MELHORA DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DE PACUS ALIMENTADOS COM PROBIÓTICO

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1 MELHORA DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS DE PACUS ALIMENTADOS COM PROBIÓTICO IMPROVEMENT IN HAEMATOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PARAMETERSOF PACU FED WITH PROBIOTIC Thais Heloisa Vaz Farias (1) Gabriela Pala (2) Robson Andrade Rodrigues (3) Fabiana Pilarski (4) Maria José Tavares Ranzani Paiva (5) Resumo O uso de probiótico na aquicultura é uma alternativa sustentável e eficaz para a melhoria da saúde dos peixes. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito das dietas contendo diferentes níveis de inclusão de probiótico sobre os parâmetros hematológicos e bioquímicos de pacu, Piaractus mesopotamicus. Durante 60 dias, os peixes foram alimentados com diferentes níveis (2, 4, 8 e 16 g kg -1 ) de probiótico comercial PAS-TR (Bacillus cereus e Bacillus subtilis) e dieta controle (sem probiótico). A inclusão de probiótico na dieta de pacu proporcionou efeitos benéficos sobre os parâmetros hematológicos de série vermelha e branca, assim como valores menores de glicose e cortisol plasmático, demonstrando que a inclusão de Bacillus cereus e Bacillus subtilis incorporados à dieta de pacus promoveram melhora dos parâmetros hematológicos e supressão dos efeitos do estresse, melhorando o estado de saúde destes animais. Palavras-chave: Bacillus. Cortisol. Glicose. Hematologia. Piaractus mesopotamicus Abstract The use of probiotics in aquaculture is sustainable and effective alternative for improving fish health. The present study aimed to evaluate the effect of diets containing different levels of probiotic on hematological and biochemical parameters of pacu, Piaractus mesopotamicus. 1 Doutora em Aquicultura pelo Centro de Aquicultura da Unesp.. Endereço eletrônico: thais.vfarias@yahoo.com.br 2 Mestre em Aquicultura pelo Centro de Aquicultura da Unesp Endereço eletrônico: gabipala2309vet@gmail.com 3 Doutorando em Ciência Animal pela Universidade Federal do Mato Grosso do Sul. Endereço eletrônico: robson.adrade.rodrigues17@hotmail.com 4 Doutora em Aquicultura pelo Centro de Aquicultura da Unesp. Pesquisadora do Caunesp. Endereço eletrônico: fabianap@caunesp.unesp.br 5 Doutora em Ecologia e Recursos Naturais pela Universidade Federal de São Carlos. Pesquisadora do Instituto de Pesca-SP. Endereço eletrônico: mranzanipaiva@uol.com.br

2 The fish were fed for 60 days with different levels (2, 4, 8 and 16 g kg-1) of commercial probiotic PAS-TR (Bacillus cereus and Bacillus subtilis) and control diet (without probiotics). The inclusion of probiotics in pacu diet provided beneficial effects on hematological parameters of red and white series, as well as lower levels of glucose and plasma cortisol, showing that the inclusion of Bacillus cereus and Bacillus subtilis in the for pacu diet promoted improvement in hematological parameters and suppression of the effects of stress, improving the health status of these animals. Keywords: Bacillus. Cortisol. Hematology. Glucose. Piaractus mesopotamicus 1 Introdução O pacu (Piaractus mesopotamicus) é uma das principais espécies de peixes cultivadas no Brasil e emergente na aquicultura mundial (BILLER et al., 2015), no entanto, a intensificação do cultivo desta espécie predispõe estes animais às enfermidades (FARIAS et al., 2016). Na aquicultura, a inclusão de Bacillus na dieta de peixes como probiótico têm mostrado efeito positivo, melhorando os parâmetros positivos, resposta imune e aumento da resistência aos agentes patogênicos, sendo uma alternativa sustentável e eficaz para a melhoria da saúde dos peixes (FARIAS et al., 2016). Diante disso, este estudo teve por objetivo avaliar o efeito das dietas com probiótico Bacillus cereus e Bacillus subtilis sobre os parâmetros hematológicos e bioquímicos de pacus, P. mesopotamicus. 2 Material e Métodos 660 juvenis de pacu (67,7± 7 g) foram divididos em 20 tanques experimentais (n=33, quatro tanques por tratamento). Quatro grupos foram alimentados com diferentes níveis (2, 4, 8 e 16 g kg -1 ) de probiótico comercial PAS-TR (B. cereus e B. subtilis na proporção 1:1, liofilizadas à concentração de 10 8 UFC g -1 ) e um quinto grupo alimentado com uma dieta controle (sem probiótico). O experimento foi realizado por um período de 60 dias. Após esse período, o sangue total foi coletado para avaliação dos parâmetros hematológicos: hematócrito (Ht), concentração de hemoglobina (Hb), número de eritrócitos (RBC 10 6 ml -1 ) e cálculo das equações hematimétricas (VCM e CHCM). As extensões sanguíneas foram coradas com MG-G-W (May-Grünwald-Gyemsa-Writh) para posterior contagem total e

3 diferencial de trombócitos e leucócitos. O plasma obtido por centrifugação foi utilizado para determinação de cortisol pelo método de ELISA utilizando o kit DBC (Diagnostics Biochem Canadá Inc.), de glicose por método colorimétrico (Labtest, Minas Gerais, Brazil) e determinação de proteínas totais por refratômetro. Os dados foram analisados usando ANOVA e a análise de variância para comparar os diferentes grupos experimentais foi estimada por teste de Tukey (p < 0.05), e testados efeito quadático e linear. 3 Resultados e Discussão A inclusão de B. cereus e B. subtilis na dieta de pacus proporcionou aumento dos valores de hemoglobina e CHCM que foram significativamente superiores quando comparado ao grupo controle (p< 0,05), assim como RBC foi superior nos animais suplementados com 4 g kg 1 (p<0,05) (Tabela 1). Resultados similares foram observados em tilápia (Oreochromis niloticus) (REDA; SELIM, 2015). O aumento dos valores destes parâmetros sugere que a inclusão de probiótico na dieta promoveu a estimulação hematopoiética (GHODRATIZADEH et al., 2011), sendo considerado seguro e capaz de melhorar o estado de higidez dos animais. Tabela 1. Valores médios (± desvio padrão) 1 e ANOVA 2 observado no eritrograma de P. mesopotamicus após 60 dias de alimentação com dieta contendo diferentes níveis de probiótico ( Bacillus cereus e Bacillus subtilis, 1:1, 10 8 UFC g- 1 ). Parâmetros 3 Probióticos ( g kg -1 ) valor de p Ht (%) 37,08 ± 3, ± 4,6 35,8 ± 4,1 36,08±4,15 37,07±4,3 0,3370 Hb (g.dl -1 ) 5,13 ± 0,4c 8,5± 2,3a 8,7 ± 3,4a 8,0±2,8b 7,9 ± 2,5b <0,0001* VCM (fl) ± 19,9 217,03 ± 95,3 199,23 ± 70,6 210,16±83,26 216,53 ± 79,9 0,83855 CHCM (g dl -1 ) 12,67 ± 1,44c 24,4 ± 6,1b 24,4 ± 9,7a 22,7±8,14b 21,7 ± 7b <0,0001* RBC (x 10 6 µl -1 ) 1,7 ± 0,08b 1,8 ± 0.5ab 1,89 ± 0,4a 1,75±0,58ab 1,8 ± 0.6ab <0,0001* 1 Valores médios de 12 amostras; 2 Médias comparadas nas linhas, com pelo menos uma letra em comum não difere dos outros tratamentos no teste de Duncan (p > 0.05); 3 Ht- hematócrito; Hb- hemoglobina; RBC- contagem de células vermelhas; VCM- volume corpuscular médio; CHCM- concentração de hemoglobina corpuscular média; 4 Probabilidade de significância. Os animais alimentados com diferentes níveis de inclusão de probiótico na dieta apresentaram leucocitose com marcada linfocitose absoluta e monocitopenia absoluta (p< 0,05) (Tabela 2), assim como observado por Kangar e Ghane (2012) em trutas (Oncorhynchus mykiss), o que sugere que a inclusão Bacillus na dieta de pacus promove um efeito

4 imunomodulador, levando a uma maior produção ou liberação de linfócitos, que frequentemente está associado ao aumento da resistência do hospedeiro frente aos agentes patogênicos. A contagem de eosinófilos foi superior nos animais do grupo controle e no grupo alimentado com 4 g kg -1 de probiótico (p< 0,05) (Tabela 2), sugerindo uma possível infestação parasitária. Tabela 2. Valores médios (± desvio padrão) 1 e ANOVA 2 observado no leucograma de P. mesopotamicus após 60 dias de alimentação com dieta contendo diferentes níveis de probiótico (Bacillus cereus e Bacillus subtilis, 1:1, 10 8 UFC g- 1 ). Parâmetros 3 valor de p Probiótico (g kg -1) Trom (x 10 3 µl -1 ) ± 10.77b ± 38.55ab ± 32.9ab ± 67.87a ±28.04b 0,0007 Leuc (x 10 3 µl -1 ) ± 4.5b ± 11.8a ± 13.0a ± 10.8a ±14.9a <0,0001 Mono (x 10 3 µl -1 ) ± 84,2a 403,0 ± 52,3b 191,43 ± 25,5b 190,43 ± 28,5b 194,86±30,4b <0,0001 Linf (x 10 3 µl -1 ) ± 4,5b ± 9,63a ± 10.54a ± 9.84a ±14.84a <0,0001 Neutro (x 10 3 µl -1 ) ± ± ± ± ±3.63 0,4335 Eos (x 10 3 µl -1 ) 214,87± 34,8a 32,73 ±7,7 c 162,5± 31,3ab 43,06± 8,1c 89,25±17,8b <0,0001 Leuc. im. (x 10 3 µl -1 ) 1291 ±1014, ±1067, ,5±1257, ,4±884, ,9±858,33 0,4051 CGE (x 10 3 µl -1 ) 430,6 ± 20,3 443,9 ± 49,7 466,4± 59,0 543,3± 67,4 357,1±40,4 0, Valores médios de 12 amostra; 2 Médias comparadas nas linhas, com pelo menos uma letra em comum não difere dos outros tratamentos no teste de Duncan (p > 0.05); 3 Trom-Trombócito; Leuc-Leucócito; Mono-Monócito; Linf-Linfócito; Neutro Neutófilo; Eos-Eosinófilo; Leuc. im- Leucócito imaturo; CGS-Célula Granulocítica Especial; 4 Probabilidade de significância. O fornecimento de probiótico não interferiu nos valores de proteína plasmática (p>0,05) (Tabela 3), demonstrando a manutenção da homeostasia dos fluidos corpóreos destes animais, assim como observado por Wang et al. (2008). Os níveis de cortisol foram significativamente menores nos pacus suplementados com os diferentes níveis de probiótico, assim como menores níveis de glicose foram observados nos animais alimentados com 2, 8 e 16 g kg- 1 refletindo o estado de homeostasia dos animais tratados frente às condições adversas e capacidade do probiótico em suprimir as resposta secundária ao estresse nos pacus. (Tabela 3). Resultados similares foram descritos em dourada (Spaurus aurata) (PICCHIETTI et al., 2009) alimentados com ração suplementada com probiótico

5 Tabela 3. Valores médios (± desvio padrão) 1 e ANOVA 2 observado na bioquímica sanguínea e cortisol sérico de P. mesopotamicus após 60 dias de alimentação com dieta contendo diferentes níveis de probiótico ( Bacillus cereus e Bacillus subtilis, 1:1, 10 8 UFC g- 1 ). Parâmetros Probióticos ( g kg -1 ) valor de p Proteína totais (ml.dl -1 ) 6,87 ± 0,35 6,58 ± 0,34 7,89 ± 8,8 6,49±0,48 6,67±0,4 0,47741 Glisose (mg.dl -1 ) 71,85 ± 2,33a 66,3 ± 18,8b 69,97 ± 18,9a 64,8±15,4c 64,8 ± 15,6c 0,0002 Cortisol (g.dl -1 ) 14,63 ± 5,74a 8,47 ±3,6b 8,05 ± 4,34b 10,08 ± 5,31b 7,86 ± 3,4b <0, Valores médios de 12 amostras; 2 Médias comparadas nas linhas, com pelo menos uma letra em comum não difere dos outros tratamentos no teste de Duncan (p > 0.05); 3 Probabilidade de significância 4 Conclusões Os diferentes níveis de inclusão de B. cereus e B. subtilis incorporados à dieta de pacus promoveram a melhoria dos parâmetros hematológicos e supressão dos efeitos do estresse, melhorando o estado de saúde destes animais. Referências BILLER-TAKAHASHI, J. D.; TAKAHASHI, L. S.; MINGATTO, F. E.; URBINATI, E. C. The immune system is limited by oxidative stress: Dietary selenium promotes optimal antioxidative status and greatest immune defense in pacu Piaractus mesopotamicus. Fish Shellfish Immunology, v.47., p , FARIAS, T. H. V.; LEVY-PEREIRA, N.; DE OLIVEIRA ALVES, L.; DE CARLA DIAS, D.; TACHIBANA, L.; PILARSKI, F.; RANZANI-PAIVA, M. J. T. Probiotic feeding improves the immunity of pacus, Piaractus mesopotamicus, during Aeromonas hydrophila infection. Animal Feed Science and Technology. v.211., p , GHODRATIZADEH, S.; GHODRATIZADEH, S.; FARHOUDI, M.; HABIBIAN, R. Effects of addition of Saccharomyces cerevisae and Bacillus subtilis in diets on selected hematological and biochemical parameters in common carp (Cyprinus carpio). World Journal of Fish and Marine Science. v. 3., p , KAMGAR, M.; GHANE, M. Evaluation of Bacillus subtilis Effect as Probiotic on Hematological Parameters of Rainbow Trout, Oncorhynchus mykiss (WaIbaum) Following Experimental Infection with Streptococcus iniae. Journal of Fisheries and Aquatic Science, v.7., p , PICCHIETTI, S.; FAUSTO, A. M.; RANDELLI, E.; CARNEVALI, O.; TADDEI, A. R.; BUONOCORE, F.; SCAPIGLIATI, G.; ABELLI, L. Early treatment with Lactobacillus delbrueckii strain induces an increase in intestinal T-cells and granulocytes and modulates immune-related genes of larval Dicentrarchus labrax (L.). Fish & Shellfish Immunology, v. 26., p , 2009.

6 REDA, R. M.; SELIM, K. M. Evaluation of Bacillus amyloliquefaciens on the growth performance, intestinal morphology, hematology and body composition of Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Aquaculture International, v.23., p , WANG, Y. B.; TIAN, Z. Q.; YAO, J. T.; LI, W. F. Effect of probiotics, Enteroccus faecium, on tilapia (Oreochromis niloticus) growth performance and immune response. Aquaculture, v.277., p , 2008.