Avaliação clínica e parasitológica de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum L. chagasi

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1 1 Avaliação clínica e parasitológica de cães naturalmente infectados por Leishmania infantum L. chagasi submetidos a tratamento com antimoniato de meglumina. Prof. Adjunto Mary Marcondes Curso de Medicina Veterinária UNESP Campus de Araçatuba A leishmaniose visceral, também conhecida como Calazar, é uma antropozoonose, causada por um protozoário pertencente à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania, sendo a Leishmania chagasi (Cunha & Chagas, 1937) a espécie encontrada no Brasil (Genaro, 1993; Kontos e Koutinas, 1993; Ribeiro, 1997; Santa Rosa e Oliveira, 1997; Ciaramella e Corona, 2003). No ambiente doméstico, o cão é considerado o principal reservatório epidemiológico da doença, o que gera dificuldade no controle da mesma. O Calazar canino, do ponto de vista epidemiológico, é considerado mais importante que a doença humana, pois além de ser mais prevalente, a enzootia canina tem precedido a ocorrência de casos humanos, apresentando um grande contingente de animais infectados com parasitismo cutâneo, que servem como fonte de infecção para os insetos vetores (Santa Rosa e Oliveira, 1997; Brasil, 2003). A transmissão entre hospedeiros vertebrados ocorre através da picada de um flebotomíneo hematófago (Brasil, 2003). A Leishmania chagasi pode acometer praticamente todos os sistemas orgânicos, levando a uma grande variedade de sintomas inespecíficos no cão (Slappendel, 1988; Kontos e Koutinas, 1993; Ferrer, 1999; Noli, 1999; Blavier et al., 2001). A forma mais segura de diagnóstico de leishmaniose visceral é a observação direta de formas amastigotas do parasita em esfregaços de linfonodos, medula óssea, aspirado esplênico, biópsia hepática e esfregaços sangüíneos (Kontos e Koutinas, 1993; Ferrer, 1999). É o método mais simples e mais utilizado nas clínicas veterinárias, e a técnica, se realizada apropriadamente, é rápida e pouco traumática (Ferrer, 1999). A especificidade deste método é virtualmente 100%, mas dependendo do tempo despendido procurando o parasita a sensibilidade passa a ser de no máximo 80% em cães sintomáticos e menor em cães assintomáticos (Slappendel e Ferrer, 1998). A sensibilidade deste método varia de acordo com alguns autores, variando de 50 a 83% para amostras de medula óssea, de 30 a 85% para citologias de linfonodos (Ferrer, 1999; Koutinas et al., 2001) e de 71 a 91% quando ambos os tecidos estão combinados 1

2 2 (Koutinas et al., 2001). O número de amastigotas detectado em aspirados varia consideravelmente sendo que poucos parasitas são evidenciados em casos avançados e em animais tratados (Kontos e Koutinas, 1993). Os principais medicamentos utilizados no tratamento da leishmaniose visceral são os antimoniatos pentavalentes, alopurinol, aminosidina e anfotericina B, empregados isoladamente ou em associação (Baneth e Shaw, 2002). Os antimoniatos pentavalentes, especialmente o antimoniato de meglumina, são os medicamentos de escolha no tratamento da leishmaniose visceral humana, e têm sido utilizados como protocolo de tratamento para cães (Ribeiro, 2001). O mecanismo de ação destes medicamentos ainda não é totalmente conhecido, mas sabe-se que atuam nas formas amastigotas do parasita, bloqueando seu metabolismo através da inibição de sua atividade glicolítica e da via oxidativa de ácidos graxos, sendo, desta forma, considerados leishmanicidas (Ribeiro, 2001; Brasil, 2003). Os antimoniatos pentavalentes proporcionam a redução dos sintomas e, em alguns casos, até a cura clínica dos cães (Alvar et al., 1994; Ginel et al., 1998; Denerolle e Bourdoiseau, 1999; Riera et al., 1999; Baneth e Shaw, 2002), entretanto, existem evidências de que não promovem a completa eliminação dos parasitas, possibilitando, dessa forma, que cães tratados permaneçam como reservatório para a doença (Alvar et al., 1994; Riera et al., 1999, Baneth e Shaw, 2002). Com o objetivo de acompanhar animais infectados submetidos a tratamento, avaliar a eficácia do protocolo no tratamento da leishmaniose visceral canina, verificar a ocorrência de recidivas da doença e avaliar a presença de parasitas em cães portadores de leishmaniose visceral após a realização do tratamento, foram utilizados 14 cães naturalmente acometidos por leishmaniose visceral. O diagnóstico da doença foi realizado através da identificação de formas amastigotas de Leishmania sp. no exame citológico de punção biópsia aspirativa de linfonodo e de medula óssea, e confirmado através do teste imunoenzimático (ELISA). Durante todo o período experimental, os cães foram alimentados com ração comercial balanceada, receberam água ad libitum, utilizaram coleira antiparasitária à base de deltametrina (Scalibor - Intervet Production S.A.) e foram mantidos em um canil telado, a fim de evitar riscos de contaminação de outros animais ou humanos e também para evitar que os mesmos fossem reinfectados. Todos os animais foram submetidos a um tratamento com o antimoniato de meglumina (Glucantime - Aventis Pharma Ltda), na dose de 75 mg/kg a cada 12 horas, por via subcutânea, durante 21 dias. Sete foram mantidos apenas com esse tratamento e 2

3 3 sete receberam ainda alopurinol na dose de 10mg/kg, por via oral, a cada 12 horas, por 180 dias. Foram realizadas punções biópsias aspirativas de linfonodos e de medula óssea para pesquisa do parasita em até sete momentos, quais foram: M1- antes do início do tratamento; M2-30 dias; M3-60 dias; M4-90 dias; M5-120 dias; M6-150 dias e M7-180 dias após o início do tratamento. Os animais foram acompanhados diariamente durante um período máximo de 180 dias para a verificação da ocorrência de recidivas e, após esse período, todos os cães foram submetidos à eutanásia com Pentobarbital sódico (Hypnol 3% - Fontoveter Itapira, SP), na dose de 15 mg/kg por via intravenosa, seguida de uma ampola de 10 ml de cloreto de potássio (Cloreto de potássio a 19,1% - Darrow Rio de Janeiro, RJ), em cumprimento ao Decreto no do Ministério da Saúde do Brasil, de 14 de março de 1963, o qual estabelece que animais domésticos portadores de leishmaniose devem ser submetidos à eutanásia. O método empregado para a eutanásia seguiu as recomendações da Resolução nº. 714, de 20 de junho de 2002, do Conselho Federal de Medicina Veterinária, que dispõe sobre procedimentos e métodos de eutanásia em animais. Após a eutanásia os animais foram necropsiados para a realização dos imprints e cultivo in vitro de fragmentos do baço e fígado. A colheita de medula óssea foi realizada com agulha especial para biópsia aspirativa de medula óssea (Monoject ), mediante punção na crista ilíaca dos animais e a punção biópsia aspirativa de linfonodos foi realizada com agulha 25x7mm e seringa de 10 ml acoplada a um citoaspirador de Valeri. Após o exame externo do cadáver, foi realizada a evisceração para a colheita de um fragmento de baço e fígado, os quais foram destinados à realização dos imprints e do cultivo in vitro. As lâminas foram coradas com o corante hematológico rápido e observadas ao microscópio óptico em aumento de 100x, para a pesquisa de formas amastigotas do parasita no esfregaço. As amostras obtidas do baço e do fígado foram incubadas em meio RPMI (SIGMA) suplementado com 10% de soro bovino fetal (v/v), antibióticos (100 IU / ml de penicilina e 100 µg / ml de streptomicina), hemina (0.01 g/l ), ácido fólico (0.02 g/l) e 2% de urina masculina humana, na temperatura de 26 C por 30 dias. As culturas foram observadas em microscópio óptico para a pesquisa de formas promastigotas do parasita, uma vez por semana durante 30 dias. Todos os animais apresentaram remissão dos sintomas sendo que 60 dias após o início do tratamento todos os cães estavam assintomáticos. Dois animais, tratados apenas com antimoniato de meglumina voltararm a apresentar sintomas da doença a partir de 150 dias do início do tratamento. Durante todo o período de observação não 3

4 4 foram visualizadas formas amastigotas do parasita em nenhum animal através das punções biópsias aspirativas de medula óssea e linfonodo, exceto ao término do experimento, quando foram evidenciadas formas amastigotas do parasita em quatro cães submetidos a tratamento apenas com antimoniato de meglumina. No entanto, por meio da realização de imprints e cultivo in vitro do baço e do fígado, realizados ao término do experimento, verificou-se a presença de parasitas em sete dos 14 cães, sendo cinco que receberam somente o antimoniato de meglumina e dois que receberam a associação dos dois medicamentos. Durante o período do experimento, apesar da maioria dos animais não apresentar sintomas, continuava albergando o parasita que, entretanto, não pode se evidenciado através dos exames parasitológicos durante os primeiros 150 dias. Portanto, a avaliação de punções biópsias aspirativas de linfonodo e medula óssea não foi um método eficiente e seguro para confirmar cura parasitológica em cães submetidos a este protocolo terapêutico. Somente após 180 dias é que foi possível confirmar a condição de portador destes animais. Em três cães este tempo foi insuficiente e, somente com a investigação de órgãos como fígado e baço é que foi possível a identificação do parasita. Estes dados discordam dos achados de Koutinas et al. (2001), os quais afirmaram que a sensibilidade do exame citológico de linfonodo e medula óssea associados varia de 71 a 91%. Por outro lado, confirmam os relatos de Kontos & Koutinas (1993) e Slappendel & Ferrer (1998), os quais relataram que o exame citológico apresenta baixa sensibilidade e que, em animais assintomáticos e submetidos a tratamentos, são identificados poucos parasitas. Não podemos afirmar que o agente foi definitivamente eliminado nos outros cães que não possuíam parasitas, ao término do experimento. Em função dos resultados obtidos nesse estudo foi possível concluir que o antimoniato de meglumina, associado ou não ao alopurinol, promove remissão dos sintomas mas não previne a ocorrência de recidivas da doença e que, apesar de assintomáticos, muitos animais tratados permanecem infectados, tornando o tratamento desaconselhado principalmente em áreas endêmicas, onde os cães tratados continuam sendo uma fonte de infecção da doença. REFERÊNCIAS 4

5 5 ALVAR, J.; MOLINA, R.; SAN ANDRÉS, M.; TESOURO, M.; NIETO, J.; VITUTIA, M.; GONZÁLEZ, F.; SAN ANDRÉS, M.D.; BOGGIO, J.; RODRIGUEZ, F.; SÁINZI, A.; ESCACENA, C. Canine leishmaniasis: clinical, parasitalogical and entomological follow-up after chemotherapy. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, v.88, n.4, p , Aug BANETH, G.; SHAW, S.E. Chemotherapy of canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology, v.106, n.4, p , Jul BLAVIER, A.; KEROACK, S.; DENEROLLE, Ph.; GOY-THOLLOT, I.; CHABANNE, L.; CADORÉ, J.L. Atypical forms of canine leishmaniosis. Veterinary Journal, v.162, n.2, p , Sep BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília: Ministério da Saúde, p. CIARAMELLA, P.; CORONA, M. Canine leishmaniasis: clinical and diagnostic aspects. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v.25, n.5, p , May DENEROLLE, P.; BOURDOISEAU, G. Combination allopurinol and antimony treatment versus antimony alone and allopurinol alone in the treatment of canine leishmaniasis (96 cases). Journal of Veterinary International Medicine, v.13, n.5, p , Sep.-Oct FERRER, L. Clinical aspects of canine leishmaniasis. In: Canine leishmaniasis: an up date. INTERNATIONAL CANINE LEISHMANIASIS FORUM, 1, 1999, Barcelona, Spain. Proceedings... Wiesbaden: Hoeschst Roussel Vet, p GENARO, O. Leishmaniose visceral canina experimental. Belo Horizonte, p. Tese (Doutorado)- Universidade Federal de Minas Gerais. 5

6 6 GINEL, P.J.; LUCENA, R.; LÓPEZ, R.; MOLLEDA, J.M. Use of allopurinol for maintenance of remission in dogs with leishmaniasis. Journal of Small Animal Practice, v.39, n.6, p , Jun KONTOS, V.J.; KOUTINAS, A.F. Old world canine leishmaniasis. Compendium on Continuing Education for the practing veterinarian, v.15, n.7, p , Jul KOUTINAS, A.F.; SARIDOMICHELAKIS, M.N.; MYLONAKIS, M.E.; LEONTIDES, L.; POLIZOPOULOU, Z.; BILLINIS, C.; ARGYRIADIS, D.; DIAKOU, N.; PAPADOPOULOS, O. A randomised, blinded, placebo-controlled clinical trial with allopurinol in canine leishmaniosis. Veterinary Parasitology, v.98, n.4, p , Jul NOLI, C. Leishmaniosis canina. Waltham Focus. v.9, n.2, p.16-24, RIBEIRO, V.M. Leishmanioses. Revista do Conselho Federal de Medicina Veterinária. ano3, n.11, p.13-14, RIBEIRO, V.M. Protocolos terapêuticos e controle da leishmaniose visceral canina. Ciência Animal, v.11, n.3, p.13-19, RIERA, C; VALLADARES, J.E.; GÁLLEGO, M.J.; AISA, M.J.; CASTILLEJO, S.; FISA, R.; RIBAS, N.; CARRIÓ, J.; ALBEROLA, J.; ARBOIX, M. Serological and parasitalogical follow-up in dogs experimentally infected with Leishmania infantum and treated with meglumine antimoniate. Veterinary Parasitology, v.84, n.1-2, p.33-47, Jul SANTA ROSA, I.C.A.; OLIVEIRA, I.C.S. Leishmaniose visceral: breve revisão sobre uma zoonose reemergente. Revista Clínica Veterinária, v.2, n.11, p.24-28, SLAPPENDEL, R.J. Canine leishmaniasis: a review based on 95 cases in the Netherlands. The Veterinary Quarterly, v.10, n.1, p.1-16, Jan

7 7 SLAPPENDEL, R.J.; FERRER, L. Leishmaniasis. In: GREENE, C.E. Clinical microbiology and infectious diseases of the dog and cat. Philadelphia: W.B.Saunders, p