Folha de protocolo QIAsymphony RGQ

Transcrição

1 Folha de protocolo QIAsymphony RGQ Definições de corrida dos kits artus QS-RGQ (software Rotor-Gene Q ou superior) Kit artus HBV QS-RGQ Versão 1, Kit artus HCV QS-RGQ Versão 1, Kit artus HI Virus-1 QS-RGQ Versão 1, Controle de versão Este documento é a folha de protocolo QIAsymphony RGQ (elabelling), versão 1, R1. Verificar se há novas revisões de rotulagem eletrônica disponíveis em antes de realizar o teste. Pontos importantes antes de iniciar o procedimento Familiarizar-se com o Rotor-Gene Q antes de dar início ao protocolo. Consultar o manual do usuário do instrumento. Ver também o respectivo manual do kit artus QS-RGQ e sua folha de aplicação em Certificar-se de que todos os padrões de quantificação, além de pelo menos um controle negativo (água, grau de PCR) sejam incluídos em cada corrida de PCR. Para criar uma curva-padrão, usar todos os padrões de quantificação fornecidos. Setembro de 2015 Sample & Assay Technologies

2 Procedimento 1. Colocar os tubos de PCR no rotor de 72 poços do Rotor-Gene Q. Vedar o rotor com o anel bloqueador ( locking ring ). 2. Transferir o arquivo do ciclador do QIAsymphony AS para o computador do Rotor-Gene Q. 3. Abrir a caixa de diálogo New Run Wizard (Assistente de nova corrida) (figura 1). Marcar a caixa Locking Ring Attached (Anel bloqueador fixado) e clicar em Next (Seguinte). Figura 1. A caixa de diálogo "New Run Wizard" (Assistente de nova corrida). 4. Selecionar 50 como volume de reação da PCR e clicar em Next (figura 2). superior) página 2 de 8

3 Figura 2. Definição dos parâmetros de ensaio gerais. Nota: Mesmo que o volume físico de reação não seja 50 µl, selecione sempre 50 como volume de reação no software Rotor-Gene. 5. Clicar no botão Edit Profile (Editar perfil) na próxima caixa de diálogo do New Run Wizard (figura 3). Programar o perfil de temperatura indicado para o respectivo kit artus QS-RGQ tal como mostra a tabela 1, orientando-se pelos exemplos de imagens de tela nas figuras 3 6 (imagens do kit artus HI Virus-1 QS- RGQ são mostradas a título de exemplo). Figura 3. Edição do perfil. Exemplo de imagem de tela do kit artus HI Virus-1 QS-RGQ. superior) página 3 de 8

4 Tabela 1. Perfis de temperatura para os kits artus QS-RGQ Kit artus QS-RGQ HBV HCV, HI Virus-1 Hold Temperatura: 95 graus Tempo: 10 min Temperatura: 50 graus Tempo: 30 min Hold 2 Passo não necessário Temperatura: 95 graus Tempo: 15 min Cycling 45 vezes 95 graus durante 15 s 55 graus durante 30 s 72 graus durante 15 s 50 vezes 95 graus durante 30 s 50 graus durante 60 s 72 graus durante 30 s Nota: Ver também a respectiva folha de aplicação QIAsymphony RGQ em Figura 4. Transcrição reversa do RNA. Exemplo de imagem de tela do kit artus HI Virus-1 QS- RGQ. Nota: Este passo pode ser diferente para os outros kits artus QS-RGQ. Ver na tabela 1 as informações específicas para cada kit artus QS-RGQ. superior) página 4 de 8

5 Figura 5. Ativação inicial da enzima de "hot-start". Exemplo de imagem de tela do kit artus HI Virus-1 QS-RGQ. Nota: Este passo pode ser diferente para os outros kits artus QS-RGQ. Ver na tabela 1 as informações específicas para cada kit artus QS-RGQ. Figura 6. Amplificação do DNA. Exemplo de imagem de tela do kit artus HI Virus-1 QS-RGQ. Nota: Este passo pode ser diferente para os outros kits artus QS-RGQ. Ver na tabela 1 as informações específicas para cada kit artus QS-RGQ. superior) página 5 de 8

6 6. O intervalo de detecção dos canais de fluorescência tem de ser determinado de acordo com as intensidades de fluorescência nos tubos de PCR. Clicar em Gain Optimisation (Otimização de ganho) na caixa de diálogo New Run Wizard (ver figura 3) para abrir a caixa de diálogo Auto-Gain Optimisation Setup (Configuração da otimização automática de ganho). Definir a temperatura de calibração para coincidir com a temperatura de anelamento do programa de amplificação, e ajustar as sensibilidades do canal de fluorescência (tabela 2 e exemplo de imagem de tela na figura 7). Tabela 2. Definições Auto-Gain Optimisation para os kits artus QS-RGQ Kit artus QS-RGQ HBV HCV, HI Virus-1 Temperatura 55 graus 50 graus Definições dos canais Verde Amarelo Verde Laranja Nota: Ver também a respectiva folha de aplicação QIAsymphony RGQ em superior) página 6 de 8

7 Figura 7. Ajustar a sensibilidade do canal de fluorescência. Exemplo de imagem de tela do kit artus HI Virus-1 QS-RGQ. Nota: Este passo pode ser diferente para os outros kits artus QS- RGQ. Ver na tabela 2 as informações específicas para cada kit artus QS-RGQ. 7. Os valores de ganho determinados pela calibração dos canais são salvos automaticamente e listados na última janela do menu do procedimento de programação (figura 8). Clique em Start Run (Iniciar corrida). Figura 8. Iniciar corrida. Exemplo de imagem de tela do kit artus HI Virus-1 QS-RGQ. superior) página 7 de 8

8 8. Depois de iniciar a corrida de ensaio, importe as informações do arquivo do ciclador clicando no botão ("Open"), ou edite manualmente as amostras. 9. Para a interpretação dos resultados, ver o manual do usuário do instrumento e a respectiva folha de aplicação QIAsymphony RGQ em Para obter informações de licenciamento atualizadas e termos de isenção de responsabilidade específicos do produto, consultar o manual do usuário ou o manual de instruções do respectivo kit QIAGEN. Os manuais dos kits QIAGEN e manuais do usuário estão disponíveis em ou podem ser solicitados à assistência técnica ou ao distribuidor local da QIAGEN. Marcas registradas: QIAGEN, QIAsymphony, artus, Rotor-Gene (Grupo QIAGEN). Setembro de 2015 HB-2004-S QIAGEN, todos os direitos reservados. Dinamarca Itália Cingapura Austrália Finlândia Japão Espanha Áustria França Coreia do Sul Suécia Bélgica Alemanha Luxemburgo Suíça Brasil Hong-Kong México Taiwan Canadá Índia Países Baixos Reino Unido China Irlanda Noruega EUA Sample & Assay Technologies