Instruções de Uso XGEN MULTI GB Kit MULTIPLEX para Detecção de Bactérias Causadoras de Gastroenterite
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- Amália Ferreira Benke
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1 Instruções de Uso XGEN MULTI GB Kit MULTIPLEX para Detecção de Bactérias Causadoras de Gastroenterite 1. USO PRETENDIDO O Kit XGEN MULTI GB (XG-GB-MB) é um teste in vitro para a detecção qualitativa de ácido nucleico bacteriano em amostras de fezes como auxílio para a avaliação de infecções por Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Clostridium difficile, Escherichia coli verotoxigênica, Escherichia coli enteroinvasiva, Salmonella spp., Shigella spp., e Yersinia enterocolítica. O Kit foi otimizado para uso nos aparelhos de PCR em Tempo Real ABI SDS 7500 (Thermo Fisher Scientific Inc. ). PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO DE USO IN VITRO 2. INTRODUÇÃO Campylobacter é uma bactéria em forma de bastão, não formadoras de esporos, Gram-negativas, microaerofílica encontrada predominantemente em fezes de animais. As espécies patogênicas para o ser humano são classificadas como termofílicas e a infecção por estes microrganismos está associada à ingestão de alimentos contaminados. Dentre as espécies, a Campylobacter jejuni (Cjeju), Campylobacter coli (Ccoli) e Campylobacter lari (Clari) destacam-se se como agentes causadores de gastroenterites. Os sintomas clínicos mais comuns da campilobacteriose incluem diarreia (frequentemente com sangue nas fezes), dor abdominal, febre, dor de cabeça, náuseas e/ou vômitos. As crianças, idosos e pacientes imunocomprometidos têm a tendência de desenvolver a doenças com maior gravidade, podendo levar a óbito. Clostridium difficile (Cdiff) é um bacilo Gram-positivo formador de esporos. A bactéria pode ser adquirida através da ingestão dos esporos no ambiente ou geralmente transferidos de pessoas infectadas através das mãos. Estes esporos resistem à acidez do estômago e germinam de forma vegetativa no intestino delgado. A perturbação da flora intestinal normal, tipicamente por exposição a agentes microbianos, permite a proliferação de C. difficile, causando um largo espectro de manifestações clínicas que podem variar de portadores assintomáticos até diarreias de gravidade variável, colite fulminante e até mesmo a morte. Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, não esporulado, encontrado como componente da microbiota intestinal, e normalmente não patogênico. Entretanto, algumas linhagens são patogênicas, de acordo com o mecanismo de virulência. Entre elas estão as Escherichia coli verotoxigênica (VTEC) e a Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC). As VTEC são produtoras de verotoxina, que causam efeito citotóxico em células e está associada à diarreia hemorrágica, especialmente a diarreia dos viajantes. Os principais sintomas são cólicas abdominais e febre baixa. Ocasionalmente podem causar a síndrome hemolítica urêmica ou insuficiência renal, especialmente em crianças pequenas e idosos. Por vezes as infecções podem ser assintomáticas. A maioria das infecções foi relacionada à ingestão de carne contaminada mal cozida, ingestão de leite não pasteurizado, beber ou nadar em águas contaminadas e comer vegetais contaminados. As EIEC são altamente invasivas e utilizam proteínas adesinas para se ligar e entrar nas células intestinais. Não produzem toxinas, mas danificam gravemente a parede intestinal por meio da destruição mecânica das células, causando uma infecção idêntica a Shigelose, com diarreia profusa e febres altas. Salmonella (Salm) é um bacilo Gram-negativo não formador de esporos predominantemente móvel. O gênero é amplamente distribuído na natureza, sendo o trato intestinal do homem e dos animais o principal reservatório natural, sendo um dos principais agentes responsáveis por graves intoxicações alimentares. As doenças causadas por Salmonella podem ser divididas em três grupos: a febre tifoide, as febres entéricas, e a salmonelose. Em pacientes imunocomprometidos, recémnascidos e crianças as doenças podem ser bastante graves, podendo levar a óbito. Shigella (Shig) é um gênero Gram-negativo, não formador de esporos, e agente causador da shigelose. A Shigella induz o aparecimento da doença nos primatas, mas não em outros mamíferos. Durante a infecção pela bactéria, causa o sintoma 1
2 típico de disenteria, o que resulta na destruição das células epiteliais da mucosa intestinal do ceco e do reto. Normalmente a infecção ocorre via contaminação fecaloral. Algumas linhagens produzem a enterotoxina tipo Shiga (semelhante à verotoxina da E. coli), podendo causar a síndrome hemolítico-urêmica (SHU), a doença de Reiter e artrite reativa. Yersinia enterocolitica (Yent) é uma espécie de bactérias Gram-negativas em forma de bastonetes, não esporulada, pertencente à família Enterobacteriaceae. A infecção pela bactéria ocorre através do consumo de alimentos contaminados e causa a doença conhecida como yersiniose, que possui como manifestação clínica mais frequente a enterocolite. Porém, a infecção também tem sido associada com linfadenite mesentérica, ilite terminal, eritemas nodosos e artrite. 3. PRINCÍPIO DO TESTE O ácido nucleico bacteriano é amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) por primers específicos. A detecção do produto de PCR é realizada através de uma sonda molecular duplamente marcada específica para cada agente patogênico dentro da PCR MULTIPLEX. A presença de uma sequência específica do patógeno na reação é detectada por um aumento na fluorescência observada a partir da sonda correspondente duplamente marcada, e é relatado como o valor limiar de ciclo (Ct) pelo termociclador em Tempo Real. O ensaio utiliza o Cytomegalovirus de Murino (mcmv) como controle de extração - Controle Interno (CI), adicionado a cada amostra e ao controle negativo no estágio de tampão de lise do processo de extração. 4. COMPONENTES O formato padrão do contém reagentes para 64 testes. COMPONENTES CONTEÚDO QUANTIDADE EZ GB Solução de Enzima e dntps 2 x 64 µl TAMPÃO GB Mistura de Tampão 2 x 800 µl PS GB 1 PS GB 2 CP GB 1 CP GB 2 Mistura de Primers e Sondas Cjeju/Ccoli/Clari, VTEC e Controle Interno Mistura de Primers e Sondas para Cdiff, EIEC, Salm, Shig, Yent Controle Positivo Contendo Plasmídeos para a Detecção de Cjeju/Ccoli/Clari e VTEC Controle Positivo Contendo Plasmídeos para a Detecção de Cdiff, EIEC, Salm, Shig, Yent 2 x 48 µl 2 x 48 µl 2 x 150 µl 2 x 150 µl CI GB Controle Interno 2 x 128 µl CN 6 Controle Negativo 4 x µl * Cada frasco contém um volume adicional para imprecisão de pipetagem. 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE O Kit XGEN MULTI GB deve ser armazenado na embalagem original em temperatura controlada entre -25 C e -15 C e são estáveis até à data de vencimento indicada no rótulo. Após a utilização, os componentes devem ser armazenados em temperatura controlada entre -25 C e -15 C. Recomenda-se realizar no máximo oito ciclos de congelamento/descongelamento após o primeiro descongelamento dos reagentes. Caso sejam utilizados de forma intervalada, sugere-se que sejam realizadas alíquotas em tubos livres de RNAse e DNAse, de acordo com a necessidade. 2
3 6. MATERIAIS NECESSÁRIOS, MAS NÃO FORNECIDOS Micropipetas Calibradas (0,5 µl < volume < 200 µl); Microcentrífuga; Agitador tipo Vortex ou similar; Racks para Tubos; Ponteiras Estéreis com Filtro; Microtubos Livres de Nuclease; Microplacas de PCR e Filme Adesivo, recomendados pelo fabricante do equipamento de PCR em Tempo Real; Luvas Descartáveis Sem Talco; Termociclador* para PCR em Tempo Real. *ATENÇÃO: Uma calibração válida dos filtros (Pure Spectra Component File) e do background (Background Component File) deve ser feita rotineiramente. 7. AVISOS E PRECAUÇÕES 1. O kit deve ser utilizado somente por pessoal técnico qualificado e devidamente treinado. 2. O pessoal técnico deve ser profundamente treinado no uso dos termocicladores em Tempo Real, na manipulação de reagentes de biologia molecular e qualificados em protocolos de amplificação de PCR em Tempo Real. 3. Todo o pessoal envolvido na execução do teste deve utilizar equipamentos de proteção individual. O uso de objetos perfurocortantes deve ser evitado. Além disso, todos devem ser treinados em procedimentos de biossegurança, como recomendado pela legislação em vigor. 4. Os envolvidos no manuseio de amostras devem ser vacinados contra tétano, difteria, hepatite B e os estabelecidos no PCMSO, de acordo com a Norma Regulamentadora O ambiente do laboratório deve ser controlado, a fim de evitar contaminantes como poeira ou agentes microbianos transportados pelo ar. 6. Evitar vibração na superfície da bancada onde o teste é realizado. 7. Após o recebimento, armazenar o kit entre -25 C e -15 C, em um freezer ou câmara fria com temperatura controlada. 8. Não trocar os componentes entre diferentes lotes dos kits. Recomenda-se que os componentes entre dois kits do mesmo lote também não sejam trocados. 9. Verificar se os reagentes estão limpos e não contém partículas visíveis pesadas ou grumos. Caso contrário, comunicar o supervisor do laboratório para iniciar os procedimentos necessários para reposição do kit. 10. Evitar contaminação cruzada das amostras utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as após cada amostra. 11. Evitar contaminação cruzada entre os reagentes do kit utilizando ponteiras descartáveis e trocando-as entre o uso de cada uma. 12. Não utilizar o kit após a data de validade apresentada na etiqueta externa. 13. Tratar todas as amostras como potencialmente infectantes. Todas as amostras de soro humano, sangue, plasma devem ser manuseadas em Nível de Biossegurança 2, como recomendado pela legislação em vigor. 14. Armazenar e extrair as amostras separadamente de outros reagentes e utilizar sala dedicada para o manuseio. 15. Realizar os procedimentos o mais rápido possível, mantendo os componentes no gelo ou em reservatório refrigerado. 16. O fluxo de trabalho no laboratório deve proceder de maneira unidirecional, começando na área de extração e passando para a amplificação e área de análises de dados. Não retornar as amostras, equipamentos e reagentes para a área onde as primeiras etapas foram realizadas. 17. O uso de plásticos descartáveis é recomendado na preparação dos componentes líquidos ou na transferência dos componentes para sistemas automatizados, a fim de evitar contaminação cruzada. 18. Os resíduos gerados durante a utilização do kit devem ser descartados, de acordo com as diretrizes e regras de descarte de resíduos químicos e substâncias biológicas do laboratório, conforme legislação em vigor. 3
4 19. Os respingos provocados acidentalmente durante o manuseio das amostras devem ser absorvidos por lenços de papel umedecidos com hipoclorito, e em seguida, com água. 20. Outros resíduos gerados (exemplo: ponteiras usadas para amostras) devem ser manuseados como potencialmente infectantes e descartados, de acordo com as diretrizes e regras relativas a resíduos laboratoriais. 8. AMOSTRAS: PREPARAÇÕES E RECOMENDAÇÕES O ensaio deve ser utilizado com acido nucleico extraído de amostras de fezes de origem humana. 1. As amostras devem ser claramente identificadas em códigos ou nomes, a fim de evitar resultados com erros de interpretação. 2. É recomendado fazer a suspensão das amostras de fezes em tampão apropriado. 3. Para longos períodos de armazenamento recomenda-se que todas as amostras fiquem a -20 C até a extração. NOTA: Para utilização do kit com outras amostras deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 9. PREPARAÇÃO DOS COMPONENTES E AVISOS EZ GB Solução pronta para uso. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. TAMPÃO GB Solução pronta para uso. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. PS GB 1 e 2 Solução pronta para uso. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. CP GB 1 e 2 Solução pronta para uso para ser utilizado como amostra na etapa de amplificação. Não extrair o Controle Positivo, uma vez que a solução é constituída por plasmídeos e a reação será inibida. CN 6 Solução pronta para uso que deve ser utilizado no processo de extração. Antes de utilizar, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso) para concentrar o componente no fundo do tubo. CI GB Solução pronta para uso. Antes do uso, descongelar, homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Na extração, para volume de eluição de 55 µl, recomenda-se adicionar 2 µl do Controle Interno ao tampão de lise em cada extração. Nunca adicionar o Controle Interno diretamente à amostra, ao menos que esteja diluída no tampão de lise. Caso 4
5 seja utilizado volume de eluição diferente do descrito acima, adicionar o volume de Controle Interno proporcional. ELUIÇÃO CI 50 µl a 65 µl 2 µl 60 µl a 90 µl 3 µl > 100 µl 4 µl Para utilização do kit em outros equipamentos deverá ser realizada a validação para confirmar que os requisitos necessários para a finalidade pretendida são atendidos. 3. Kit de Extração Entrar em contato com o Suporte ao Cliente (info@mobiuslife.com.br) para verificar a compatibilidade do kit de extração utilizado antes de iniciar o procedimento. IMPORTANTE: Adicionar o Controle Interno a cada uma das amostras e ao Controle Negativo é uma etapa muito importante para confirmar o sucesso do procedimento de extração de ácido nucleico e para verificar possível inibição da PCR. 10. EQUIPAMENTOS E FERRAMENTAS USADOS EM COMBINAÇÃO COM O KIT 1. Micropipetas Devem estar calibradas para distribuir o volume correto necessário para o teste e devem ser submetidas a regulares descontaminações das partes que podem acidentalmente entrarem em contato com a amostra. Elas devem ser certificadas e devem estar com seus certificados válidos a fim de mostrar precisão de 1% e uma exatidão de +/- 5%. 2. Equipamento O Kit XGEN MULTI GB é direcionado para uso em combinação com os aparelhos de PCR em Tempo Real ABI SDS 7500 (Thermo Fisher Scientific Inc. ). Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. Os usuários finais devem seguir estritamente a instrução de uso fornecida pelo fabricante. 11. CONTROLE PRÉ-ENSAIO E OPERAÇÕES 1. Verificar a data de validade do kit impresso na etiqueta externa da caixa do kit. 2. Verificar se os componentes líquidos não estão contaminados por partículas visíveis a olho nu ou grumos. Observar se há ruptura na caixa de transporte e se não há derramamento de líquido dentro da caixa. 3. Ligar os termocicladores e verificar as configurações para garantir a utilização do protocolo de ensaio correto. 4. Seguir estritamente o manual de equipamentos fornecidos pelo fabricante para a correta configuração dos termocicladores em Tempo Real. 5. Verificar se as micropipetas estão configuradas para o volume necessário. 6. Verificar se todos os outros equipamentos estão prontos para uso. 7. Em caso de problemas, não continuar o teste e comunicar ao supervisor. 12. PROTOCOLO IMPORTANTE: Um exemplo de gabarito para dispensação dos reagentes é informado no Item 13. CONTROLES DE AMPLIFICAÇÃO É obrigatório validar cada sessão de amplificação com reações de Controle Negativo (CN) e Controle Positivo (CP). 5
6 Os Controles Positivos (CP) devem ser descongelados em temperatura ambiente por minutos e homogeneizados completamente antes de utilizar. PREPARAÇÃO DA MISTURA DE AMPLIFICAÇÃO Certificar-se de manter a EZ GB no freezer ou em bloco de refrigeração o tempo todo. # Reações Componente x 1 x 16 x 32 x 64 TAMPÃO GB 12,5 µl 200 µl 400 µl 800 µl PS GB 1,5 µl 24 µl 48 µl 96 µl EZ GB 1 µl 16 µl 32 µl 64 µl Volume Total 15 µl 240 µl 480 µl 960 µl MONTAGEM DA REAÇÃO 1. Dispensar 15 µl da mistura de amplificação (TAMPÃO GB + EZ GB + PS GB) em cada poço da microplaca. 2. Adicionar 10 µl de cada amostra extraída, do Controle Negativo extraído e do Controle Positivo. 3. Fechar a placa com filme adesivo óptico. 4. Homogeneizar a placa em vortex e centrifugar brevemente. 5. Colocar a placa no equipamento. 6. Após configurar as operações descritas no subitem PROGRAMAÇÂO DO EQUIPAMENTO, iniciar a corrida no termociclador. Programação da PCR PROGRAMAÇÃO DO EQUIPAMENTO A programação deve ser feita conforme descrito abaixo. Separar um microtubo de 1,5 ml (não fornecido) para preparar cada mistura de amplificação. Descongelar os reagentes para a reação: PS GB (1 e 2) e TAMPÃO GB. Homogeneizar em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Pipetar a quantidade requerida de TAMPÃO GB dentro do microtubo, de acordo com a relação da quantidade dos outros reagentes. Trocar as ponteiras após cada passo de pipetagem. Pipetar a quantidade requerida de PS GB e EZ GB dentro do miccrotubo. Homogeneizar a mistura de amplificação em agitador tipo vortex e centrifugar brevemente (pulso). Certifique-se de congelar os volumes restantes dos reagentes não utilizados logo após a utilização. Etapa Temperatura Tempo # Ciclos Hold 42 C 15 min. 1 Hold 94 C 3 min. 1 Ciclo PCR 94 C 8 seg. (*Coleta de Dados) 60 C (*) 34 seg. AVISO: Configurar o equipamento com a correta programação da PCR seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante. Seleção de Detectores Selecionar os detectores informados na tabela abaixo, conforme o manual de instrução do equipamento a ser utilizado. 40 6
7 NOTA IMPORTANTE: Detecção Corante Quencher Cdiff / VTEC FAM Não Fluorescente Shig / EIEC / CI ROX Não Fluorescente Cjeju / Ccoli / Clari / Salm CY5 Não Fluorescente Yent JOE/VIC Não Fluorescente Ao utilizar o equipamento ABI 7500 é necessário alterar a configuração para o corante de Referência Passiva. (Por padrão, o corante ROX é selecionado). Após a etapa de especificação dos detectores e atribuição para cada poço, clicar para concluir e o software irá criar o documento da placa. Clicar em um poço, ou clicar e arrastar para selecionar e replicar poços. Digitar o nome da amostra e alterar a Referência Passiva para None. Se utilizar o equipamento ABI 7500 Fast, NÃO utilizar o programa rápido. 13. GABARITO DE TESTE Exemplo de gabarito para posicionamento das amostras e controles para a análise com o kit A A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 B A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 C CP1 CP2 CN D E F G H LEGENDA: A1 A8 = Amostras; CP = Controle Positivo; CN = Controle Negativo. 14. CONTROLE DE QUALIDADE INTERNO Análise de Dados 1. Abrir o experimento. 2. No Experiment Menu ao lado esquerdo, clicar sobre o ícone Analysis e depois Amplification Plot. 3. No campo Graph Type escolher a opção Linear. A análise deverá ser realizada neste modo. 4. No campo Color escolher a opção Target. 5. No canto superior direito da tela escolher Analysis Settings. 6. Uma nova janela será aberta. Retirar para todos os alvos a marcação para análise automática de THRESHOLD e BASELINE, desmarcando o campo Use Default Settings. 7. Os parâmetros de THRESHOLD e BASELINE devem ser ajustados manualmente e os alvos devem ser analisados separadamente. IMPORTANTE: Os Controles Positivos e qualquer amostra positiva irá mostrar um traçado de fluorescência exponencial. Qualquer amostra exibindo um traço exponencial é considerada como positiva. As sondas possuem diferentes níveis de fluorescência, por isso as curvas para diferentes alvos apresentam aspectos diferentes. Validação do Ensaio Configurar o THRESHOLD, de acordo com as informações abaixo. 1. Todos os valores para Controles Negativos devem ser inferiores ao THRESHOLD. Se existir potencial contaminação (aparecimento de curva de amplificação no Controle Negativo ou conjunto de curvas em amostras com alto Ct, por exemplo, acima de 36), os resultados obtidos não são interpretáveis e toda a corrida (incluindo extração) deve ser repetida. 2. Todos os Controles Positivos deverão mostrar traço de amplificação positiva (ou seja, exponencial). O Controle Positivo deve apresentar Ct abaixo de 33. 7
8 3. Verificar o traço do "componente" antes de aceitar o traço exponencial como verdadeiro. 4. Todos os Controles Internos devem apresentar traço positivo (ou seja, exponencial) de amplificação. O Controle Interno deve apresentar Ct abaixo de 33. Se o Controle Interno apresentar Ct acima de 33, isso aponta para problema de purificação ou amostra fortemente positiva, causando a inibição do Controle Interno. 15. QUANTIFICAÇÃO Princípio da Análise O kit contém Controles Positivos que são adicionados não diluídos a cada corrida. Para a conveniência do cliente, não é necessário diluir estes reagentes, a fim de quantificar as amostras. O controle positivo indica que os primers e sondas para o gene alvo do patógeno desempenham corretamente a situação experimental. Se um resultado negativo é obtido, os resultados do teste são inválidos e devem ser repetidos. Para determinação de gene em cópias/ml, os dados são fornecidos a partir de séries de quantificação realizado no equipamento ABI Sequence Detection System 7500 em triplicata e executado em três dias diferentes. Determinou-se a dinâmica de amplificação da diluição em séries dos Controles Positivos com uma relação linear entre o número de cópias do gene em log10 e valores de Ct. A tabela abaixo fornece a fórmula que pode ser diretamente utilizada para quantificar os números de cópias para os agentes patogénicos detectados pelo Kit XGEN MULTI GB. Alvo Fórmula de Quantificação Valor do Ct na Amostra Cópias/mL do Gene na Amostra Cjeju / Ccoli / Clari x=e ((y - 45,255) / -1,463) 25 1,03E6 VTEC x=e ((y - 43,173) / -1,400) 20 1,54E7 Salm x=e ((y - 43,845) / -1,408) 30 1,86E4 Shig / EIEC x=e ((y 43,321) / -1,415) 31 6,05E3 Yent x=e ((y 44,014) / -1,429) 33 2,22E3 Cdiff x=e ((y 44,112) / -1,421) 18 9,56E7 LEGENDA: (X= Cópias/mL do Gene; Y= Valor do Ct na Amostra; Ct= Ciclo de Threshold). Configuração da Quantificação Extrair as amostras, de acordo com as recomendações do Tópico 8. Preparar a mistura de amplificação e executar o ensaio, conforme descrito no Tópico Certificar de homogeneizar os Controles Positivos em vortex por 5 segundos e centrifugar brevemente imediatamente antes de utilizar. Para quantificar os resultados, os valores de Ct das amostras encontrados no ensaio deverão ser inseridos nas funções descritas na Tabela 2. O resultado irá apresentar as cópias/ml do gene para o patógeno de interesse. Certificar-se de verificar primeiramente durante análise os valores de Controle Negativo e Controles Positivos. O Controle Interno deve apresentar Ct abaixo de 33, ou a quantificação do resultado para a amostra será inválida. Os valores de Ct encontrados para os Controles Positivos devem estar dentro da faixa indicada na tabela abaixo. Alvo Faixa Aceitável Cjeju / Ccoli / Clari 25,4 < Ct < 29,4 VTEC 24,8 < Ct < 30,8 Salm 25,2 < Ct < 29,2 Shig / EIEC 24,3 < Ct < 28,3 Yent 22,5 < Ct < 26,5 Cdiff 24,6 < Ct < 28,6 8
9 IMPORTANTE: Os Controles Positivos e qualquer amostra positiva irá mostrar um traçado de fluorescência exponencial. Qualquer amostra exibindo um traço exponencial é considerada como positiva. 16. SOLUÇÕES DE PROBLEMAS CONTROLE POSITIVO SEM SINAL DE AMPLIFICAÇÃO Configuração incorreta da temperatura na programação da PCR no equipamento. Comparar se a configuração está de acordo com a instrução de uso. Configuração incorreta da reação de PCR. Verificar as etapas de trabalho por meio do esquema de pipetagem e repetir o procedimento, se necessário. Checar a calibração das micropipetas. Manuseio incorreto dos controles positivos. Homogeneização inadequada. Condições de armazenamento para um ou mais componentes do kit não estão de acordo com a instrução de uso ou a data de validade do kit expirou. Checar as condições de armazenamento e a data de validade (verificar na etiqueta do produto) dos reagentes e repetir o procedimento, se necessário. CONTROLE INTERNO COM SINAL FRACO OU SEM SINAL DE AMPLIFICAÇÃO As condições da PCR não cumprem o protocolo. Verificar as condições da PCR e repetir o procedimento de acordo com a instrução de uso, se necessário. A PCR foi inibida, não houve adição ou o volume de Controle Interno adicionado na etapa de extração não foi suficiente. Verificar se o método de extração utilizado é compatível com o kit. Sinal positivo muito forte de um alvo pode, por vezes, inibir a fluorescência do Controle Interno. CONTROLE NEGATIVO COM SINAL DE AMPLIFICAÇÃO Contaminação durante a extração ou durante a preparação da PCR. Repetir a PCR com novos reagentes em replicatas. É recomendado realizar a pipetagem do Controle Positivo após todos os outros reagentes. Certificar-se de que o local de trabalho e os instrumentos são descontaminados em intervalos regulares. NOTA IMPORTANTE: A interpretação dos resultados deve ser feita sob a supervisão do responsável do laboratório para reduzir o risco de erros e resultados mal interpretados. Quando os resultados são transmitidos do laboratório para o centro de informática, deve se prestar muita atenção para evitar erro na transferência de dados. Se um ou mais dos problemas descritos acima acontecer, depois de verifica-los, informe qualquer problema residual ao supervisor para futuras ações. 17. LIMITAÇÕES Para o usuário deste kit recomenda-se a leitura cuidadosa e a compreensão da Instrução de Uso. A adesão estrita ao protocolo é necessária para a obtenção de resultados confiáveis. Em particular, a veracidade da amostra, a pipetagem de reagentes, a aplicação de fluxo de trabalho correto, juntamente com a etapa da programação cuidadosa do termociclador é essencial para detecções precisas e reprodutíveis. A determinação de um ou mais patógenos em uma amostra do paciente tem implicações médicas, sociais, psicológicas e econômicas. Os resultados obtidos com o Kit XGEN MULTI GB devem ser interpretados pelos responsáveis do laboratório levando em consideração os sintomas clínicos dos pacientes e outros parâmetros de laboratório relacionados às condições do paciente. 9
10 É recomendado que a confidencialidade, aconselhamento apropriado e avaliação médica sejam considerados como aspectos essenciais na sequência dos testes. 20. REGISTRO ANVISA GARANTIA DA QUALIDADE A Mobius Life Science fornece garantia de todos os produtos por ela revendidos dentro dos seguintes termos: GARANTIA O produto Kit XGEN MULTI GB é garantido pela Mobius contra defeitos de produção pelo período de validade do produto, salvo especificações em contrário a constar da proposta. A garantia abrange defeitos de produção. EXCEÇÕES NA GARANTIA Todos os produtos com defeitos oriundos de mau uso, imperícia, conservação ou armazenagem inadequada. EXTINÇÃO DA GARANTIA Quando não for utilizado de acordo com sua finalidade de aplicação 21. RESPONSÁVEL TÉCNICO Flávia Rosenstein Schiel CRBio /07-D 19. INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Mobius Life Science Comércio de Produto para Laboratórios Ltda. Rua Paraíso do Norte, Pinhais - PR - CEP: Telefone: (41) info@mobiuslife.com.br WEBSITE: CNPJ: /
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