UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO INSTITUTO QUALITTAS CURSO DE PATOLOGIA CLÍNICA

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1 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO INSTITUTO QUALITTAS CURSO DE PATOLOGIA CLÍNICA PESQUISA DE Leishmania sp. POR MEIO DE PUNÇÃO BIÓPSIA APIRATIVA E IMPRESSÃO DE DIFERENTES LINFONODOS EM CINQUENTA CÃES SUSPEITOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA, NO MUNICÍPIO DE ANDRADINA, SÃO PAULO, BRASIL Débora Dugaich Ribeiro Lima São Paulo, out.2011

2 DÉBORA DUGAICH RIBEIRO LIMA ALUNA DO CURSO DE PATOLOGIA CLÍNICA VETERINÁRIA DA UCB PESQUISA DE Leishmania sp. POR MEIO DE PUNÇÃO BIÓPSIA APIRATIVA E IMPRESSÃO DE DIFERENTES LINFONODOS EM CINQUENTA CÃES SUSPEITOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA, NO MUNICÍPIO DE ANDRADINA, SÃO PAULO, BRASIL Trabalho monográfico de conclusão do curso de Patologia Clinica Veterinária (TCC), apresentado à UCB como requisito parcial para a obtenção do título de especialista a nível lato sensu em Patologia Clinica Veterinária, sob a orientação do Prof.: Fábio Luís Bonello São Paulo,out. 2011

3 PESQUISA DE Leishmania sp. POR MEIO DE PUNÇÃO BIÓPSIA APIRATIVA E IMPRESSÃO DE DIFERENTES LINFONODOS EM CINQUENTA CÃES SUSPEITOS DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA, NO MUNICÍPIO DE ANDRADINA, SÃO PAULO, BRASIL Débora Dugaich Ribeiro Lima Aluna do curso de Patologia Clínica Veterinária Foi analisado e aprovado com grau:... I São Paulo de de Professor Orientador São Paulo, out.2011

4 Dedico este trabalho aos meus pais Denison e Maria Angélica, ao meu irmão Danilo, e à minha avó Saida.

5 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar quero agradecer ao meu orientador Fábio Bonello pela sua disponibilidade e pelo acompanhamento exercido durante a execução do trabalho. Agradeço aos meus pais e toda minha família pelo apoio; Ao meu namorado Caio, agradeço todo o seu amor, carinho, admiração, e pela presença incansável com que me apoiou ao longo do período de elaboração desta pesquisa, Aos meus amigos, em especial minha amiga Cristiane Zachi, que contribuíram nesta minha pesquisa.

6 RESUMO A leishmaniose é uma doença crônica de manifestação cutânea ou visceral, tendo como agente etiológico o protozoário Leishmania spp. É uma zoonose de caráter endêmico em todo Brasil, tendo os canídeos domésticos como reservatório em ambiente humano. Este estudo teve como objetivo pesquisar Leishmania sp.em linfonodos de cães sintomáticos, através de exames diretos ( punção e impressão de linfonodos ) e comparar a sensibilidade das técnicas de colheitas utilizadas. Foram avaliados 50 cães do Centro de Controle de Zoonoses,Andradina, São Paulo, para ser realizada punção de linfonodo (poplíteo e pré-escapular)e em 14 cães foi feita impressão de linfonodos.das 200 amostras analisadas em PBA, houve 70 positivas (35%), e a positividade aumentou quanto mais linfonodos foram avaliados. Nas 56 amostras analisadas de PBA e impressão houve uma maior sensibilidade da impressão em relação à PBA (28,57% contra 60,71%). Esses resultados permitiram concluir que o clínico e/ou pesquisador deve puncionar tantos linfonodos quantos possíveis para o diagnóstico parasitológico de leishmaniose visceral canina e que, pós-morte, deve preferir a impressão a PBA.

7 ABSTRACT Leishmaniasis is a chronic disease with visceral or cutaneous manifestations. It is a endemic disease throughout Brazil, and domestic canids are the reservoirs in urban environment. This studyaimed to search for Leishmania in lymph nodes from symptomatic dogs, using direct exams (aspirate and imprinting) and to comparate the sensibility between those methods. Fifty dogs from Center for Zooonosis Control (Andradina, São Paulo, Brazil) were evaluated for aspirates from popliteos and preescapularlympho nodes, while 14 dogs were evaluated for both lymph nodes imprinting and aspirates. Two hundred samples were analyzed and 70 samples (35%) presented positive results for Leishmania, with a positivity increasing when more lympho nodes were evaluated. In56samples analyzed for bothaspirateand imprinting, imprintin presentedagreater sensitivitythan aspirates(28.57% vs %). Theseresults showedthat theclinical and /or researchermustpunchingso manylymph nodesas possiblefor theparasitological diagnosisof canine visceral leishmaniasisand,after death, imprinting must to be the first choice.

8 "Os animais têm muitas vantagens sobre os homens: não precisam de teólogos para instruí-los, seus funerais saem de graça e ninguém briga por seus testamentos." Voltaire

9 SUMÁRIO Resumo Problema Objetivos Geral Específicos Revisão de Literatura Metodologia Local e Período do experimento Animais Pesquisados Colheita e identificação das amostras Exames laboratoriais Análise estatística Resultados e discussão Punção biopsia aspirativa Punção biopsia aspirativa associada a impressão Conclusão Referências Bibliográficas...25

10 LISTA DE TABELAS TABELA 1.RESULTADOS GERAIS INDIVIDUAIS OBTIDOS DAS AMOSTRAS (n=200) OBTIDAS DE 50 cães de área endêmica para leishmaniose visceral canina...18 Gráfico 1 Resultados das 200 amostras PBAs de linfonodos obtidas dos 50 cães estudados. Setenta amostras foram positivas, 100 negativas e 30 foram consideradas impróprias para análise...20 GRÁFICO 2. Amostras positivas em PBA, conforme o linfonodo puncionado 22 Tabela 3. Resultados individuais e totais gerais encontrados nos 14 cães cujas amostras de linfonodos também foram submetidas a impressões para pesquisa de Leishmania sp Gráfico 3. Número de amostras positivas em PBA de linfonodos (16) e em impressões dos mesmos órgãos (36). Para cada técnica foram avaliados 14 cães, obtendo quatro amostras de cada para PBA e quatro para impressão. O teste de quiquadrado revelou que há maior probabilidade de haver positividade nas impressões, em comparação com a PBAs Gráfico 4. Comparação da positividade encontrada em linfonodos poplíteos (POP) e em linfonodos pré-escapulares (PRÉ-ESC), utillizando-se PBA...24

11 9 1. O PROBLEMA (Leishmaniose) Este projeto justifica-se devido à importância leishmaniose visceral no município de Andradina e à dificuldade de controle da mesma, o que demanda contínuas pesquisas relacionadas à doença. 1.1 OBJETIVOS Geral Este trabalho teve como objetivo pesquisar formas amastigotas de Leishmaniasp. em linfonodos de 50 cães suspeitos de leishmaniose visceral (LV) no município de Araçatuba, São Paulo, Brasil Específicos - pesquisar Leishmaniasp. em amostras obtidas de punção biópsia aspirativa (PBA) de linfonodos poplíteos e pré-escapulares de 50 cães suspeitos de leishmaniose visceral no município de Araçatuba, São Paulo, Brasil - pesquisar Leishmaniasp. em amostras obtidas de impressão de linfonodos poplíteos e pré-escapulares de 14 cães suspeitos de leishmaniose visceral no município de Araçatuba, São Paulo, Brasil - verificar se existe diferença de resultados quando comparada positividade nos diferentes linfonodos avaliados - verificar se existe diferença de resultados positivos quando comparadas as positividades obtidas de PBA ou impressão de linfonodo, nos diferentes linfonodos avaliados. 2. REVISÃO DE LITERATURA A leishmaniose visceral canina (calazar) é uma antropozoonose (CAVALCANTI et al., 2005) de distribuição cosmopolita com ocorrência em 88 países.

12 10 Segundo Dunn (2001), a leishmaniose visceral é considerada atualmente uma doença emergente e reemergente, tanto em áreas rurais como urbanas ela ocorre em áreas mais quentes, possui larga distribuição em áreas tropicais e subtropicais, se estendendo desde a América Central e do Sul até os países mediterrâneos, África, Ásia central, Índia e China. GRIMALDI et al. (1989) já relatavam que nas Américas, a LV ocorria desde o México até a Argentina, sendo que cerca de 90% dos casos humanos descritos estavam no Brasil. Atualmente, no Brasil, a doença em humanos aparece nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Sudeste e vem apresentando franca expansão pelo país (IKEDA ET AL., 2005). A doença é de caráter crônico e apresenta crescente incidência no Brasil, pode assumir formas graves e letais quando não tratada adequadamente, principalmente em crianças, idosos e pacientes portadores de co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O padrão de transmissão da doença tem apresentado mudanças importantes, inicialmente predominados pelas características de ambientes rurais e periurbanas e, mais recentemente, em centros urbanos como Rio de Janeiro (RJ), Corumbá (MS), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Bauru (SP), Palmas (TO), Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS), entre outros. Atualmente, no Brasil a leishmaniose visceral está registrada em 19 das 27 Unidades da Federação, com aproximadamente municípios apresentando transmissão autóctone, tornando-se assim, preocupação para os órgãos de Saúde Pública (SILVA ET AL., 2001; MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003) Leishmaniasp em cães foi inicialmente detectada no Estado de São Paulo no município de Araçatuba, no ano de 1988, em amostras obtidas de linfonodo e submetidas à pesquisa direta em microscopia de luz. No ano de 1999 foi confirmado também o primeiro caso de leishmaniose visceral humana autóctone no estado de São Paulo, na mesma Araçatuba (CAMARGO-NEVES & KATZ, 1999). No município de Andradina já foram confirmados 72 casos de leishmaniose visceral humana no período compreendido entre 2001 e julho de 2011, sendo registrados 10 óbitos nesse mesmo período. Há uma franca diminuição na incidência a partir de 2004, apenas um óbito registrado de 2008 a 2011, num total de 13 casos notificados nesse mesmo intervalo de tempo (CVE, 2011).

13 11 Segundo Gallati et al. (1997), no Brasil, a transmissão de Leishmaniachagasi, principal agente etiológico da LV, se dá pela picada de fêmeas de insetos dípteros pertencentes à família Psychodidae, tendo como principal vetor Lutzomyialongipalpis. Mais recentemente, Lutzomyia cruz foi também incriminado como vetor no Estado de Mato Grosso do Sul. Segundo Feitosa et al 2000, É causada por um protozoário do complexo de Leishmaniadonovani, que compreende a Leishmania (Leishmania) donovani, a Leishmania (Leishmania) chagasi, sendo esta última observada no Brasil. Leishmania sp é um protozoário flageliforme, que provoca leishmaniose visceral e cutânea transmitida por vetor em cães, humanos e outros mamíferos. (Birchard e Sherding 2003) De acordo com TILLEY & SMITH JR, 2003 a leishmaniose visceral tem como agentes etiológicos L. donovani e L. chagasi. Na maior parte do mundo, roedores e cães atuam como reservatórios do parasita e a infecção é transmitida por mosquitos Phlebotomusspp, Culicoides, Simulium e Austrosimulium. A leishmaniose é uma enfermidade cosmopolita, endêmica na região mediterrânea da Europa e na América do Sul (Birchard e Sherding 2003). Após a inoculação pelos flebotomíneos, na pele dos cães susceptíveis, a maioria dos parasitos é eliminada pelos fatores do complemento, enquanto outros sobrevivem usando diferentes estratégias (DOMINGUEZ & TORANO, 1999). No segundo caso, em alguns animais há o desenvolvimento de resposta imune adequada e controle da infecção, enquanto que em outros há disseminação dos parasitas da pele para os linfonodos, o baço e medula óssea e destes órgãos para todo o organismo (FERRER, citado por VAL, 2004). Os inquéritos sorológicos na população de cães e os levantamentos entomológicos, nas áreas endêmicas, revelam em alguns locais, prevalência da LVC muito alta e a presença predominante e abundante do vetor, o que redunda em elevado risco de transmissão para o homem (VIEIRA & COELHO, 1998). O quadro clínico dos cães infectados apresenta um espectro de características clínicas que varia do aparente estado sadio a um severo estágio final (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). As síndromes variam desde lesões cutâneas autolimitantes até doença sistêmica fatal (CORREIA & CORREIA,1992). Dentre os sintomas da LVC, as alterações dermatológicas são as mais comuns (VAL, 2004).

14 12 Observa-se uma dermatite esfoliativa não pruriginosa (WILLENSE, 2002), que afetam frequentemente a face, especialmente ao redor dos olhos, do nariz e das orelhas, e os pés, mas as lesões podem ser generalizadas. Os pêlos ficam finos e quebradiços, a pele fica escamosa, espessada e, algumas vezes, despigmentadas, e as unhas ficam frequentemente longas e quebradiças (DUNN, 2001). A onicogrifose é um sinal marcante da doença canina, observada em cerca de 25% dos animais com LVC (CIARAMELLA ET al., 1997). Vale salientar que este sinal não é patognomônico da doença (ALVES & FAUSTINO, 2005). Em cães encontramse nódulos intradérmicos e úlceras, já em gatos geralmente são encontrados nódulos cutâneos (TILLEY & SMITH JR, 2003). Pode ocorrer alopecia, eritrema e, especialmente descamação e ulceração (ETTINGER & FELDMAN, 1997). Após as alterações cutâneas, o sinal clínico mais comumente descrito na LVC é a linfoadenomegalia, seja localizada ou generalizada (AYALI & BANETH, 2001). As manifestações oculares nos cães com leishmaniose visceral são variadas, sendo a uveíte e a conjuntivite as mais freqüentes (BRITO et al., 2006). Na leishmaniose visceral os órgãos mais afetados são: o baço o fígado e a medula óssea (ETTINGER &FELDMAN, 1997). A deposição de imunocomplexos nos rins (ao longo da membrana basal glomerular e tubular) eventualmente resulta em glomerulonefrite proliferativa e, em muitos casos, em nefrite intersticial, podendo levar a uma insuficiência renal, que é muitas vezes, a principal causa de morte em cães com leishmaniose. As leishmanias também se multiplicam em macrófagos do fígado, produzindo uma hepatite ativa crônica e, eventualmente, hepatomegalia, vômitos, poliúria, polidipsia, anorexia e perda de peso. As alterações hepáticas e renais levam a uma hipoalbuminemia que, juntamente com fatores vasculares locais, podem levar à formação de edema de membros. Nas fases finais da doença pode-se observar também ascite e edema generalizado (FEITOSA, 2001). Os animais acometidos por leishmaniose visceral desenvolvem intolerância ao exercício, anorexia e grave perda de peso, além de diarréia, vômito, epistaxe, melena (menos comum) e sinais respiratórios (DUNN 2001). É possível observar animais com quadros de diarréia crônica e melena, devido à presença de ulcerações de mucosa gástrica e intestinal. A enterite pode ser resultado de um dano parasitário direto ou consequência de uma insuficiência renal (FEITOSA, 2001).

15 13 A temperatura corporal pode oscilar, mas geralmente é normal ou subnormal. Imunossupressão pode favorecer a ocorrência de infecções concomitantes, de forma que o quadro clínico pode ser complicado com demodicose, piodermite ou pneumonia (BIRCHARD & SHERDING, 2003). A forma mais segura de diagnóstico de leishmaniose visceral canina é a observação direta de formas amastigotas do parasito em esfregaços de linfonodos, medula óssea, aspirado esplênico, biópsia hepática e até esfregaços sanguíneos (FEITOSA, 2001). As técnicas parasitológicas possuem especificidade de 100% no entanto, sua sensibilidade pode ser muito baixa. A identificação da Leishmaniasp. em preparações citológicas feitas a partir de punções aspirativas de linfonodos e medula óssea, é rápida e fácil (FERRER et al.,1995) A principal desvantagem deste método é a sensibilidade de apenas 50% nos aspirados de medula óssea e menos de 30% nos aspirados obtidos de linfonodos (FERRER, 1997, citado por FEITOSA, 2001). Outra desvantagem desses procedimentos, que embora ofereçam a vantagem da simplicidade, são métodos invasivos, significando a probabilidade de riscos para o animal e também impraticáveis em programas de saúde pública, nos quais um grande número de animais necessite de avaliação em curto espaço de tempo (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003). Segundo MOREIRA et. al (2000), o diagnóstico da LVC realizado a partir de esfregaços de punção de linfonodo poplíteo corados pelo método de Romanowsky (Diff-Quik ), tem mostrado, nos casos tipicamente positivos, a presença de formas amastigotas de Leishmania livres ou dentro de vacúolos de macrófagos com identificação bem definida de núcleo e cinetoplasto do parasito. Porém, em alguns casos observam-se sinais citopatológicos de reatividade do sistema linfo-histiocitário, com ausência de formas amastigotas típicas. Alguns estudos parasitológicos já foram realizados em cães para verificar a positividade em linfonodos, comparando ou não com outros métodos de diagnóstico. Em um estudo como 60 cães de área endêmica para leishmaniose visceral e com manifestações clínicas da doença, ao se realizar a pesquisa direta do parasita em esfregaços de punção biópsia aspirativa de linfonodos poplíteos, constatou-se que 30 foram positivos em tal exame, 22 suspeitos e oito negativos.

16 14 Neste mesmo estudo, ao se utilizar a RIFI nos mesmos cães, 56 mostraram-se positivos e quatro foram negativos, fato que deixa clara a baixa sensibilidade da pesquisa direta do parasita (MOREIRA et al., 2002). Da SILVA et. al (2007), trabalharam com 95 cães do Centro de Controle de Zoonoses do município de Andradina, São Paulo, e realizaram avaliação parasitológica em amostras obtidas de linfonodos e medula óssea de cães sorologicamente positivos para leishmaniose visceral, encontrando 23,15% de positividade em todas as amostras analisadas, concluindo que quanto mais sítios forem puncionados e mais amostras analisadas, maior a possibilidade de diagnóstico por meio de exame parasitológico direto. No município de Araçatuba, São Paulo, MOREIEA et. al (2002) compararam métodos de diagnóstico para a leishmaniose visceral em 89 cães. Dentre os métodos, foi realizada punção biópsia aspirativa em linfonodos e pesquisa direta de Leishmania sp. em microscopia de luz. Encontraram positividades de 75, 32 e 39%, respectivamente para cães sintomáticos, oligossintomáticos e assintomáticos. A reação em cadeia pela polimerase (PCR) tem sido recentemente utilizada como um método de alta especificidade e sensibilidade na identificação de DNA parasitário em tecidos e fluidos provenientes de casos humanos e caninos( AVILES et al., 1996). Além disso, atualmente, os testes sorológicos, como o imunoenzimático (ELISA) e a reação de imunofluorescência indireta (RIFI), são recomendados pelo Ministério da Saúde no inquérito epidemiológico canino (BRASIL, 2006), porém quando a sorologia é utilizada como único método de diagnóstico da leishmaniose visceral canina a ocorrência de reação cruzada pode implicar na eutanásia de um animal acometido por outro agente passível de tratamento, devido aos antígenos de Leishmania apresentam epitopos que podem apresentar reação cruzada com outros microorganismos, como Trypanossoma, Mycobacterium, Plasmodium e Schistosoma (Kar 1995). A despeito das reconhecidas vantagens apresentadas por esta técnica, como facilidade na execução, rapidez na emissão de resultados e baixo custo, alguns problemas existem com relação à sua precisão, expressos numa sensibilidade que varia de % e numa especificidade de 80% para amostras de soro (Alves et al., 2004).

17 15 Visando evitar os problemas relacionados à demonstração do parasito, foram desenvolvidos métodos de diagnósticos não invasivos, sendo os que detectam anticorpos no soro do paciente os mais utilizados, já que os portadores de LV apresentam hipergamaglobulinemia (TAVARES et al., 2003, citado por VAL, 2004). As provas sorológicas mais utilizadas são a imunofluorescência indireta (RIFI), ensaio imunoenzimático (ELISA), fixação de complemento e aglutinação direta (FEITOSA, 2001). A Organização Mundial de Saúde (OMS) preconiza a eutanásia dos cães portadores da doença, associada a outras medidas de controle ambiental visando eliminação dos vetores e tratamento de pacientes humanos, embora reconheça as limitações do primeiro procedimento citado. Tais limitações são também reconhecidas no Brasil pelo Comitê de Consultores em leishmaniose visceral, bem como por pesquisadores brasileiros ou estrangeiros que estudam a epidemiologia da doença em nosso país (VAL, 2004). Porém essas medidas não são eficazes. Foram desenvolvidas vacinas caninas como forma de controle da doença que tem se mostrado eficazes. De acordo com WOOLHOUSE et. al (1997), um importante aspecto de doenças ligadas a vetor, é a existência de uma população de hospedeiros, que é efetivamente responsável pela manutenção e dispersão da doença. Portanto, o conhecimento dos reservatórios é importante para o efetivo controle da LV. (CABRERA et al., 2003). O uso de inseticidas de efeito residual nas casas e arredores, aplicação de inseticidas em cães e utilização de coleira impregnada com inseticida em cães, tem sido utilizado como medidas para controlar a população de insetos flebotomíneos. Outra medida é a redução do contato humano-vetor, através do uso de proteção individual tais como utilização de telas, mosquiteiros impregnados com inseticidas, além do diagnóstico precoce e tratamento dos casos humanos (ALVES & FAUSTINO, 2005). Porém essas medidas não tem se mostrado eficazes. Foram desenvolvidas vacinas caninas como forma de controle da doença que tem se mostrado eficazes. Segundo as indicações de bula, essas vacinas devem ser usadas somente para a prevenção da Leishmaniose Visceral Canina e não como

18 16 tratamento. Por isso, é necessária a realização do teste sorológico previamente à vacinação, para que apenas cães sadios e livres da infecção sejam vacinados. (LEISHMUNE - Leish-Tec - ) 3.METODOLOGIA 3.1 Local e Período do Experimento O experimento foi realizado no hospital Veterinário da Faculdade de Ciências Agrárias de Andradina, no período 07de Abril de 2011 a 27 de Maio de Animais Pesquisados Foram incluídos na pesquisa 50 cães, independentemente de raça, idade ou sexo, oriundos do município de Andradina e recolhidos pelo Centro de Controle de Zoonoses, Andradina- SP para eutanásia, com suspeita de leishmaniose visceral canina. 3.3 Colheita e identificação das amostras Os animais foram contidos por mordaças, anestesiados por via intravenosa, através de scalp G23, com 1mL/Kg PV de pentobarbital sódico após a diluição em 40 ml de solução fisiológica, na veia cefálica. Posteriormente eram colocados em decúbito lateral para a colheita de material através de punção aspirativa (PBA) dos linfonodos poplíteos e pré-escapulares, com seringa de 10mL e agulha 25X7. De cada linfonodo foi confeccionado um esfregaço ( squash ) em lâmina de microscopia, num total quatro lâminas por animal. Ainda anestesiados foram eutanasiados com Cloreto de Potássio (uma ampola para cada 10kg PV). Em

19 17 14 cães eutanasiados houve a possibilidade de realizar a retirada dos mesmos linfonodos pesquisados nas punções aspirativas, para impressão, resultando em uma lâmina de impressão para cada linfonodo, totalizando quatro impressões por cão. As lâminas foram identificadas com etiquetas, da seguinte maneira: PE (linfonodo poplíteo esquerdo), PD (linfonodo poplíteo direito), PEE (linfonodo préescapular esquerdo, e PED (linfonodo pré-escapular direito). 3.4 Exames laboratoriais As lâminas, após a secagem, foram coradas com corante panótico rápido (Newprov ) e observadas ao microscópio de luz em aumento de 1000x, com óleo de imersão. Num primeiro momento, a amostra foi considerada própria ou imprópria para análise, conforme a qualidade e a quantidade de material na mesma. Uma amostra própria só foi considerada negativa depois de observados 300 campos microscópicos e nenhum parasita tivesse sido encontrado. Foi considerada positiva a amostra em que foi encontrada uma ou mais formas amastigotas de Leishmaniasp., dentro do limite de 300 campos de contagem. Imediatamente após encontrada Leishmaniasp. a contagem era interrompida, não se estendendo até a contagem de 300 campos microscópicos. 3.5 Análise estatística Os resultados foram dispostos em tabelas e gráficos de colunas, com números absolutos e percentuais, parciais e totais. Para comparação das variáveis (não quantitativas) poplíteo contra pré-escapular e PBA de linfonodo contra impressão foi utilizado o teste de qui-quadrado com probabilidade de 5% (CONTI, 2011). 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Punção biópsia aspirativa

20 18 Os resultados das análises das lâminas confeccionadas a partir de PBAs (n=50 cães) e de impressões (n=14 cães) de linfonodos estão dispostos na tabela 1, a seguir. TABELA 1. RESULTADOS GERAIS INDIVIDUAIS OBTIDOS DAS AMOSTRAS (n=200) OBTIDAS DE 50 cães de área endêmica para leishmaniose visceral canina. Pop E Pop D Pré-E E Pré E D 1 NN NN SMN SMN 2 NN SMN NN SMP 3 PN PP PP PP 4 NP PP NP NN 5 NN N N NN NN 6 NN SMN SMN NP 7 NP NP SMN NP 8 SMP SMP NP PP 9 SMP PP SMP PP 10 SMP SMP SMN SMN 11 PP SMP PP PP 12 PP PP NP PP 13 SMN NP NN PP 14 SMP SMP SMN SMP 15 P SM P P 16 P P P P 17 P P N N 18 N N N N 19 N N N P 20 P N P P 21 N N P N 22 N N N N 23 N N N N 24 P N P P 25 N N N N 26 N N N N 27 P P P P 28 P P P P 29 SM SM SM SM 30 P P P N 31 N N N N 32 N N N N 34 SM SM SM SM 35 P N P N 36 N N N N

21 19 37 P N P P 38 P N P P 39 N N N N 40 P P P P 41 N N N N 42 N N P P 43 N N N N 44 P P P P 45 N N N N 46 N N N N 47 N N N P 48 N N P P 49 P P P P 50 P N P N Pop: linfonodo poplíteo; Pré-E: linfonodo pré-escapular; E: esquerdo; D: direito; P: Positivo; N: Negativo SM: sem material (amostra imprópria). As letras em vermelho correspondem aos resultados das impressões de linfonodos, realizadas em 14 cães. Dezessete cães (34%) foram negativos em todas as amostras de PBA e em três cães todas as amostras de PBA foram consideradas impróprias para análise. Resultado semelhante foi encontrado por da Silva et al. (2007), que avaliaram linfonodos poplíteos de 95 cães em Andradina (SP) e obtiveram 33 amostras negativas (34,74%) em ambos os linfonodos. Quatro cães (28,6%) foram positivos em todas as amostras de impressão, enquanto três outros cães (21,4%) foram negativos em todas as amostras obtidas por impressão dos linfonodos. Dos 27 cães positivos (54%) nas amostras obtidas por meio de PBA, em seis deles (12%) houve positividade em apenas um dos linfonodos; em sete cães (14%) apenas dois linfonodos foram positivos; oito cães (16%) foram positivos em três dos quatro linfonodos analisados, enquanto outros oito cães (16%) apresentaram positividade nas amostras de PBA obtidas dos quatro linfonodos. No município de Andradina, São Paulo, da Silva et. al (2007) demonstraram que quando amostras obtidas de um único sítio de punção são analisadas a positividade pode ficar em torno de apenas 20%, na pesquisa direta de formas amastigotas de Leishmaniasp., tendo os mesmos obtido 23,15% de cães positivos em ambos os linfonodos poplíteos. Isso demonstra a importância da realização de várias punções num mesmo cão avaliado, visto que quanto mais linfonodos forem pesquisados, maior a chance de se encontram Leishmaniasp, não só pelas amostras impróprias obtidas, mas pelo fato que as formas amastigotas podem ser raras num determinado

22 20 linfonodo e, por outro lado, um achado constante em linfonodo diferente do mesmo cão pesquisado. Embora controverso na literatura, o diagnóstico parasitológico é considerado o teste de eleição para o diagnóstico conclusivo da leishmaniose visceral canina (FERRER, 1999; KOUTINAS et al., 2001), já que a especificidade é de 100%, mas a sensibilidade máxima, dependendo do tempo gasto procurando o parasita, chega a 80% em cães sintomáticos, diminuindo em cães assintomáticos (WOLSCHRIJN et al., 1996; LUVIZOTTO et al., 2005). No entanto, para atingir esses 80%, na prática, a pesquisa deve ser demorada, consumindo um tempo incompatível com os trabalhos de rotina ou pesquisas, visto que falsos-negativos são comuns, principalmente em casos crônicos da doença (SLAPPENDEL, 1988; IKEDA-GARCIA & FEITOSA, 2003) retirado de da Silva et al (2007), IKEDA-GARCIA& FEITOSA, 2006, WOLCHRIJN et al Observações semelhantes foram descritas por da Silva et. al (2007), que concluíram que o linfonodo é melhor sítio para PBA, quando comparado à medula óssea devido à menor invasividade e por ser menos laboriosa a técnica, e que quantos mais sítios forem puncionados e mais amostras analisadas, maior é a possibilidade de se diagnosticar a leishmaniose por meio do exame parasitológico. Gráfico 1 Resultados das 200 amostras PBAs de linfonodos obtidas dos 50 cães estudados. Setenta amostras foram positivas, 100 negativas e 30 foram consideradas impróprias para análise. 30; 15% 70; 35% 100; 50% POSITIVA NEGATIVA IMPRÓPRIA

23 21 TABELA 2. RESULTADOS EM SOMATÓRIA DAS AMOSTRAS (200) OBTIDAS DE linfonodos de 50 cães de área endêmica para LVC Pop E Pop D Pré-E E Pré-E D TOTAL POSITIVO SEM MATERIAL NEGATIVO Pop: linfonodo poplíteo; Pré-E: linfonodo pré-escapular; E: esquerdo; D: direito Do total de 200 amostras de punção de linfonodos, 30 delas (15%) foram consideradas impróprias, ou seja, o material era escasso ou não havia celularidade característica de linfonodo, constituindo-se muitas vezes apenas de células sanguíneas ou gordura. Das 170 amostras boas para análise, 100 (50%) foram negativas e 70 (35%) apresentaram positividade. Moreira et. al (2002) em um estudo com 60 cães de área endêmica para leishmaniose visceral e com manifestações clínicas da doença, encontraram Leishmania em linfonodos poplíteos de 30 cães (50%), sem relatarem, no entanto, a positividade em se tratando do total de amostras, como realizamos nesta pesquisa, que indica 35% de amostras positivas. Se considerássemos positividade em apenas um dos linfonodos (pré-escapular esquerdo (23 positivas), por exemplo, a positividade em nossas amostras cairiam para 11,5%, o que deixa claro a importância de colher amostras de mais de um linfonodo. Os resultados deste trabalho também se aproximam dos 32 e 39%, respectivamente para cães oligossintomáticos e assintomáticos, encontrados em exame parasitológico de linfonodos poplíteos por Moreira et al. (2007), ao trabalharem com 89 cães no município de Araçatuba, São Paulo. COSTA et al (2010) pesquisaram Leishmaniasp. em amostras obtidas de PBA de linfonodos poplíteos de 200 gatos provenientes do Centro de Controle de Zoonoses de Araçatuba (SP) e encontraram sete amostras positivas, enquanto em amostras de PBA de baço e fígado foram encontradas duas e uma amostra positivas, respectivamente, resultados que corroboram a indicação do linfonodo como órgão de eleição para PBA, procedimento que ocorreu nesta presente pesquisa.

24 22 puncionado GRÁFICO 2. Amostras positivas em PBA, conforme o linfonodo POP E: poplíteo esquerdo; POP D: poplíteo direito; PRÉ-ESC E: pré- escapular esquerdo; PRÉ-ESC D: pré-escapular direito 4.2 Punção biópsia aspirativa associada à impressão Para a comparação entre punção biópsia aspirativa dos linfonodos e impressões em fragmentos dos mesmos, foram utilizados 14 animais. Cinquenta e seis lâminas de PBA foram comparadas a 56 lâminas de impressão (14 animais, quatro linfonodos de cada um deles) (tabela 3). Tabela 3. Resultados individuais e totais gerais encontrados nos 14 cães cujas amostras de linfonodos também foram submetidas a impressões para pesquisa de Leishmaniasp. Pop E Pop D Pré-E E Pré-E D total

25 23 1 NN NN SMN SMN - 2 NN SMN NN SMP - 3 PN* PP PP PP - 4 NP PP NP NN - 5 NN N N NN NN - 6 NN SMN SMN NP - 7 NP NP SMN NP - 8 SMP SMP NP PP - 9 SMP PP SMP PP - 10 SMP SMP SMN SMN - 11 PP SMP PP PP - 12 PP PP NP PP - 13 SMN NP NN PP - 14 SMP SMP SMN SMP - Positivo PBA 03** 04** Positivo IMPR 08** 10** SM PBA *** Negativo PBA NP PP Pop: linfonodo poplíteo; Pré-E: linfonodo pré-escapular; E: esquerdo; D: direito; P: Positivo; N: Negativo SM: sem material (amostra imprópria); IMPR:impressão. As letras em vermelho correspondem aos resultados das impressões de linfonodos, realizadas em 14 cães. NP: negativo em PBA e positivo em impressão; PP: positividade em PBA e em impressão. *única amostra que foi positiva em PBA e negativa em impressão. **diferença que pode ser explicada principalmente pela maior qualidade das amotras obtidas em impressões, já que 04 PBAs sem material foram positivas em impressões. *** 11 dessas 22 foram positivas nas amostras obtidas por impressão. Gráfico 3. Número de amostras positivas em PBA de linfonodos (16) e em impressões dos mesmos órgãos (36). Para cada técnica foram avaliados 14 cães, obtendo quatro amostras de cada para PBA e quatro para impressão. O teste de qui-quadrado revelou que há maior probabilidade de haver positividade nas impressões, em comparação com a PBAs PBA IMPRESSÃO

26 24 Os resultados demonstram diferença significativa entre positividade em PBA e positividade em impressões de linfonodos. Isso é importante principalmente no que tange à realização da pesquisa do parasita pós-morte, quando sempre deve ser preferida a colheita de fragmentos de linfonodos para impressão em lâminas, em vez de apenas realizar a PBA em cão que vier a óbito, cuja suspeita seja de leishmaniose visceral. Essa diferença ocorreu principalmente pela viabilidade das amostras de impressão em comparação com a inviabilidade de muitas amostras de PBA. De fato, das 56 amostras de PBAs, 22 delas estavam impróprias para análise, o que não ocorreu em nenhuma amostra de impressão. Dessas amostras impróprias em PBAs, 11 (50%) foram positivas para Leishmaniasp nas impressões correspondentes. De acordo com IKEDA (2004) a forma mais segura de diagnóstico de leishmaniose visceral canina é a observação direta de formas amastigotas do parasita em esfregaços de linfonodos, medula óssea, aspirado esplênico, biópsia hepática e esfregaços sanguíneos. Neste estudo pesquisou-se Leishmaniasp. apenas nos linfonodos e, pode-se constatar que a técnica parasitológica mais sensível pós-morte é a impressão de linfonodo. Gráfico 4. Comparação da positividade encontrada em linfonodos poplíteos (POP) e em linfonodos pré-escapulares (PRÉ-ESC), utillizando-se PBA POP 40 PRÉ-ESC

27 25 Do total de 200 amostras provenientes de PBA dos linfonodos, 70 (35%) foram positivas, 30 delas (15%) nos linfonodos poplíteos e 40 (20%) nos linfonodos pré-escapulares. Utilizando-se o teste de qui-quadrado com probabilidade de 5%, constatou-se que não houve diferença (X 2 = 1,732) entre positividade conforme o linfonodo puncionado na PBA, ou seja, tanto PBA de poplíteo como de pré-escapular pode ser realizada sem haver maiores ou menores chances de se encontrar o parasita, se apenas o sítio de punção for considerado. Na literatura, a maioria dos trabalhos utiliza apenas linfonodos poplíteos para a colheita de amostras, Moreira et al. (2002), Moreira et al. (2007), da Silva et al. (2007), COSTA et al (2010) o que é condizente com os resultados aqui obtidos. CONCLUSÃO Quanto mais linfonodos forem puncionadas e mais amostras analisadas, maior é a possibilidade de se diagnosticar a leishmaniose por meio de exame parasitológico direto. Ao se comparar linfonodos poplíteos e pré-escapulares não há diferença significativa de resultados no exame parasitológico direto dos mesmos. Ao se optar entre PBA e impressão de linfonodos para diagnóstico pósmorte de cão com suspeita de leishmaniose visceral a impressão deve ser de eleição, visto que a sensibilidade é superior a da PBA de linfonodo. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA AVILES, H.; BELLI, A.; ARMIJOS, R.; MONROY, F. P.; HARRIS, E. PCR detectionandidentificationofleishmania parasites in clinicalspecimes in Ecuador: A comparisonwithclassicaldiagnosticmethods. JournalofParasitology, v. 85, n. 2, p , ALVES, W. A.; BEVILAQUA, P.D. Reflexões sobre a qualidade do diagnóstico da leishmaniose visceral canina em inquéritos epidemiológicos; o caso da epidemia de Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil, Cadernos de Saúde Pública, v. 20 (1), p , 2004.

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