O produto consiste de uma reação enzimática pela transcriptase reversa com

Transcrição

1 BRK BRK RT kit para síntese de cdna Instruções de Uso USO PRETENDIDO O produto «RT kit plus» consiste em reagentes de transcrição reversa para a síntese de cdna de RNA extraído de amostras celulares e não celulares. O produto é utilizado na síntese de cdna para detecção e quantificação de RNA vírus humanos e para a detecção e quantificação de RNA mensageiro humano. O cdna sintetizado com este produto pode ser usado para testes diagnósticos baseados em reações de amplificação de ácidos nucleicos com enzimas DNA polimerases (como as DNA polimerases termoestáveis). METODOLOGIA O produto consiste de uma reação enzimática pela transcriptase reversa com um termociclador programável. A reação usa primers randômicos e o RNA dependente de uma DNA polimerase dependente de RNA do Moloney murine leukaemia virus (MMLV). A reação gera cdna de todas as diferentes moléculas de RNA presentes nas amostras de RNA extraído. O inibidor RNAse STOP impede a degradação do RNA extraído no caso de contaminação por RNases. DESCRIÇÃO DO KIT O kit fornece os seguintes reagentes: RT-MIX, mistura de reação para transcrição reversa, em 50 tubos monorreagente prontos para uso. Cada tubo contém 10 µl da mistura. MMLV-RT, enzima transcriptase reversa, em um tubo com 70 µl. RNase STOP, inibidor de RNases, em um tubo com 35 µl. Água Ultrapura, água para biologia molecular, aliquotada em 2 tubos com 1900 µl cada. O kit possibilita a execução de 50 reações de transcrição reversa, incluindo controles positivo e negativo. 1

2 MATERIAIS FORNECIDOS Componente Descrição Quantidade Composição RT-MIX MMLV-RT 200U/ µl 14000U RNase STOP 40U/ µl 1400U Água Ultrapura Mistura para transcrição reversa em tubos de 0,2 ou 0,5mL Enzima transcriptase reversa em tubo com tampa azul Inibidor de RNase em tubo com tampa amarela Água para Biologia Molecular Armazenar a -20 C ou inferior. 50 x 10 µl 1 x 70 µl 1 x 35 µl Oligonucleotídeos hexâmeros, TRIS base, TRIS cloridrato, Cloreto de Potássio, Cloreto de Magnésio, Trifosfatos deoxyribonucleotídeos, Dithiothreitol, Triton X- 100, Albumina de soro bovino acetilado MMLV-RTenzyme,TRIS base, TRIS cloridrato, Cloreto de Sódio, Dithiothreitol, Glicerina, EDTA de Sódio, NP-40 Inibidor RNase STOP, TRIS base, TRIS Cloridrato, Cloreto de Potássio, Dithiothreitol, EDTA de Sódio, Glycerina 2 x 1900 µl _ MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS - Fluxo laminar. - Luvas descartáveis sem talco. - Agitador vórtex. - Microcentrífuga de bancada ( RPM). - Micropipetas estéreis e ponteiras com filtro ou deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Água bidestilada estéril. - Real Time ABI PRISM 7000, completo com computador. ACESSÓRIOS Os reagentes para a extração de RNA das amostras a serem analisadas, para o controle positivo de extração, para amplificação do cdna e para a detecção do DNA amplificado não estão inclusos neste kit. Para realizar estes passos analíticos, os produtos a seguir são recomendados: «EXTRAgen» (EXTG01), kit para extração de ácidos nucleicos de amostras não celulares; total de 50 extrações. 2

3 «EXTRAzol» (EXTR01), kit para extração de RNA de amostras celulares; total de 50 extrações. «CPE-RNA Controle Interno» (CTRRNA/2), controle positivo de extração para RNA genômico de amostras não celulares, total de 50 extrações. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este produto é exclusivamente para uso in vitro. Advertências e precauções gerais Manusear e descartar todas as amostras biológicas como potencialmente infecciosas. Evitar o contato direto com amostras biológicas. Evitar respingos. Os materiais que entram em contato com amostras biológicas devem ser tratados com hipoclorito de sódio 3% por, no mínimo, 30 minutos, ou autoclavados a 121 C por uma hora antes de serem descartados. Manusear e descartar todos os reagentes e materiais como potencialmente infecciosos. Evitar contato direto com reagentes. Evitar respingos. Os resíduos devem ser tratados e descartados de acordo com normas de segurança. Resíduos líquidos contendo ácidos ou bases devem ser neutralizados antes do descarte. Usar jaleco, luvas e óculos de proteção. Nunca pipetar soluções com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos dentro da área de trabalho. Lavar as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes. Descartar as sobras de reagentes e resíduos de acordo com as normas de segurança. Ler as instruções de uso antes de utilizar o produto. Seguir as instruções. Não usar produtos após o prazo de validade estabelecido. Somente usar os reagentes fornecidos no kit e aqueles recomendados pelo fabricante. Não misturar reagentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes de outros fabricantes. Advertências e precauções de biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extração, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal especializado para prevenir o risco de resultados incorretos, em particular devido à degradação dos ácidos nucleicos das amostras ou devido à contaminação das amostras por produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extração/preparação das reações de amplificação e para a amplificação/detecção dos produtos de amplificação (áreas de pré e pós-pcr). Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extração/preparação das reações de amplificação. É necessário uso de EPI adequado a cada uma das áreas de trabalho em laboratório de biologia molecular. Nunca transferir materiais da área de amplificação/detecção para a área de extração/preparação de reações. As amostras devem ser empregadas exclusivamente a este tipo de análise. As 3

4 amostras devem ser manipuladas em uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contêm amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados em câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a ser utilizados em uma única vez. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente a este propósito. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo, ou usar ponteiras com barreira / filtro. As ponteiras utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para sua área de trabalho. Advertências e precauções para componentes específicos O produto RT-MIX, deve ser descongelado e usado apenas uma vez. RT-MIX, apresenta a seguinte advertência (S): S Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos. MMLV-RT, apresenta a seguinte advertência (S): S Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos. RNase STOP, apresenta a seguinte advertência (S): S Não inalar vapores. Evitar contato com os olhos. AMOSTRAS E CONTROLES Amostras O produto deve ser utilizado com RNA extraído de amostras biológicas celulares e não celulares. O volume de RNA extraído a ser adicionado na reação de transcrição reversa deve ser de 10 µl. Quando usar volumes menores de amostra, ajustar o volume da amostra para 10 µl com água ultrapura. A quantidade de RNA extraído a ser adicionada na reação de transcrição reversa não deve exceder 1ug a fim de prevenir o aparecimento de produtos não específicos e possível efeito de inibição na próxima reação de amplificação de ácidos nucleicos. Recomenda-se a criação de vários frascos das amostras a serem armazenadas congeladas, a fim de evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Quando usar amostras congeladas, descongela-las somente antes da extração, a fim de prevenir uma possível degradação de ácidos nucleicos. 4

5 Substâncias interferentes O RNA extraído de amostras não deve conter heparina, hemoglobina, dextrana ou Ficoll, a fim de evitar problemas de inibição e a possibilidade de resultados inválidos. Não existem dados disponíveis a respeito da inibição causada por drogas antivirais, antibióticos, quimioterápicos e imunossupressores. Controles de transcrição reversa É absolutamente necessário validar cada sessão de transcrição reversa com controles de reação positivos e negativos. Para o controle negativo utilizar água bidestilada estéril (não incluída no kit) para acrescentar à reação no lugar do RNA extraído da amostra ou o controle negativo de extração. Para o controle positivo utilizar um RNA extraído de uma amostra positiva já testada. PROCEDIMENTO Procedimento da seção de Transcriptase reversa. (Deve ser realizada na área amplificação / detecção de produtos de amplificação). Antes de iniciar a seção, considerando-se o instrumento, é necessário possuir: - Certificar-se de que o termociclador é compatível com o formato <<monotest>> e de que é adequado para microtubos de 0,2 e 0,5 ml: - Realizar a montagem dos parâmetros da ciclagem da transcriptase reversa no termociclador como mostrado na tabela abaixo: Ciclos da transcriptase reversa Etapas Temperatura Tempo Anelamento do primer 25 C 10 minutos Transcrição reversa 37 C 45 minutos Passo de desnaturação 95 C 5 minutos Procedimento de transcriptase reversa (deve ser preparada na área de extração / e preparação de reação de amplificação). Antes de iniciar a sessão, é necessário: - descongelar as amostras contendo o alvo a ser analisado. Agitar gentilmente, dar spin por 5 segundos e manter em gelo. - descongelar os microtubos da RT MIX <<monotest>> em número suficiente para as amostras da sessão. Agiotar gentilmente e dar SPIN por 5 segundos, marcar cada microtubo usando uma caneta permanente e manter em gelo. - Pegar o microtubo contendo a enzima Transcriptase reversa MMLV RT 200u / µl (tampa azul) e o tubo contendo RNAse stop 40 u / µl (tampa amarela). Dar SPIN nos tubos por 5 segundos e manter em gelo. 5

6 OBSERVAÇÃO: A enzima Transcriptase Reversa MMLV RT e a RNAse STOP são extremamente sensíveis à temperatura. Para prevenir a reatividade destes reagentes, é recomendado mantê-los fora do freezer pelo tempo necessário para realizar a montagem da reação. - diluir a enzima Transcriptase reversa (40u / µl) e a enzima RNAse STOP (4u / µl) com água ultrapura, conforme descrito na tabela abaixo. Preparar quantidade suficiente da reação para todas as amostras incluindo controles (1 amostra a mais). As enzimas diluídas não podem ser estocadas. OBSERVAÇÃO: As enzimas Transcriptase reversa e RNAse stop diluídas são muito sensíveis à temperatura. Para prevenir a redução da atividade enzimática, recomenda-se mantê-las fora do gelo apenas pelo tempo necessário para a dispensação nos microtubos. Número de reações MMLV RT (tampa azul) RNAse STOP (tampa amarela) Água ultrapura Volume total 4 4 µl 2,0 µl 14,0 µl 20 µl 5 5 µl 2,5 µl 17,5 µl 25 µl 6 6 µl 3 µl 21 µl 30 µl 7 7 µl 3,5 µl 24,5 µl 35 µl 8 8 µl 4 µl 28 µl 40 µl 9 9 µl 4,5 µl 31,5 µl 45 µl µl 5 µl 35 µl 50 µl µl 5,5 µl 38,5 µl 55 µl µl 6 µl 42 µl 60 µl µl 6,5 µl 45,5 µl 65 µl µl 7 µl 49 µl 70 µl µl 7,5 µl 52,5 µl 75 µl µl 8 µl 56 µl 80 µl µl 8,5 µl 59,5 µl 85 µl µl 9 µl 63 µl 90 µl µl 9,5 µl 66,5 µl 95 µl µl 10 µl 70 µl 100 µl 21 2 µl 10,5 µl 73,5 µl 105 µl 1. Para cada teste <<monotest>> adicionar 5 µl das enzimas MMLV e RNAse STOP diluídas (total de 200U de Transcriptase reversa MMLV e 20U RNAse STOP) pipetando com precisão dentro da mistura. 2. Para cada teste <<monotest>> adicionar 10 µl de RNA pipetando com cuidado o volume de 10 µl 3 vezes dentro da mistura. Proceder da mesma forma com os controles negativo e positivo. 3. Transferir os microtubos testes <<monotest>> para o termociclador e iniciar a ciclagem da Transcriptase reversa. 6

7 Produtos que podem ser usados depois da Transcriptase Reversa << Amplificação por NESTED>> <<Amplificação REAL TIME>> <<Amplificação DUPLEX REAL TIME>> <<MONOREAGENT DUPLEX REAL TIME Como usar os produtos da reação Usar diretamente o produto de reação Dilui r o produto da reação em 40 µl de água ultrapura, para termos 65 µl de volume final OBSERVAÇÃO: Os produtos da reação podem ser estocados a -20 C por no máximo 1 mês. OBSERVAÇÃO: Os produtos da reação podem contaminar subsequentes testes de diagnóstico. Fechar ou descartar adequadamente as reações residuais e descartar o lixo subsequente. Usar este produto somente com RNA extraído de amostras biológicas celulares e não celulares. Não usar RNA extraído de amostras heparinizadas com este produto: heparina inibe a amplificação de ácidos nucleicos e pode causar resultados inválidos. Não usar RNA extraído que esteja contaminado com hemoglobina, dextrana ou Ficoll, com este produto: estas substâncias inibem a amplificação de ácidos nucleicos e podem causar resultados inválidos. Não existem dados avaliando a inibição causada por antivirais, antibióticos, quimioterápicos e drogas imunossupressoras. Os resultados obtidos dependem de adequados processos de coleta, estocagem e transporte, além do processamento correto das amostras. Para impedir resultados incorretos, é necessário tomar cuidado durante estes passos e seguir as instruções de uso dos produtos de extração de ácidos nucleicos. Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado no manuseio de amostras biológicas potencialmente infecciosas e de preparações químicas classificadas com perigosas, para prevenir acidentes sérios com consequências para o usuário e outras pessoas. Este produto requer o uso roupas de trabalho e áreas específicas para processar amostras biológicas potencialmente infectadas e preparações químicas classificadas como perigosas evitando-se acidentes com sérias consequências para o usuário e outras pessoas. Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado em técnicas de Biologia molecular, assim como extração, transcrição reversa, amplificação e detecção de ácidos nucleicos, para evitar resultados incorretos nos passos subsequentes evitando serias consequências para o paciente. É necessário possuir áreas separadas para extração / preparação das reações de amplificação e para amplificação / detecção dos produtos da amplificação para evitar resultados falso positivos nos passos de análise dos ácidos nucleicos evitando sérias consequências para o paciente. 7

8 Este produto requer o uso de roupas especiais e instrumentos para extração/preparação das reações de amplificação e para amplificação/ detecção de produtos de amplificação para impedir a liberação de resultados falsos positivos durante a análise, impossibilitando consequências sérias para o paciente. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO Eficiência da transcriptase reversa: teste com RNA do fago MS2 A eficiência da reação da transcriptase reversa permite de obter uma razão de quantidade de cdna igual a 50% do RNA extraído adicionada a reação. A eficiência da reação de Transcriptase reversa foi testada usando-se como referência RNA genômico do fago MS2, a concentração inicial foi mensurada usandose um espectrofotômetro. O RNA do fago foi diluído com títulos de 100 a 10 copias a cada 10 µl em RNA de leveduras á um título de 1 µg a cada 10 µl. cada diluição foi testada 10 vezes para se testar a Transcriptase reversa, adicionando-se 5 µl de cdna à reação de PCR Real time usando-se produtos acessórios da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. Os resultados concordam com suposição da razão da eficiência da Transcriptase reversa sendo igual a 50%. O resultado final esta resumido na tabela a seguir: Cópias do RNA do fago MS2 adicionados à reação de transcriptase reversa Cópias de cdna do fago MS2 na reação de PCR real time Esperado (50% de eficiência) Resultados Positivo / cópias / /10 As amostras de cdna sintetizadas de 10 cópias de RNA do fago MS2 na reação de Transcriptase reversa apresentaram um título menor que o limite de detecção da reação de PCR real time. Neste caso resultados randômicos podem ser apresentados. A eficiência da reação de transcriptase reversa foi testada usando-se como material genômico o RNA do fago MS2, com titulação inicial mensurada em espectrofotômetro. A quantidade de cópias do RNA do fago MS2 foi adicionado em 6 amostras de 300 µl de plasma coletados em EDTA. Cada amostra foi usada para contaminar a extração. Tanto para a transcriptase reversa, quanto para a amplificação em tempo real, foram usados produtos e acessórios da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. O teste foi repetido com 3 diferentes lotes de Transcriptase reversa. Os resultados concordam com suposição da razão da eficiência de reação da Transcriptase reversa sendo igual a 50%. Os resultados finais estão resumidos na tabela seguinte: Cópias do RNA do fago Cópias do cdna do fago MS2 esperados na MS2 na reação real time reação de Transcriptase (50% de eficiência reversa esperada) Razão da quantidade de cdna do fago MS2 mensurado na amplificação real time

9 Eficiência da transcriptase reversa: teste com RNA total positivo para Cromossomo Philadelphia p210 A Eficiência da transcriptase reversa foi testada usando como referência um RNA total proveniente da translocação t(9:22) p210 positivo (célula K562) diluído 1: em RNA normal. A amostra foi usada 6 vezes para alcançar uma análise total. Tanto para a transcriptase reversa quanto para a e a amplificação real time foram usados produtos e acessórios da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. O resultado final esta resumido na tabela abaixo: Amostra 1: (RNA) p210 positivo Positivo / cópias Razão da amplificação de p210 Razão da amplificação de ABL % de p210 / ABL 6/ ,027% Todas as duplicações foram detectadas corretamente. O resultado quantitativo esta expresso como uma quantificação absoluta do cdna de p210 e cdna do gene ABL, mas também em porcentagem. Estes resultados mostram uma alta eficiência dos produtos da transcriptase reversa. Eficiência da transcriptase reversa: teste com material de referência certificado A reação de Transcriptase reversa foi testada usando-se um material de referência certificado com diluições de um painel de Enterovírus (Coxackievírus A9) com 3 diferentes títulos (Qnostics EV Mini panel, Qnostics Ltd, Scotland, UK). Cada amostra do painel foi reconstituída para se obter um titulo de 1,5 vezes menor que o esperado para se determinar o limite de detecção do produto. Cada amostra foi usada em 3 cópias para se alcançar uma análise total. A extração e amplificação Real Time foram realizadas com produtos e acessórios da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. Os resultados são reportados na tabela a seguir: Razão de Amostra Título viral ct esperado Positivas/ cópias ct s ENT06D Alta /3 30 ENT06C Média /3 33 ENT06B Baixa /3 39 Todas as amostras foram detectadas corretamente. Os resultados quantitativos estão expressos em Cycle Threshold (ct) e estão dentro de uma razão definida pela Qnostics, sem a padronização de 1,5 vezes da diluição das amostras. Os resultados mostram uma alta eficiência dos produtos da Transcriptase reversa. OBSERVAÇÃO: Os dados e resultados completos desta avaliação de desempenho da Transcriptase reversa estão reportados na seção 7 dos arquivos técnicos do produto RT - kit plus, FTB BRK

10 SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Falso Positivo Causas Possíveis Erro na dispensação do RNA extraído. Contaminação dos reagentes preparados para a sessão. Contaminação da H2O ultrapura usada nas diluições. Contaminação da enzima estoque. Contaminação da área de extração / preparação de reações. Falso Negativo Causas Possíveis Enzimas muito diluídas ou erros de dispensação Redução da reatividade da enzima Erro de dispensação do RNA extraído. Degradação dos ácidos nucleicos extraídos Superdiluição do extraído Erro na ciclagem do termociclador Erro na dispensação das enzimas da reação de Transcriptase reversa Soluções Abrir um tubo de cada vez, evitar o derramamento dos conteúdos dos tubos, sempre trocar as ponteiras. Tomar muito cuidado quando diluir e pipetar as enzimas, sempre trocar as ponteiras. Usar uma nova alíquota da H2O ultrapura. Usar uma nova alíquota de enzimas. Limpar as superfícies e instrumentos usando detergentes aquosos, lavando as coberturas e trocando as ponteiras e tubos usados. Soluções Checar os cálculos de diluições. Tome muito cuidado quando dispensar as enzimas na Mix. Manter os tubos contendo as enzimas em gelo. Usar uma nova alíquota de enzimas. Tomar muito cuidado quando adicionar o RNA extraído. Usar plásticos livres de DNAse e RNAse. Mudar a alíquota usada e de Etanol absoluto, reagentes de lavagem e H2O ultrapura. Extrair uma nova alíquota da amostra e diluir o depósito de ácidos nucleicos em H 2 O ultrapura Checar a ciclagem do termociclador Com cuidado, remover e dispense a reação de transcriptase reversa no tubo de reação. Produtos não específicos na reação de amplificação de cdna Causas Possíveis Excesso de RNA extraído na reação Excesso de cdna ou reagentes da Transcriptase reversa Soluções Calcular a concentração do RNA extraído. Não exceder a concentração de 1pg de RNA na Transcriptase reversa Não exceder a quantidade de produtos na reação de transcriptase reversa, transferido para o tubo de reação 10

11 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GARSON J. A. et al. (1990) Lancet 336: IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: / INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. C.so Torino, 89/d Buttigliera Alta (TO) - Itália REGISTRO ANVISA Isento RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: Aprovação: 20/12/2013 X Maurício Cichon Laboratório Assinado por: Maurício Cichon 11