Instruções de Uso XGEN MULTI PR21. Kit MULTIPLEX para Detecção de 21 Patógenos Respiratórios

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1 Instruções de Uso XGEN MULTI PR21 Kit MULTIPLEX para Detecção de 21 Patógenos Respiratórios 1. USO PRETENDIDO O Kit XGEN MULTI PR21 é um teste in vitro para a detecção qualitativa de ácido nucleico em amostras do trato respiratório como auxílio para a avaliação de infecções com vírus Influenza A, vírus Influenza B (FLUB), vírus Influenza A H1N1-swl (H1N1), Coronavírus NL63 (Cor63), Coronavírus 229E (Cor229), Coronavírus OC43 (Cor43), Coronavírus HKU1 (HKU), vírus Parainfluenza 1 (HPIV1), vírus Parainfluenza 2 (HPIV2), vrus Parainfluenza 3 (HPIV3), vírus Parainfluenza 4 (HPIV4), Metapneumovírus humano A e B (HMPVA/B), Rinovírus (RV), vírus Sincicial Respiratório A e B (HRSVA/B), Enterovírus (EV), Parecovírus (HPeV), Adenovírus (HAdV), Bocavírus (HBoV) e Mycoplasma pneumoniae (Mpneu). O Kit XGEN MULTI PR21 é direcionado para uso em combinação com o Termociclador ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific Inc. ). PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO. 2. INTRODUÇÃO O vírus Influenza é um vírus de RNA da família Orthomyxoviridae. A infecção pelo vírus Influenza A (FLUA) está associada a infecções respiratórias severas de gravidade variável e vão desde infecções assintomáticas a doenças fatais. Os sintomas típicos da Influenza incluem febre, dor de garganta, tosse, dor de cabeça e mialgia. Complicações das infecções pelo vírus Influenza incluem pneumonia viral primária, pneumonia bacteriana e exacerbação das doenças crônicas subjacentes. A infecção tende ser mais grave em pacientes idosos, crianças nos primeiros anos de vida, crianças pequenas e em pacientes imunocomprometidos. A gripe suína é causada pela linhagem H1N1-swl do vírus Influenza A (H1N1) foi relatado na primavera de Em 11 de junho de 2009 a OMS declarou uma pandemia de H1N1, marcando a primeira pandemia global desde As viroses causadas pelo vírus Influenza B (FLUB) causam os mesmos sintomas da infecção por Influenza A. No entanto, os vírus Influenza B não são conhecidos por causar pandemias. O vírus Parainfluenza (HPIV1-4) é um vírus RNA associado com doenças do trato respiratório superior, incluído resfriados comuns com febre, laringotraqueobronquite, bronquiolite e pneumonia. Parainfluenza-1 e Parainfluenza-2 são os patógenos mais comuns associados com a inflamação das vias áreas superiores, e Parainfluenza-3 é associado na maioria dos casos de bronquiolite e pneumonia em crianças nos primeiros anos de vida e crianças jovens. Os tipos 1 e 2 tendem a ocorrer principalmente nos meses de inverno, enquanto o tipo 3 ocorre principalmente na primavera. Pouco se sabe sobre a epidemiologia da HPIV4. Geralmente, tem-se observado que a taxa de infecção é relativamente a mesma em grupos de idade a partir de crianças pequenas a adultos. A doença é normalmente transmitida de pessoa para pessoa através do ar, da tosse e espirros, e contato pessoal com um período de incubação de 4 dias aproximadamente. O Rinovírus (RV) é o agente infeccioso viral mais comum em humanos e a causa predominante do resfriado comum. O rinovírus é um vírus RNA e é comum em todas as faixas etárias onde podem causar infecções no trato respiratório inferior e superior. O aumento dos testes recentemente associou este vírus a doenças graves como asma e DPOC. Embora as infecções ocorram o ano todo, a incidência é maior no outono e na primavera. Existem dois modos de transmissão: via aerossóis de gotículas respiratórias, diretamente de pessoa para pessoa e via superfícies contaminadas. Os quatro Coronavírus (NL63, Cor63, Cor229, Cor43 e HKU) são associados a uma gama de consequências respiratórias, incluindo bronquiolite e pneumonia. São vírus com genoma de RNA. O NL63 é associado com infecções das vias 1

2 aéreas superiores em crianças, considerando que é sugerido que este vírus provavelmente cause resfriado comum em adultos. O Cor229 é comprovadamente o causador da gripe comum em adultos saudáveis, por isso é provável que ambos os vírus induzam sintomas similares em adultos, mesmo que os modos de infecção sejam diferentes. O OC43 é geralmente caracterizado pelas dores de garganta. O HKU provoca doenças leves nas vias respiratórias superiores como o resfriado comum, bronquiolite e pneumonia, com sintomas como rinorréia, febre, convulsão febril, tosse e respiração ofegante. Os vírus Respiratórios Sinciciais (HRSVA e HRSVB) são uma importante causa de infecção no trato inferior respiratório em todos os grupos etários. O genoma é constituído por RNA. A maioria das infecções ocorre durante o inverno. O RSV é de particular importância como causa de infecções severas no trato respiratório inferior em crianças nos primeiros anos de vida (causando bronquiolite e pneumonia), imunocomprometidos e idosos. HRSV pode ser transmitido quando gotículas nasais e de saliva contendo o vírus são encontrados no ar. A infecção também pode resultar do contato direto e indireto com secreções nasais ou orais. As pessoas infectadas com RSV são geralmente contagiosas durante 3 a 8 dias; pessoas saudáveis normalmente se recuperam da infecção por RSV ente 1 a 2 semanas. No entanto, a infecção pode ser grave em crianças pequenas, crianças e idosos. O Adenovírus (HAdV) são vírus DNA fita dupla e são a causa comum de doenças respiratórias. Os sintomas podem variar desde um resfriado comum a pneumonia, infecções do trato respiratório superior e bronquite. Dependendo do tipo, o adenovírus pode causar outras doenças como gastroenterites, conjuntivites, cistites, e menos comum, doenças neurológicas. O HAdV infecta crianças com mais frequência do que adultos. Infecções graves e disseminadas podem ocorrer em pacientes imunocomprometidos. O adenovírus é responsável por cerca de 15% das crianças hospitalizadas com gastroenterite. O Bocavírus (HBoV) é um vírus DNA fita simples pertencente a família Parvoviridae e são encontrados em crianças de todas as idades com doenças no trato respiratório em todo o mundo. São relatados sintomas de infecção no trato respiratório, sintomas gastrointestinais e erupções cutâneas. Sugere-se que o HBoV é transmitido através de secreções respiratórias. Entretanto, também pode ser encontrado em fezes e sangue, tornando-se outras formas de propagação do vírus. O Enterovírus (EV) é um vírus RNA fita simples. Eles são o segundo vírus que mais causam resfriados comuns em humano. As infecções por EV normalmente acontecem no outono e verão e afetam milhões de pessoas por ano no mundo inteiro. Os vírus são encontrados em secreções respiratórias como saliva, expectoração e muco. Também são encontrados nas fezes de uma pessoa infectada. Ainda não existe vacina disponível para o EV não pólio. O Parecovírus (HPeV) é um vírus de RNA fita dupla prevalente em crianças. Estão associados a doenças respiratórias, incluindo infecções nos tratos respiratórios superior e inferior. Também foi relatado que eles podem causar gastroenterite leve, e com menos frequência, meningite e sepse neonatal. Mycoplasma pneumoniae (Mpneu) é um comum causador de infecções do trato respiratório superior com febre, tosse, mal-estar e dor de cabeça. Esta bactéria não possui parede celular de peptideoglicano e não pode, portanto, ser detectada pela coloração de gram. Radiologicamente confirmada a pneumonia se desenvolve em 5-10% dos casos de síndromes extrapulmonares raras, incluindo casos cardiológicos, neurológicos e dermatológicos. A transmissão é por contato pessoa-a-pessoa através de secreções respiratórias. O período de incubação é de entre 1 a 4 semanas. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O RNA viral é transcrito em cdna utilizando um primer específico mediado na etapa de transcrição reversa seguido imediatamente no mesmo tubo de PCR. A presença de uma sequência específica do patógeno na reação é 2

3 detectada por um aumento na fluorescência observada a partir da sonda correspondente duplamente marcada, e é relatado como o valor limiar de ciclo (Ct) pelo termociclador em Tempo Real. O ensaio utiliza o vírus da Arterite Equina (EAV) como controle de extração - Controle Interno (CI), adicionado a cada amostra e ao controle negativo no processo de extração. 4. COMPONENTES O formato padrão do contém reagentes para 64 testes. COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE EZ PR21 Solução de Enzima e dntps 2 x 160 µl TAMPÃO PR21 Mistura de Tampão 4 x µl PS PR21 1 PS PR21 2 Mistura de Primers e Sonda para: FLUA, FLUB, H1N1 & RV Mistura de Primers e Sonda para: Cor63, Cor43, Cor229 & HKU 2 x 48 µl 2 x 48 µl PS PR21 3 Mistura de Primers e Sonda para: HPIV2-4 & CI 2 x 48 µl PS PR21 4 PS PR21 5 CP PR21 Mistura de Primers e Sonda para: HPIV1, HMPV A & B, HBoV & Mpneu Mistura de Primers e Sonda para: HRSVA & B, HAdV, EV & HPeV Controle Positivo contendo plasmídeos para a detecção de: FLUA, FLUB, H1N1swl, RV, Cor63, Cor229, Cor43, HKU, HPIV1-4, HMPV, HBoV, Mpneu, HRSV, HAdV, EV & HPeV 2 x 48 µl 2 x 48 µl 2 x 750 µl CI PR21 Controle Interno 2 x 128 µl CN 6 Controle Negativo 4 x µl * Cada frasco contém um volume adicional para imprecisão de pipetagem. A própria caixa, a tampa e cada frasco são etiquetados com o número do lote. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE Os componentes do kit devem ser armazenados na embalagem original à temperatura entre -25 C e -15 C e são estáveis até a data de vencimento indicada no rótulo. O produto é fornecido em embalagens com gelo seco que devem garantir uma temperatura de transporte abaixo de -15 C à -25 (satisfatória de acordo com os estudos de estabilidade). Congelar o produto imediatamente após o uso. Deve se evitar o congelamento e o descongelamento dos reagentes por mais de dez vezes, pois pode reduzir a sensibilidade do ensaio. Recomenda-se realizar alíquotas dos reagentes de acordo com suas necessidades após o primeiro descongelamento. 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS. Micropipetas calibradas (0,5 µl < volume < 200 µl); Microcentrífuga; Racks para tubos; Ponteiras estéreis com filtro; Microtubos livres de nuclease; Microplacas de PCR, recomendadas pelo fabricante do equipamento de PCR em Tempo Real; Luvas descartáveis sem talco; Termociclador para PCR em Tempo Real; Agitador tipo vortex ou similar. 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 3

4 2. O pessoal técnico deve ser profundamente treinado no uso dos termocicladores em tempo real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em Tempo Real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit entre -20 C e -80 C, em um freezer ou câmara fria com temperatura controlada. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada amostra. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança 2, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os componentes no gelo ou em reservatório refrigerado. 16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 19. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 20. Outros resíduos gerados (exemplo: ponteiras usadas para amostras) devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES O ensaio é para uso com ácido nucleico extraído a partir de amostras respiratórias (swab nasal e de garganta, lavado broncoalveolar e escarro) de origem humana. Em alguns casos, outras amostras podem ser testadas 4

5 incluindo materiais post mortem como tecido de pulmão. Para períodos longos de armazenamento recomenda-se que todas as amostras fiquem a -20 C até a extração. IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS Enzima - EZ PR21 Solução pronta para uso. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. Solução Tampão TAMPÃO PR21 Solução pronta para uso. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. Primers e Sondas PS PR21 1 / PS PR21 2 / PS PR21 3 / PS PR21 4 / PS PR21 5 Solução pronta para uso. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. Controle Positivo CP PR21 Solução pronta para uso para ser utilizado como amostra na etapa de amplificação. Não extrair o Controle Positivo, uma vez que a solução é constituída por plasmídeos e a reação será inibida. Controle Negativo - CN Solução pronta para uso que deve ser utilizado no processo de extração. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Controle Interno - CI Solução pronta para uso. Antes do uso, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Na extração, para volume de eluição de 55 µl, recomenda-se adicionar 2 µl do Controle Interno ao tampão de lise em cada extração. Nunca adicionar o Controle Interno diretamente à amostra, ao menos que esteja diluída no tampão de lise. Caso seja utilizado volume de eluição diferente do descrito acima, adicionar o volume de Controle Interno proporcional. ELUIÇÃO CI 50 µl a 65 µl 2 µl 60 µl a 90 µl 3 µl > 100 µl 4 µl IMPORTANTE: Adicionar o Controle Interno a cada uma das amostras e ao Controle Negativo é uma etapa muito importante para confirmar o sucesso do procedimento de extração de ácido nucleico e para verificar possível inibição da PCR. 10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT 1. Micropipetas As micropipetas devem estar calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em em 5

6 contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e uma exatidão de +/- 5%. 2. Termociclador em Tempo Real O Kit XGEN MULTI PR21 é direcionado para uso em combinação somente com o Termociclador ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific Inc. ). Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 11. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Observar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar os termocicladores e verificar as configurações. Ter certeza de usar o protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual de equipamentos fornecidos pelo fabricante para a correta configuração dos termocicladores em Tempo Real. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao supervisor. 12. PROTOCOLO IMPORTANTE: Um exemplo de gabarito para dispensação dos reagentes é informado no item Gabarito do Teste. Favor consultar o item antes de iniciar o procedimento prático. ATENÇÃO: Utilizar somente microplacas recomendadas pelo fabricante do termociclador em Tempo Real. CONTROLES DE AMPLIFICAÇÃO É obrigatório validar cada sessão de amplificação com reações de Controle Negativo (CN) e Controle Positivo (CP). IMPORTANTE: Os Controles Positivos devem ser descongelados em temperatura ambiente por minutos e homogeneizados completamente antes de utilizar. PREPARAÇÃO DA MISTURA DE AMPLIFICAÇÃO Para cada frasco de Primer e Sonda (PS), preparar uma mistura com os seguintes componentes: tampão, primer e sonda e enzima. Certificar-se de manter a EZ PR21 no freezer ou em bloco de refrigeração o tempo todo. # Reações Componente x 1 x 16 x 32 x 64 TAMPÃO PR21 12,5 µl 200 µl 400 µl 800 µl PS PR21 (1, 2, 3, 4 ou 5) 1,5 µl 24 µl 48 µl 96 µl EZ PR21 1 µl 16 µl 32 µl 64 µl Volume Total 15 µl 240 µl 480 µl 960 µl Tabela 1. Quantidade de Reagente Necessária para Número de Reações Especificado. 6

7 1. Separar um microtubo de 1,5 ml (não fornecido) para preparar cada mistura de amplificação. 2. Descongelar os reagentes para a reação: PS PR21 (1, 2, 3, 4 ou 5) e TAMPÃO PR21. Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). 3. Pipetar a quantidade requerida de TAMPÃO PR21 dentro do microtubo, de acordo com a relação da quantidade dos outros reagentes, conforme Tabela 1. Trocar as ponteiras após cada passo de pipetagem. 4. Pipetar a quantidade requerida de PS PR Pipetar a quantidade requerida de EZ PR Homogeneizar a mistura de amplificação em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). 7. Certifique-se de congelar os volumes restantes dos reagentes não utilizados logo após a utilização. IMPORTANTE: O volume de PS PR21 (1, 2, 3, 4 ou 5) é suficiente para 64 reações (+ imprecisão de pipetagem). O Kit XGEN MULTI PR21 possibilita a máxima flexibilidade desde 1 a 62 pacientes, com a adição de Controle Negativo e Controle Positivo em cada corrida. Quantidade de Amostras 1 62 Número de Corridas Fechar a placa com filme adesivo óptico. 5. Homogeneizar a placa em vórtex e centrifugar brevemente. 6. Colocar a placa no equipamento. Programação da PCR PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO A programação deve ser feita conforme descrito abaixo. Etapa Temperatura Tempo # Ciclos Hold 42 C 15 min. 1 Hold 94 C 3 min. 1 Ciclo PCR 94 C 8 seg. (*Coleta de Dados) 60 C (*) 34 seg. AVISO: Configurar o equipamento com a correta programação da PCR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Seleção de Detectores Selecionar os detectores informados na tabela abaixo, conforme o manual de instrução do equipamento a ser utilizado. 40 PROCEDIMENTO DE AMPLIFICAÇÃO 1. Utilizar uma placa de 96 poços compatível com o equipamento em Tempo Real 2. Pipetar 15 µl da mistura de amplificação (TAMPÃO PR21 + EZ PR21 + PS PR21(1, 2, 3, 4 ou 5)) nos poços. 3. Adicionar 10 µl de cada amostra extraída, do Controle Negativo extraído e do Controle Positivo. Detecção Reporter* Quencher FLUA, Cor 229, HPIV3, HPIV1, HRSVA/B. RV, Cor 63 HPIV2, HMPV A/B, HPeV. FLUB, HKU, HPIV4, HBoV, EV H1N1, Cor 43, CI (EAV), Mpneu, HAdV. FAM VIC ROX CY5 Não Fluorescente Não Fluorescente Não Fluorescente Não Fluorescente 7

8 NOTA IMPORTANTE: Ao utilizar o equipamento ABI 7500 é necessário alterar a configuração para o corante de Referência Passiva. (Por padrão, o corante ROX é selecionado). Após a etapa de especificação dos detectores e atribuição para cada poço, clicar para concluir e o software irá criar o documento da placa. Clicar em um poço, ou clicar e arrastar para selecionar e replicar poços. Digitar o nome da amostra e alterar a Referência Passiva para "None". Se utilizar o equipamento ABI 7500 Fast, NÃO utilizar o programa rápido. 13. GABARITO DE TESTE Exemplo de gabarito para posicionamento das amostras e controles para a análise com o kit A A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 C A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 D A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 E A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 F CP1 CP2 CP3 CP4 CP5 G CN1 CN2 CN3 CN4 CN5 H Legenda: A1 A12 = Amostras; Primers e Sondas = PS 1; PS 2 ;PS 3 ;PS 4 ;PS 5; CN = Controle Negativo; CP = Controle Positivo. 14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Análise de Dados 1. Abrir o experimento. 2. No Experiment Menu ao lado esquerdo, clicar sobre o ícone Analysis e depois Amplification Plot. 3. No campo Graph Type escolher a opção Linear. A análise deverá ser realizada neste modo. 4. No campo Color escolher a opção Target. 5. Retirar a marcação para análise automática de THRESHOLD e BASELINE. 6. Os parâmetros de THRESHOLD e BASELINE devem ser ajustados manualmente e os alvos devem ser analisados separadamente. Configurações de Análise Configurar o THRESHOLD, de acordo com as informações abaixo. 1. Todos os valores para Controles Negativos devem ser inferiores ao THRESHOLD. Se existir potencial contaminação (aparecimento de curva de amplificação no Controle Negativo ou conjunto de curvas em amostras com alto Ct,, por exemplo, acima de 36), os resultados obtidos não são interpretáveis e toda a corrida (incluindo extração) deve ser repetida. 2. Todos os Controles Positivos deverão mostrar traço de amplificação positiva (ou seja, exponencial). O Controle Positivo deve apresentar Ct abaixo de Verificar o traço do "componente" antes de aceitar o traço exponencial como verdadeiro. 8

9 4. Todos os Controles Internos devem apresentar traço positivo (ou seja, exponencial) de amplificação. O Controle Interno deve apresentar Ct abaixo de 33. Se o Controle Interno apresentar Ct acima de 33, isso aponta para problema de purificação ou amostra fortemente positiva, causando a inibição do Controle Interno. IMPORTANTE: Os Controles Positivos e qualquer amostra positiva irá mostrar um traçado de fluorescência exponencial. Qualquer amostra exibindo um traço exponencial é considerada como positiva. As sondas possuem diferentes níveis de fluorescência, por isso as curvas para diferentes alvos apresentam aspectos diferentes. 15. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS CONTROLE POSITIVO SEM SINAL DE AMPLIFICAÇÃO Configuração incorreta da temperatura na programação da PCR no equipamento. Comparar se a configuração está de acordo com a instrução de uso. Configuração incorreta da reação de PCR. Verificar as etapas de trabalho por meio do esquema de pipetagem e repetir o procedimento, se necessário. Checar a calibração das micropipetas. Manuseio incorreto dos controles positivos. Homogeneização inadequada ou descongelamento em temperatura ambiente. Condições de armazenamento para um ou mais componentes do kit não estão de acordo com a instrução de uso ou a data de validade do kit expirou. Checar as condições de armazenamento e a data de validade (verificar na etiqueta do produto) dos reagentes e repetir o procedimento, se necessário. CONTROLE INTERNO COM SINAL FRACO OU SEM SINAL DE AMPLIFICAÇÃO As condições da PCR não cumprem o protocolo. Verificar as condições da PCR e repetir o procedimento de acordo com a instrução de uso, se necessário. A PCR foi inibida, não houve adição ou o volume de Controle Interno adicionado na etapa de extração não foi suficiente. Verificar se o método de extração utilizado é compatível com o kit. Sinal positivo muito forte de um alvo pode, por vezes, inibir a fluorescência do Controle Interno. CONTROLE NEGATIVO COM SINAL DE AMPLIFICAÇÃO Contaminação durante a extração ou durante a preparação da PCR. Repetir a PCR com novos reagentes em replicatas. É recomendado realizar a pipetagem do Controle Positivo após todos os outros reagentes. Certificar-se de que o local de trabalho e os instrumentos são descontaminados em intervalos regulares. IMPORTANTE: A interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. 9

10 Quando os resultados do laboratório são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois de verifica-los, informe qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. 16. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da instrução de uso. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação do fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador, é essencial para que a detecção do ácido nucleico dos patógenos seja precisa e reprodutível. A determinação do ácido nucleico destes patógenos em uma amostra do paciente tem implicações médicas, sociais, psicológicas e econômicas. É recomendado que a confidencialidade, aconselhamento apropriado e avaliação médica sejam considerados aspectos essenciais na sequência de testes. 17. GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: GARANTIA O produto KIT XGEN MULTIPLEX PR21 é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. EXCEÇÕES NA GARANTIA Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 18. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866 Pinhais PR - CEP: Telefone: (41) info@mobiuslife.com.br WEBSITE: CNPJ: / REGISTRO ANVISA RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D 10