UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL FARLEN JOSÉ BEBBER MIRANDA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL FARLEN JOSÉ BEBBER MIRANDA CARACTERIZAÇÃO SORO-EPIDEMIOLÓGICA DA ERLIQUIOSE CANINA EM CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ. Campos dos Goytacazes Julho, 2008

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3 FARLEN JOSÉ BEBBER MIRANDA CARACTERIZAÇÃO SORO-EPIDEMIOLÓGICA DA ERLIQUIOSE CANINA EM CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ. Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal, na área de concentração de Sanidade Animal, linha de pesquisa Ensaios Farmacológicos, Afecções Clínicas e Cirúrgicas dos Animais. ORIENTADOR: Prof. Dr. Antonio Peixoto Albernaz Campos dos Goytacazes Julho, 2008

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5 FARLEN JOSÉ BEBBER MIRANDA CARACTERIZAÇÃO SORO-EPIDEMIOLÓGICA DA ERLIQUIOSE CANINA EM CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ. Dissertação apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal, na área de concentração Sanidade Animal, e linha de pesquisa Afecções Clínicas e Cirúrgicas dos Animais. Aprovada em 03 de julho de 2008 BANCA EXAMINADORA Profª. Flávya Mendes de Almeida (D.Sc., Clínica Médica) - UFF Profª. Maria Angélica Vieira da Costa Pereira (D.Sc., Parasitologia) - UENF Prof. Leonardo Serafim da Silveira (D.Sc., Morfologia) UENF Prof. Antonio Peixoto Albernaz (D.Sc., Laboratório Clínico) - UENF (Orientador)

6 Aos meus amados pais, Nivaldo Candido Miranda e Maria Terezinha Bebber Miranda; À minha querida irmã, Kamila Kelen Bebber Miranda; A todos os meus familiares, em especial ao meu avô José Costa Bebber, que nos deixou neste período; À minha companheira Luize Néli Nunes Garcia; Com todo o carinho. DEDICO.

7 AGRADECIMENTOS À minha família, e em especial aos meus pais, Nivaldo Candido Miranda e Maria Terezinha Bebber Miranda, que sempre colocaram a educação dos filhos em primeiro lugar; A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, onde foram realizados todos os procedimentos contidos no presente trabalho; Ao programa de Pós-Graduação em Produção Animal, que me acolheu em seu quadro, me dando a oportunidade do aperfeiçoamento. E ao Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal, que concretizou a minha formação; À prof a. Drª Célia Rachel Quirino e ao prof. Dr. Olney Vieira da Motta, coordenadores da Pós-Graduação neste período; Aos professores, pelo apoio científico nas disciplinas realizadas, assim como pela assistência técnico-científica. Em especial ao prof. Dr. Cláudio Baptista de Carvalho, professor de Clínica Médica do Hospital Veterinário; Aos Médicos Veterinários Dr. Ricardo Benjamin Machado Alves e Msc. Maria Angélica Dutra Viestel, pelo suporte oferecido durante a realização dos exames clínicos; Aos técnicos Marília Cipriano Dias, pela costumeira boa vontade em ajudar, e José Evaldo Machado, pela incansável ajuda nas coletas de sangue; À secretária do Programa de Pós-Graduação, Jovana F. C. Campos, pelos prestativos auxílios ao longo deste período; À prof a. Dr a. Rosângela Zacarias Machado, presidente do Colégio Brasileiro de Parasitologia Veterinária, pela assistência teórica e atenção dispensada;

8 Ao prof. Dr. Rogério Figueiredo Daher, pela ajuda na estatística; Aos Médicos Veterinários Doutorando Israel Pereira dos Santos e Mestranda Luize Néli Nunes Garcia, pelo auxílio técnico no diagnóstico sorológico; Aos laboratoristas Orlando Augusto Melo Júnior e Josias Alves Machado, pela companhia amigável e auxílio; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de Mestrado; Ao Setor de Patologia Clínica do Hospital Veterinário, responsável pelo custeio de todo o material diagnóstico utilizado neste experimento; Ao prof. Dr. Antonio Peixoto Albernaz, orientador na Monitoria em Patologia Clínica, por dois anos de Iniciação Científica, e agora, no Mestrado. Meus sinceros agradecimentos.

9 "Mude suas opiniões, mantenha seus princípios. Troque suas folhas, mantenha suas raízes." (Victor Hugo, ) O Senhor é o meu pastor; nada me faltará. Deitar-me faz em verdes pastos. Guia-me mansamente a águas tranqüilas. Refrigera a minha alma. Guia-me pelas veredas da justiça, por amor do seu nome. Salmo 23, 1-3

10 RESUMO MIRANDA, Farlen José Bebber, M.Sc., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Julho de Soro-epidemiologia da erliquiose canina em Campos dos Goytacazes, RJ. Orientador: Prof. Antonio Peixoto Albernaz. A erliquiose canina é uma das principais doenças infecciosas que acometem o cão, sendo a Ehrlichia canis o principal agente etiológico da doença no Brasil, possuindo ainda importância zoonótica. Os sinais clínicos podem se apresentar bastante inespecíficos, e o auxílio laboratorial é item fundamental para se chegar a um diagnóstico definitivo, e assim haver maiores chances de cura. O diagnóstico de erliquiose pode ser feito em lâmina, embora seja um teste de baixa sensibilidade, principalmente em baixas parasitemias, sendo a sorologia pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) o método de escolha diagnóstica. No presente estudo foram utilizadas amostras de sangue de 85 cães sintomáticos e oriundos do município de Campos dos Goytacazes, para realização de exames de esfregaço sangüíneo periférico e sorológico. Dos 85 cães, 55 (64,71%) apresentaram corpúsculos de inclusão ou mórulas em leucócitos ou plaquetas, e todos apresentaram anticorpos séricos IgG anti-ehrlichia canis. A análise estatística demonstrou que os principais achados clínicos nos animais soropositivos foram a presença de carrapatos, mucosas pálidas, apatia, pirexia e emaciação, com número significativamente maior de fêmeas apresentando linfoadenomegalia nos animais positivos em lâmina. Palavras-chave: Ehrlichia canis, Imunofluorescência Indireta, hemoparasitose, zoonose.

11 ABSTRACT MIRANDA, Farlen José Bebber, M.Sc., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. July; Serum epidemiology of canine ehrlichiosis in Campos dos Goytacazes, RJ. Advisor: Prof. Antonio Peixoto Albernaz. Canine ehrlichiosis is a very important infectious disease, and Ehrlichia canis is the most common and pathogenic causative agent in Brazil, with zoonotic importance. The clinical symptoms can be unspecific, and the laboratorial assistance is necessary for the definitive diagnosis and correct treatment, increasing the chances of cure. The presence of morulae in blood smear is considered a definitive diagnosis, however, is a test of low sensitivity, difficult at low parasitemia, when is necessary the use of other tests, such as Indirect Immunofluorescence (IIF), considered the best serological test for the diagnosis. In this study, 85 blood samples of symptomatic dogs were used for the conduct cytological and serological examinations in the city of Campos dos Goytacazes. 55 (64.71%) dogs showed bodies of inclusion or morulaes in leukocytes or platelets, and all had anti-ehrlichia canis IgG antibodies in this clinic serological study. The statistical analysis of the clinical data showed that the most importants clinical signs were the presence of ticks, pale mucous membranes, apathy, pyrexia and weight loss. When the animals that presented bodies inclusions or morulaes were analyzed, was observed a significantly higher number of females with lymphoadenomegaly. Key-Words: Ehrlichia canis, Indirect Immunofluorescence, hemoparasitosis, zoonosis.

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 09 2 REVISÃO DE LITERATURA HISTÓRICO AGENTES ETIOLÓGICOS PATOGENIA ALTERAÇÕES CLÍNICAS ALTERAÇÕES LABORATORIAIS DIAGNÓSTICO TRATAMENTO 17 3 MATERIAL E MÉTODOS VERIFICAÇÃO DAS ALTERAÇÕES CLÍNICAS AMOSTRAGEM E COLETA PROCESSAMENTO DA AMOSTRA E REALIZAÇÃO DOS EXAMES ANÁLISE ESTATÍSTICA 20 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ALTERAÇÕES CLÍNICAS PESQUISAS DE HEMOCITOZOÁRIOS DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO 25 5 CONCLUSÕES 27 REFERÊNCIAS 28 ANEXOS 36 ANEXO A - Ficha clínica utilizada 36 ANEXO B - Metodologia da Reação de Imunofluorescência Indireta 37 ABEXO C Tabelas 38 ANEXO D Fotografias de animais positivos à sorologia 39 ANEXO E Fotomicrografias 40

13 1 INTRODUÇÃO 09 As erliquioses são causadas por bactérias pleomórficas Gram-negativas intracelulares obrigatórias que parasitam leucócitos de muitas espécies de animais, inclusive o homem (McDADE, 1990; GALVÃO et al., 2002; SILVA; GALVÃO, 2004), já tendo havido positividade sorológica humana por Ehrlichia canis no Brasil (CALIC et al., 2004). Em caninos, a Ehrlichia canis e o Anaplasma platys são os organismos riquetsiais mais importantes. Ehrlichia canis comumente parasita leucócitos e plaquetas e o Anaplasma platys parasita plaquetas, o que poderia eventualmente dificultar o diagnóstico, principalmente por existir a possibilidade de infecções concomitantes, tendo inclusive o mesmo vetor (WOLDEHIWET; RISTIC, 1993; HUA et al., 2000; LABRUNA et al., 2001). O carrapato ixodideo Rhipicephalus sanguineus ou carrapato vermelho do cão é o principal responsável pela transmissão da erliquiose canina através de sua secreção salivar (SMITH et al., 1976). Este artrópode habita ambientes urbanos e tem hábitos nidícolas, vivendo em tocas, ninhos, e até mesmo em esconderijos nos canis. Preferem se fixar às regiões do pescoço, orelhas, espaços interdigitais e dorso (LABRUNA et al., 2001). A erliquiose canina é uma infecção que se caracteriza por diferentes alterações clínicas, distribuídas nas fases aguda, subclínica e crônica. Os sinais clínicos geralmente são oriundos de hiperplasia linforreticular disseminada e das alterações hematológicas, muitas vezes com hipoplasia medular na fase crônica (STILES, 2000; MOREIRA et al., 2003; MORAIS et al., 2004). A patogenia das erliquioses se dá em grande parte pela intensa vasculite que pode ser causada. Assim, a nefrite intersticial, meningoencefalite não supurativa, esplenomegalia, hiperplasia de cordões medulares e inflamação perivascular no fígado com presença de degeneração hidrópica podem ser algumas conseqüências da erliquiose aguda (CASTRO et al., 2004). A Reação de Imunofluorescência Indireta - RIFI é o método considerado padrão-ouro pela Organização Mundial da Saúde OMS para o diagnóstico das riquetsioses através da utilização de antígenos específicos, e é bastante eficiente (WOODY; HOSKINS, 1991; GALVÃO et al., 2005). Trata-se de uma técnica utilizada desde 1972, e pode ser aplicável para detecção de IgG em estudos epidemiológicos e experimentais, sendo os antígenos utilizados oriundos de cultivo em células infectadas por Ehrlichia canis (ANDEREG; PASSOS, 1999). É possível

14 10 haver reação cruzada entre Ehrlichia canis e Ehrlichia chaffeensis, embora esse problema não seja considerável em relação ao Anaplasma platys (HARRUS et al., 1997). O tratamento da erliquiose canina é feito com o uso de drogas como tetraciclina, doxiciclina (NEER et al., 2002) e dipropionato de imidocarb (MATTHERWMAN et al., 1994). Corticosteróides são utilizados com certa freqüência (NYNDO et al., 1980), e dentre os antibióticos, a oxitetraciclina é o fármaco de escolha, seguido de doxiciclina. O tratamento deve ser iniciado quando forem constatadas mórulas, no entanto, sinais clínicos ou alterações laboratoriais compatíveis com erliquiose justificam o tratamento (TRAPP et al., 2006). O objetivo deste trabalho foi detectar a positividade sorológica frente à erliquiose canina através da imunofluorescência indireta em pacientes sintomáticos, bem como estudar a casuística dos sintomas, além de inserir a referida técnica como ferramenta diagnóstica na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ.

15 2 REVISÃO DE LITERATURA HISTÓRICO O primeiro relato da doença em cão ocorreu em 1935, na Argélia, em um pastor alemão. Foi descrita por Donatien e Lestoquard como Rickettsia canis e redenominada Ehrlichia canis em 1945, por Mashkovsky. No entanto, foi no Vietnã que surgiu a primeira grande epizootia, quando aproximadamente 300 cães militares americanos desenvolveram uma doença hemorrágica em grande parte fatal, denominada à época por pancitopenia tropical canina, onde se observou mais freqüentemente apatia, epistaxe, anemia e leucocitopenia (HUXSOLL et al., 1970). A erliquiose monocítica canina causada por Ehrlichia canis foi documentada em todo o mundo, principalmente nas áreas tropicais e subtropicais, casando grandes prejuízos à sanidade animal (RIKIHISA, 1991). 2.2 AGENTES ETIOLÓGICOS Inicialmente, as bactérias do gênero Ehrlichia eram classificadas quanto às características das células parasitadas, na sua distribuição geográfica e na gravidade da doença. No entanto, um intenso estudo molecular recente sugeriu um reagrupamento taxonômico das espécies do gênero, com a transferência de espécies deste para o gênero Anaplasma, dentre elas a Ehrlichia platys, que passou a ser denominada Anaplasma platys (DUMLER et al., 2001). Outros agentes riquetsiais, inclusive do mesmo gênero Ehrlichia, podem causar sintomatologia semelhante àquela causada pela Ehrlichia canis. Podem ser citadas Ehrlichia chaffeensis, tendo inclusive tropismo por células mononucleares (DAWSON; EWING, 1992), a Ehrlichia ewing, que causa infecção granulocítica em cães e Anaplasma phagocytophila, que também causa infecção em felinos. No entanto, tais microrganismos são endêmicos da América do Norte (BJOERSDORFF et al., 1999). O Anaplasma platys tem distribuição mundial e pode causar infecção grave, a exemplo de Ehrlichia canis, inclusive sendo possível haver co-infecção entre os dois agentes, haja vista possuírem o mesmo vetor (HUA et al., 2000; LABRUNA et al., 2001).

16 12 É sabido que a Ehrlichia canis é o agente causador de doença mais corriqueiro e grave nos cães, se localizando nas células do sistema retículo endotelial do fígado, baço e linfonodos, onde se reproduzem em grande escala em células mononucleares e linfócitos, por divisão binária (BANETH et al., 1996). No entanto, casos complicados também podem ser observados em infecções concomitantes com outros microrganismos (ASSARASAKORN; NIWETPATHOMWAT, 2007). 2.3 PATOGENIA A patogenia das erliquioses na fase aguda se dá em parte pela intensa vasculite ocasionada pela ligação de mononucleares ao endotélio vascular com infecção subendotelial, assim, a nefrite intersticial, meningoencefalite não supurativa, esplenomegalia, hiperplasia de cordões medulares e inflamação perivascular no fígado com presença de degeneração hidrópica podem ser algumas conseqüências da erliquiose aguda (CASTRO et al., 2004). A multiplicação do agente ocasiona hiperplasia linforreticular com organomegalia (DAVOUST, 1993), seguida da disseminação da bactéria por todo o corpo através de células infectadas, ocasionando vasculites com respostas inflamatórias perivasculares (HARRUS et al., 1997). A patogenia dos distúrbios plaquetários pode ocasionar hemorragias, que é justificada por vários fatores, como hipoplasia megacariocítica e redução do tempo de vida, por fatores inflamatórios e imunomediados, além de alteração no mecanismo de coagulação propriamente dito (DAVOUST, 1993). Além de fatores hemorrágicos, a hipoplasia medular é uma causa de anemia na erliquiose canina, assim como as hemólises (ALMOSNY et al., 2000a). Pode-se considerar a erliquiose canina como de patogênese auto-imune, em função do grande número de auto-anticorpos formados contra as plaquetas dos cães infectados (HARRUS et al., 1996b), além da importante ocorrência de hipergamaglobulinemia, plasmocitose tecidual intensa e hiperplasia linforreticular (NYNDO et al., 1980), além disso, cães submetidos à terapia corticosteróide normalmente desenvolvem sintomatologia mais branda (HARRUS et al., 1998b). Distúrbios circulatórios podem ser exacerbados pela síndrome da viscosidade sangüínea em virtude do grande aumento de concentração protéica no sangue, particularmente por hipergamaglobulinemia. Tal processo é originado pela intensa e

17 13 ineficaz resposta imune do hospedeiro frente ao agente agressor, com produção de grande quantidade de anticorpos séricos, podendo também estar presente na fase subclínica e crônica. No entanto, em cães pancitopênicos pode não haver hipergamaglobulinemia. Isso pode ser explicado pelo baixo número de células T- helper e de células apresentadoras de antígenos, que são os principais secretores de citocinas responsáveis pela ativação de linfócitos B em plasmócitos, ocasionando infecções importantes com baixas concentrações de gamaglobulinemias (HARRUS et al., 1996a). Os níveis plasmáticos de ALT, de fosfatase alcalina, de proteases c-reativas (CRP) e de alfa-1-ácido-glicoproteínas (AAG) podem estar aumentados na fase aguda, sendo indícios de eventuais lesões hepáticas. A hiperbilirrubinemia corrobora com este fato, além de indicar um possível quadro hemolítico (WOODY; HOSKINS, 1991; RIKIHISA et al., 1994). Em contraste com o comum aumento das gamaglobulinas, observa-se freqüentemente hipoalbuminemia na fase aguda, que também pode se estender por todo o transcorrer da doença em alguns animais. O fato pode ser explicado por hiporexia ou anorexia, perda de peso, perda de fluídos em conseqüência de vasculites, hepatopatia e nefropatia (WOODY; HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1996a). É provável também ser a hipoalbuminemia um mecanismo compensatório de manutenção da pressão vascular em níveis tolerados, controlando a pressão oncótica e a viscosidade do sangue, que por outro lado, estão sendo desequilibradas pela hipergamaglobulinemia (HARRUS et al., 1996b). 2.4 ALTERAÇÕES CLÍNICAS A fase aguda da doença tem início aproximadamente de oito a 20 dias após a inoculação, podendo durar de 15 a 28 dias. Neste período há multiplicação do microrganismo nas células mononucleares, principalmente no fígado e baço, causando organomegalia. Nesta fase, os sinais observados são geralmente inespecíficos, como febre, secreção oculonasal, anorexia, apatia, perda de peso, cianose, estertores pulmonares e petéquias, equimoses, vômito e descarga nasal mucopurulenta (WOODY; HOSKINS, 1991). No entanto, a fase aguda pode não ser evidente em uma parcela dos casos, passando despercebida pelos proprietários dos animais (ANDEREG; PASSOS, 1999).

18 14 Inais clínicos podem diminuir bastante ou até desaparecer em grande parte dos animais doentes dentro de até quatro semanas, mesmo sem tratamento específico, mas o hospedeiro permanece infectado, fase essa conhecida como subclínica (HARRUS et al., 1998a). A fase subclínica instala-se quando o cão sobrevive à fase aguda e é caracterizada pela diminuição dos sintomas clínicos e elevados níveis de anticorpos séricos, em virtude da intensa resposta imunológica frente aos antígenos, podendo durar meses, progredindo ou não para a cronicidade. Nesta fase há a possibilidade de eliminação da doença em cães imunocompetentes, enquanto cães imunodeprimidos evoluem para a fase crônica (WANER et al., 1997). A instalação da fase crônica também está na dependência da cepa infectante, de doenças concomitantes, alimentação, raça, características individuais e idade do animal (WOODY; HOSKINS, 1991). Os sinais são exacerbados, e incluem pneumonia, apatia, caquexia, sangramentos, tosses, equimoses, poliartrites e hematúria. Lesões oculares como hifema, hemorragias sub-retinal, uveítes, descolamento de retina e cegueira podem ocorrer, estando relacionadas às vasculites, ao aumento da pressão oncótica e às plaquetopenias (HARRUS et al., 1998b). Alterações neurológicas como ataxia, disfunção motora, hiperestesia localizada e tremores podem ser ocasionadas por meningites, hemorragias nas meninges, no parênquima cerebral ou na medula espinhal. Inoculações experimentais com amostras brasileiras de Ehrlichia canis demonstraram lesões cerebrais importantes com meningites não supurativas e acúmulo de mononucleares no córtex cerebral, cerebelo e cordões espinhais (CASTRO et al., 2004). Poliartrites graves acompanhadas de edemas de membros podem surgir em decorrência de formação de imunocomplexos, e é comum se observar acúmulo celular no líquido sinovial, que se torna viscoso. Imunocomplexos também são em grande parte responsáveis por glomerulonefrites e grave decréscimo da função renal (HARRUS et al., 1996a). Epistaxe, hemorragias generalizadas e insuficiência renal progressiva agravam o quadro do paciente (ANDEREG; PASSOS, 1999). Alguns cães apresentam dermatites freqüentes por fungos Aspergillus niger e Penicillium sp., o que demonstra uma evidente imunodepressão (ALMOSNY et al., 2000b). A neutropenia observada em fase crônica pode resultar em sérios danos à defesa

19 15 orgânica frente a agentes microbianos oportunistas, fator que corrobora com os altos índices de cães portadores de infecções secundárias (HARRUS et al., 1996b). 2.5 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS A presença de mórulas em leucócitos ou plaquetas é mais freqüentemente observada na fase aguda, embora apenas em uma pequena parcela de cães. (ANDEREG; PASSOS, 1999). A anemia na fase aguda de erliquiose canina pode variar de leve a grave, e é de caráter arregenerativo, em conseqüência de forte diminuição da resposta medular aos estímulos de eritropoiese (ALMOSNY et al., 2000a; PAGANI et al., 2000) e em decorrência de comprometimento orgânico importante (OLIVEIRA et al., 2000). A contagem total de leucócitos freqüentemente varia durante a fase aguda, podendo levar primariamente a linfocitopenia e eosinopenia (WADDLE; LITTMAN, 1987). O número de monócitos pode variar muito entre cães, sendo a monocitose um achado freqüente e indicativo da possibilidade de erliquiose mesmo antes da observação de mórulas, que comumente são observadas nas altas parasitemias, características de fase aguda (PAGANI et al., 2000). A trombocitopenia pode ocorrer entre 10 e 20 dias pós-infecção, acompanhada de um aumento do número de plaquetas jovens circulantes, característica que pode ser observada em toda a fase da doença em grande parte dos cães acometidos (ANDEREG; PASSOS, 1999). Sua causa é decorrente da diminuição do tempo de meia-vida das plaquetas, em virtude de lise secundária a fatores imunológicos e de coagulação, resposta inflamatória (WANER et al., 1995), além da infecção propriamente dita (ANDEREG; PASSOS, 1999; STILLES, 2000). Casos positivos sem trombocitopenia são freqüentemente observados. O aumento do tempo de coagulação é proveniente da inibição da agregação plaquetária, resultante da presença de anticorpos antiplaquetas ligantes às glicoproteínas de suas membranas (HARRUS et al., 1996b). Na fase subaguda, a trombocitopenia segue como achado importante (CODNER; FARRIS-SMITH, 1986) e são comuns também leucopenia acompanhada de monocitose, além de neutropenia (WANER et al., 1997). A concentração de globinas continua a crescer, sendo esta fase caracterizada por ocorrer o pico de hipergamaglobulinemia. A urinálise freqüentemente é caracterizada por proteinúria,

20 16 decorrente de glomerulonefrites ocasionadas pela hipergamaglobulinemia (VARELA et al., 1997). A azotemia observada na erliquiose canina também pode ser oriunda de nefropatia (CODNER; MASLIN, 1992). O tempo de sedimentação e de coagulação comumente encontram-se aumentado (HARRUS et al., 1996b). Pode ser observado o aumento do tamanho das plaquetas, relacionado ao grande aumento de liberação de trombócitos jovens na circulação, em decorrência de importante perda. Anemia pode ocorrer com um esperado decréscimo da concentração de hemoglobina (WANER et al., 1997). Na fase crônica, o principal achado laboratorial é a pancitopenia, resultante de hipoplasia medular grave ou até mesmo de uma aplasia, que pode ser observada em biópsia. Destacam-se ainda monocitose, linfocitose e leucopenia, além da diminuição drástica da concentração de gamaglobulinas (HARRUS et al., 1996a). 2.6 DIAGNÓSTICO As alterações clínicas são importantes e sugestivas ao diagnóstico, apesar de serem inespecíficas (ALMOSNY; MASSARD, 2002; MOREIRA et al., 2003; MORAIS et al., 2004; ORIÁ et al., 2004). Apesar de ser confirmatória e altamente específica, a pesquisa de hemocitozoários apresenta limitações importantes pela baixa sensibilidade, já que nas fases subaguda e crônica a visualização de corpúsculos e mórulas pode ficar dificultada, em virtude de baixa parasitemia (CASTRO et al., 2004; MOREIRA et al., 2005). Neste caso, os testes sorológicos como a Imunofluorescência Indireta - RIFI (ORIÁ et al., 2004) e o DOT-ELISA são importantes (OLIVEIRA et al., 2000; BÉLANGER et al., 2002; MACHADO, 2004), além do diagnóstico molecular utilizando-se o nested-pcr, capaz de fazer diagnóstico diferencial entre espécies (HARRUS et al., 1998a; DAGNONE et al., 2003). O primeiro pico de anticorpos IgA e IgM séricos acontece no sétimo dia pósinfecção natural (BANETH et al., 1996), enquanto o pico de IgG pode ocorrer no 15º (WANER et al., 1995) e entre o segundo e sexto dia pós-infecção experimental (IQBAL; RIKIHISA, 1994). A detecção de anticorpos IgG séricos pode ficar prejudicada pela diminuição de proporção de células CD4+:CD8+, e somente haver a conversão sorológica 28 dias pós-infecção (HESS et al., 1997). O título de anticorpos aumenta no transcorrer da doença e pode se observar detecção em

21 17 média por nove meses pós-infecção (NEER et al., 2002). É sabido ainda que o aparecimento de anticorpos séricos obedece a uma série de mecanismos fisiológicos e imunológicos, e que podem estar na dependência de fatores individuais e microbiológicos, acarretando um falso negativo na sorologia mesmo havendo a positividade em lâmina, devendo o teste ser repetido entre 14 e 21 dias (MORAIS et al., 2004). Animais positivos em lâmina e negativos na sorologia provavelmente foram infectados recentemente (WOODY; ROSKINS, 1991). A RIFI é utilizada desde 1972 para o diagnóstico da erliquiose canina (RISTIC et al., 1972), e é a técnica sorológica mais empregada (WOODY; HOSKINS, 1991) tanto em situações experimentais como em pesquisas epidemiológicas, sendo os antígenos comumente procedentes de cultivo celular infectado com Ehrlichia canis (ANDEREG; PASSOS, 1999). Apesar de ser um método eficiente e sensível capaz de detectar anticorpos a partir do sétimo dia pós-infecção (WOODY; HOSKINS, 1991), a positividade não indica a fase da doença na qual o animal se encontra, mas apenas comprova se o animal teve contato com o agente etiológico, pois anticorpos séricos podem ser detectáveis por longos períodos (NEER et al, 2002). A RIFI tem como desvantagem as fortes reações cruzadas que podem ocorrer frente a outros microrganismos do gênero, como Ehrlichia sennetsu (RISTIC et al., 1981; RIKIHISA, 1991) e Ehrlichia chaffeensis, não sendo possível a realização do diagnóstico preciso entre essas três espécies pela RIFI. Reação cruzada com Anaplasma platys não ocorre (GREGORY; FORRESTER, 1990; EGENVALL, 1997). 2.7 TRATAMENTO Devem ser tratados os cães que demonstrarem detecção de anticorpos séricos, alterações clínicas e laboratoriais características, além de presença de mórulas. No entanto, há ocasiões em que cães assintomáticos são soropositivos, e nestes casos se torna necessário diferenciar uma situação em que o cão apenas teve contato com o agente de casos de erliquiose. Nestas situações é importante a utilização de PCR ou a confecção de esfregaço sangüíneo periférico a procura de mórulas, o que caracteriza infecção (TRAPP et al., 2006). Em ocasiões de soropositividade sem sinais característicos, ficará a cargo do médico veterinário a escolha da conduta a ser tomada, após avaliar os prós e contras do tratamento (MORAIS et al., 2004).

22 18 O tratamento da erliquiose canina é feito mais freqüentemente com as tetraciclinas ou imidocarb, sendo a doxiciclina mais usual devido à sua baixa toxicidade, na dose de 10 mg/kg uma vez ao dia (SID) via oral (VO) por 28 dias, considerado o tratamento de eleição (NEER et al., 2002). O tratamento com o dipropionato de imidocarb é feito na dose de 5 mg/kg via subcutânea (SC) em duas aplicações em intervalo de 15 dias (MATTHERWMAN et al., 1994), e pode ser utilizado concomitantemente com a doxiciclina, sendo mais eficaz que as tetraciclinas no tratamento de infecções por Ehrlichia chaffeensis (KORDICK et al., 1999). Os cães tratados com tetraciclina ou imidocarb não têm a parasitemia eliminada, apesar de diminuída mesmo após a melhora do quadro clínico, que ocorre após 24 a 48 horas após o início da terapia. A plaquetometria aumenta lentamente, retornando ao normal até 14 dias iniciado o tratamento. Os anticorpos séricos permanecem detectáveis na circulação por até nove meses, o que leva ao entendimento de que a repetição sorológica não tem valor para o controle da eficácia medicamentosa (NEER et al., 1999). Cães tratados parecem não ter imunidade persistente frente à erliquiose, e podem se infectar novamente por cepas homólogas e heterólogas, assim, o controle de ectoparasitos é item fundamental na prevenção e manejo sanitário. Pode ser considerada viável como profilaxia o tratamento de cães parasitados por carrapatos ou que serão introduzidos em locais com animais sabidamente não infectados (MORAIS et al., 2004).

23 3 MATERIAL E MÉTODOS VERIFICAÇÃO DAS ALTERAÇÕES CLÍNICAS Foram considerados clinicamente suspeitos cães que apresentaram pelo menos dois sintomas sugestivos de erliquiose, como ectoparasitismo por carrapatos (MORAIS et al., 2004) mucosas pálidas, apatia, pirexia, emaciação e alterações oftálmicas, linfoadenomegalia, desidratação, infecções respiratórias, dermatopatias e alterações hemorrágicas, mucosas congestas, poliartrites, ataxia e aumento do tempo de coagulação, gastroenterite hemorrágica e hipotermia, edema de membro, icterícia e emese (STILES, 2000; ALMOSNY; MASSARD, 2002; MORAIS et al., 2004; TRAPP et al., 2006). 3.2 AMOSTRAGEM E COLETA Foram coletadas amostras de 85 caninos com suspeita clínica de erliquiose, independente de raça, entre 15 de maio a 07 de novembro de 2007, no atendimento clínico do Hospital Veterinário da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Os dados referentes ao animal e proprietário foram anotados em uma ficha própria, para organização e posterior reunião dos dados para análise. O modelo de ficha em questão se encontra nos anexos. Os animais foram separados por sexo e alocados em três grupos etários, sendo o primeiro grupo formado com cães com menos de um ano de idade, o segundo formado com cães entre um e seis anos, e o terceiro grupo, formado com animais com idade superior a seis anos. Visando a realização da pesquisa de hemocitozoários, os animais suspeitos tiveram sangue periférico coletado por punção auricular interna utilizando-se agulha fina, quando se aproveitou apenas a primeira gota de sangue. Em seguida, foram coletados 10 ml de sangue sem anticoagulante através da veia cefálica com agulha 25x7mm, para a obtenção do soro e realização da Reação de Imunofluorescência Indireta RIFI, tendo em vista a pesquisa por anticorpos IgG anti-ehrlichia canis. As amostras de sangue foram acondicionadas em tubos com gel separador Vacutainer, que foram mantidas entre 2 a 8 C e posteriormente encaminhados, juntamente com os esfregaços, para o Setor de Patologia Clínica do Laboratório de

24 20 Sanidade Animal, do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. 3.3 PROCESSAMENTO DA AMOSTRA E REALIZAÇÃO DOS EXAMES Os esfregaços foram corados com o Panótico New Prov, e observados à microscopia de luz em objetiva de imersão em aumento de 1.000X em microscópio Nikon, a procura de corpúsculos elementares, iniciais ou mórulas em leucócitos e plaquetas, que caracterizam a positividade para erliquiose. As amostras de sangue total foram centrifugadas a 1,26x10 4 G por cinco minutos em centrífuga RCE, com a finalidade de se obter o soro límpido, necessário à sorologia. O soro foi posteriormente pipetado e acondicionado em tubos tipo Eppendorf em temperatura de 20 C até o seu descongelamento, 15 minutos antes da sorologia. O Kit sorológico foi produzido a partir de isolados de Ehrlichia canis amostra Jaboticabal SP, produzido em substrato de cultura celular de células DH82 (AGUIAR et al., 2007), e adquiridos junto à empresa Imunodot. A sorologia seguiu as orientações técnicas do fabricante, e o procedimento em questão pode ser observado nos anexos. 3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA Com base nos resultados referentes ao diagnóstico em lâmina, foi utilizado o teste Qui-quadrado (α=5%), tanto para comparar os grupos sexuais na realização do teste de homogeneidade, em que se testaram as hipóteses de independência entre sexo e forma de avaliação (mórula e sintomas), quanto de independência entre sexo nos grupos etários. Foi realizado o teste de intervalo de confiança para proporção (COCHRAN, 1955), considerando o nível de significância α igual a 5% pelo programa SAEG (UFV, 1997), para a verificação da casuística dos sintomas observados nos animais positivos na sorologia.

25 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ALTERAÇÕES CLÍNICAS A erliquiose canina é uma doença conhecida por apresentar alterações clínicas inespecíficas, embora sugestivas, de caráter inflamatório e auto-imune e de tendência a cronificação (HARRUS et al., 2001). Ao uso do teste de intervalo de confiança para proporção (α= 5%), foi observado que infestação por carrapatos, mucosas pálidas, apatia, pirexia e emaciação foram as alterações mais importantes nos animais soropositivos. Mylonakis et al. (2004) ao observarem 19 casos de erliquiose canina crônica, observaram achados clínicos compatíveis com o presente estudo, na seguinte ordem: apatia, eventos hemorrágicos, emaciação, mucosas pálidas, pirexia e adenomegalia. Segundo Andereg e Passos (1999), a fase crônica apresenta os mesmos sinais clínicos da fase aguda, embora mais exacerbados e com agravamento das alterações hematológicas, aplasia de medula, sinais de insuficiência renal e eventos hemorrágicos. Assim, sugere-se a possibilidade de que a maioria dos animais sintomáticos no presente estudo estivesse em fase aguda no momento da avaliação clínica, tendo em vista a pouca casuística de eventos hemorrágicos e a importante freqüência de animais que apresentou pirexia, que é uma característica marcante de fase aguda (JOHNSON et al., 1998; ANDEREG; PASSOS, 1999). Sinais geralmente inespecíficos compõem o quadro clínico da erliquiose canina, tendo em vista a patogenia de caráter inflamatório e auto-imune da doença, embora sejam sugestivos para o clínico, havendo a necessidade de confirmação laboratorial (MOREIRA et al., 2003; MORAIS et al., 2004). No presente trabalho foi observada uma considerável variação de sinais nos animais suspeitos, fato explicado pelos autores citados anteriormente, e dispostos estatisticamente no Gráfico 1, em anexo. O ectoparasitismo por carrapatos destoou como achado mais importante nos animais sintomáticos, sendo um fato a ser observado na investigação de casos inespecíficos em ambientes altamente propícios ao desenvolvimento do vetor (MORAIS et al., 2004), como ocorre em Campos dos Goytacazes. Bulla et al. (2004) mencionaram o fato da maior probabilidade de infecção nestes ambientes pela maior

26 22 freqüência de contato com o vetor, principalmente nos animais que têm acesso ao ambiente externo. Morais et al. (2004) relataram a presença de carrapatos como indicativo de possível infecção por Ehrlichia spp., inclusive como sendo um achado clínico, de anamnese, e de histórico, que justificam uma avaliação mais detalhada nestes animais, além dos sintomas clássicos. Mucosas pálidas, apatia, pirexia e emaciação seguiram como alterações mais importantes nos animais suspeitos, não se diferenciando estatisticamente entre si. Tais sinais são oriundos das características patogênicas de erliquiose, e embora sejam inespecíficos, são bastante observados em fase aguda da doença (ANDEREG; PASSOS, 1999). Pirexia tem como causas mais prováveis as alterações inflamatórias causadas e hiperplasia do sistema fagocítico mononuclear, com liberação de pirógenos que causam febre e debilidade no estado geral do paciente (WOODY; ROSKINS, 1991; HARRUS et al., 1997). Segundo Almosny e Massard (2002), mucosa hipocorada, apatia e emaciação são alterações também rotineiras em casos crônicos, oriundos das alterações fisiopatológicas causadas por importantes anemias, infiltrações perivasculares e hipoplasia medular, com pancitopenia e destruição de plaquetas. No entanto, em infecções naturais a diferenciação entre as fases da doença se mostra extremamente dificultosa, particularmente em virtude das complicações oriundas de co-infecções com babesiose, hemobartonelose e hapatozoonose, além de infecções secundárias à baixa imunidade (BUORO et al., 1990). Alterações oftálmicas são achados importantes na avaliação do animal sintomático, principalmente em relação às uveítes (MORAIS et al., 2004; ORIÁ et al., 2004). Podem ser citados também hifema, hemorragia e deslocamento de retina, sendo provável a participação de várias alterações fisiológicas nos processos patológicos oculares, como hiperviscosidade sangüínea, elevação da pressão oncótica, vasculites, trombocitopenia e disfunções plaquetárias (HARRUS et al., 1998c). Poliartrites, ataxia, hipotermia, e aumento do tempo de coagulação, edema de membro, icterícia e emese não tiveram importância estatística e constituíram, no total, características não significativas, pois seus valores não se diferenciaram estatisticamente de zero, com pouca significância clínica no presente estudo. Na Figura 1 (anexos) são mostrados um animal com mucosa oral pálida e um cão apresentando caquexia e apatia, ambos atendidos durante o presente experimento.

27 23 Quadros hemorrágicos difusos, embora sugiram erliquiose em áreas de risco, não tiveram grande freqüência no presente trabalho, corroborando com os relatos de Almosny e Massard (2002), que citaram uma diminuição destas alterações no Estado do Rio de Janeiro ao longo do tempo, provavelmente em decorrência de adaptação parasito-hospedeiro ou de cepa infectante. Trapp et al. (2006) observaram sangramentos mais freqüentes em cães com positividade sorológica concomitante para Ehrlichia spp. e Babesia spp. Fotografias de cães apresentando sintomas hemorrágicos podem ser observadas na Figura 2 (anexos). 4.2 PESQUISA DE HEMOCITOZOÁRIOS Dos 85 animais sintomáticos, 55 (64,71%) apresentaram corpúsculos de inclusão ou mórulas em leucócitos ou plaquetas, uma positividade maior que a observada em estudos já realizados na mesma cidade (ALBERNAZ et al., 2007), no entanto, tais estudos não discriminaram sintomatologia específica, sendo focados nos aspectos epidemiológicos e hematológicos de dados retrospectivos. Fonseca et al. (2007), em Niterói, observaram 2,5% de parasitismo, também em estudo retrospectivo, enquanto Soares et al. (2006) observaram 16% de parasitismo em lâmina em seus estudos. Moreira et al. (2003) ao analisarem 194 fichas clínicas de animais com suspeita de erliquiose, constataram uma positividade em lâmina em 52 (26,88%) animais parasitados, sendo que destes, 31 cães com parasitismo em leucócitos e 21 em plaquetas, fazendo uma correlação com Ehrlichia canis e Ehrlichia platys, respectivamente. O exame de hemocitozoários é considerado uma técnica específica, caracterizando a erliquiose, embora seja de baixa sensibilidade em virtude da dificuldade de observação de mórulas na fase crônica da doença (OLIVEIRA et al., 2000; CASTRO et al., 2004), sendo mais freqüentemente observada em fase aguda, principalmente em picos febris (CASTRO et al., 2004). Elias (1991) mencionou que a positividade por mórulas pode ser observada em 4% dos cães estudados em áreas enzoóticas, no entanto, o mesmo autor também enfatizou que se forem considerados os corpúsculos de inclusão, os estudos podem revelar um parasitismo de 88%, chamando a atenção para tal característica como importante ítem a ser considerado nestas áreas. A Figura 3 (anexos) ilustra duas células parasitadas, nas

28 24 quais é possível a observação de mórulas, respectivamente em um monócito e em uma plaqueta. Três a cinco dias pós-infecção podem aparecer os primeiros corpúsculos elementares como inclusões pleomórficas no interior do citoplasma, sendo a mórula observada entre 10 e 17 dias pós-infecção (SWANGO et al., 1989). A fase aguda da doença tem início aproximadamente de oito a 20 dias após a inoculação, podendo durar de 15 a 28 dias, período o qual é caracterizado por alta parasitemia, quando as mórulas ou corpúsculos de inclusão são mais facilmente observados (WOODY; ROSKINS, 1991). Assim, tendo em vista as alterações clínicas observadas e a alta porcentagem de positividade em lâmina, o que indica possíveis altas parasitemias, provavelmente a maioria dos animais que apresentou mórulas estavam em fase aguda da doença. Esta hipótese é reforçada pelos estudos de Johnson et al. (1998), que em situação experimental, demonstraram que a pirexia tem início entre um e quatro dias antes do aparecimento de mórulas, alteração clínica essa das mais importantes neste trabalho. As considerações acerca das células parasitadas nos referidos animais estão dispostas na tabela 1, que se encontra nos anexos. Na análise estatística entre os dois grupos sexuais sem levar em consideração a idade pelo teste de Qui-quadrado com intervalo de confiança de 95%, foi observada diferença significativa entre o diagnóstico de corpúsculos ou mórulas e linfoadenomegalia, com valores significativamente maiores observados no grupo composto por fêmeas. Linfoadenomegalia é uma característica mais freqüentemente observada em erliquiose aguda, particularmente em virtude da natureza auto-imune e inflamatória da doença (ALMOSNY; MASSARD, 2002), entretanto, outros fatores podem estar envolvidos, como hormonais ligados ao sexo e gestação, que eventualmente podem acarretar diminuição da competência imunológica e favorecendo o aparecimento de infecções secundárias ou exacerbação dos sinais clínicos nos animais afetados, tendo em vista a patogênese da doença (NYNDO et al., 1980). Porém, é sabido que os hospedeiros do sexo feminino apresentam uma capacidade de implementação da resposta imune mais imediata, característica que provavelmente tenha caráter evolutivo em virtude de gestação e parto, períodos de maior estresse e exposição aos patógenos. Assim, é provável que a observação de contrastes entre os tratamentos seja em virtude do sexo (SAMPAIO, 2004), particularmente se for levado em conta o fato de que a

29 25 amplitude das alterações clínicas nas erliquioses está diretamente correlacionada à própria resposta imune do hospedeiro, por ser doença de caráter inflamatório e autoimune (STILES, 2000; ALMOSNY; MASSARD, 2002; MOREIRA et al., 2003; MORAIS et al., 2004). No entanto, ao se realizar a análise entre os sexos levando em consideração as faixas etárias, não foi observada qualquer diferença entre o diagnóstico em lâmina e sintomatologia. Trinta animais sintomáticos (35,29%) tiveram resultado negativo na pesquisa por inclusões características de erliquiose. A ausência de mórulas em animais sintomáticos não exclui a possibilidade de infecção, tendo em vista a baixa sensibilidade deste teste, situação esta em que a sorologia pode ser usada como método diagnóstico (MORAIS et al., 2004). 4.3 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO Dos 85 animais que apresentavam pelo menos duas alterações clínicas, a positividade sorológica foi observada em sua totalidade, pois em todos houve fluorescência específica. No entanto, apesar de confirmar o resultado em lâmina e sinais clínicos observados, a positividade sorológica não evidencia há quanto tempo o animal está infectado, apenas diz que ele teve contato com o microrganismo, mesmo se a doença tiver sido debelada (RISTIC et al., 1972; TRAPP et al., 2006). A soropositividade pela RIFI começa entre 7 a 21 dias pós-infecção, com máxima reatividade aproximadamente aos 80 dias e persiste, podendo a positividade permanecer por meses, mesmo após a cura (SWANGO et al., 1989; NEER et al., 2002). Waner et al. (1997) detectaram anticorpos através da RIFI em todos os animais sabidamente em fase subclínica, e citaram a sorologia como forma de identificar e tratar animais nesta fase da doença, prevenindo assim a fase crônica. Labarthe et al. (2003) citaram que 29,5% dos cães do Estado do Rio de Janeiro apresentam anticorpos contra Ehrlichia canis, e que aproximadamente 20% dos cães dos Estados do Rio Grande do Sul, Minas Gerais, Alagoas, Pernambuco, Mato Grosso do Sul e Paraná, Bahia, Santa Catarina, São Paulo, Ceará, e Distrito Federal também apresentam. No entanto, esses números são oriundos de estudos epidemiológicos que não levaram em conta os aspectos clínicos, portanto, não devem servir de comparação ao presente, tendo em vista este ser dirigido a animais com evidências clínicas de erliquiose. Esse fato é reforçado por Trapp et al. (2006),

30 26 que citaram a presença de carrapatos e de sinais clínicos como aumento das probabilidades de detecção de anticorpos séricos. No presente estudo, fotomicrografias obtidas ao momento da visualização ao microscópio de fluorescência podem ser observadas na figura 4, em anexo. Também em um estudo com amostragem aleatória, Trapp et al. (2006) no Brasil, observaram sorologia positiva para erliquiose através da RIFI em 23% dos cães, e 14% para co-infecção entre erliquiose e babesiose, enquanto Galvão et al. (2002) encontraram 17,81% de positividade para Ehrlichia canis. Da mesma forma, Watanabe et al. (2004) no Japão, detectaram positividade sorológica em 10% dos cães avaliados, porcentagem superior àquelas observadas em relação a outras espécies de Ehrlichia no mesmo estudo. Brouqui et al. (1991) usando a RIFI, detectaram 50% de positividade para Ehrlichia canis na África. Rodriguez-Vivas et al. (2005) no México, detectaram positividade sorológica em todos os animais clinicamente suspeitos que apresentaram mórulas em monócitos, pelo método ELISA. Em estudo realizado com RIFI em 172 cães sintomáticos, Tresamol et al. (1998) observaram positividade em 68,6% dos animais, chamando a atenção sobre a importância do teste nas investigações dos casos clínicos inespecíficos. Aguiar et al. (2007) realizaram sorologia por RIFI em 23 cães com sintomas variados, muitos deles com sintomas típicos de erliquiose, e observaram positividade em 17 (68%) animais. Os referidos autores, além de enfatizarem a investigação clínica, mencionam a importância de sua correlação ao histórico como forma de seleção dos animais submetidos à RIFI. O presente trabalho utilizou animais com sinais clínicos compatíveis de erliquiose, o que aumenta as chances de positividade. Isso resultou em achados parecidos com os de Rodriguez-Vivas et al. (2005), e que vão de encontro com as palavras de Morais et al. (2004) e Trapp et al. (2006), relacionadas às características do meio e conseqüente facilidade de exposição ao carrapato como importante aspecto a ser considerado, fator que provavelmente influi na cidade de Campos dos Goytacazes, por ter clima bastante propício ao desenvolvimento do vetor.

31 CONCLUSÕES Presença de carrapatos, palidez de mucosas, apatia, pirexia e emaciação foram consideradas as alterações clínicas mais freqüentes nos cães com suspeita clínica de erliquiose em Campos dos Goytacazes, RJ. Imunoglobulinas do tipo IgG anti-ehrlichia canis foram detectadas em todos os animais que apresentaram pelo menos dois sintomas típicos da doença. Pesquisas envolvendo o mesmo tema merecem continuidade na região.

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40 ANEXOS ANEXO A Ficha clínica utilizada durante o presente trabalho. Dissertação de Mestrado Farlen José Bebber Miranda Ficha clínica n.º Data: / / Dados do proprietário: Nome: End.: Tel.: Dados do animal: Nome: Espécie: Raça: Idade: Peso: Sexo: Local do atendimento/coleta: Alterações clínicas: Hemorragia ( ) não ( ) sim: ( ) Petéquias ( ) Equimoses ( ) Sufusão ( ) Epistaxe Outras: Diagnóstico citológico: ( ) pos. ( ) neg. / Diagnóstico sorológico: ( ) pos. ( ) neg. Obs: Tratamento:

41 ANEXO B Metodologia da Reação de Imunofluorescência Indireta. 1 Descongelamento da lâmina em temperatura ambiente 15 minutos antes de iniciar a reação; 2 Homogeneização do soro e posterior diluição deste a 1:20 em PBS 1X diluído + 0,1% BSA em tampão de diluição do soro; 3 Adicionamento de 10 µl do soro diluído nos poços, e incubação da lâmina em câmara úmida a 37 C por 30 minutos; 4 Lavagem da lâmina três vezes por cinco minutos, seguida de lavagem com água destilada, por um minuto, e secagem em temperatura ambiente; 5 Em sala escura, adicionamento do conjugado (IgG de coelho anti-igg de cão + isotiocionato de fluoresceína), diluído a 1:70 em PBS com 0,1% de Azul de Evans; 6 Lavagem da lâmina, conforme item quatro, e secagem em temperatura ambiente; 7 Descanso da lâmina por 45 minutos em sala escura, em temperatura ambiente; 9 Instilação na lâmina de cinco gotas de glicerina tamponada em ph 9,6 e cobertura desta com lamínula 24x50 mm; 10 Observação ao microscópio de fluorescência em aumento de 100X, e confirmação do diagnóstico ao aumento de 400X. As lâminas foram lidas ao microscópio de fluorescência modelo Jenalumar Zeiss, do Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal da UENF.

42 ANEXO C Tabela 1: Alterações clínicas, número de animais e porcentagem da sintomatologia nos 85 cães suspeitos para erliquiose em Campos dos Goytacazes, RJ. Sinal clínico N Incidência (%) Infestação por carrapatos 56 65,8 Mucosas pálidas 33 38,8 Apatia 30 35,3 Pirexia 26 30,5 Emaciação 26 30,5 Alterações oftálmicas 14 16,4 Dermatopatia 13 15,3 Linfoadenomegalia 9 10,5 Desidratação 7 8,3 Pneumopatias 7 8,3 Alterações hemorrágicas 6 7,1 Gastroenterite hemorrágica 5 5,8 Mucosa congesta 4 4,7 Poliartrites 3 3,5 Ataxia 3 3,5 Hipotermia 3 3,5 Aumento do tempo de coagulação 2 2,4 Edema de membro 1 1,2 Icterícia 1 1,2 Emese 1 1,2 Tabela 2: Células parasitadas, número de cães e sua porcentagem nos 55 animais sintomáticos que apresentaram corpúsculos ou mórulas em lâmina na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ. Célula parasitada N Porcentagem (%) Plaquetas 23 41,8 Monócitos 23 41,8 Plaquetas e monócitos 5 9,1 Plaquetas e linfócitos 3 5,5 Monócitos e linfócitos 1 1,8 Total

43 A 09 ANEXO D A B Figura 1: Fotografias demonstrando cães positivos para erliquiose, apresentando mucosa oral pálida (A), apatia e caquexia (B), incluídos no presente estudo. A B C Figura 2: Fotografias demonstrando hifema (A), hemorragia ocular (B) e equimoses (C), em cães positivos para erliquiose na cidade de Campos dos Goytacazes, RJ.

44 ANEXO E Figura 3: Fotomicrografias demonstrando, respectivamente, mórulas em monócito e em plaqueta (setas) de cães na cidade de Campos dos Goytacazes. Aumento de 1.000X, zoom óptico 2,8X. Figura 4: Fotomicrografia demonstrando reação positiva pela RIFI à Ehrlichia canis em cães na cidade de Campos dos Goytacazes. Ao lado são observados controle positivo (A) e o controle negativo (B), respectivamente. 400X, zoom óptico 2,8X.