3. PRINCÍPIO DO TESTE
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- Manuel Mendes
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1 1. USO PRETENDIDO Instruções de Uso XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN Determinação da mutação G1691A do Fator V de Leiden O Kit XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN é um teste qualitativo in vitro que permite a discriminação dos alelos, por PCR em Tempo Real, da mutação de Leiden (G1691A) associada à trombofilia hereditária. O procedimento de amplificação do alelo selvagem e alelo mutante do Fator V de Leiden permite diferenciar os três genótipos possíveis: homozigoto selvagem, homozigoto mutante ou heterozigoto. O kit foi otimizado para uso no aparelho de PCR em Tempo Real ABI 7300 e ABI 7500 (Software Sequence Detection System Applied Biosystems ). PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO. 2. INTRODUÇÃO Leiden localizada no Gene Fator V, interagem resultando na expressão desta doença. 3. PRINCÍPIO DO TESTE A reação de PCR em Tempo Real explora a atividade exonuclease 5' da DNA Taq polimerase para clivar uma sonda TaqMan durante a amplificação. A sonda TaqMan é composta por um corante reporter na extremidade 5' e um corante quencher (silenciador) na extremidade 3'. Quando a sonda está intacta, a proximidade do corante reporter com o corante quencher resulta em supressão da fluorescência reporter, principalmente por transferência de energia tipo Förster. Durante a reação, se o alvo de interesse estiver presente, a sonda se liga especificamente entre os primers forward e reverse, e a clivagem da sonda resulta na emissão de fluorescência do reporter, e o acúmulo de produtos de PCR é detectado diretamente pelo aumento da fluorescência deste corante. A utilização do Kit XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN permite a identificação dos alelos selvagem e mutante, e a triagem de pacientes portadores da mutação e estudos epidemiológicos em populações de risco. O Fator V é um cofator essencial para a ativação da Protrombina (Fator II) em Trombina. Esta reação é inibida pelo pró-coagulante Proteína C, dividindo-o em 3 partes e impedindo o efeito de trombofilia. A mutação G1691A (rs6025), observada em 20% a 40% dos pacientes com trombose, provoca a substituição da base nitrogenada guanina (G) pela adenina (A) no nucleotídeo 1691, resultando na troca de arginina pela glutamina na posição 506 da proteína (aminoácido R506Q), tornando o Fator V resistente à degradação da Proteína C. Os portadores heterozigotos que apresentam essa mutação têm risco de desenvolver trombose de 50 a 100 vezes, quando comparados com não portadores do Fator V de Leiden. Os fatores de risco do ambiente (cigarro, álcool, estresse, dieta, etc.) e as mutações genéticas, como esta mutação de
2 4. COMPONENTES O formato padrão do kit contém reagentes para 96 testes. COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE MM FV XGEN PS FV XGEN CP FV Sel XGEN CP FV Mut XGEN mmix de Amplificação dntps, Tris-HCl, MgCl2, Taq polimerase, água livre de nuclease. Primers e Sondas Fator V Primer 1, primer 2, primer reverso, sondas, água livre de nuclease. Controle Positivo Homozigoto Selvagem DNA clonado correspondente ao FV selvagem. Controle Positivo Homozigoto Mutante DNA clonado correspondente ao FV mutante. 3 x 440 µl 3 x 260 µl 3 x 70 µl 3 x 70 µl CN 2 XGEN Controle negativo 1 x 60 µl 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O Kit deve ser armazenado e transportado a -20 C. O produto estocado corretamente é estável até a data de validade impressa no rótulo. O Kit quando em uso, apresenta uma estabilidade de até 6 horas a temperatura ambiente e em condições de luz normal. Minimizar a exposição à luz dos componentes do kit. Os componentes armazenados sob outras condições que não as especificadas no rótulo podem não proporcionar um desempenho correto, afetando negativamente os resultados dos testes. 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Luvas descartáveis sem talco; Microcentrífuga ( rpm); Micropipetas calibradas (0,5 μl < volume < 200 μl); Cabine de fluxo laminar; Agitador tipo vortex ou similar; Microtubos; Ponteiras estéreis com filtro; Termociclador* para PCR em Tempo Real. *ATENÇÃO: Uma calibração válida dos filtros (Pure Spectra Component File) e do background (Background Component File) deve ser feita rotineiramente. 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser treinado no uso dos termocicladores em Tempo Real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em Tempo Real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfurocortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor.
3 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit a -20 C em freezer ou câmara fria com temperatura controlada. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada amostra. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança II, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os componentes no gelo ou em reservatório refrigerado. 16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 19. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 20. Outros resíduos gerados devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES O Kit XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN pode ser utilizado com DNA extraído de sangue total coletado em EDTA. As amostras biológicas devem ser armazenadas e transportadas a +2 a +8 C. É recomendável o uso das amostras em até três dias da data de coleta, caso não seja utilizada neste intervalo, recomenda-se armazenar a amostra a -20 C.
4 É recomendável que o material genético apresente concentração entre ng/µl em cada reação para bons resultados. ATENÇÃO: Amostras de pacientes heparinizados não devem ser utilizadas, uma vez que a heparina é substância interferente na reação de PCR. OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS Os componentes do Kit XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN são prontos para o uso. 10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT Micropipetas Devem ser calibradas para dispensar o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e exatidão de ±5%. Equipamento O Kit XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN é direcionado para uso em combinação somente com os Termocicladores ABI SDS 7300 e ABI SDS 7500 (Software Sequence Detection System Applied Biosystems ). Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 11. CONTROLE DE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Verificar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar os termocicladores, verificar as configurações e certificar-se de utilizar o protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual do equipamento fornecido pelo fabricante para a correta configuração do termociclador em Tempo Real. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao responsável pelo laboratório. 12. PROTOCOLO IMPORTANTE: Um exemplo de gabarito para dispensação dos reagentes é informado no item Gabarito do Teste. Favor, consultar o item antes de começar a ler as instruções abaixo.
5 NOTA IMPORTANTE: Utilizar somente microplacas recomendadas pelos fabricantes de termocicladores em Tempo Real. CONTROLES DE AMPLIFICAÇÃO É obrigatório validar cada sessão de amplificação com reações de controle negativo e controles positivos. PREPARAÇÃO DA MISTURA DE AMPLIFICAÇÃO 1) Descongelar o reagente MM FV, homogeneizar cuidadosamente em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar todo o conteúdo no fundo do tubo. 2) Descongelar o reagente PS FV, homogeneizar cuidadosamente em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar todo o conteúdo no fundo do tubo. 3) Preparar a mistura de amplificação, de acordo com o número de amostras a serem analisadas. # Reações Componente x 1 x 32 x 64 x 96 MM FV 13,75 µl 440 µl 880 µl µl MONTAGEM DA REAÇÃO 1) Dispensar 20 µl da mistura de amplificação em cada microtubo ou poço da microplaca, conforme Gabarito de Teste. 2) Adicionar 5 μl de AMOSTRA em cada em cada microtubo ou poço da microplaca. 3) Adicionar 5 µl de Controle Positivo Selvagem em cada microtubo ou poço da microplaca. 4) Adicionar 5 µl de Controle Positivo Mutante em cada microtubo ou poço da microplaca. 5) Adicionar 5 µl de Controle Negativo em cada microtubo ou poço da microplaca. 6) Fechar os microtubos ou selar a microplaca. 7) Centrifugar brevemente os microtubos ou a microplaca a rpm. 8) Colocar os microtubos ou a microplaca no termociclador de PCR em Tempo Real. 9) Após configurar as operações descritas no item PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO, iniciar a corrida no termociclador. PS FV 8,1 µl 259,2 µl 518,4 µl 776,6 µl Volume Total 21,85 µl 699,2 µl 1.398,4 µl 2.096,6 µl
6 Programação da PCR PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO A programação deve ser feita conforme descrito abaixo. 13. GABARITO DE TESTE Exemplo de gabarito para posicionamento das amostras e reagentes para uma análise qualitativa. Fase Temperatura Tempo # Ciclos Hold 50 C 2 min. 1 Hold 95 C 10 min. 1 Ciclo PCR 95 C 15 seg. (*Coleta de Dados) 60 C (*) 1 min. AVISO: Configurar o equipamento com a correta programação da PCR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. 35 Seleção de Detectores Selecionar os detectores informados na tabela abaixo, conforme o manual de instrução do equipamento a ser utilizado. Detecção Repórter Quencher Alelo 1: Fator V Selvagem FAM Não fluorescente Alelo 2: Fator V Mutante VIC Não fluorescente Configurar ROX como referência passiva. LEGENDA: A1 A9 = Amostras; CPS = Controle Positivo Selvagem; CPM = Controle Positivo Mutante; CN = Controle Negativo.
7 14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Configurações Pré-Análise Definir BASELINE, de acordo com as informações abaixo. ANÁLISE DE ΔCt Valor de ΔCt Resultado do Ensaio ΔCt 2 Homozigoto Selvagem ABI TM SDS 7300 ABI TM SDS 7500 BASELINE Automático -2 < ΔCt < 2 Heterozigoto ΔCt -2 Homozigoto Mutante NOTA: Se um dos Cts for indeterminado, não se calcula o ΔCt, e o resultado deve ser considerado homozigoto para o alvo detectado. Configurar manualmente o THRESHOLD, de acordo com as informações abaixo. THRESHOLD FAM VIC ABI SDS ,05 0,05 ABI SDS ,25 0,25 Análises de Dados Após configurar o equipamento conforme instruções, verificar os valores de Ct (ciclo threshold) para calcular os valores de ΔCt (diferença nos ciclos do threshold) conforme abaixo: ΔCt = Ct (VIC) Ct (FAM) Uma verificação deve ser realizada nos controles positivos sempre que o kit é utilizado a fim de verificar se os valores de Ct são esperados e informados na tabela abaixo. TM ABI SDS 7300/7500 Controle Positivo FAM VIC Homozigoto Selvagem Homozigoto Mutante Ct < 30 Ct Determinado ou Indeterminado Ct Determinado ou Indeterminado Ct < 30 Resultado do Ensaio VÁLIDO VÁLIDO Onde: Ct (VIC) Ciclo threshold para VIC Ct (FAM) Ciclo threshold para FAM 15. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Os resultados obtidos com o Kit XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN devem ser interpretados pelos responsáveis do laboratório levando em consideração os sintomas clínicos dos pacientes e outros parâmetros de laboratório relacionados às condições do paciente.
8 CAUSA PROVÁVEL Contaminação durante a pipetagem dos controles positivos ou de amostra. Contaminação do Mix de amplificação. Controle negativo com presença de fluorescência AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA Usar somente micropipetas e ponteiras estéreis e com filtro para aerossóis. Sempre trocar a ponteira entre aplicação das amostras. Limpar as superfícies e instrumentos corretamente. Pipetar os controles positivos no final do procedimento de preparação. Pipetar o controle negativo no início do procedimento de preparação. Não dispensar o Mix de amplificação com as mesmas pipetas utilizadas nas áreas de extração. Usar somente micropipetas com ponteiras estéreis e com filtros para aerossóis. Limpar as superfícies e instrumentos corretamente. Após o uso do Mix de amplificação, tampar e retornar ao freezer antes de abrir outros tubos com amostras. Erro durante a escolha da placa ou do instrumento. Contaminação da área dedicada aos passos de amplificação. CAUSA PROVÁVEL Possíveis erros de pipetagem dos controles positivos. Degradação do controle positivo. Erro na temperatura dos ciclos. Checar a placa a as configurações do instrumento e o real posicionamento das amostras e controles na placa. Limpar as superfícies e instrumentos corretamente. Usar jalecos. Amplificação incorreta do controle positivo AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA Pipetar cuidadosamente o controle positivo. Conferir a calibração das micropipetas utilizadas. Verificar a quantidade pipetada de acordo com o procedimento Testar um novo lote de controle positivo. Conferir as configurações de temperatura dos ciclos. Mau posicionamento da microplaca. Posicionar a microplaca cuidadosamente. Mix de amplificação mantido por muito tempo em temperatura ambiente. Deixar o Mix de amplificação no gelo durante o procedimento e guarde-o imediatamente no freezer -20 C após o uso.
9 NOTA IMPORTANTE: A Interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. Quando os resultados do laboratório são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve-se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois da investigação, informar qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. 16. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da instrução de uso. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação de fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador é essencial para resultados precisos e reprodutíveis. A determinação positiva em amostra do paciente tem implicações médicas, sociais, psicológicas e econômicas. É recomendado que a confidencialidade, aconselhamento apropriado e avaliação médica sejam considerados como aspectos essenciais na sequência dos testes. O produto XGEN MASTER FATOR V DE LEIDEN é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. Exceções na garantia: Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. Extinção da garantia: Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 18. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866. CEP: Pinhais/PR BRASIL Fone: DDG: info@mobiuslife.com.br CNPJ: / REGISTRO ANVISA Website: GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: Garantia 20. RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D
MM FV XGEN PS FV XGEN. CP FV Sel XGEN. CP FV Mut XGEN
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