Marcos Tavares-Dias* e Maria Isabel Mataqueiro

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1 Características hematológicas, bioquímicas e biométricas de Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Osteichthyes: Characidae) oriundos de cultivo intensivo Marcos Tavares-Dias* e Maria Isabel Mataqueiro Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista, Via Prof. Paulo Donato Castellane, s/n, , Jaboticabal, São Paulo, Brasil. *Autor para correspondência. tavares-dias@bol.com.br RESUMO. O estudo das características sangüíneas pode fornecer subsídios importantes para o diagnóstico e prognóstico das condições mórbidas em populações de peixes e, contribuir para a compreensão da fisiologia comparativa, relação filogenética, condições alimentares e outros parâmetros ecológicos. Foram estudados no teleósteo Piaractus mesopotamicus o eritrograma, leucograma, trombograma, a glicemia, o cortisol, a relação hepatosomática e a relação esplenosomática. Os valores da relação hepatosomática variaram de 0,67% a 2,79%, a relação esplenosomática de 0,011% a 0,108%, número de eritrócitos de 1,870 a 4,590 x 10 6 /µl de sangue, concentração de hemoglobina de 5,7 a 12,1g/dL, hematócrito de 24,0% a 40,0%, volume corpuscular médio de 98,0 a 174,0fL, concentração da hemoglobina corpuscular média de 19,1 a 34,2g/dL, glicose plasmática de 40,6 a 89,2mg/dL e cortisol plasmático de 4,73 a 110,5ng/dL. O número de trombócitos totais variou de 12160,0 a 89280,0/µL de sangue e leucócitos de 2019,0 a 47473,0/µl de sangue. Na contagem diferencial de leucócitos foram observados 54,1% de linfócitos; 10,9% de neutrófilos; 10,3% de monócitos; 9,9% de leucócitos granulares PAS-positivos (LG-PAS); 6,7% de eosinófilos; 0,3% de basófilos e 7,8% de leucócitos imaturos. Variações intraespecíficas foram observadas em todas as características estudadas, podendo ser consideradas como normais, no que tange aos peixes. Não se deve esperar, portanto, que as características biológicas em peixes apresentem- se distribuídas normalmente. Palavras-chave: cultivo, peixe de água doce, Piaractus mesopotamicus, sangue, hematologia. ABSTRACT. Hematological, biochemical and biometric characteristics of Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (Osteichthyes: Characidae), reared in captivity. Hematological characteristics are important tools for diagnosis and prognostic features in fish population and they contribute to the comprehension of comparative physiology, phylogenetic relation, food habit and other ecological parameters. Red blood cell count (RBC), white blood cell count (WBC), thrombocytes counts, glucose, cortisol, hepatosomatic and splenosomatic relation were evaluated in Piaractus mesopotamicus. The values of hepatosomatic relation varied from 0.67% to 2.79% and splenosomatic relation from 0.011% to 0.108%. RBC to x 106/µL, hemoglobin concentration 5.7 to 12.1g/dL, haematocrit 24.0% to 40,0%, mean corpuscular volume 98.0 to fl, mean corpuscular haemoglobin concentration 19.1 to 34.2g/dL, glucose 40.6 to 89.2mg/dL and cortisol 4.73 to 110.5ng/dL. The number of total thrombocytes was 12,160.0 to 89,280.0/µL and WBC 2,019.0 to 47,473.0/µL. Differential count of leucocytes showed 54.1% limphocytes, 10.9% neutrophils, 10.3% monocytes, 9.9% PAS-positive granular leukocytes (PAS-GL), 6.7% eosinophils, 0.3% basophils and 7.8% immature leucocytes. Variation of these haematological characteristics in the same fish species was observed, being considered as the normal variation in the fish concerned. Hence it is incorrect to assume that biological characteristics in fishes are distributed normally. Key words: culture, freshwater fish, Piaractus mesopotamicus, blood, hemathology. Introdução Vários peixes nativos brasileiros despertaram o interesse dos piscicultores e pesquisadores devido as suas características de crescimento rápido, boa conversão alimentar, facilidade de reprodução induzida e por características apropriadas à pesca esportiva

2 158 Tavares-Dias e Mataqueiro (Tavares-Dias et al., 1999a). Dentre eles destaca-se o pacu Piaractus mesopotamicus, espécie da família Characidae (subfamília Myleinae), encontrado na América do Sul, nos rios que compõem a bacia do Prata e Pantanal Mato-Grossense (bacia do Alto Paraguai). Devido a tais características, essa espécie neotropical vem sendo cultivada em todas as regiões do Brasil, e recentemente seu cultivo foi introduzido em Israel. Mesmo sendo uma importante espécie para a aqüicultura brasileira, pouco se conhece sobre sua fisiologia, especialmente no tocante às características sangüíneas. Os estudos bioquímicos contribuem para compreensão de variações das características sangüíneas em relação a fatores como posição filogenética, hábitos ecológicos, seleção alimentar e meio de vida (Carneiro e Amaral, 1979). A determinação dos valores médios da relação hepatosomática e esplenosomática é importante para a compreensão dos distúrbios que podem ocorrer durante os processos patológicos. Esplenomegalia sugere o desenvolvimento de respostas leucocitárias às infecções ou a produção de eritrócitos para reposição sangüínea em casos de processos anemiantes. A aqüicultura intensiva tem necessidade de informações acuradas sobre a identificação e o controle de situações de estresse e/ou de enfermidades, a fim de assegurar a saúde dos peixes. Nesse caso, o estudo das variáveis hematológicas assume importância como meio auxiliar de diagnóstico (Tavares-Dias et al., 2000a; Tavares-Dias e Moraes, 2004). Estudos prévios descreveram o eritrograma e o percentual de leucócitos em Piaractus mesopotamicus oriundos de policultivo (Tavares-Dias et al., 1999b) e de cultivo semi-intensivo (Ranzani-Paiva et al., 1998/1999). Devido a todos os fatores supramencionados, o presente trabalho teve como objetivo descrever os valores do eritrograma, leucograma, trombograma, glicemia, cortisol, relação hepato e esplenosomática em P. mesopotamicus, mantidos em cativeiro no Caunesp, Jaboticabal, Estado de São Paulo. Material e métodos Peixes e características de criação Piaractus mesopotamicus oriundos de uma mesma desova foram mantidos em viveiro do Centro de Aqüicultura da Universidade Estadual Paulista (Caunesp), Campus de Jaboticabal, Estado de São Paulo, Brasil, por 3 a 4 meses. Durante a alevinagem, os peixes foram alimentados com ração farelada contendo 42% de proteína bruta e, na engorda, ração extrusada com 28% de proteína bruta. Ao fim desse período, 48 espécimes (peso corporal variando de 102,8g a 324,2g) foram submetidos aos exames hematológico, bioquímico e biométrico. Avaliações hematológicas Os peixes foram anestesiados com solução aquosa de benzocaína (1g/15L) e, em seguida, por punção do vaso caudal e com auxílio de seringa contendo EDTA, (10%) colheu-se 1,0mL de sangue de cada animal. Essa alíquota destinou-se à determinação da contagem de eritrócitos, hemoglobina, hematócrito, volume corpuscular médio (VCM) e concentração da hemoglobina corpuscular média (CHCM), de acordo com metodologia previamente descrita (Tavares-Dias et al., 2000a, 2002) e do trombograma, leucograma, glicose e cortisol. Para a contagem diferencial de leucócitos, contagem de leucócitos e de trombócitos totais, extensões sangüíneas foram confeccionadas e coradas de acordo com método previamente descrito (Tavares- Dias e Moraes, 2003). A identificação e nomenclatura dos leucócitos seguiu as recomendações de Tavares- Dias et al. (1999b). A contagem de leucócitos e trombócitos foi realizada por métodos indiretos. Para tal, em 10 campos similares de cada extensão sangüínea foram quantificados o número de eritrócitos, o número de leucócitos e de trombócitos. De posse desses resultados e da contagem de eritrócitos em hemocitômetro, em cada peixe foi realizado o seguinte cálculo: 1) Leucócitos (µl de sangue) = número de leucócitos x contagem de eritrócitos/µl número eritrócitos na extensão sangüínea 2) Trombócitos (µl de sangue) = número trombócitos x contagem de eritrócitos/µl número eritrócitos na extensão sangüínea Avaliações bioquímicas do plasma A determinação do cortisol foi obtida pelo método de radioimunoensaio, utilizando Kits DPC (Diagnostic Products Corporation). Para a dosagem da glicose, utilizou-se a metodologia preconizada por King e Garner (1947). Avaliações biométricas Após a colheita sangüínea, foram retirados e pesados o fígado e baço. De posse desses dados e do peso corporal, determinou-se a relação hepatosomática (RHS%) e a relação esplenosomática (RES%), segundo método previamente descrito (Tavares-Dias et al., 2000b). Resultados Os valores médios, a variação e o coeficiente de variação do eritrograma, características biométricas e

3 Características hematológicas de Piaractus mesopotamicus 159 bioquímicas em P. mesopotamicus estão relacionados na Tabela 1. Variação intraespecífica ocorre na relação hepato e esplenosomática, eritrograma, glicose e cortisol plasmáticos. Os valores da relação hepatosomática, relação esplenosomática e cortisol apresentam elevado coeficiente de variação. O trombograma e o leucograma em P. mesopotamicus são mostrados na Tabela 2. Variação intraespecífica ocorre nos valores do trombograma e leucograma. Os leucócitos foram classificados em linfócitos, neutrófilos, monócitos, leucócitos granulares PAS-positivo (LG-PAS), eosinófilos, basófilos e células imaturas. A contagem de trombócitos e leucócitos totais apresenta elevado coeficiente de variação, 31,3% e 51,9%, respectivamente. No leucograma, a contagem de linfócitos é a que apresentou menor coeficiente de variação. Tabela 1. Valores médios ± desvio padrão, variação e coeficiente de variação (CV) da relação hepatosomática (RHS) e relação esplenosomática (RES), eritrograma, glicose e cortisol plasmáticos em P. mesopotamicus oriundos de cultivo intensivo, Centro de Aqüicultura da Unesp, Jaboticabal, São Paulo. Parâmetros Valores médios Variação CV(%) RHS (%) 1,80 ± 0,57 0,67 2,79 31,8 RES (%) 0,023 ± 0,018 0,011 0,108 77,9 Glicose (mg/dl) 63,0 ± 8,1 40,6 89,2 12,8 Cortisol (ng/ml) 31,4 ± 19,1 4,73 110,51 60,9 Eritrócitos (x 10 6 /µl) 2,964 ± 0,63 1,870 4,590 21,3 Hemoglobina (g/dl) 8,9 ± 1,5 5,7 12,1 17,3 Hematócrito (%) 31,9 ± 4,8 24,0 40,0 14,9 VCM (fl) 125,0 ± 16,9 98,0 174,0 13,5 CHCM (g/dl) 28,7 ± 2,9 19,1 34,2 10,0 Tabela 2. Valores médios ± desvio padrão, variação e coeficiente de variação (CV) do trombograma e leucograma em P. mesopotamicus oriundos de cultivo intensivo, Centro de Aqüicultura da Unesp, Jaboticabal, São Paulo. LG-PAS = leucócitos granulares PAS-positivos. Parâmetros Valores médios Variação CV(%) Trombócitos (µl) 56584,3 ± 17696, , ,0 31,3 Leucócitos (µl) 18730,8 ± 9721,1 2019, ,0 51,9 Linfócitos (µl) 10260,8± 6700,1 3224, ,4 65,3 Linfócitos (%) 54,1 ± 14,4 25,0 75,0 27,5 Neutrófilos (µl) 1695,5 ± 1982,8 141, ,8 109,0 Neutrófilos (%) 10,9 ± 10,6 1,0 48,0 97,7 Monócitos (µl) 1945,8 ± 1927,3 70, ,0 99,0 Monócitos (%) 10,3 ± 7,3 0,0 30,0 71,0 LG-PAS (µl) 1952,7 ± 2953,0 0, ,0 151,2 LG-PAS (%) 9,9 ± 12,7 0,0 59,0 128,9 Eosinófilos (µl) 1295,9 ± 1762,4 0,0 9019,8 131,6 Eosinófilos (%) 6,7 ± 6,0 0,0 23,0 89,0 Basófilos (µl) 39,9 ± 128,0 0,0 696,3 313,6 Basófilos (%) 0,3 ± 0,8 0,0 4,0 296,2 Células imaturas (µl) 1428,1 ± 1267,2 183,7 5619,3 88,7 Células imaturas (%) 7,8 ± 4,7 1,0 17,0 60,0 Discussão Os valores médios da relação hepato e esplenosomática em juvenis de P. mesopotamicus do presente trabalho foram superiores aos descritos por Tavares-Dias et al.(2000b), para peixes jovens dessa mesma espécie. Os resultados da relação hepatosomática também são maiores que os verificados em adultos de P. mesopotamicus, em que as fêmeas mostram redução dos níveis de glicemia juntamente com a diminuição dessa relação quando comparadas aos machos (Ranzani-Paiva e Godinho, 1988). Todavia, tais valores biométricos podem variar com a idade, o ambiente (Tavares-Dias et al., 2000b) e as condições fisiológicas. O cortisol é o principal corticosteróide nos teleósteos e sua concentração plasmática aumenta consideravelmente durante estresse. Esse hormônio afeta o metabolismo de carboidratos, principalmente a glicemia e o glicogênio hepático (Barton e Iwama, 1991). Diversos fatores, incluindo a temperatura, a nutrição e o período do dia, podem influenciar os níveis basais desse hormônio (Barton e Iwama, 1991). Em P. mesopotamicus do presente ensaio, o nível plasmático de cortisol mostrou variação intraespecífica, 4,73 110,51ng/mL e interespecífica, uma vez que seus valores médios (31,4ng/mL) são inferiores aos valores basais descritos nos Characidae Brycon cephalus, 125,9ng/mL (Urbinati e Carneiro, 2001) e C. macropomum, 182,1ng/mL (Tavares-Dias e Sandrin, 1998; Tavares-Dias et al., 2001). A literatura sugere que os níveis basais médios de corticosteróide varia de 30,0 a 40,0ng/mL, mas o ideal seriam valores menores que 5,0ng/mL (Barton e Iwama, 1991), e que nos peixes em melhores condições de bem-estar é menor o nível circulante desse hormônio (Esch e Hazen, 1980). Foi sugerido que possivelmente o elevado nível circulante de cortisol em C. macropomum pode ser o responsável pelos freqüentes problemas de infecções parasitárias enfrentados por piscicultores após a manipulação e/ou transporte (Tavares-Dias e Sandrin, 1998). O nível plasmático de glicose em juvenis de P. mesopotamicus foi inferior ao relatado para adultos de ambos os sexos dessa mesma espécie em confinamento (Ranzani-Paiva e Godinho, 1988; Zuim et al., 1988) e em ambiente natural (Zuim et al., 1988). No entanto, quando comparado a outras espécies da família Characidae, observa-se que os valores médios dos peixes analisados neste trabalho, 63,0mg/dL, foram inferiores aos do Myleinae C. macropomum, 116,7mg/dL (Tavares-Dias e Sandrin, 1998) mas similares aos do Bryconinae B. cephalus, 60,4mg/dL (Tavares-Dias et al., 1999a). Diversos fatores ambientais e não ambientais podem afetar os níveis basais de glicose em peixes teleósteos (Barton e Iwama, 1991).

4 160 Tavares-Dias e Mataqueiro Em P. mesopotamicus de cultivo intensivo, os valores médios da contagem de eritrócitos, concentração de hemoglobina e CHCM foram superiores aos valores relatados para essa mesma espécie quando em policultivo (Tavares-Dias et al., 1999b) e em cultivo semi-intensivo (Ranzani-Paiva et al., 1998/1999), mas o VCM foi menor e o percentual de hematócrito similar aos desses dois estudos. Tais resultados divergentes podem ser considerados resposta natural desses peixes ao ambiente, já que são provenientes de localidades distintas e com características da água também distintas. Os peixes respondem fisiologicamente às alterações de oxigênio na água, como forma de adaptação a esse ambiente (Tavares-Dias e Moraes, 2004). Em P. mesopotamicus, o coeficiente de variação (CV%) da contagem de eritrócitos (21,3%), hematócrito (14,9%), hemoglobina (17,3%), VCM (13,5%) e CHCM (10,0%) foi relativamente elevado, mas pode ser considerado dentro do esperado, uma vez que os valores do CV são normalmente elevados em peixes. Todavia, esses valores são muito superiores aos do homem, os quais apresentam uma distribuição normal. Os trombócitos em peixes teleósteos são células multifuncionais que estão envolvidas na liberação de eicosanoides (Lloyd-Evans et al., 1994), no processo de coagulação sangüínea (Jagadeeswawaran et al., 1999) e na defesa orgânica, pois embora não sejam consideradas de linhagem leucocitária, também realizam fagocitose (Tavares-Dias et al., 1999a,b; Tavares-Dias et al., 2000a,c,d; Tavares-Dias et al., 2002; Tavares-Dias e Moraes, 2004). Em P. mesopotamicus deste estudo, o número de trombócitos totais mostrou variação intraespecífica e os valores médios são similares aos descritos em Hoplias malabaricus (Camargo et al., 1986/87) e Oreochromis niloticus (Ueda et al., 1997) mas são superiores aos relatados por Foresti et al. (1977), em H. malabaricus. Variação intraespecífica também ocorreu nos estudos de Camargo et al. (1986/87) e Ueda et al. (1997). Hines e Yashouv (1970) postularam que a elevada variabilidade no número de trombócitos deve-se à retenção dessas células nos órgãos trombopoiéticos. Entretanto esse fato não procede, pois sabe-se que os trombócitos são produzidos no rim e no baço dos peixes teleósteos (Tavares-Dias e Moraes, 2004) e apresentam diversas funções e, portanto, estão em constante movimentação entre esses órgãos e a circulação. Assim, deve-se considerar que isso pode causar variabilidade no número dessas células quando no sangue. Além disso, a resposta individual aos diferentes estímulos ambientais não é igual para cada indivíduo. Os valores médios de leucócitos em teleósteos podem apresentar variações intraespecífica (Hines e Yashouv, 1970; Tandon e Joshi, 1976; Ueda et al., 1997; Tavares-Dias et al., 1999a,b,c, 2000a,c,d) e interespecífica (Tandon e Joshi, 1976; Ranzani-Paiva et al., 1998/1999). As variações intraespecíficas são influenciadas por características próprias de cada indivíduo, relacionadas ao caracter migratório dos leucócitos entre a circulação e os órgãos leucopoéticos (rim e baço), em resposta aos estímulos ambientais que cada indivíduo está sujeito. São, portanto, variações normalmente esperadas em peixes, e cada indivíduo pode responder de maneira distinta a tais estímulos. As variações interespecíficas podem ser ocasionadas por diversos fatores, como a sazonalidade (Raizada e Singh, 1981; Tavares-Dias e Moraes, 2004), a reprodução (Raizada e Singh, 1981), o hábito alimentar, as necessidades metabólicas de cada espécie (Tandon e Joshi, 1976), e as condições ecofisiológicas (Tandon e Joshi, 1976; Raizada e Singh, 1981; Tavares-Dias e Moraes, 2004). A literatura relata que em teleósteos dulciaqüicolas tropicais o número de leucócitos varia de 6450,0 a 72500,0/µL de sangue (Tandon e Joshi, 1976). Os valores médios de leucócitos em P. mesopotamicus do presente estudo foi de 18730,8/µL, com variação de 2019,0 a 47473,0/µL. Esses valores estão de acordo com o esperado para peixes de água doce. Na contagem diferencial de leucócitos em P. mesopotamicus, oriundos do cultivo intensivo, foram observados linfócitos, neutrófilos, monócitos, LG- PAS, eosinófilos, basófilos e células imaturas. Esses leucócitos apresentaram características morfológicas semelhantes às descritas para essa mesma espécie mantida em policultivo (Tavares-Dias et al., 1999b), exceto basófilos e células imaturas, os quais foram descritos apenas no presente estudo. O LG-PAS é um granulócito cujas características morfológicas e citoquímicas diferem dos demais leucócitos e que vem sendo descrito na literatura sob diversas denominações. Isso já foi amplamente discutido em estudos recentes (Tavares-Dias e Moraes, 2004). A ocorrência de basófilos é raramente relatada no sangue circulante dos peixes, enquanto os leucócitos imaturos ou células imaturas são freqüentemente observados, mas poucas vezes são quantificados e/ou caracterizados. Tais células imaturas observadas nas extensões sangüíneas de P. mesopotamicus apresentaram características morfológicas similares às descritas em Rhamdia

5 Características hematológicas de Piaractus mesopotamicus 161 quelen (Tavares-Dias et al., 2002). Pouco se conhece, até o presente momento, sobre a origem e o desenvolvimento dos leucócitos nos peixes, embora algumas idéias vêm sendo propostas desde o início do século. Os dados obtidos dos estudos de hematologia e/ou órgãos hematopoéticos são ainda pouco conclusivos (Tavares-Dias et al., 2002; Tavares-Dias e Moraes, 2004). Isso sugere que, além de estudos sobre o quadro hematológico das diferentes espécies, nas variadas condições ambientais, há a urgente necessidade de estudos que vise melhor elucidar a leucopoiése nos teleósteos. Conclusão Os resultados do presente estudo demonstraram que em P. mesopotamicus, mantidos em cultivo intensivo, alguns valores das características hematológicas e bioquímicas distanciam-se daquelas descritas na literatura para essa espécie ou outras espécies da mesma família. Tais variações interespecíficas podem ser ocasionadas por fatores como sazonalidade, reprodução, hábito alimentar, necessidades metabólicas de cada espécie e condições ecofisiológicas. Os altos valores do coeficiente de variação (CV%) das características hematológicas, bioquímicas e biométricas sugerem que a dispersão dos dados em relação à média foi elevada, sendo menor no que se refere à glicemia e o eritrograma. Tais variações individuais podem ser consideradas normais, pois os parâmetros biológicos em peixes não apresentam uma distribuição normal. Todavia, essa distribuição ainda não está estabelecida, como já ocorre nos mamíferos, assim, nosso laboratório está trabalhando nessa questão. Referências BARTON, B. A.; IWAMA, G. K. Physiological changes in fish from stress in aquaculture with emphasis on the response and effects of corticosteroids. Ann. Rev. Fish Dis., Bethesda, v. 1, p 3-26, CAMARGO, F. T. et al. 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