CARACTERIZAÇÃO DE MICROPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS CARREGADAS COM VITAMINA B12 E PRODUZIDAS PELA TÉCNICA DE SPRAY CHILLING

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1 CARACTERIZAÇÃO DE MICROPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS CARREGADAS COM VITAMINA B12 E PRODUZIDAS PELA TÉCNICA DE SPRAY CHILLING M. Chalella-Mazzocato 1, C.S. Favaro-Trindade 1 1-Universidade de São Paulo, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Av. Duque de Caxias Norte, 225, CP 23, CEP , Pirassununga, SP, Brazil. (marcella.mazzocato@usp.br) RESUMO A vitamina B 12 ou cianocobalamina é uma substância hidrossolúvel produzida por alguns microrganismos. Ocorre em quantias diminutas principalmente em alimentos de origem animal e em algumas leguminosas. A ocorrência em baixa concentração e a pouca variedade natural de alimentos impactam no consumo humano adequado da vitamina B 12 e sua ausência no metabolismo humano pode causar grandes impactos na saúde humana. O objetivo deste trabalho foi produzir micropartículas lipídicas sólidas por spray chilling carregadas com vitamina B 12 e caracteriza-las por meio de microscopia eletrônica de varredura, análises de tamanho e distribuição de partículas, de coloração, atividade de água e quantificação da vitamina. Observou-se que as micropartículas produzidas pela técnica apresentaram coloração menos intensa que a vitamina pura, formas esféricas, superfícies lisas e contínuas, além de apresentarem tamanhos médios inferiores a 15 m. Portanto, a morfologia determinada é viável para a aplicação das micropartículas em alimentos, uma vez que o formato esférico facilita o fluxo do material e seu tamanho não impactaria negativamente na textura. ABSTRACT Vitamin B12, or Cyanocobalamin, is a water-soluble substance produced by some microorganisms. It occurs in small amounts primarily in animal food and some leguminous plant. The low concentration of vitamin B12 and its presence in just a few natural food varieties cause some impacts in the appropriate human consumption of vitamin B12 and its absence in our metabolism cause many negative effects. The aim of this study was to characterize solid lipid microparticles containing vitamin B12 produced by spray chilling technique by scanning electron microscopy, size analysis and particle distribution, color and water activity. It was observed that the microparticules produced by the technique presented less intense color, espherical shape, smooth and continuous surface, besides to show dimensions lower than 15 m and unimodal size distribution. Therefore, the particular morphology is feasible for the application of the microparticles in food since the spherical shape facilitates the flow of the material and its size would have no impact in texture. PALAVRAS-CHAVE: Spray chilling, microencapsulação, spray congealing, vitamina B 12 KEYWORDS: Spray chilling, microencapsulation, spray congealing, vitamin B INTRODUÇÃO A vitamina B 12 pertence à família das cobalaminas, é hidrossolúvel e produzida por apenas alguns microrganismos. A vitamina está disponível em alimentos de origem animal e, a maioria dos alimentos de origem vegetal é desprovida da mesma. (Fennema et al., 2010).

2 Estudos apontam que o número de pessoas que possuem baixos níveis de vitamina B 12 tem crescido desenfreadamente não apenas entre as pessoas veganas e idosas, mas também entre as pessoas que comem carne. Uma vez que, atualmente, a maioria das pessoas apresentam deficiência desta vitamina, uma suplementação adequada de vitamina B 12 seria de extrema importância para fornecer a elas benefícios à saúde; tais como, proteção das células nervosas e do cérebro, contribuição com a criação de DNA e RNA saudáveis, proteção do sistema cardiovascular, entre outros (Madhaiyan et al., 2013). A cianocobalamina, uma forma sintética de vitamina B 12, utilizada na fortificação de alimentos e em suplementos nutricionais exibe uma estabilidade superior e é de fácil disponibilidade comercial. Sob a maioria das condições de processamento, preservação e armazenamento existe pouca perda nutricional significativa. Entretanto, pode ser facilmente degradada quando submetida a aquecimentos prolongados em ph neutro ou próximo dele, à ação da luz e a agentes oxidantes. Afim de aumentar ainda mais a sua estabilidade, pode-se optar pela sua microencapsulação (Fennema et al., 2010; Paniz et al., 2005). Na microencapsulação utilizam-se agentes carreadores para envolver a substância de interesse e permitir a proteção em condições adversas, liberação controlada, além de mascarar a coloração de substâncias coloridas, como no caso da B 12 que apresenta coloração avermelhada. Uma das técnicas de microencapsulação é a de spray chilling. Esta tornou-se uma estratégia promissora pois consiste na atomização em temperaturas baixas de emulsão, dispersão ou solução, contendo a substância de interesse e um agente carreador lipídico liquefeito. (Arshady,1993; Comunian et al., 2013; Okuro et al., 2013a; Matos-jr et al, 2015). Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi produzir e caracterizar as micropartículas lipídicas sólidas contendo vitamina B 12 obtidas pela técnica de spray chilling por meio análises de microscopia eletrônica de varredura, distribuição de tamanho partícula, atividade de água, cor e quantificação da vitamina. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Materiais As micropartículas foram produzidas com vitamina B12 (Pharmanostra, China/Hong Kong), gordura vegetal (TRI CS 48 Triângulo Alimentos, Brasil), com ponto de fusão de aproximadamente 48 o C e lecitina de soja (Phospholipon 90G - Phospholipid Gmbh, Germany), para alguns tratamentos. 2.2 Preparo de amostras e estudo das micropartículas As alimentações foram constituídas de dispersões que foram preparadas com o auxílio de um ultraturrax (T25 digital Ultra-Turrax IKA, Alemanha) contendo a vitamina B 12, lecitina de soja e a gordura vegetal previamente fundida a 65 C em banho-maria (MA184 Marconi, Brasil). Foram preparados seis tratamentos, variando-se as proporções de vitamina e lecitina de soja. As formulações estão apresentadas na Tabela 1. As micropartículas lipídicas foram produzidas utilizando um spray chiller (MSD 1.0 Labmaq do Brasil, Brasil) equipado com um compressor de ar a 8,2 bar (MSV 6 Schulz, Brasil) e um banho resfriador de ar a 5 C (Labmaq do Brasil, Brasil). A velocidade do ar resfriado foi controlada por um conversor de frequência (CFW-08 WEG, Brasil) em 1,60 m.s -1 e a

3 vazão de alimentação foi mantida em 60 ml.min -1 por uma bomba peristáltica (LS Masterflex, EUA). Todos os tratamentos foram submetidos a caracterização por meio de análises de microscopia de varredura eletrônica (TM3000 Hitachi, Japão), distribuição de tamanho de partícula (Difração a laser - SALD 201V Shimadzu, Japão), atividade de água (Aqualab - Series 3 TE Decagon Devices, EUA), análise de cor (Mini Scan XE Plus Hunterlab, EUA) e quantificação da vitamina por sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) (Prominence Shimadzu, Japão). Tabela 1 - Composição dos seis tratamentos atomizados por Spray Chilling. Tratamento Vitamina B12 (g/100g) Lecitina de soja (g/100g) Gordura vegetal (g/100g) 1 0,1 0 99,9 2 0,1 2,5 97,4 3 0,1 5 94, , ,5 96, ,0 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1. Caracterização das Micropartículas Análise de Cor: A diferença de coloração entre o grupo com os tratamentos compostos por 0,1 e 1% de vitamina pode ser observada por meio da Figura 1a. Os tratamentos com maior teor de vitamina B 12 (placas D, E e F) apresentaram coloração mais intensa, porém ainda assim foi possível mascarar a coloração avermelhada da vitamina livre apresentada na Figura 1b, facilitando a sua possível aplicação em alimentos que apresentem pouca coloração. Figura 1 - A) Vitamina B 12 microencapsulada pela técnica de Spray Chilling ; B) Vitamina B 12 livre (A) (B) Legenda: A corresponde ao tratamento 1 cuja formulação é de 0,1% vitamina, 0% lecitina de soja e 99,9% gordura vegetal; B (tratamento 2) apresenta formulação de 0,1% de vitamina, 2,5 % de lecitina de soja e 97,4% de gordura vegetal; C (tratamento 3) equivale a 0,1 % de vitamina, 5 % de lecitina de soja e 94,9% de gordura vegetal; D (tratamento 4) corresponde a 1 % de vitamina, 0 % de lecitina de soja e 99% de gordura vegetal; E

4 (tratamento 5) apresenta 1% de vitamina, 2,5 % de lecitina de soja e 96,5% de gordura vegetal e Placa F (tratamento 6) possui 1 % de vitamina, 5 % de lecitina de soja e 94 % de gordura vegetal. Distribuição e tamanho médio de partícula: Todas as formulações apresentaram diâmetros médios inferiores a 15 m além de exibirem comportamento semelhante entre elas, conforme mostra a Figura 2, significando que a composição das suspensões atomizadas não apresentou grande influência na distribuição de tamanhos e diâmetros de partículas. De acordo com Fávado-Trindade et al (2015) e Matos-Jr (2015), variáveis utilizadas no processo de atomização como temperatura, velocidade do ar congelante, fluxo de alimentação da mistura no atomizador e diâmetro do bico de atomização podem influenciar mais na distribuição do tamanho de partículas do que a formulação. Além disso, Hasen et al. (2002) sugere que o tamanho de micropartículas seja inferior a 100 m para que não cause impactos negativos na textura, sendo assim, pode-se dizer que o processo de atomização com spray chiller é viável para obtenção de partículas como potencial aplicação em alimentos. Figura 2 - Distribuição dos tamanhos das micropartículas atomizadas em spray chiller Análises Morfológicas: As imagens obtidas por meio de microscopia de varredura eletrônica das micropartículas sólidas lipídicas (MSL) estão apresentadas na Figura 3. Pode-se notar que as micropartículas exibem geometria esférica, com paredes bem definidas, anucleadas e de tamanhos heterogêneos, além de revelarem superfícies lisas e contínuas. Pedroso et al. (2012) afirmam que este formato de partícula facilita o escoamento dos pós, bem como a sua aplicação em produtos alimentícios. Figura 3 - Morfologia das micropartículas lipídicas atomizadas carregadas com vitamina B12 obtidas por meio de análises de microscopia eletrônica de varredura.

5 Atividade de água: Os resultados de atividade de água podem ser observados na Tabela 2. Nota-se que todas as amostras podem ser consideradas seguras microbiologicamente, pois os valores obtidos não são propícios para desenvolvimento de bactérias e fungos. Já com relação a estabilidade da gordura vegetal, de acordo Van Den Berg & Bruin (1981), a atividade de água obtida nas micropartículas sólidas lipídicas não se apresentou segura, pois a faixa encontrada, de 0,48 a 0,68, é bastante propícia para a oxidação lipídica, que promove a produção de radicais livres e pode provocar a degradação da vitamina B12. Tabela 2 - Atividade de água média obtida para os tratamentos 1, 2, 3, 4, 5 e 6 após atomização em spray chiller. Tratamentos Atividade de água 1 0,68 ± 0,07 A 2 0,59 ± 0,09 A,B 3 0,58 ± 0,01 B 4 0,56 ± 0,01 B 5 0,55 ± 0,02 B 6 0,48 ± 0,02 B Letras maiúsculas iguais não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância. Quantificação da vitamina B12: Os resultados obtidos após a produção das micropartículas para a quantificação da vitamina estão expressos na Tabela 3. Pode-se observar que todos os tratamentos, com exceção aos 5 e 6, apresentaram quantidade menor de vitamina nas micropartículas que a quantidade de B 12 adicionada na dispersão inicialmente. Deste modo, pode-se afirmar que existe perda de vitamina durante o processo de atomização devido ao fato de a vitamina B 12 ser hidrossolúvel e, consequentemente, não se solubilizar na gordura utilizada no preparo das dispersões. Tabela 3 - Quantificação da vitamina B12 nas micropartículas (experimental) e na dispersão (teórico) Experimental Adicionado Tratamento ug B12/g Amostra ug B12/g Amostra2 Perdas (%) 1 838,72 ± 99,8 995,58 15, ,18 ± 66,4 1031,81 14, ,80 ± 42,6 986,33 19, ,18 ± 1228,3 9817,51 0, ,19 ± 474,9 9843, ,18 ± 232,0 9823,76-4. CONCLUSÕES As micropartículas de vitamina B 12 produzidas pela técnica de spray chilling foram caracterizadas com sucesso uma vez que foi possível obter geometria e tamanhos que favorecessem a sua aplicação em alimentos, bem como mascarar a coloração avermelhada do componente, obter uma

6 atividade de água relativamente segura e uma quantidade de vitamina considerável ao que foi adicionado no processo. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de iniciação científica de M. Chalella-Mazzocato (Processo 2015/ ) e a Triângulo Alimentos Brasil pela doação da gordura vegetal. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Arshady, R. (1993). Microcapsules for food. Journal of Microencapsulation, v. 10, Comunian, T. A., Thomazini, M., Alves, A. J. G., Matos-Jr, F. E., Bailieiro, J. C. C., Favaro-trindade, C. S. (2013). Microencapsulation of ascorbic acid by complex coacervation: protection and controlled release. Food Research International, v. 52, p Favaro-Trindade, C.S., Okuro P.K., Matos-Jr, F.E. (2015) Chapter 5. Encapsulation via Spray Chilling/Cooling/Congealing In: Mishra, M. Handbook of Encapsulation and Controlled Release. Editado por CRC Press. Fennema, O. R, Damodaran, S, Parkin, K. L. (2010). Química de Alimentos de Fennema 4. Ed. Porto Alegre: Artmed, p Hansen, L.T., Allan-wojtas, P.M., Jin, L.A., Paulson, A.T. (2002). Survival of Ca alginate microencapsulated Bifidobacterium spp. in milk and simulated gastrointestinal conditions Food Microbiology, v.19, p Madhaiyan, K., Sridhad, R., Sundarrajan, S., Venugopal, J. R., Ramakrishna, S. (2013). Vitamin B12 loaded polycaprolactone nanofibers: A novel transdermal route for the water-soluble energy supplement delivery. International Journal of Pharmaceutis, v. 444, p Matos-Jr, F. E., Sabatino, M D, Passerini, N, Fávaro-Trindade. C, S, Albertini, B. (2015). Development and characterization of solid lipid microparticles loaded with ascorbic acid and produced by spray congealing. Food Research International, v. 67, p Okuro, P. K, Matos-jr, F. E., Fávaro-Trindade. C, S. (2013) Technological challenges for spray chilling encapsulation of functional food ingredients. Food Technol. Biotechnol, v. 51, p Paniz, C.; Grotto, D., Schmitt, G. C., Valentini, J., Schott, K. L., Pomblum, V. J., Garcia, S. C. (2005). Fisiopatologia da deficiência de vitamina B12 e seu diagnóstico laboratorial. Bras Patol Med Lab. v.41, n.5, p Pedroso, D. L., Thomazini, M., Heinemann, J.B., Favaro-Trindade, C. S. (2012). Protection of Bifidobacterium lactis and Lactobacillus acidophilus by microencapsulation using spray-chilling. International Dairy Journal. v. 26, p Van den Berg, C.; Bruin, S. (1981). Water activity and its estimation in food systems: theorical aspects. Advances in Food and Nutrition Research, v. 51, Academic Press.