CARACTERIZAÇÃO E CONTAGEM DIFERENCIAL DE CÉLULAS DA SÉRIE BRANCA EM Astyanax altiparanae

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1 CARACTERIZAÇÃO E CONTAGEM DIFERENCIAL DE CÉLULAS DA SÉRIE BRANCA EM Astyanax altiparanae Flávia Regina Moraes da Silva; Alessandra Paim Berti*; Maria Aparecida Martins Alves e Yzel Rondon Súarez *Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul (UEMS), Dourados, MS. alessandrabiologa@hotmail.com Resumo Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de obter definições relacionadas à contagem diferencial da série branca como instrumento de análise das condições fisiológicas e indicativo das condições ambientais, através do estudo hematológico em Astyanax altiparanae. Foram coletadas 75 amostras de sangue em dois períodos (verão e inverno) de dois locais distintos, considerando as possíveis influências das condições climáticas. As mesmas foram fixadas em lâminas, coradas e analisadas através de microscopia óptica, com objetiva de imersão. No ambiente natural, verificou-se uma elevação no número de monócitos, seguido por basófilos, indicando condição de estresse ambiental, devido a variações climáticas, dentre outros fatores ambientais, o que estimula respostas fisiológicas no animal. O baixo valor das células da série branca para a maioria dos indivíduos sob cultivo principalmente no período do verão, demonstrou uma boa condição de sanidade dos organismos, tendo em vista que não houve queda de temperatura. Entretanto, os resultados apresentaram o componente celular da série branca que geralmente é encontrado em Astyanax altiparanae, tanto em condições de cultivo, como em condições naturais nos dois períodos analisados. Introdução Segundo Godinho (1999), na década de 70 houve uma grande preocupação quanto à ampliação dos conhecimentos sobre os ambientes aquáticos e as espécies que neles vivem, direcionando as pesquisas para esta área de conhecimento, principalmente aos voltados á criação de organismos aquáticos considerando sua importância socioeconômica. Para se verificar quais as condições mais propícias para o cultivo da espécie que se pretende criar, torna-se necessária a ampliação dos conhecimentos relacionados à biologia destes animais e como estes respondem a diversas alterações ambientais e métodos de manejo (Baldisseroto, 2002). No setor de produção aqüícola nacional, a produção de peixes de água doce é a única atualmente presente em quase todo o território nacional, representando quase 80% do total da produção em aqüicultura. A principal preocupação do setor está relacionada à qualidade da água dos ambientes de cultivo, cujas condições apresentam relações diretas com as características fisiológicas e sanitárias desses animais, portanto, o foco atual da produção é o cultivo das espécies em condições de manejo economicamente sustentável que garanta melhores condições sanitárias para as espécies cultivadas, sendo também preocupação do setor os impactos ambientais em função do uso do solo, dos recursos hídricos bem como dos efluentes gerados na produção (Roubach et al. 2003). Nos últimos anos observou-se o aumento do interesse econômico sobre a espécie Astyanax altiparanae, a qual é bastante comum nos cursos d água no entorno do Município

2 de Dourados, MS (Oliveira & Duarte, 2003). Sendo assim, apresenta-se a necessidade de obtenção de informações sobre a biologia básica da mesma. Desta forma, o conhecimento das características hematológicas é de fundamental importância como critério de avaliação das condições fisiológicas e das relações das mesmas com o ambiente, em qualquer grupo animal, portanto, faz-se necessário um estudo hematológico para obtenção de definições relacionadas à contagem diferencial da série branca como instrumento de análise das condições fisiológico e indicativo das condições ambientais. Este trabalho teve como objetivo a determinação dos valores de referência para a série branca em Astyanax altiparanae. Material e Métodos: Foram coletadas 75 amostras de sangue dos animais Astyanax altiparanae em dois períodos, sendo 25 coletadas nos tanques da UEMS, sob condição de cultivo no verão, 25 no ambiente natural, no córrego Curral de Arame do Município de Dourados, realizada no inverno e 25 novamente no tanque sob cultivo, no inverno, considerando as possíveis influências das condições climáticas. As amostras sanguíneas foram coletadas através de punção da veia caudal, empregando-se seringas e agulhas para insulina previamente heparinizadas. Foram coletadas amostras de cerca de 0,5 ml de sangue por animal (Grassi, 1996). A confecção das lâminas foi efetuada através do processo de esfregaço de sangue, sendo preparado imediatamente após a colheita, secos a temperatura ambiente. Para a coloração utilizou-se o corante de Leishman. A contagem diferencial de leucócitos segue a metodologia descrita em Ranzani & Paiva (1981), realizada através de microscopia óptica, com objetiva de imersão. Foram contados todos os elementos da série branca. O termo diferencial neste contexto refere-se a diferenças percentuais por tipo de célula. Resultados e Discussão: Em relação às células da série branca de Astyanax altiperanae, foi possível a identificação de diferentes tipos como: monócitos, neutrófilos, basófilos, trombócitos, linfócitos, eosinófilos e macrófagos. A nomenclatura aplicada baseia-se nos aspectos morfológicos do núcleo e da disposição granular do citoplasma de acordo com Tavares Dias et al. (2002) & Roberts (1981). Os valores médios dos componentes da série branca encontrada em Astyanax altiparanae estão representados na Figura 1. Já a tabela 1 apresenta os resultados da análise de variância dos componentes celulares para esta espécie.

3 Sob cultivo (verão) Ambiente natural(inverno) Sob cultivo (inverno) 10 0 Monócitos Neutrófilos Basófilos Trombócitos Linfócitos Eosinófilos Macrófagos Figura 1. Representação dos valores médios dos componentes da série branca encontrada em Astyanax altiparanae, levando em conta a condição de cultivo (verão), natural (inverno) e cultivo (inverno), Tabela 1. Representação dos resultados da análise de variância dos componentes celulares de Astyanax altiparanae, levando em conta a condição de cultivo (verão), natural (inverno) e cultivo (inverno), Tipos celulares Sob cultivo (verão) Ambiente natural Sob cultivo (inverno) (inverno) Monócitos 30,76 49,88 31,76 Neutrófilos 8 12,07 10,31 Basófilos 13,68 19,3 10,18 Trombócitros 2,75 3,5 2 Linfócitos 4,66 3,8 3,2 Eosinófilos 9 10,5 12 Macrófagos 1 2,5 2,5 Desvio Padrão 10, , , A descrição das características das células da série branca em peixes de água doce pode fornecer subsídios importantes para o diagnóstico e prognóstico das condições mórbidas em populações de peixes e, contribuir para a compreensão da fisiologia comparativa, relação filogenética, condições alimentares e outros parâmetros ecológicos. Apesar de muitos dos resultados obtidos apresentarem dados conflitantes á nomenclatura dos componentes da série branca, considerando as espécies nativas do Brasil, em peixes parece haver grande dificuldade na aplicação da classificação usual dos leucócitos aplicada á mamíferos (Tavares-Dias & Mataqueiro, 2004; Dhutie, 1939 apud Ranzani-Paiva, 1981). Neste estudo observou-se baixa quantidade de macrófagos, trombócitos e linfócitos em relação aos demais tipos celulares, tanto em condições de cultivo como em ambiente natural nos dois períodos verão e inverno. Pode-se sugerir que boa parte dos peixes não está sujeita a quadros infecciosos e nem de hemorragia, considerando baixos valores para macrófagos linfócitos e trombócitos. Segundo Ranzani-Paiva (2003) os monócitos são precursores dos macrófagos nas ações fagocitárias, agindo diretamente na fagocitose de bactérias e vírus, correntes na circulação, e apresenta grande velocidade de migração para regiões inflamadas. Sendo assim

4 o número de macrófagos neste estudo deveria ser ao menos similar ao de monócitos, portanto isso não ocorre considerando a presença de macrófagos individualizada da presença de monócitos. Os linfócitos ou células imunocompetentes conforme Ueda et al. (2003) e Roberts (1981) são responsáveis pela resposta imunitária em peixes, bem como nos demais vertebrados. Já os trombócitos em peixes teleósteos são células multifuncionais que estão envolvidas na liberação de eicosanoides no processo de coagulação sanguínea, argumento relatado por Lloyd-Evans et al. (1994), contudo Tavares-Dias et al. (2002) descreve que os trombócitos participam na defesa orgânica, pois embora não sejam células consideradas de linhagem leucocitária, também realizam fagocitose. Foi observada alta quantidade de monócitos, seguidos por basófilos e neutrófilos nos dois períodos e nos dois ambientes, principalmente no ambiente natural (inverno). Os monócitos apresentaram-se sempre comum nas lâminas analisadas, podendo inferir que estas células são predominantes dessa espécie, a elevação desta e das demais células no ambiente natural (inverno), pode ser conseqüência das diferentes condições ambientais, pois se trata de localidades distintas, com características de água também distintas, sendo o ambiente natural heterogêneo e ambiente de cultivo homogêneo, levando em conta a queda da temperatura, no inverno. Assim os peixes respondem fisiologicamente às alterações ambientais como forma de adaptação á esse ambiente, considerando que indivíduos de tamanhos diferentes liberam energia em quantidades também diversa de acordo com seu tamanho corporal, podendo interferir no seu quadro hematológico (Tavares-Dias & Moraes, 2004). As variações intra-específicas são influenciadas por características próprias de cada indivíduo, relacionadas ao caráter migratório dos leucócitos entre a circulação e os órgãos leucopoéticos (rim e baço), em resposta aos estímulos ambientais que cada indivíduo está sujeito (Ranzani-Paiva et al., 1998/1999). Ribeiro (1978) considera que os neutrófilos são responsáveis pela limpeza de regiões afetadas por infecções ou necroses, assim como os macrófagos. Entretanto, Roberts (1981) indica que a liberação dos neutrófilos seja em função de atividade adeno-hipofisiaria, refletindo uma série de fatores, apresentando função similar a observada em mamíferos. Sobre os basófilos e eosinófilos Ueda et al. (2001), não há na literatura a conclusão para as suas respectivas funções, acredita-se que eosinófilos tenha alto poder fagocitário e estão geralmente aglomerados em regiões inflamadas ou parasitadas. Roberts (1981) corrobora com esta afirmação a respeito da função do eosinófilo e, associa o basófilo a quadros de estresse. Sugere-se que para A. altiparanae a presença de basófilos pode estar realmente relacionada ao quadro de estresse, observando que os indivíduos que apresentaram maior índice deste componente celular, foram coletados no período de inverno e no ambiente natural, tendo em vista a queda da temperatura, escassez de itens alimentares, dentre outros fatores que desencadeie quadros de estresse em peixe. A contagem diferencial da série branca tem sido usada para detecção de grande quantidade de doenças de peixe, pois em alterações na aparência e freqüência de normal distribuição de uma determinada células podem, em muitos casos, revelar um quadro patológico específico (Ranzani-Paiva, 1981).

5 Contudo há grande dificuldade de comparação dos componentes celulares, pois vários autores descrevem os mesmos componentes com nomenclaturas distintas, como por exemplo, o basófilo que autores como Tavares-Dias et al. (2002) e Ranzani-Paiva et al. (2003), denominam como células granulocíticas especiais. Pouco se conhece até o presente momento sobre a origem e o desenvolvimento dos leucócitos nos peixes, embora algumas idéias vêm sendo propostas desde o inicio do século. Os dados obtidos dos estudos se hematologia e/ou órgãos hematopoéticos são ainda poucos conclusivos (Tavares-Dias et al., 2002; Tavares-Dias & Moraes, 2004). Conclusão Os resultados do presente estudo comprovam em Astyanax altiparanae, o componente celular da série branca que geralmente sempre é encontrado nas amostras de sangue de peixes, tanto em condições de cultivo, como em condições naturais nos dois períodos, verão e inverno. O monócito, seguido por basófilos, verificando uma elevação no número destas células em ambiente natural, nos quais indica condição de estresse ambiental, devido a variações climáticas, dentre outros fatores ambientais que variam muito de forma que estimula uma resposta fisiológica no animal. O baixo valor das células da série branca para a maioria dos indivíduos sob cultivo principalmente no período do verão, indica uma boa condição de saúde dos organismos, pois não houve queda de temperatura. As oscilações ambientais no sistema fechado são bem menores, sendo um ambiente homogêneo e com muitos itens alimentares, proporcionados pelas algas, aguapés e certos insetos aquáticos presentes no tanque. Para uma maior compreensão do comportamento dos componentes celulares do sangue se faz necessário o desenvolvimento de outros estudos, principalmente para maiores definições dos macrófagos como conseqüência da maturação de monócitos em Astyanax altiparanae. Referências BALDISSEROTO, B. Fisiologia de Peixe Aplicada á Piscicultura, Santa Maria: ed. UFSM, p.15-16, GODINHO, H. M; MARTINS, M. A; SILVEIRA, W. F. Secretaria da Agricultura e Abastecimento, Coordenadoria de Pesquisas dos Agronegócios Instituto de pesca, São Paulo, 1999, (acessado na internet em 15/09/05). GRASSI, L.E. Estudos hematológicos em Gymnotus aff carapo (Teleostei, Gymnotidae). Influências de fatores ambientais, sexo e estádios de maturação. Rio Claro, p. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) - Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista.

6 LLOYD-EVANS, P; BARROW, S. E; HILL, D. J; BOWDEN, L. A; RAINGER, G. E; KNIGHT, J; ROWLEY, A. F. Eicosanoid generations and effects on the aggregation of thrombocytes from the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Biochim. Biophy. Acta, Amsterdam, 1215: , OLIVEIRA, M. C; DUARTE, M. M. Levantamento Ictiofaunistico do Córrego Água Boa Dourados -M.S. Dourados, p. Monografia (Licenciatura em ciências Biológicas)- Universidade Federal de Mato Grosso do Sul. RANZANI-PAIVA, M. J. T. et. al. Análise hematológica de Curimbatá (Prochilodus scrofa), pacu (Piaractus mesopotamicus) e tambaqui (Colossomamacropomum) das estações de psicultura do instituto de pesca, Estado de São Paulo, Bolteim do instituto de pesca, São Paulo, V.25, p.77-83, 1988/1999. RANZANI PAIVA, M.J.T. Estudos hematológicos em curimbatá, Prochilodus scrofa Steindacher, 1981 (Osteichthyes, Cypriniformes, Prochilodontidae). São Carlos, p. Dissertação de mestrado, Universidade Federal de São Carlos. RANZANI-PAIVA, M. J. T; RODRIGUES, E. L; VEIGA, M. L; EIRAS. A. C; CAMPOS, B.E.S. Diferential Leukocytes Counts in DOURADO Salminus maxillosus ALENCIENNES, 1840, From the Mogi-Guasu River, Pirassununga, SP, Braz J.Biol., 63(3): ,2003. ROBERTS, R.J. Patologia de Los Peces. Madrid, Editora - Ediciones Mundi - Prensa, Edição Española, RIBEIRO, W.R. Contribuição ao estudo da hematologia de peixes. Morfologia e Citoquimica das células do sangue e dos tecidos hematopoéticos do Mandi Amarelo, Pimelodus maculatus Lacépede, Ribeirão Preto 1978, 110p. Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção de título de Doutor em Ciência. ROUBACH, R; CORREIAS, S. Z. R; CAVALLI, C. M. Revista Panorama da Aqüicultura Vol. 13, nº 76, Blumenal - SC, TAVARES-DIAS, M; MELO, J. F.B; MORAES, G & MORAES, F. R. Características Hematológicas de Teleósteos Brasileiros. IV. Variáveis do Jundiá Rhamdia quelen (Pimelodidae), Ciência Natural, V.32, nº4, Santa Maria - RS, p , TAVARES-DIAS,M & MATAQUEIRO, M. I. Características hematológicas, bioquímicas e biométricas de Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Osteichthyes: Characidae) oriundos de cultivo intenso. Biological Scieces, V.26, nº2, Maringá - PR, p , TAVARES-DIAS, M; MORAES, F.R. Hematologia de peixes teleósteos. Ribeirão Preto: M. Tavares-Dias, UEDA, I.K; EGAMI, M. I; SASSO, W. S; MATUSHIMA, E.R.Citochemical aspects of the peripheral blood cells of Oreochromes (Tilapia) niloticus (Linnaeus,1758) (Cichlidae, Teleóste) Part II. Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. São Paulo, V.38,n.6, p , 2001.