Instruções de Uso. XGEN MASTER PAI-1 (XG-PAI1-MB) Determinação da inserção/deleção de 4G/5G em PAI-1 1. USO PRETENDIDO
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- João Henrique Faria Chaves
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1 1. USO PRETENDIDO Instruções de Uso XGEN MASTER PAI-1 (XG-PAI1-MB) Determinação da inserção/deleção de 4G/5G em PAI-1 O KIT XGEN MASTER PAI-1, também conhecido como inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1, é um teste qualitativo que permite a discriminação alélica, através de PCR em Tempo Real, do polimorfismo 4G/5G no gene PAI-1. O procedimento permite a amplificação dos alelos selvagens (Wild-type) e alelos mutantes de PAI-1. A discriminação alélica é realizada pela construção do gráfico de dispersão da fluorescência dos alelos mutantes (eixo Y) versus fluorescência dos alelos selvagens (eixo X), discriminando assim três possíveis genótipos: Homozigoto selvagem, Homozigoto mutante e Heterozigoto mutante. O kit foi otimizado para uso nos aparelhos de PCR em Tempo Real ABI SDS 7300 e ABI SDS 7500 (Thermo Fisher Scientific Inc. ). RUO- PRODUTO PARA USO EM PESQUISA 2. INTRODUÇÃO O Inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-1) é uma proteína de 48 kd que atua neutralizando a ação do ativador tecidual do plasminogenio (TPA) e inibindo a clivagem de plasminogênio em plasmina de modo a impedir a dissolução do coágulo. Ele é o principal inibidor dos ativadores de plasminogênio t-pa e u-pa. Em indivíduos normais é baixo, elevando-se em condições patológicas como tromboembolismo venoso, obesidade, doença arterial coronariana e sepse. A proteína PAI-1 é relatada ser super expressada em um número de malignidades incluindo câncer de ovários e linhas de células derivadas, câncer endometrial, câncer cervical, câncer maligno no cérebro, carcinomas nasofaríngeos, tumores de mama, carcinomas das células escamosas da cabeça e pescoço e câncer gástrico. Verificou-se que diferentes polimorfismos resultam em diferentes níveis de concentrações de PAI-1. No caso do PAI G / 5G, os níveis aumentados de PAI-1 no plasma foram detectados especialmente em pacientes portadores de genótipos 4G/4G. Alguns estudos demonstraram associação do genótipo PAI-1 4G4G com infarto do miocárdio. 3. PRINCÍPIO DO TESTE A reação de PCR em Tempo Real explora a atividade exonuclease 5' da DNA Taq polimerase para clivar uma sonda TaqMan durante a amplificação. A sonda TaqMan é composta por um corante reporter na extremidade 5' e um corante quencher (silenciador) na extremidade 3'. Quando a sonda está intacta, a proximidade do corante reporter com o corante quencher resulta em supressão da fluorescência reporter, principalmente por transferência de energia tipo Förster. Durante a reação, se o alvo de interesse estiver presente, a sonda se liga especificamente entre os primers forward e reverse, e a clivagem da sonda resulta na emissão de fluorescência do reporter, e o acúmulo de produtos de PCR é detectado diretamente pelo aumento da fluorescência deste corante. A utilização do KIT XGEN MASTER PAI-1 permite a identificação dos alelos selvagem e mutante, e a triagem de pacientes portadores da mutação e estudos epidemiológicos em populações de risco. 1
2 4. COMPONENTES O formato padrão do kit contém reagentes para 96 testes. COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE MM PAI-1 mmix de Amplificação dntps, Tris-HCl, KCl, MgCl 2, Taq Polimerase, Água livre de 3 x 440 µl nuclease, ROX PS PAI-1 Primers e Sondas PAI-1 Mistura de Primers e Sondas para PAI-1 3 x 260 µl CP PAI-1 Sel CP PAI-1 Mut Controle Positivo Homozigoto Selvagem Controle Positivo Homozigoto Mutante 3 x 70 µl 3 x 70 µl CN 2 Controle Negativo 1 x 60 µl 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O KIT XGEN MASTER PAI-1 deve ser armazenado na embalagem original em temperatura controlada entre -25 C e -15 C e são estáveis até à data de vencimento indicada no rótulo. Após a utilização, os componentes devem ser armazenados em temperatura controlada entre -25 C e -15 C. 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Luvas Descartáveis Sem Talco; Microcentrífuga ( rpm); Micropipetas; Cabine de Fluxo Laminar; Agitador Tipo Vórtex; Microtubos; Ponteiras Estéreis com Filtro; Termociclador* para PCR em Tempo Real. ATENÇÃO: Uma calibração válida dos filtros (Pure Spectra Component File) e do background (Background Component File) deve ser feita rotineiramente 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser treinado no uso dos termocicladores em Tempo Real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em tempo real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfuro-cortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os responsáveis pelo manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit a -20 C em freezer ou câmara fria com temperatura controlada. 2
3 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Manusear e descartar todos os materiais utilizados em local apropriado para descarte de resíduos perigosos. Além disso, deve-se seguir as leis locais para o descarte adequado. 11. Manter as áreas de extração e preparação de reagentes separada. 8. AMOSTRAS: PREPARAÇÃO E RECOMENDAÇÕES O Kit XGEN MASTER PAI-1 pode ser utilizado com DNA extraído de sangue total coletado em EDTA. Amostras coletadas devem ser transportadas e armazenadas a +2 a +8 C e utilizadas em até 3 dias após a data de coleta. Armazenar a amostra a -20 C caso seja usada após 3 dias. OBSERVAÇÃO IMPORTANTE: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS Os componentes do Kit XGEN MASTER PAI-1 são prontos para o uso. 10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT Micropipetas Devem ser calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrar em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e exatidão de ±5%. Equipamento O Kit XGEN MASTER PAI-1 é direcionado para uso em combinação somente com os Termocicladores ABI Sequence Detection System 7300 e Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 11. CONTROLE DE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Verificar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar os termocicladores, verificar as configurações e certificar-se de utilizar o protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual do equipamento fornecido pelo fabricante para a correta configuração do termociclador em Tempo Real. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao responsável pelo laboratório. 3
4 12. PROTOCOLO IMPORTANTE: Um exemplo de gabarito para dispensação dos reagentes é informado no item Gabarito do Teste. Favor consultar o item antes de começar a ler as instruções abaixo. NOTA IMPORTANTE: Utilizar somente microplacas recomendadas pelos fabricantes de termocicladores em Tempo Real. CONTROLES DE AMPLIFICAÇÃO É obrigatório validar cada sessão de amplificação com reações de controle negativo e controles positivos. PREPARAÇÃO DA MISTURA DE AMPLIFICAÇÃO 1) Descongelar o reagente MM PAI-1, homogeneizar cuidadosamente em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar todo o conteúdo no fundo do tubo. 2) Descongelar o reagente PS PAI-1, homogeneizar cuidadosamente em agitador tipo vórtex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar todo o conteúdo no fundo do tubo. 3) Preparar a mistura de amplificação, de acordo com o número de amostras a serem analisadas: MONTAGEM DA REAÇÃO 1) Dispensar 20 μl da mistura de amplificação em cada microtubo ou poço da microplaca, conforme Gabarito de Teste. 2) Adicionar 5 μl de AMOSTRA em cada microtubo ou poço da microplaca. 3) Adicionar 5 μl de Controle Positivo Selvagem em cada microtubo ou poço da microplaca. 4) Adicionar 5 μl de Controle Positivo Mutante em cada microtubo ou poço da microplaca. 5) Adicionar 5 μl de Controle Negativo em cada microtubo ou poço da microplaca. 6) Fechar os microtubos ou selar a microplaca. 7) Centrifugar brevemente os microtubos ou a microplaca a rpm. 8) Colocar os microtubos ou a microplaca no Termociclador de PCR em Tempo Real. 9) Após configurar as operações descritas no item PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO, iniciar a corrida no termociclador. Programação da PCR PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO A programação deve ser feita conform descrito abaixo. Fase Temperatura Tempo # Ciclos Hold 60 C 1 min. 1 Hold 95 C 10 min. 1 Ciclo PCR 95 C 15 seg. (*Coleta de Dados) 58 C 1 min. 35 4
5 AVISO: Configurar o equipamento com a correta programação da PCR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Seleção de Detectores Selecionar os detectores informados na tabela abaixo, conforme o manual de instrução do equipamento a ser utilizado. Detecção Repórter Quencher Alelo 1: PAI-1 Selvagem FAM Não fluorescente Alelo 2: PAI-1 Mutante VIC Não fluorescente Referência Passiva ROX Não fluorescente 13. GABARITO DO TESTE Exemplo de gabarito para posicionamento das amostras e reagentes para uma análise qualitativa. 14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Configurações Pré-Análise Definir BASELINE, de acordo com as informações abaixo. ABI PRISM 7300 SDS ABI PRISM 7500 SDS BASELINE Automático Configurar manualmente o THRESHOLD, de acordo com as informações abaixo. ABI PRISM 7300 SDS ABI PRISM 7500 SDS THRESHOLD FAM THRESHOLD VIC 0,02 ABI PRISM 7300 SDS 0,01 ABI PRISM 7500 SDS 0,02 Análise de Dados Após configurar o equipamento conforme instruções, verificar os valores de Ct (ciclo threshold) para calcular os valores de ΔCt (diferença nos ciclos do threshold) conforme abaixo: ΔCt = Ct (VIC) Ct (FAM) Onde: Ct (VIC) Ciclo threshold para VIC Ct (FAM) Ciclo threshold para FAM 5
6 Controle negativo com presença de fluorescência NOTA: Se um dos Cts for indeterminado, não se calcula o ΔCt, e o resultado deve ser considerado homozigoto para o alvo detectado. Uma verificação deve ser realizada nos controles positivos sempre que o kit é utilizado a fim de verificar se os valores de Ct são esperados e informados na tabela abaixo. 15. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Os resultados obtidos com o Kit XGEN MASTER PAI-1 devem ser interpretados pelos responsáveis do laboratório levando em consideração os sintomas clínicos dos pacientes e outros parâmetros de laboratório relacionados às condições do paciente. CAUSA PROVÁVEL Contaminação durante a pipetagem dos controles positivos ou de amostra. Contaminação do Mix de amplificação. Mau posicionamento da microplaca. AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA Usar somente micropipetas e ponteiras estéreis e com filtro para aerossóis. Sempre trocar a ponteira entre aplicação das amostras. Limpar as superfícies e instrumentos corretamente. Pipetar os controles positivos no final do procedimento de preparação. Pipetar o controle negativo no início do procedimento de preparação. Não dispensar o Mix de amplificação com as mesmas pipetas utilizadas nas áreas de extração. Usar somente micropipetas com ponteiras estéreis e com filtros para aerossóis. Limpar as superfícies e instrumentos corretamente. Após o uso do Mix de amplificação, tampar e retornar ao freezer antes de abrir outros tubos com amostras. Posicionar a microplaca cuidadosamente. 6
7 Erro durante a escolha da placa ou do instrumento. Contaminação da área dedicada aos passos de amplificação. Checar a placa e a as configurações do instrumento. Checar o posicionamento das amostras e controles na placa. Limpar as superfícies e instrumentos corretamente. Usar jalecos. NOTA IMPORTANTE: Interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. Quando os resultados do laboratório são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve-se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Se um ou mais dos problemas descritos na tabela acima acontecer, depois da investigação, informe qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. CAUSA PROVÁVEL Possíveis erros de pipetagem dos controles positivos. Degradação do controle positivo. Amplificação incorreta do controle positivo AÇÃO CORRETIVA RECOMENDADA Pipetar cuidadosamente o controle positivo. Conferir a calibração das micropipetas utilizadas. Verificar a quantidade pipetada de acordo com o procedimento. Testar um novo lote de controle positivo. 16. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da instrução de uso. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação de fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador é essencial para resultados precisos e reprodutíveis. A determinação positiva em amostra do paciente tem implicações médicas, sociais, psicológicas e econômicas. É recomendado que a confidencialidade, aconselhamento apropriado e avaliação médica sejam considerados como aspectos essenciais na sequência dos testes. Erro na temperatura dos ciclos. Mix de amplificação mantido por muito tempo em temperatura ambiente. Conferir as configurações de temperatura dos ciclos. Deixar o Mix de amplificação no gelo durante o procedimento e guarde-o imediatamente no freezer -20 C após o uso 17. GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: GARANTIA O produto XGEN MASTER PAI-1 é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. 7
8 A garantia abrange defeitos de produção. EXCEÇÕES NA GARANTIA Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação. 18. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, 866 Pinhais PR - CEP: Telefone: (41) info@mobiuslife.com.br WEBSITE: CNPJ: / REGISTRO ANVISA REGISTRO EM ANDAMENTO 20. RESPONSÁVEL TÉCNICA Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D 8
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