus mantidos em cativeiros, apesar de não haver diferenças significativas para as duas espécies.

26 26 2,8 a 2,6 IHS (%) 2,4 2,2 2,0 b b 1,8 1,6 1, Dias 10 peixes/m 2 15 peixes/m 2 20 peixes/m 2 Figura 2. Valores médios do índice hepatosomático (IHS) de alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados. Letras minúsculas indicam difeenças entre os tratamentos no mesmo tempo. Média ± erro padrão. Os níveis de glicose tem sido bastante utilizados como indicadores de estresse em peixes teleósteos e suas variações estão relacionadas com as respostas secundárias de estresse. Três vias metabólicas garantem a manutenção das concentrações plasmáticas de glicose: digestão e absorção de carboidratos pelo intestino; produção no fígado e no rim como resultado da glicogenólise; gliconeogênese a partir do lactato, de aminoácidos e glicerol. A hiperglicemia ajuda a suprir a demanda energética dos peixes durante o estresse (Jeney et al, 1997). Neste trabalho, foi observado hiperglicemia em todos os tratamentos em 15 e 30 dias não havendo diferenças significativas entre eles. Aos 45 dias de cultivo, os peixes reduziram os níveis de glicose para todos os tratamentos, porém o T3 apresentou maiores valores em relação a T1 e T2 conforme observado na figura 3. Estes resultados indicam que os níveis de glicose permaneceram constantes em 15 e 30 dias, provavelmente como resposta dos peixes à adaptação as densidades de estocagem. Aos 45 dias, os níveis

27 27 de glicose reduziram, porém o tratamento de maior densidade apresentou valores maiores de glicose indicando uma resposta de estresse A redução da taxa de glicose com o aumento no tempo de cultivo também foi registrada para exemplares de pacu (Piaractus mesopotamicus) alimentados com dietas suplementadas com cromo trivalente em duas densidades de estocagem (4 e 20 kg/m 3 ) por 30 dias de cultivo por Fujimoto et al (2005). Esses autores observaram que os níveis glicêmicos apresentaram os valores mais elevados nos primeiros sete dias de cultivo reduzindo-se, progressivamente, com transcorrer do experimento Os resultados obtidos no presente estudo contrastam com os encontrados por Brandão et al (2004) que avaliaram quatro densidades de estocagem (200, 300, 400 e 500 peixes/m 3 ) para juvenis de tambaqui durante a recria em tanques-rede. Estes autores não observaram alterações significativas na glicose sanguínea dos peixes entre as diferentes densidades testadas aos 30 e 60 dias de criação. Ainda, Bittencourt et al (2010) avaliou parâmetros hematológicos de pacus (P. mesopotamicus) estocados em diferentes densidades (200, 300 e 400 peixes por tanque) em tanques-rede. Embora a diferença não tenha sido significativa, os valores glicêmicos foram superiores àqueles encontrados por Brandão et al. (2004). Essa hiperglicemia pode estar relacionada ao manejo de captura dos animais e ao transporte até o local da biometria e a amostragem sanguínea. Os níveis sanguíneos de glicose não foram influenciados pela densidade de criação na unidade produtiva. A partir desses resultados, a densidade de estocagem indicada para alevinos de tambaqui durante 45 dias de cultivo é de 15 peixes/m 2.

28 Glicose Sanguínea (mg/dl) a a b Dias 10 peixes/m 2 15 peixes/m 2 20 peixes/m 2 Figura 3. Glicose sanguínea de alevinos de tambaqui submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados. Letras minúsculas indicam difeenças entre os tratamentos no mesmo tempo. Média ± erro padrão. A resposta neuroendócrina primária é caracterizada por um significativo aumento dos hormônios corticosteróides (cortisol) e da concentração de catecolaminas (adrenalina e noradrenalina), que estimulam a hidrólise das reservas de glicogênio no fígado, aumentando os níveis de glicose no sangue. Affonso et al, (2002), relataram o uso de glicogênio hepático e muscular como fonte de energia em tambaquis. Neste trabalho, os valores de glicogênio hepático não apresentaram alterações significativas durante o todo o período experimental, indicando que os peixes não utilizaram suas reservas de glicogênio hepático para compensar algum tipo de estresse (figura 4). Adicionalmente, foram observados baixos valores de glicogênio muscular durante os primeiros 15 dias para as três densidades avaliadas quando comparados com os respectivos tratamentos aos 30 e 45 dias de experimento (figura 5). Estes baixos índices de glicogênio muscular deve ser atribuído ao baixo peso dos animais ainda nos

29 29 primeiros 15 dias, haja visto que os peixes tinham entre 4,08 a 8,68g de peso total e portanto, um baixo índice de massa corporal. Fujimoto et al (2005) avaliando a suplementação na dieta do cromo trivalente em pacu (P. mesopotamicus) em duas densidades de estocagem (4 e 20 Kg/m 3 ) em 30 dias de cultivo, encontrou maiores concentrações de glicogênio hepático na maior densidade de estocagem (20 kg/m 3 ) para os peixes alimentados sem a suplementação do cromo tetravalente. Aos 15 dias de experimento, os valores das concentrações de glicogênio hepático foram baixos nos peixes alimentados com dieta suplementada com 6 mg de cromo/kg (média=11,64 g/100 g) e intermediários nos peixes alimentados com dieta não suplementada ou suplementada com 12 mg de cromo/quilo. O teor de glicogênio hepático retornou aos valores iniciais no final dos 30 dias de ensaio. Barbosa et al (2007) avaliou respostas metabólicas de matrinxã expostas ao anestésico eugenol, como fator estressante e observou que o glicogênio hepático permaneceu constante durante a exposição ao agente estressor e após 24 horas observou-se queda dos níveis de glicogênio hepático enquanto o glicogênio muscular permaceneu constante durante todo o experimento.

30 Glicogênio Hepático ( g/mg) Dias 10 peixes/m 2 15 peixes/m 2 20 peixes/m 2 Figura 4. Glicogênio hepático em tambaqui (Colossoma macropomum) submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados.média ± erro padrão Glicogênio Muscular ( g/mg) Dias 10 peixes/m 2 15 peixes/m 2 20 peixes/m 2 Figura 5. Glicogênio muscular em tambaqui (Colossoma macropomum) submetidos a diferentes densidades de estocagem durante a recria em viveiros escavados.média ± erro padrão.

31 31 6. Conclusão O aumento da densidade de estocagem influencia na glicose sanguínea que é a principal resposta secundária de estresse em alevinos de tambaqui (C.macropomum). Os níveis de glicose apresentaram valores maiores para o tratamento de maior densidade aos 45 dias de cultivo. Considerando que uma densidade de estocagem ótima é representada pela maior quantidade de peixes produzidas por unidade de área, e diante dos resultados obtidos neste trabalho, sugere-se que para recria de tambaqui seja utilizada a densidade de 15 peixes/m 2 visto que nesta densidade os peixes não apresentaram nenhum resultado fisiológico extremo para a espécie.

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