DESCRIÇÃO HISTOPATOLÓGICA DE DUAS NEOPLASIAS DIAGNOSTICADAS EM RATAS PINEALECTOMIZADAS. RESUMO

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1 Ciência Animal, 13(1):39-44, 2003 DESCRIÇÃO HISTOPATOLÓGICA DE DUAS NEOPLASIAS DIAGNOSTICADAS EM RATAS PINEALECTOMIZADAS. (Histopathologic description of two neoplasms diagnosed in pinealectomized rats) Katharine Raquel Pereira dos SANTOS 1 *, Álvaro Aguiar Coelho TEIXEIRA 2,Valéria Wanderley TEIXEIRA 2 & Márcia de Figueiredo PEREIRA 3 1 Pós-Graduação em Ciências Biológicas da UFPB; 2 Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal/UFRPE, 3 Departamento de Medicina Veterinária/ UFRPE RESUMO A glândula pineal em mamíferos tem função endócrina produzindo melatonina, hormônio que desempenha, dentre várias outras funções, atividade anti-tumoral. A sua secreção depende da intensidade e tempo de exposição à luminosidade e a pinealectomia elimina níveis detectáveis de melatonina no plasma. Objetivouse descrever os tumores encontrados em ratas pinealectomizadas mantidas ou não, na ausência de luz. Foram utilizadas 16 ratas albinas, sendo divididos em quatro grupos: G-I - ratas sham-pinealectomizadas, mantidas em ciclo claro/escuro 12/12h, por três meses (controle); G-II - ratas pinealectomizadas mantidas em ciclo claro/escuro 12/12h, por três meses; G-III - ratas pinealectomizadas, mantidas na ausência de luz por três meses; G-IV - ratas sham-pinealectomizadas, mantidas na ausência de luz por três meses. Os resultados mostraram que os animais dos grupos I e IV não apresentaram desenvolvimento tumoral. Já nos grupos II e III dois animais, um em cada grupo, apresentaram neoplasias malignas, do tipo fibrosarcoma e adenocarcinoma. PALAVRAS-CHAVE: melatonina, pinealectomia, neoplasia, rata. ABSTRACT The pineal gland in mammals has an endocrine function, producing melatonin, a hormone with many functions including antitumoral activity. Melatonin secretion depends on the intensity and time of exposition to light. Pinealectomy decreases melatonin secretion to undetectable levels in the plasm. Neoplasms found in pinealectomized and sham-pinealectomized rats submitted to different photoperiods during three months are described. Sixteen female albino rats were divided into four groups: G-I sham-pinealectomized rats submitted to a 12h light/12h dark period, as control; G-II pinealectomized rats submited to a 12h light/12h dark period; G-III pinealectomized rats kept in the dark; and G-IV sham-pinealectomized rats kept in the dark. Group I and IV did not show neoplasm development. In groups II and III, two animals, one in each group, showed malignant neoplasms: fibrosarcoma and adenocarcinoma. KEY WORDS: melatonin, pinealectomy, neoplasia, rat * Autor para correspondência kraquel@dse.ufpb.br 39

2 INTRODUÇÃO A glândula pineal desempenha diferentes funções em vertebrados inferiores, funcionando como estrutura fotorreceptora nos peixes, anfíbios e répteis, e como relógio biológico nas aves. Porém, na espécie humana, ela funciona como uma glândula endócrina, produzindo indolaminas, principalmente a melatonina, hormônio ainda pouco investigado na espécie humana (REITER, 1986; WILKINSON, 1991). REITER (1989) e WILKINSON (1991) propuseram que a melatonina apresenta efeitos endócrinos com implicações clínicas, como fator de indução do sono, alteração da atividade elétrica na epilepsia, no controle do fenômeno de jet lag, no humor, desempenho, depressão e, principalmente, sua relação com o crescimento tumoral. Este último é sugerido pelos resultados de uma variedade de estudos (BARTSCH & BARTSCH, 1981; REITER, 1989). Os levantamentos realizados por REITER (1989) sugerem possíveis relações entre a melatonina e crescimentos tumorais, onde o padrão proliferativo das células tumorais é diretamente influenciado por este hormônio, fato também observado por COS & SANCHEZ (2000) em estudos de indução da proliferação in vitro de células cancerígenas da linhagem MCF-7. Sabe-se que a melatonina também pode ser sintetizada em níveis mais baixos pela retina, glândula de Harder (glândula profunda da terceira pálpebra dos suínos) e mucosa intestinal (ÖCAL-IREZ et al.,1989). Entretanto, a glândula pineal é responsável pela maior parte da síntese deste hormônio e a pinealectomia elimina níveis detectáveis de melatonina no plasma (TAMARKIN et al., 1985). Segundo REITER (1989) e WILKINSON (1991) animais pinealectomizados, desenvolvem tumores em resposta à ausência do efeito inibidor da carcinogênese, enquanto que injeções de melatonina apresentam efeitos opostos, reduzindo também o número e o peso de tumores em ratas. CAPARÓ (1982) relata que nos ratos em condições normais, os tumores de mama compreendem 32 a 55% de todos os tumores nesta espécie; entre eles encontra-se o adenocarcinoma. Os tumores de pele são considerados pouco freqüentes (0,16%), sendo que os tipos histológicos mais comuns nesta espécie são o epitelioma basal, tricoepitelioma, fibroma e melanoma.. Portanto, considerando que a pinealectomia induz ao aparecimento de tumores em animais, o presente trabalho teve o objetivo de descrever histopatologicamente tumores em ratas pinealectomizadas mantidas na ausência de luz e em fotoperíodo de 12h. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi realizado no Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Foram utilizadas 16 ratas albinas (Rattus norvegicus albinus) da linhagem Wistar, pesando aproximadamente 200g, com até 90 dias de idade, provenientes do biotério do mesmo Departamento. Os animais foram mantidos em gaiolas com alimentação e água ad libitum, à temperatura 22 C, sendo divididos em quatro grupos com quatro animais cada, pelo período de 3 meses: Grupo I - ratas sham-pinealectomizadas, mantidas em ciclo claro/escuro 12/12h, (controle); Grupo II - ratas pinealectomizadas mantidas em ciclo claro/escuro 12/12h; Grupo III - ratas pinealectomizadas, mantidas na ausência de luz; Grupo IV - ratas sham-pinealectomizadas, mantidas na ausência de luz. Pinealectomia A pinealectomia foi realizada com os animais pertencentes aos grupos II e III previamente anestesiados, utilizando inicialmente atropina (0,25mg/mL) como medicação pré-anestésica (MPA) diluída em 1mL de água destilada, e administrando 0,2mL da solução por via intraperitoneal. Em seguida, foi administrado 0,2 ml de xilazina (20mg/mL) e quetamina (50mg/mL), por via intraperitoneal. Após tricotomia e assepsia da área dorsal da cabeça, foi realizada abertura da pele e do tecido subcutâneo até a exposição da calota craniana, onde o periósteo foi afastado com o auxílio 40

3 do bisturi. Com um micromotor de baixa rotação e uma broca de dentista n o 5, foi retirado um fragmento circular da calota de aproximadamente 4mm de diâmetro, tendo como ponto central de referência o lambda, e colocado em solução fisiológica a 0,9%. Em seguida, fez-se a ligadura do seio venoso e com o auxílio de pinças adequadas, a glândula pineal foi removida. Posteriormente, o encéfalo foi recoberto com o fragmento ósseo e suturados os planos cirúrgicos. Os animais do grupo I e IV foram submetidos aos mesmos procedimentos, entretanto sem a retirada da glândula pineal, assim denominados sham-pinealectomizados. Este processo objetivou eliminar falsos resultados devido à ação do procedimento cirúrgico. Ausência de Luz Foi obtida utilizando-se uma sala de aproximadamente 3m², totalmente vedada para não permitir a entrada de luz, sendo a única fonte de luminosidade uma lâmpada marca PHILIPS (lustre color E27), vermelha de 15w, a qual era acesa apenas no momento da limpeza das gaiolas, onde os animais dos grupos III e IV permaneceram durante todo experimento. Análise Morfológica Os animais foram eutanasiados e necropsiados para identificação de neoformações teciduais. Em seguida, os tumores evidenciados foram excisados, clivados transversalmente e mergulhados em fixador de Boüin, permanecendo no mesmo pelo período de 48 horas. Após esses procedimentos, os fragmentos foram desidratados em álcool etílico em concentrações crescentes, diafanizados pelo xilol, impregnados e incluídos em paraplast. Os blocos foram cortados em micrótomo do tipo MINOT (Leica RM 2035) ajustado para 5mm. Assim, os cortes obtidos foram colocados em lâminas untadas com albumina de Mayer e mantidos em estufa regulada à temperatura de 37ºC, por 24 horas para secagem. Seqüencialmente, os cortes foram submetidos à técnica de coloração pela hematoxilina-eosina (H.E.) e analisados em microscópio de luz e fotografados em fotomicroscópio. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nos animais dos grupos I e IV (shampinealectomizados) não houve desenvolvimento de tumores. Já nos grupos II e III (pinealectomizados) dois animais, apresentaram tumores independentemente das condições fotoperiódicas às quais estavam submetidos. Os tumores eram diferentes no tocante ao tamanho, localização e tipo. No grupo II, observou-se crescimento neoplásico pesando em média 6,7 g, de contorno regular e consistência firme, de coloração rósea, estando localizado no tecido subcutâneo da região torácica ventral direita, próximo às costelas. Ao exame microscópico, era constituído por células fusiformes com núcleos grandes contendo mais de um nucléolo. As células apresentavam pleomorfismo acentuado (Fig. 1A) e inúmeras mitoses, bem como algumas células gigantes (Fig. 1B e 1C). As diversas áreas do tumor apresentavam algumas diferenças nas características celulares e no arranjo (Fig. 1D). Em alguns locais, a quantidade de substância mucinosa entre as células era bem maior. Às vezes, os contornos citoplasmáticos eram difíceis de distinguir. A vascularização era notória, havia pigmentos de hemossiderina, indicando a ocorrência de hemorragias. Estas características são compatíveis com a descrição de MOULTON (1990) para o fibrosarcoma. Ao lado da massa neoplásica descrita anteriormente, foram observados dois pequenos nódulos cartilaginosos compostos por osso condróide irregular circundado por bandas de tecido conjuntivo (Fig. 1E). No grupo III foi evidenciada massa tumoral pesando em média 75,4g, com uma coloração esbranquiçada e contorno irregular, bastante vascularizada, localizada ventralmente no tecido subcutâneo das regiões pélvica, abdominal e membro pélvico direito. Histologicamente, o tumor era composto por células pequenas, cúbicas, hipercromáticas, tipicamente epiteliais, arranjadas em inúmeros ácinos que formavam lóbulos separados por tecido conjuntivo (Fig. 2A). As células apresentavam grau moderado de variação 41

4 A B C D FC E Figura 1. Fotomicrografias de fibrossarcoma da rata pinealectomizada do grupo II. (A) Células fusiformes arranjadas em feixes irregulares, apresentando pleomorfismo e células com dois núcleos (setas) (H.E.; ±428x). (B) Células neoplásicas fusiformes, apresentando pleomorfismo, com mais de um nucléolo e célula gigante (seta) (H.E.; ±428x). (C) Células neoplásicas com mais de um nucléolo evidente, algumas com limites citoplasmáticos indistintos, figura de mitose (seta) e pleomorfismo (H.E.; ±428x). (D) Células fusiformes e estreladas, entremeadas com fibras colágenas (FC) (H.E.; ±428x). (E) Nódulo cartilaginoso (asterisco), localizado ao lado da massa neoplásica (H.E.; ±107x). no tamanho e forma, e continham mais de um nucléolo. Várias mitoses estavam presentes. As células neoplásicas infiltravam-se no tecido conjuntivo interlobular (Fig. 2B). Estes achados estão de acordo com a descrição de adenocarcinoma mamário mencionada por MOULTON (1990). De acordo com COS & SANCHEZ (2000), a manipulação experimental, com a ativação da glândula pineal ou a administração de melatonina, amplia a latência e reduz a freqüência e a taxa de crescimento tumoral na mama, enquanto que a pinealectomia tem normalmente efeito contrário. As interações envolvendo a glândula pineal e processos tumorais malignos ocorrem através da melatonina que altera a regulação de alguns hormônios 42

5 A B Figura 2. Fotomicrografias de adenocarcinoma da rata pinealectomizada do grupo III. (A) Células neoplásicas arranjadas sob a forma de ácinos e lóbulos (H.E.; ±107x). (B) Células pequenas, cubóides, hipercromáticas, arranjadas em ácinos e infiltrando o conjuntivo (H.E.; ±428x). pituitários e gonadais. Estes hormônios controlam o crescimento de tumores mamários hormôniosdependentes. Por sua vez, a melatonina também influencia diretamente nas células tumorais, alterando o seu padrão de proliferação. Trabalhando com indução de carcinogênese em ratas pinealectomizadas e submetidas a fotoperíodos variados, KOTHARI et al. (1984) observaram que nos animais mantidos em luz contínua ocorreu uma maior freqüência de crescimento do tumor mamário, enquanto que nos animais mantidos em curtos fotoperíodos essa incidência diminuiu significantemente. Em um estudo com ratas pinealectomizadas com 20 dias de idade e tratadas aos 50 dias com substância indutora de carcinogênese, TAMARKIN et al. (1981), observaram uma alta incidência de tumores comparada aos animais controle. No presente estudo, foi evidenciada a ocorrência de crescimentos neoplásicos em animais de ambos os grupos pinealectomizados mantidos tanto na ausência de luz, quanto em ciclo fotoperiódico de doze horas claro e doze horas escuro. CONCLUSÃO Conclui-se que duas ratas pinealectomizadas desenvolveram tumores malignos do tipo fibrossarcoma e adenocarcinoma mamário, independente do fotoperíodo. AGRADECIMENTOS Agradecemos ao PIBIC/CNPq/UFRPE pela bolsa de iniciação científica, ao biotério do DMFA pelo fornecimento dos animais, a ao Profº Dr. Fabrício Bezerra de Sá (Área de Anatomia/UFRPE) pela ajuda nas fotografias da pinealectomia. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARTSCH, C.; BARTSCH, H. Effects of melatonin on experimental tumors under different photoperiods and times of administracion. Journal Neural Transmission, v. 52, p , CAPARÓ, A. C. Manual de Patologia de Animales de Laboratório. Organizacion Panamericana de la Salud, Capítulo II: Enfermidades Neoplasicas, p COS, S.; SANCHEZ-BARCELO, E. J. Melatonin and mammary pathological growth. Front Neuroendocrinology, United States, v. 21, p , KOTHARI, L. S.; SHAH, P. N.; MHATRE, M. C. Pineal ablation in varying photoperiods and the incidence of 9,10-Dimethyl-1,2-Benzanthracene induced mammary cancer in rats. Cancer Letters, v. 22, p , MOULTON, J. E. Tumors in Domestic Animals. 3ª ed., University of California Press, p. ÖCAL - IREZ, T.G.;DUMUS, G.; SEKERKIRAN, Y.; PEKER, C.; UYGUR, G. Effect of pineal indolamine, 5-methoxyindole-3-acetic acid, on the estrous cycle and reproductive organs pf female Wistar albino rats. Brain Research, Istanbul, v. 493, 43

6 p. 1-7, REITER, R. J. The pineal gland: an important link to the environment. Physiological. Science, v. 1, p , REITER, R. J. The pineal gland. Endocrinology, v. 1, p , TAMARKIN, L.; COHEN, M.; ROSELLE, D.; REICHERT, C.; LIPPMAN, M.; CHABNER, B. Melatonin inhibition and pinealectomy enhancement de 7,12-Dimethylbenzanthracene-induced mammary tumors in rat. Cancer Research, v. 41, p , TAMARKIN, L.; BAIRD, C. J.; ALMEIDA, O. F. X. Melatonin: A coordinating signal for mammalian reproduction? Science, Washington, v. 227, p , WILKINSON, L. W. Endocrine rhythms and the pineal gland. In: RUCH, T.; PATTON, H. D. (eds) Phisiology. Phyladelphia, Saunders, 2nd ed, p , Recebido em Aceito em