NOTICE of CHANGE dated 23/03/16

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1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Office: Tel Fax E. mail: WEB site: NOTICE of CHANGE dated 23/03/16 IMPORTANT COMMUNICATION FOR THE USERS OF PRODUCT: «MYCOPLASMA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX» ref. Due to new product packaging, the Instruction for Use Manual (IFU) of SCH mrts094m reported following changes: The product kit (ref. ) now includes the product «MYCOPLASMA pn. Q - PCR Alert AmpliPROBE» (previously identified by ref. RTS094-P). The external aluminum envelope was removed from product packaging. For this reason the packaging of the product (ref. ) is made by a rigid plastic box containing all reagents tubes. All changes are reported in detail in the enclosed Instructions for Use (IFU). The product changes do not affect in any way the formulation of its reagents, their protocol of use and performance analytics. For this reason, the present IFU may also be used in association with the previous version of the product. PLEASE NOTE LA REVISIONE DI QUESTO IFU E COMPATIBILE ANCHE CON LA VERSIONE PRECEDENTE DEL KIT THE REVIEW OF THIS IFU IS ALSO COMPATIBLE WITH THE PREVIOUS VERSION OF THE KIT CET IFU MIS A JOUR ANNULE ET REMPLACE ET EST PARFAITEMENT COMPATIBLE AVEC LA VERSION PRECEDENTE DU KIT LA REVISIÓN DE ESTE IFU ES COMPATIBLE TAMBIÉN CON LA VERSIÓN ANTERIOR DEL KIT A REVISÃO DO ESTE IFU ÉTAMBÉM COMPATÍVEL COM A VERSÃO ANTERIOR DO KIT DIE REVIEW VON DIESER IFU IST KOMPATIBLE MIT DER VORIGE VERSION VON DEM TEST-KIT Notice of Change nr. SCH mrts020m_en, 23/03/16 Page 1/1

2 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Offices: Tel Fax E. mail: WEB site: MYCOPLASMA pn. Q - PCR Alert Kit Ref. RTS035 Composto da: Composed by: Composé par: Compuesto por: Composta por: Komponiert von: (MYCOPLASMA pn. AmpliMIX) (MYCOPLASMA pn. AmpliPROBE) Q - PCR Alert AmpliMASTER (M) (P) RTS000 _Front

3 MYCOPLASMA pn. Q - PCR Alert AmpliMIX ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 2 MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO pág. 3 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 3 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 3 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 5 PROCEDIMENTO pág. 6 LIMITES DO PROCEDIMENTO pág. 11 CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE pág. 12 BIBLIOGRAFIA pág. 14 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 15 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 16 USO PREVISTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: C O produto é parte de um teste qualitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a (M. pneumoniae) em amostras de DNA extraído de lavagens bronco-alveolares (BAL), aspirados broncotraqueais (BA). O produto é empregado, juntamente aos dados clínicos e a outros exames de laboratório, nos diagnósticos e na monitorização da infecção para M. pneumoniae. PRINCÍPIO DO TESTE O procedimento prevê a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time). Em cada pocinho se efectua uma reacção de amplificação específica para uma região do gene que codifica a citoadesina P1 de M. pneumoniae (repetida três vezes no genoma bactriano) e para uma região do gene humano da beta-globina (controlo interno de idoneidade da amostra) utilizando o DNA extraído das amostras em exame. Uma sonda específica para M. pneumoniae marcada com o fluoróforo FAM é activada quando hibrida com o produto específico da reacção de amplificação para M. pneumoniae. Outra sonda específica para o gene humano da beta-globina marcada com o fluoróforo VIC é activada quando hibrida com o produto da reacção de amplificação para o gene humano da beta-globina. A emissão da fluorescência aumenta com o aumentar dos produtos específicos da reacção de amplificação e é medida e registrada pelo equipamento. A elaboração dos dados permite determinar a presença e a titulação do DNA de M. pneumoniae na amostra de partida. A estandardização do sistema foi realizada em equipamentos Applied Biosystems ABI PRISM da série DESCRIÇÃO DO PRODUTO O kit fornece dois dos três reagentes necessários para a recuperação da mistura de reacção e completar a execução do teste: MYCO. pn. AmpliMIX Mistura de oligonucleotídeos primers AmpliMIX para amplificação real time em solução estabilizada, previamente dividida em quatro tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. MYCO. pn. AmpliPROBE Mistura de sondas fluorescentes AmpliPROBE para amplificação real time em solução estabilizada; previamente dividida em tubos descartáveis. Cada tubo contém 110 µl de solução, suficiente para 24 testes. Os oligonucleotídeos primers e a sonda para M. pneumoniae (marcada com o fluoróforo FAM e bloqueada do grupo MGB-NFQ), são específicos para uma região do gene que codifica a citoadesina P1 de M. pneumoniae. Os oligonucleotídeos primers e a sonda para controlo interno de idoneidade da amostra (marcada com o fluoróforo VIC e bloqueada do grupo MGB-NFQ), são específicos para a região promotora e 5'UTR do gene humano da beta-globina. O kit permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos. MATERIAL INCLUÍDO NO PRODUTO Componente Descrição Quantidade Composição Etiquetagem MYCO. pn. AmpliMIX MYCO. pn. AmpliPROBE mistura de oligonucleotídeos primers Mistura de sondas fluorescentes marcadas com FAM / MGB- NFQ e com VIC / MGB-NFQ 4 x 110 µl 4 x 110 µl Oligonucleotídeos, TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Triton X-100 Oligonucleotídeos fluorescentes, TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Triton X SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 1/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 2/17

4 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO PRODUTO - Câmara de fluxo laminar. - Luvas sem pó descartável em nitrílica ou similares. - Misturador vortex. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água de grau molecular para biologia. - Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência. OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes para a extracção do DNA das amostras a analisar, o controlo positivo de extracção, os reagentes optimizados para a amplificação, el controlo positivo de amplificação não estão incluídos neste produto. Para realizar esta fase analítica aconselha-se a utilização dos seguintes produtos produzidos por ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAcell» (código EXTD02), kit de extracção do DNA das amostras celulares. «CPE - Internal Control» (código CTRCPE), controlo positivo de extracção de DNA plasmídico para extracções do DNA das amostras não celulares; «Q - PCR Alert AmpliMASTER» (código RTS000), mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, aconselha-se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com pocinhos de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. «MYCOPLASMA pn. - Positive Control» (código CTR094), controlo positivo de DNA plasmídico. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este produto é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se podem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se podem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou a rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no produto antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no produto durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do produto. Utilizar somente os reagentes presentes no produto e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de produtos de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados em uma única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. Advertências e precauções específicas para os componentes Os tubos que contenham o AmpliMIX e o AmpliPROBE são descartáveis e portanto devem ser utilizados uma única vez na preparação da mistura de reacção. SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 3/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 4/17

5 AMOSTRAS E CONTROLOS PROCEDIMENTO Amostras Este produto deve ser utilizado com DNA extraído das seguintes amostras biológicas: lavagens bronco-alveolares (BAL), aspirados bronco-traqueais (BA). As amostras de lavagem bronco-alveolar e de aspirado bronco-traqueal destinadas à extracção do DNA devem ser colhidas segundo as indicações do laboratório em Solução fisiológica estéril, transportadas a +2º / +8ºC e conservadas a +2º / +8ºC por um máximo de três dias. Não congelar as amostras de escarro, de lavagem bronco-alveolar e de aspirado bronco-traqueal para evitar a lysine das células e a perda da titulação do DNA bacteriano. As instruções para o pré-tratamento da amostra clínica e para a extracção do DNA estão contidas no manual de instruções para o uso do kit «EXTRAcell». Substâncias interferentes O DNA extraído da amostra de partida não deve conter mucoproteínas ou hemoglobina para evitar fenómenos de inibição e a aparição de frequentes resultados não válidos. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antibióticos, anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores. Controlos de amplificação É absolutamente necessário confirmar cada sessão de amplificação preparando uma reacção de controlo negativo e uma reacção de controlo positivo. Para o controlo negativo utilizar Água de grau molecular para biologia (não incluída no produto) para acrescentar à reacção no lugar do DNA extraído da amostra. Para o controlo positivo utilizar o produto «MYCOPLASMA pn. - Positive Control». Controlos de qualidade É aconselhável confirmar o completo procedimento de análises de cada sessão, extracção e amplificação, utilizando uma amostra negativa e uma amostra positiva já testadas ou do material de referência calibrado. Programação da sessão de amplificação real time (Para realizar na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário: - referindo-se à documentação do equipamento, ligar o equipamento para real time PCR, lançar o software específico e abrir uma sessão "absolute quantification"; - referindo-se à documentação do instrumento, programar o "detector" para M. pneumoniae como segue: "reporter" = "FAM" e "quencher" = "none" (NFQ é um quencher escuro) e chamá-lo MYCO.PN. ; - referindo-se à documentação do instrumento, programar o "detector" para a sonda para controlo interno como segue: "reporter" = "VIC" e "quencher" = "none" (NFQ é um quencher escuro) e chamá-lo CI ; - referindo-se à documentação do instrumento, para cada pocinho da microplaca em uso, programar os parâmetros como segue: "detector" (tipo de fluorescência para detectar), o "passive reference" = "ROX" (normalização da reacção) e o tipo de reacção (amostra desconhecida, controlo negativo, controlo positivo de amplificação). Compilar o plano de trabalho anexado ao final deste manual tomando nota das programações mencionadas, ou imprimir as programações da placa directamente do instrumento para o Real Time. O plano de trabalho deve ser realizado atentamente para pipetar a mistura de reacção PCR e as amostras. Ilustra-se logo abaixo a título de exemplo, como pode ser organizada a análise de 14 amostras. A1 A9 A2 A10 A3 A11 A4 A12 A5 A13 A6 A14 A7 CN A8 CP Significado: A1 - A14: Amostras para analisar; CN: Controlo negativo de amplificação; CP: Controlo positivo de amplificação. Referindo-se à documentação do equipamento, programar no thermal cycler os parâmetros do ciclo térmico com 45 ciclos e um volume de reação de 25 µl. Para equipamento Applied Biosystems da série 7000 escolher a opção "9600 emulation". Ciclo térmico de amplificação Fase Temperaturas Tempos Descontaminação 50 C 2 mín. Desnaturação inicial 95 C 10 mín. 95 C 15 seg. 45 ciclos 60 C 1 mín. SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 5/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 6/17

6 Preparação da amplificação (Para realizar na área de extracção / preparação da reacção de amplificação) Antes de iniciar a sessão é necessário: - retirar e descongelar os tubos com as amostras para analisar. Centrifugar os tubos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar os tubos de AmpliMIX necessários para a sessão lembrando que o conteúdo de cada tubo é suficiente para preparar 24 reacções. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar um número de tubos de AmpliPROBE iguais aos dos tubos de AmpliMIX. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar um número de tubos de AmpliMASTER iguais aos dos tubos de AmpliMIX. Escrever com tinta indelével "MYCO. pn." e a data na etiqueta dos tubos. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - retirar e descongelar o tubo de Positive Control. Centrifugar o tubo por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo e mantê-lo em gelo; - se necessário, cortar a Microplaca de amplificação para separar a parte que será utilizada na sessão prestando atenção em manipulá-la com luvas sem pó e de não causar danos aos pocinhos. 1. Transferir 100 µl de AmpliMIX no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µl na mix. 2. Transferir 100 µl de AmpliPROBE no tubo de AmpliMASTER. Misturar bem pipetando por três vezes o volume de 100 µl na mix. 3. Misturar por 5 segundos com o vortex a baixa velocidade, evitando produzir espuma. 4. Centrifugar os tubos por 5 segundos para obter no fundo o conteúdo. 5. Transferir, depositando-os cuidadosamente no fundo, 20 µl da mistura de reacção assim obtida nos pocinhos da Microplaca de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. Nota: Se não se utiliza toda a mistura de reacção, conservar o volume restante em ambiente escuro a -20ºC por um máximo de um mês no tubo "MYCO. pn.". Congelar e descongelar a mistura de reacção SOMENTE UMA VEZ. 6. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µl de DNA extraído da primeira amostra no correspondente pocinho da Microplaca de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho, proceder igualmente com todos os outros DNA extraídos. 7. Transferir, depositando-os cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µl de Água de grau molecular para biologia (não fornecida no produto) no pocinho da Microplaca de amplificação do controlo negativo de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. 8. Transferir, depositando cuidadosamente na mistura de reacção, 5 µl de Positive Control no correspondente pocinho da Microplaca de amplificação como estabelecido anteriormente no Plano de trabalho. 9. Fechar cuidadosamente a Microplaca de amplificação com a Lâmina adesiva de amplificação. 10. Transferir a Microplaca de amplificação no thermal - cycler para real time na área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação e iniciar o ciclo térmico de amplificação. Análise qualitativa dos resultados Os valores da fluorescência emitidos pela sonda M. pneumoniae (fluorescência FAM MYCO.PN. ) e da sonda para el controlo interno (fluorescência VIC "CI") nas reacções de amplificação devem ser analisadas pelo software do equipamento. Antes de iniciar a análise, referindo-se à documentação do equipamento, é necessário: -programar manualmente o intervalo de cálculo do Nível de fluorescência de fundo (Baseline) do ciclo 6 ao ciclo 15*; *Atenção: No caso de amostra positiva com elevada titulação de M. pneumoniae, a fluorescência FAM poderia começar a aumentar antes do ciclo N 15. Nesse caso a amplitude da "baseline" deve ser regulado no ciclo N 6 ou no ciclo durante o qual observa-se a potencialidade do sinal. - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector FAM MYCO.PN. a 0,2; - programar manualmente o Limiar (Threshold) para o detector VIC "CI" a 0,1. Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas específicas na reacção de amplificação e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para determinar o Ciclo Limiar (Threshold cycle, Ct), o ciclo em que foi alcançado o valor Limiar de fluorescência. O valor da fluorescência de FAM (sonda M. pneumoniae) na reacção de amplificação Positive Control e os valores Ct referentes servem para dar validez a sessão de trabalho como indicado na tabela que segue: Reacção do Positive Control M. pneumoniae (FAM MYCO PN. ) Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct 25 Positivos CORRECTA Se o valor de Ct do Positive Control é Ct 25 o Ct Não determinado (Undetermined), não foi detectada a presença de DNA branco. Se são verificadas dificuldades nas fases de programação da amplificação ou de detecção (volumes incorrectos de mistura reactiva, deterioração da sonda, deterioração do positive control, incorrecta pipetagem do positive control, incorrecta programação do prato, incorrecta programação do ciclo térmico) com consequente imprecisão dos resultados. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. Na reacção de amplificação do Controlo negativo, o valor de Ct para M. pneumoniae é utilizado para convalidar a amplificação e a detecção como descrito na tabela a seguir: Reacção do Controlo negativo M. pneumoniae (FAM MYCO PN. ) Resultado do teste Amplificação / Detecção Ct Não determinado NEGATIVO CORRECTA Se o resultado da reacção de amplificação do Controlo negativo é diferente do Ct Não determinado (Undetermined), foi detectada a presença de DNA branco. Se são verificados problemas na fase de amplificação (contaminação) que podem causar resultados incorrectos e falsos positivos. A sessão não é válida e deve ser repetida a partir da fase de amplificação. SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 7/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 8/17

7 Os valores de fluorescência emitidos pelas sondas nas reacções de amplificação de cada amostra e o valor Limiar de fluorescência são utilizados para detectar a presença de DNA branco e para confirmar a amplificação e a detecção através da determinação do Ciclo limiar (Ct, o ciclo no qual foi confirmado o valor Limiar de fluorescência). Este produto está em grau de detectar uma quantidade mínima cerca de 10 cópias de DNA de M. pneumoniae para reacção de amplificação, correspondentes de aproximadamente 3 genomas Equivalentes para reacção (limite de detecção do produto, veja parágrafo nas Características da performance). Quando o produto é utilizado para a pesquisa de M. pneumoniae, os resultados relativos para cada amostra são utilizados como descrito na tabela seguinte: M. pneumoniae (FAM MYCO.PN. ) Ct Não determinado Reacção da amostra Controlo Interno (VIC CI ) Ct > 35 ou Ct Não determinado Idoneidade da amostra Resultado do teste DNA de M. pneumoniae não idóneo não válido - Ct 35 idóneo válido, negativo NÃO REVELADO Cálculo dos limites de detecção O limite de detecção expressado mediante unidades de referência definida, durante o emprego de um método de extracção definido, é calculável partindo do limite de detecção do produto em questão segundo a seguinte fórmula: Ve x 3 geq Limite de detecção (geq / Extracção) = Va x Ee Ee é a eficiência da extracção, por exemplo com «EXTRAcell» Ee é igual a 1,0 (eficiência igual a 100%). Ve é o volume total do produto de extracção expresso em µl, por exemplo com o produto «EXTRAcell», Ve é igual a 100 µl. Va é o volume do produto de extracção usado na reacção de amplificação: com este produto o parâmetro Va é igual a 5 µl. Quando se utilizam os kit de extracção da ELITechGroup S.p.A. o limite seria: Kit de extracção «EXTRAcell» Fórmula simplificada Limite de detecção = 60 geq / extracção Ct Determinado Ct > 35 ou Ct Não determinado Idóneo* válido, positivo PRESENTE Ct 35 idóneo válido, positivo PRESENTE Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para o DNA de M. pneumoniae e Ct > 35 ou Ct Não determinado para o DNA do controlo interno, não foi possível detectar de modo eficiente o DNA do Controlo Interno. Neste caso se são verificados problemas na fase de amplificação (amplificação não eficiente ou nula) ou na fase de extracção (a perda de DNA, presença de inibidores, DNA da amostra alterado ou amostras de partida com um número de células insuficiente) que podem causar resultados incorrectos e falsos negativos. A amostra não é idónea, o teste não é válido e deve ser repetido a partir da extracção de uma nova amostra. Se o resultado da reacção de amplificação de uma amostra é Ct Não determinado para o DNA de M. pneumoniae e Ct 35 para o DNA do controlo interno, o DNA de M. pneumoniae não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não é possível descartar que o DNA esteja presente a uma titulação inferior ao limite de detecção do produto (veja parágrafo Características da perfomance). Neste caso o resultado será um falso negativo. Os resultados obtidos com este teste devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. *Nota: Quando na reacção de amplificação relativa a uma amostra foi detectada a presença de DNA de M. pneumoniae, a amplificação do controlo interno pode dar como resultado um CT > 35 ou Ct Não determinado. De facto, a reacção de amplificação de baixa eficiência do controlo interno pode ser anulada pela competição com a reacção de amplificação de alta eficiência de M. pneumoniae. Neste caso, a amostra é, de todo modo, adequada e o resultado positivo do teste é válido. SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 9/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 10/17

8 LIMITES DO PROCEDIMENTO CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE Utilizar precisamente com este produto o DNA extraído das seguintes amostras humanas: lavagens bronco-alveolares (BAL), aspirados bronco-traqueais (BA). Não utilizar com este produto o DNA extraído contaminado com mucoproteínas ou hemoglobina: as mucoproteínas e a hemoglobina inibem a reacção de amplificação dos ácidos nucléicos e podem causar resultados não válidos. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte dos medicamentos antibióticos, anti-virais, quimioterápicos ou imunosupressores. Os resultados obtidos com este produto dependem da correcta recolecção, transporte, conservação e preparação das amostras; para evitar resultados incorrectos, é necessário, portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extracção dos ácidos nucléicos. O método de amplificação real time dos ácidos nucléicos utilizados neste produto, por causa da sua elevada sensibilidade analítica, está sujeito a contaminação por parte das amostras clínicas positivas para M. pneumoniae, dos controlos positivos e dos mesmos produtos da reacção de amplificação. As contaminações levam a resultados falsos positivos. A modalidade de realização do produto pode limitar as contaminações; mas estes fenómenos podem ser evitados somente com uma boa prática das técnicas de laboratório e seguindo atentamente as instruções fornecidas neste manual. Este produto requer pessoal instruído para a manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosos para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer roupas de trabalho e áreas de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer pessoal instruído para o procedimento de biologia molecular, como a extracção, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos para evitar resultados incorrectos. Este produto requer uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Este produto requer o uso de roupas de trabalho e instrumentos destinados à extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos. Um resultado negativo obtido com este produto indica que o DNA de M. pneumoniae não foi detectado no DNA extraído da amostra mas não se pode descartar que o DNA de M. pneumoniae esteja presente a uma titulação inferior no limite de detecção do produto (veja parágrafo Características da performance); neste caso o resultado será um falso negativo. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, os resultados obtidos com este produto devem ser interpretados considerando todos os dados clínicos e os outros exames de laboratório relativos ao paciente. Como para qualquer outro dispositivo diagnóstico, existe um risco latente de obter resultados não válidos, falsos positivos e falsos negativos com este produto. Este risco resíduo não pode ser eliminado ou reduzido posteriormente. Este risco resíduo em situações particulares, como os diagnósticos de urgência, pode contribuir a decisões erradas com consequências graves para o paciente. Sensibilidade analítica: limites de detecção A sensibilidade analítica deste teste permite identificar a presença de aproximadamente 10 moléculas de DNA branco nos 5 µl de DNA extraído e acrescentado à reacção de amplificação. A sensibilidade analítica do teste, como limite de detecção, está determinada utilizando um DNA plasmídico contendo o produto de amplificação cuja concentração inicial foi medida espectrofotometricamente. O DNA plasmídico foi diluído a uma titulação de 10 cópias / 5 µl em DNA genómico humano a uma titulação de 500 ng / 5 µl. Esta amostra foi empregada em 50 repetições para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. (veja parágrafo no produtos acessórios). Os resultados finais são resumidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas 10 cópias DNA plasmídico ng de DNA genómico humano Sensibilidade diagnóstica: eficiência de detecção nos diferentes genótipos / sub-tipos A sensibilidade diagnóstica do teste, como eficiência de detecção nos diversos genótipos / subtipos, está avaliada pelo confronto de sequências com banco de dados nucleotídicos. O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos primers AmpliMIX e da sonda fluorescente AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados do gene que codifica a citoadesina P1 de M. pneumoniae demonstrou sua conservação e a ausência de mutações significativas. A sensibilidade diagnóstica do teste, como eficiência de detecção nos diversos genótipos / subtipos, está avaliada realizando-se a análise de amostras positivas para M. pneumoniae. A sensibilidade diagnóstica do teste foi avaliada utilizando como material de referência amostras certificadas positivas para o DNA de M. pneumoniae, cepa FH, ATCC (Vircell SL, Espanha), de M. pneumoniae, NCTC (Minerva Biolabs GmbH, Alemanha) e de M. pneumoniae de uma amostra clínica. Cada amostra foi empregada para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas M. pneumoniae cepa FH M. pneumoniae NCTC M. pneumoniae de amostra positiva Especificidade analítica: marcadores potencialmente interferentes A especificidade analítica do teste, como ausência de cross reactividade com outros marcadores potencialmente interferentes, foi avaliada para confronto de sequência com bancos de dados nucleotídicos. O exame do alinhamento das regiões seleccionadas para a hibridação dos oligonucleotídeos primers do AmpliMIX e das sondas fluorescentes AmpliPROBE com as sequências disponibilizadas no banco de dados dos diversos organismos da M. pneumoniae, entre aqueles dos genomas completos de Chlamydophila pneumoniae e Legionella pneumophila, demostrou a sua especificidade e a ausência de homologias significativas. SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 11/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 12/17

9 A especificidade analítica do teste, como ausência de cross reactividade com outros marcadores potencialmente interferentes, foi verificada realizando-se a análise de amostras positivas para o DNA de Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila e Mycoplasma hominis. A especificidade analítica do teste foi avaliada utilizando como material de referência amostras certificadas positivas com alta titulação para o DNA de Chlamydophila pneumoniae, cepa CM-1, ATCC VR (Vircell SL, Espanha) e para o DNA de Legionella pneumophila, sorogrupo 1, ATCC (Minerva Biolabs GmbH, Alemanha). Estes microorganismos causam infecções respiratórias e encontram-se frequentemente nas mesmas amostras clínicas. Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Chlamydophila pneumoniae Legionella pneumophila A especificidade analítica do teste foi avaliada utilizando como material de referência amostras clínicas certificadas positivas para o DNA de Mycoplasma hominis. Cada amostra foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Amostras positivas para o DNA de M. hominis Especificidade diagnóstica: amostras negativas A especificidade diagnóstica do teste, como confirmação das amostras clínicas negativas, foi verificada interpretando a análise de um painel de amostras celulares negativos para o DNA de M. pneumoniae e resultou igual a 96,1%. A especificidade diagnóstica foi avaliada utilizando como material de referência um painel de amostras clínicas de BAL e BA negativas para o DNA de M. pneumoniae testados com um método de amplificação nested. Cada amostra do painel foi empregada para realizar o completo procedimento de análise, extracção e amplificação, com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Amostras negativas para o DNA de M. pneumoniae Resistência: efeito da matriz do Positive Control A resistência do teste, como efeito da matriz que leva a resultados falsos negativos, foi verificada realizando a análise de um painel de extractos de amostras clínicas consideradas positivas para o DNA de M. pneumoniae com uma titulação próxima ao limite de detecção. O efeito da matriz da amostra foi avaliado utilizando como material de referência amostras de DNA extraídas de BAL e BA negativos para o DNA de M. pneumoniae (testadas com um método de amplificação nested) e positivizadas com o DNA plasmídico diluído a uma titulação de 30 cópias / 5 µl (3 vezes o limite de detecção). Estas amostras foram empregadas para realizar a amplificação com os produtos ELITechGroup S.p.A. Os resultados são referidos na tabela seguinte. Amostras N positivas negativas Extractos positivizados para o DNA de M. pneumoniae Nota: Os dados e os resultados completos das provas realizadas para a avaliação das características da perfomance do produto estão registrados na Sessão 7 do Fascículo Técnico do Produto "", FTP RTS094. BIBLIOGRAFIA B. de Barbeyrac et al. (1993) Clin Inf Dis 17: S83 - S89 Duas amostras geraram um resultado positivo discordante com os produtos ELITechGroup S.p.A. Estas amostras foram testadas novamente e geraram um resultado negativo. As amostras foram avaliadas a nível quantitativo e demonstraram uma titulação inferior a 10 geq / reacção que está abaixo do limite de detecção do produto e do sistema da amplificação nested utilizado para testar as amostras. Assim, com titulação baixas as amostras podem produzir resultados positivos em modo eventual. Três amostras geraram um resultado não válido. SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 13/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 14/17

10 PROBLEMAS E SOLUÇÕES SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS DNA branco não detectado na reacção de Positive Control Possíveis causas Erro na preparação da mistura de reacção. Erro na deslocamento na microplaca. Soluções Controlar os volumes de reagentes dispensados durante a preparação da mistura de reacção. Dispensar com atenção as reacções na microplaca seguindo o plano de trabalho. Controlar os volumes de mistura de reacção dispensados. Controlar o volume de controlo positivo dispensado. Número do catálogo. Limite superior de temperatura. Código do lote. Degradação da sonda. Degradação do controlo positivo Utilizar uma nova alíquota de sonda. Utilizar uma nova divisão do controlo positivo. Para utilizar antes do (último dia do mês). Erro na programação do equipamento. DNA branco detectado na reacção de Controlo negativo Controlar a posição das reacções do controlo positivo programado no equipamento. Controlar o ciclo térmico programado no equipamento. Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Possíveis causas Erro na deslocamento na microplaca. Erro durante a programação do equipamento. Microplaca mal fechada. Contaminação da Água de grau molecular para biologia. Contaminação da mix de amplificação. Soluções Evitar derramar o conteúdo dos tubos das amostras. Trocar sempre as pontas entre uma amostra e outra. Dispensar com atenção as amostras, controlo negativo e positivo na microplaca seguindo o plano de trabalho. Controlar a posição de amostras, controlo negativo e controlo positivo programada no equipamento Fechar cuidadosamente a microplaca. Utilizar uma nova divisão de água. Utilizar uma nova alíquota de mix de amplificação. Conteúdo suficiente para "N" teste. Atenção, consultar as instruções de uso. Fabricante. Contaminação da área para a extracção / preparação das reacções de amplificação. Presença de fluorescência de fundo elevada nas reacções Limpar as superfícies e equipamentos com detergentes aquoso, lavar as batas, substituir tubos e pontas em uso. Possíveis causas Erro na programação da "baseline". Soluções Programar o intervalo de cálculo da "baseline" em um âmbito de ciclos em que a fluorescência de fundo já esteja estabilizada (controlar os registros "component") e a fluorescência do sinal ainda não tenha começado a crescer, por exemplo do ciclo 9 ao ciclo 15. A aquisição deste produto dá direito ao adquirente de utilizá-lo para a amplificação e a detecção de sequências de ácidos nucléicos com a finalidade de fornecer serviço de diagnóstico humano in vitro. Este direito é conferido somente se o produto fornecido é utilizado junto aos produtos licenciados para "Positive Control" da ELITechGroup S.p.A. Nenhum direito geral ou outra licença de tipo diferente deste específico direito de uso é conferido por meio do aquisição. SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 15/17 SCH mrts094m_pt 02/02/16 Revisão 04 Pág. 16/17

11 PLANO DE TRABALHO A B C D E F G H SCH m_pt 02/02/16 Revisão 04 Page 17/17

12 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 DESCRIÇÃO DO PRODUTO pág. 1 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT pág. 2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 2 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 3 PROCEDIMENTO pág. 4 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 4 USO PREVISTO O produto «Q - PCR Alert AmpliMASTER» é parte de um teste quantitativo de amplificação dos ácidos nucléicos para a pesquisa e a dosagem do DNA branco com o método de amplificação real time em amostras de DNA extraído ou de cdna obtido por RNA extraído. O produto é um acessório dos produtos da série «Q - PCR Alert AmpliMIX», «Q - PCR Standard» e «Positive Control» da ELITechGroup S.p.A. O produto é empregado na preparação de provas diagnósticas baseadas no método da amplificação real time. DESCRIÇÃO DO PRODUTO ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Sítio WEB: +2 C +8 C O produto no formato completo (código RTS000) fornece a mistura de reagentes optimizados para a amplificação real time AmpliMASTER, em uma solução estabilizada previamente dividida em quatro tubos e prontos para o uso. A mistura de reagentes fornece o sistema tampão, o cloreto de magnésio, os nucleotídeos trifosfatos, o fluoróforo ROX de referência passivo para a normalização da fluorescência, a enzima Uracil-N-glucosidase (UNG) para a inactivação das contaminações do produto de amplificação, a enzima Taq DNA polimerase e activação térmica (hot start). Nota: as Microplacas para amplificação não devem ser utilizadas com os equipamentos Applied Biosystems da série 7000 que aumentam o bloco térmico "FAST". O produto no formato completo (código RTS000) permite efectuar 96 determinações, standard e controlos incluídos. Produto formato completo código RTS000 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT Componente Descrição Quantidade Composição Etiquetagem AmpliMASTER mistura de reagentes optimizados 4 x 340 µl TRIS base, TRIS cloridrato, Glicerol, Cloreto de magnésio, Desoxiribonucleotídeos trifosfatos, ROX, Uracil-Nglicosidase, Tag DNA polimerase MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT - Câmara de fluxo laminar. - Luvas descartáveis em nitrilo ou similares. - Misturador vortex. - Microcentrífuga de bancada ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água de grau molecular para biologia. - Termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal - cycler para real time). OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes de primers (oligonucleotídeos), os reagentes de detecção (sondas fluorescentes), os DNAs standard a quantidade reconhecida, os controlos heterozigotos de DNA plasmídico, as microplacas para amplificação, os lâminas adesiva para amplificação não são incluídos neste kit. Para realizar esta fase analítica é necessário se a utilização dos seguintes produtos acessórios produzidos por ELITechGroup S.p.A.: série «Q - PCR Alert AmpliMIX», oligonucleotídeos primers para a amplificação real time e sondas fluorescentes para a amplificação real time. série «Q - PCR Standard», DNA plasmídico a quantidade reconhecida para obter a curva standard. série «Positive Control», controlo heterozigoto de DA plasmídico. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7300 Real-Time PCR System, é necessário se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC01) microplacas com pocinhos de 0,2 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. Caso seja previsto o uso de um instrumento 7500 Fast Dx Real-Time PCR Instrument, é necessário se a utilização do produto genérico «Q - PCR Microplates Fast» (ELITechGroup S.p.A., código RTSACC02) microplacas com pocinhos de 0,1 ml e lâminas adesivas para a amplificação em tempo real. - SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 1/4 SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 2/4

13 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 Q - PCR Alert AmpliMASTER reagentes optimizados para a amplificação real time RTS000 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES PROCEDIMENTO Este kit é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121ºC durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se fossem potencialmente infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou / rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análises. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados em uma única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. O kit «Q - PCR Alert AmpliMASTER» deve ser utilizado com os kits da série «Q - PCR Alert AmpliMIX» para obter a mistura de reacções. A AmpliMASTER está pronta para o uso, portanto deve ser utilizada directamente na preparação da mistura de reacção. O procedimento completo, que prevê a preparação e a execução de uma reacção de amplificação real time em microplaca com um termóstato programável com sistema óptico de detecção da fluorescência (thermal cycler para real time), está descrito detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado ao kit «Q - PCR Alert AmpliMIX». As características da performance e os limites do procedimento do teste completo de pesquisa e dosagem do DNA branco estão descritas detalhadamente no manual de instruções para o uso anexado aos kits da série «Q - PCR Alert AmpliMIX». Número do catálogo. Limites de temperatura. Código do lote. SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS Para utilizar antes do (último dia do mês). Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Européia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Conteúdo suficiente para "N" teste. Atenção, consultar as instruções de uso. Fabricante. A aquisição deste produto dá direito ao adquirente utilizá-lo para a amplificação de sequências de ácidos nucléicos com a finalidade de fornecer serviço de diagnóstico humano in vitro. Este direito é conferido somente se o produto fornecido é utilizado junto a produtos licenciados "Positive Control" ou "Q - PCR Standard" da ELITechGroup S.p.A. Nenhum direito geral ou outra licença de tipo diferente deste específico direito de uso é conferido por meio do adquirente. SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 3/4 SCH mrts000_pt 03/03/16 Revisão 06 Pág. 4/4