RT - kit plus síntese de cdna com random primer

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1 ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Escritórios: Tel Fax E. mail: Sitio WEB: C PRINCÍPIO DO TESTE O procedimento prevê a execução com um termóstato programável (thermal cycler) de uma reacção de transcrição reversa que utiliza oligonucleotídeos hexâmeros de sequência casual (random primer) como primers de iniciação de polimerização e a DNA polimerase dependente de RNA do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV). A reacção de transcrição reversa produz cdna de todas as diferentes moléculas de RNA presentes no RNA extraído das amostras em exame. O inibidor RNase STOP na mistura de reacção permite evitar a degradação do RNA extraído causada por RNases eventualmente presentes. DESCRIÇÃO DO KIT O produto fornece os seguintes componentes: - as misturas de reacção RT - MIX para a transcrição reversa, já pré-aliquotadas em 50 tubos «monotest» prontos para o uso. Cada tubo contém 10 µl de solução. - a enzima transcriptase reversa MMLV-RT, aliquotada em um tubo com 70 µl. - o inibidor das RNases RNase STOP, aliquotado em um tubo com 35 µl. - a Água Ultrapura, para biologia molecular, aliquotada em dois tubos com 1900 µl cada. O kit permite efectuar 50 reacções de transcrição reversa, controlos positivos e negativos incluídos. MATERIAL INCLUÍDO NO KIT ÍNDICE USO PREVISTO pág. 1 PRINCÍPIO DO TESTE pág. 2 DESCRIÇÃO DO KIT pág. 2 MATERIAL INCLUÍDO NO KIT pág. 2 MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT pág. 2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO pág. 3 AMOSTRAS E CONTROLOS pág. 3 PROCEDIMENTO pág. 5 ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES pág. 5 LIMITES DO PROCEDIMENTO pág. 7 CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE pág. 8 BIBLIOGRAFIA pág. 9 PROBLEMAS E SOLUÇÕES pág. 10 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS pág. 11 Componente Descrição Quantidade Composição Etiquetagem RT - MIX MMLV-RT 200 U / µl U RNAse STOP 40 U / µl U Mistura de retrotranscrição em tubos de 0,2 ou 0,5 ml U de transcriptase reversa em tubos com inserto AZUL U de inibidor das RNAse em tubos com inserto AMARELO 50 x 10 µl 1 x 70 µl 1 x 35 µl oligonucleotídeos hexâmeros, TRIS base, TRIS cloridrato, Cloreto de potássio, Cloreto de magnésio, Desoxirribonucleotídeos trifosfatos, Ditiotreitol, Triton X-100, Albumina Sérica Bovina acetilada enzima MMLV-RT, TRIS base, TRIS cloridrato, Cloreto de sódio, Ditiotreitol, Sódio EDTA, NP-40, Glicerol inibidor RNase STOP, TRIS base, TRIS cloridrato, Cloreto de potássio, Ditiotreitol, Sódio EDTA, Glicerol Água Ultra pura Água para biologia molecular 2 x 1900 µl USO PREVISTO O produto é um sistema de transcrição reversa para a síntese de cdna a partir do RNA extraído de amostras celulares e não celulares. O produto é utilizado na síntese de cdna para a pesquisa e a dosagem de vírus humanos com genoma de RNA e para a pesquisa e a dosagem de RNAs mensageiros humanos. Os cdnas sintetizados com este produto podem ser utilizados para testes diagnósticos baseados em reacções de amplificação dos ácidos nucléicos com enzimas DNA polimerases (por exemplo, DNA polimerases termoestáveis). MATERIAL NECESSÁRIO NÃO INCLUÍDO NO KIT - Câmara de fluxo laminar. - Luvas descartáveis em látex ou similares. - Microcentrífuga de mesa ( RPM). - Micropipetas e pontas estéreis com filtro para aerosol ou a deslocamento positivo (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl). - Termóstato programável (thermal - cycler). SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 1/11 SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 2/11

2 OUTROS PRODUTOS REQUERIDO Os reagentes para a extracção do RNA das amostras a analisar, para o controlo positivo de extracção, para a amplificação do cdna e para a detecção do DNA amplificado não estão incluídos neste kit. Para realizar esta fase analítica aconselha-se a utilização dos seguintes produtos acessórios produzidos por ELITechGroup S.p.A.: «EXTRAgen» (código EXTG01), kit de extracção dos ácidos nucléicos das amostras não celulares; o kit permite efectuar 50 extracções; «EXTRAzol» (código EXTR01), kit de extracção do RNA das amostras celulares; o kit permite efectuar 50 extracções; «RECK» (código RK100), controlo interno de idoneidade que utiliza o «CPE-RNA» como branco; o produto permite realizar 100 reacções; «CPE-RNA - Internal Control» (código CTRRNA ou incluído na RECK», código RK100), controlo positivo de extracção de RNA genómico de fago MS2 para sistemas de extracção do RNA de amostras não celulares. O produto permite efectuar 50 extracções ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Este kit é reservado para uso exclusivo in vitro. Advertências e precauções gerais Manipular e eliminar todas as amostras biológicas como se podem transmitir agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com as amostras biológicas. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. O material que está em contacto com as amostras biológicas deve ser tratado com Hipoclorito de sódio a 3% pelo menos por 30 minutos ou ainda tratado em autoclave a 121º C durante uma hora antes de ser eliminado. Manipular e eliminar todos os reagentes e todos os materiais usados para efectuar o teste como se fossem agentes infecciosos. Evitar o contacto directo com os reagentes. Evitar a produção de salpicos ou aerosol. Os resíduos devem ser tratados e eliminados segundo as regras adequadas de segurança. O material descartável combustível deve ser incinerado. Os resíduos líquidos que contém ácidos ou bases devem ser neutralizados antes da eliminação. Usar roupas de protecção, luvas adequadas e proteger os olhos ou o rosto. Não pipetar nenhuma solução com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos na área de trabalho. Lavar bem as mãos depois de haver manipulado as amostras e os reagentes. Eliminar os reagentes sobrantes e os resíduos segundo as normas vigentes. Ler todas as instruções fornecidas no kit antes de realizar o teste. Respeitar às instruções fornecidas no kit durante a execução do teste. Respeitar a data de validade do kit. Utilizar somente os reagentes presentes no kit e aqueles aconselhados pelo fabricante. Não intercambiar reagentes procedentes de diferentes lotes. Não utilizar reagentes procedentes de kits de outros fabricantes. Advertências e precauções para a biologia molecular Os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucléicos, requerem pessoal instruído para evitar o risco de resultados incorrectos, em particular por causa da degradação dos ácidos nucléicos das amostras ou da contaminação das amostras por parte de produtos de amplificação. É necessário dispor de uma área separada para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca introduzir um produto de amplificação na área de extracção / preparação das reacções de amplificação. É necessário dispor de batas, luvas e instrumentos destinados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação. Nunca transferir batas, luvas e instrumentos da área de amplificação / detecção dos produtos de amplificação à área de extracção / preparação das reacções de amplificação. As amostras devem ser destinadas exclusivamente a este tipo de análise. As amostras devem ser manipuladas debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os tubos que contenham amostras diferentes nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. As pipetas utilizadas para manipular as amostras devem ser destinadas exclusivamente a este uso. As pipetas devem ser do tipo deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os reagentes devem ser manipulados debaixo de uma câmara de fluxo laminar. Os reagentes necessários para a amplificação devem ser preparados de modo a serem utilizados em uma única sessão. As pipetas utilizadas para manipular os reagentes devem ser destinadas exclusivamente para este uso. As pipetas devem ser do tipo de deslocamento positivo ou usar pontas com filtro para aerosol. As pontas utilizadas devem ser estéreis, sem a presença de DNAse e RNAse, sem a presença de DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manipulados de modo a limitar ao máximo a dispersão no ambiente para evitar a possibilidade de contaminações. As pipetas utilizadas para manipular os produtos de amplificação devem ser destinadas exclusivamente para este uso. Advertências e precauções específicas para os componentes As RT-MIX para a transcrição reversa são descartáveis e portanto devem ser utilizadas uma única vez em reacções de transcrição reversa. (S): As RT-MIX não apresenta frases de risco (R) e apresenta os seguintes conselhos de prudência (S): S Não respirar gases/fumos/vapores/aerosol. Evitar o contacto com os olhos. As MMLV-R não apresenta frases de risco (R) e apresenta os seguintes conselhos de prudência (S): S Não respirar gases/fumos/vapores/aerosol. Evitar o contacto com os olhos. As RNAse STOP não apresenta frases de risco (R) e apresenta os seguintes conselhos de prudência S Não respirar gases/fumos/vapores/aerosol. Evitar o contacto com os olhos. SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 3/11 SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 4/11

3 Amostras AMOSTRAS E CONTROLOS Este produto deve ser utilizado com RNA extraído de amostras biológicas celulares e não celulares: O volume de RNA extraído a ser adicionado à reacção de transcrição reversa é de 10 µl. Quando se pretende extrair uma amostra de volume inferior a 10 µl, complete a amostra até 10 µl com a adição de Água ultrapura. A quantidade de RNA extraído adicionada à reacção de transcrição reversa não deve ultrapassar 1 µg, de modo a evitar o aparecimento de produtos inespecíficos e possíveis fenómenos de inibição na sucessiva reacção de amplificação dos ácidos nucleicos. Quando se pretende congelar os RNAs extraídos, recomenda-se preparar mais alíquotas das amostras, de modo a não submetê-las a ciclos de congelamento / descongelamento repetidos. Quando se utilizam RNAs extraídos congelados, descongele as amostras imediatamente antes do início da extracção para evitar eventuais fenómenos de degradação dos ácidos nucléicos. Substâncias interferentes O RNA extraído da amostra não deve conter heparina, hemoglobina, dextrano ou Ficoll para evitar fenómenos de inibição e a aparição de frequentes resultados inválidos. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte de medicamentos antibióticos, antivirais, quimioterápicos ou imunossupressores. Controlos de transcrição reversa É absolutamente necessário confirmar cada sessão de transcrição reversa preparando uma reacção para o controlo negativo e uma reacção para o controlo positivo. Para o controlo negativo, utilize água bidestilada estéril (não incluída no kit) para acrescentar à reacção no lugar do RNA extraído da amostra, ou o controlo negativo de extracção. Para o controlo positivo, utilize o RNA extraído de uma amostra positiva já testada. Programação do ciclo térmico PROCEDIMENTO Antes de iniciar a sessão é necessário: - verificar que o bloqueio térmico do termóstato programável (thermal - cycler) seja compatível com o formato dos tubos «monotest» incluídos no kit (tubos de 0,2 ou 0,5 ml); - programar no thermal - cycler os parâmetros apropriados para o ciclo térmico como descrito na tabela seguinte. Ciclo térmico da transcrição reversa Número de ciclos Temperaturas Tempos Hibridação dos primer 25 C 10 min. Transcrição reversa 37 C 45 min. Desnaturação final 95 C 5 min. Preparação da transcrição reversa Antes de iniciar a sessão é necessário: - descongelar as amostras a serem analisadas e o controlo positivo, centrifugá-los por 5 segundos para levar ao fundo o conteúdo e mantê-los em gelo; - retirar e descongelar os tubos «monotest» de RT - MIX necessários para a sessão. Agitar delicadamente os tubos, centrifugá-los por 5 segundos para reconduzir o conteúdo ao fundo, relatam de uma forma reconhecível com um marcador permanente e mantê-los em gelo; - retire o tubo da enzima transcriptase reversa MMLV-RT 200 U / µl (tampa com inserto AZUL ESCURO) e o tubo do inibidor das RNAses RNase STOP 40 U / µl (tampa com inserto AMARELO), centrifugue-os por 5 segundos para levar ao fundo o conteúdo e mantenha-os em gelo. Nota: A transcriptase reversa MMLV-RT e o inibidor das RNase RNase STOP são muito sensíveis ao calor. Para evitar a perda de actividades desses reagentes, aconselha-se mantê-los fora do congelador apenas pelo tempo necessário para preparar as diluições. - diluir conjuntamente como descrito na tabela seguinte a transcriptase reversa MMLV-RT (40 U / µl) e o inibidor das RNase RNase STOP (4 U / µl) com Água Ultra pura. Preparar um volume de enzimas suficientemente diluídas para todas as reacções previstas (controlos incluídos) mais uma, para uma margem de segurança. As enzimas diluídas não podem ser conservadas. Nota: A transcriptase reversa MMLV-RT e o inibidor das RNase RNase STOP diluídos são muito sensíveis ao calor. Para evitar a perda de actividades desses reagentes, aconselha-se mantê-los fora do gelo apenas pelo tempo necessário para o deslocamento. Número de reacções MMLV-RT RNAse STOP Água Ultra pura Volume total 4 4 µl 2,0 µl 14,0 µl 20 µl 5 5 µl 2,5 µl 17,5 µl 25 µl 6 6 µl 3,0 µl 21,0 µl 30 µl 7 7 µl 3,5 µl 24,5 µl 35 µl 8 8 µl 4,0 µl 28,0 µl 40 µl 9 9 µl 4,5 µl 31,5 µl 45 µl µl 5,0 µl 35,0 µl 50 µl µl 5,5 µl 38,5 µl 55 µl µl 6,0 µl 42,0 µl 60 µl µl 6,5 µl 45,5 µl 65 µl µl 7,0 µl 49,0 µl 70 µl µl 7,5 µl 52,5 µl 75 µl µl 8,0 µl 56,0 µl 80 µl µl 8,5 µl 59,5 µl 85 µl µl 9,0 µl 63,0 µl 90 µl µl 9,5µL 66,5 µl 95 µl µl 10,0 µl 70,0 µl 100 µl µl 10,5 µl 73,5 µl 105 µl 1. Adicionar a cada tubo «monotest» 5 µl de MMLV-RT e RNase STOP diluídos (em total 200 U de MMLV-RT e 20 U RNase STOP). 2. Adicionar a cada tubo «monotest» 10 µl de RNA extraído e misturar bem RT-MIX, enzimas diluídas e amostra pipetando por três vezes o volume de 10 µl. Proceder do mesmo modo com o controlo negativo e com o controlo positivo. 3. Transferir os tubos «monotest» no thermal cycler e iniciar o ciclo térmico da transcrição reversa. Produtos utilizados após a transcrição reversa série «AMPLIFICAÇÃO NESTED» série «AMPLIFICAZIONE REAL TIME» série «AMPLIFICAÇÃO REAL TIME DUPLEX» série «REAL TIME PCR DUPLEX MONOREAGENTE» Modo de uso do produto de reacção utilize directamente o produto de reacção. Nota: O produto de reacção pode ser conservado a -20 ºC por no máximo um mês. adicione ao produto de reacção 40 µl de Água ultrapura de modo que chegue a cerca de 65 µl finais. Nota: O produto de reacção pode contaminar os testes seguintes. Isole ou elimine de modo apropriado o produto de reacção residual e os descartes produzidos nas manipulações posteriores. SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 5/11 SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 6/11

4 LIMITES DO PROCEDIMENTO CARACTERÍSTICAS DA PERFORMANCE Este produto deve ser utilizado com RNA extraído de amostras biológicas celulares e não celulares. Não utilize com este produto o RNA extraído de amostras heparinizadas: a heparina inibe a reacção de amplificação dos ácidos nucleicos e causa resultados inválidos. Não utilize com este produto o RNA extraído contaminado com hemoglobina, dextrano ou Ficoll : estas substâncias inibem a reacção de amplificação dos ácidos nucleicos e podem causar resultados inválidos. Não estão disponíveis dados pertinentes a eventuais fenómenos de inibição por parte de medicamentos antibióticos, antivirais, quimioterápicos ou imunossupressores. Os resultados obtidos com este produto dependem da correcta recolha, transporte, conservação e preparação das amostras; para evitar resultados incorrectos, é necessário, portanto, ter particular atenção durante estas fases e seguir atentamente as instruções fornecidas com os produtos para a extracção dos ácidos nucleicos. Este produto requer pessoal instruído para a manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer roupas de trabalho e áreas de trabalho adequadas à manipulação de amostras biológicas que podem transmitir agentes infecciosos e de preparações químicas classificadas como perigosas para evitar incidentes com consequências potencialmente graves para o utilizador ou outras pessoas. Este produto requer pessoal instruído para os procedimentos de biologia molecular, como a extracção, a transcrição reversa, a amplificação e a detecção de ácidos nucleicos, para evitar resultados incorrectos nas fases seguintes das análises realizadas com os ácidos nucleicos, com consequências potencialmente graves para o paciente. Este produto requer áreas separadas para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos nas fases seguintes das análises realizadas com os ácidos nucleicos, com consequências potencialmente graves para o paciente. Este produto requer roupas de trabalho e equipamentos dedicados para a extracção / preparação das reacções de amplificação e para a amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falsos positivos nas fases seguintes das análises realizadas com os ácidos nucléicos, com consequências potencialmente graves para o paciente. Eficiência de transcrição reversa: teste com RNA de fago MS2 A eficiência de transcrição reversa deste produto permite obter uma quantidade de cdna igual em média a 50% do RNA extraído adicionado à reacção de transcrição reversa. A eficiência de transcrição reversa foi testada utilizando como material de referência uma preparação de RNA genómico purificado do fago MS2 cuja concentração inicial foi estabelecida com o espectrofotómetro. O RNA do fago MS2 foi diluído a um título de 100 e 10 cópias por 10 µl em RNA total de levedura a uma concentração de 1 µg por 10 µl. Cada diluição foi utilizada em 10 réplicas para realizar a transcrição reversa e 5 µl do cdna produzido foram utilizados em amplificação real time com os produtos ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. Os resultados obtidos são coerentes com uma eficiência de transcrição reversa igual a pelo menos 50% e estão resumidos na tabela a seguir. Cópias de RNA de fago MS2 presentes na reacção de transcrição reversa Cópias esperadas (eficiência de 50%) de cdna de fago MS2 na reacção de amplificação real time Resultado obtido positivos / replicados / /10 As amostras de cdna obtidas a partir de 10 cópias de RNA de fago MS2 na reacção de transcrição reversa apresentam um título inferior ao limite de revelação do sistema de amplificação real time que produz resultados positivos de modo casual. A eficiência de transcrição reversa foi testada utilizando como material de referência uma preparação de RNA genómico purificado do fago MS2 cuja concentração inicial foi estabelecida com o espectrofotómetro. Uma quantidade de cópias de RNA de fago MS2 foi adicionada a 6 amostras de 300 µl de plasma recolhido em EDTA. Cada amostra foi utilizada para realizar a extracção, a transcrição reversa e a amplificação real time com os produtos ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. O teste foi repetido com três diferentes lotes deste produto. Os resultados obtidos são coerentes com uma eficiência de transcrição reversa igual a em média 50% e estão resumidos na tabela a seguir. Cópias de RNA de fago MS2 esperadas na reacção de transcrição reversa Cópias de cdna de fago MS2 esperadas (eficiência de 50%) na reacção de amplificação real time Quantidade média de cdna de fago MS2 obtida na reacção de amplificação real time Eficiência de transcrição reversa: teste com RNA total positivo para Philadelphia P210 A eficiência de transcrição reversa foi testada utilizando-se como material de referência uma diluição de 1: de RNA total positivo para a translocação t(9:22) Philadelphia P210 (de células K562) em RNA total normal. A amostra foi empregada em 6 repetições para realizar o completo procedimento de análise, transcrição reversa e amplificação real time, com os produtos ELITechGroup S.p.A.e os acessórios. Os resultados finais são mostrados na tabela seguinte. Amostra RNA positivo P210 (1:10.000) Positivas / Repet. Amplificação P210 Média da quantidade Amplificação ABL Média da quantidade Relação % P210 / ABL 6 / ,027% Todas as repetições foram identificadas correctamente. Os resultados quantitativos são expressos como valor da quantidade de cdna de P210 e de cdna de ABL na reacção como relação em porcentagem. Este resultado demonstra a elevada eficiência de transcrição reversa do produto. SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 7/11 SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 8/11

5 Eficiência de transcrição reversa: teste com material de referência certificado A eficiência de transcrição reversa foi testada utilizando-se como material de referência certificado um painel de diluição de Enterovírus (Coxackievirus A9) em três concentrações diferentes (Qnostics EV Mini Panel, Qnostics Ltd, Escócia, Reino Unido). Cada amostra do painel foi reconstituída de modo a obter um título 1,5 vez inferior àquele previsto pelo fabricante e aproximar-se da concentração-limite. Cada amostra do painel foi empregada em 3 repetições para realizar o completo procedimento de análise, extracção, transcrição reversa e amplificação real time, com os produtos ELITechGroup S.p.A. e os acessórios. Os resultados finais são mostrados na tabela seguinte. Amostra Título viral Intervalo esperado de Ct Positivas / Repet. Média de Ct obtidos ENT06D Alto / 3 30 ENT06C Médio / 3 33 ENT06B Baixo / 3 39 Todas as amostras foram identificadas correctamente. Os resultados quantitativos, expressos como valor de Ct (Cycle threshold) se enquadram no intervalo declarado pela Qnostics, apesar da diluição das amostras 1,5 vez maior. Este resultado demonstra a elevada eficiência de transcrição reversa do produto. Nota: Os dados e resultados completos das provas realizadas para a avaliação das características da performance do produto com as matrizes e os instrumentos estão registrados na Sessão 7 do Fascículo Técnico do Produto "", FTP BRK200. BIBLIOGRAFIA J. A. Garson et al. (1990) Lancet 336: PROBLEMAS E SOLUÇÕES Falsos positivos com o produto de transcrição reversa Possíveis causas Erro durante o deslocamento do RNA. Contaminação dos reagentes preparados para a sessão. Contaminação da água ultra pura para a diluição das enzimas. Contaminação dos estoques de enzimas. Contaminação da área para a extracção / preparação da reacção de amplificação. Falsos negativos com o produto de transcrição reversa Possíveis causas Enzimas demasiadamente diluídas ou erro durante o deslocamento das enzimas. Perda de actividades das enzimas. Soluções Abrir um tubo por vez, evitar derramar o conteúdo do tubo, trocar sempre as pontas. Seguir com atenção a diluição e o deslocamento das enzimas, trocar sempre a ponta. Utilizar uma nova alíquota de água ultra pura. Utilizar novas alíquotas de enzimas. Limpar as superfícies e equipamentos com detergentes aquoso, lavar as batas, substituir tubos e pontas em uso. Soluções Repetir o controlo dos cálculos de diluição, seguir com atenção o deslocamento da enzima e misturar adequadamente. Manter o tubo em gelo com a diluição das enzimas, utilizar novas alíquotas de enzimas. Erro durante o deslocamento do RNA extraído. Seguir com atenção o deslocamento do RNA extraído. Degradação do ácido nucléico extraído. Extraído depois de diluído. Erro de programação do ciclo térmico. Utilizar plástico livre de DNAse e RNAse, mudar a alíquota em uso de etanol absoluto, do reagente de lavagem, de água ultra pura. Extrair uma nova alíquota de amostra e dissolver o depósito de ácidos nucléicos em um volume menor de água ultra pura. Verificar o ciclo térmico programado no thermal cycler. Erro durante o deslocamento do produto de transcrição reversa. Produtos não específicos nas reacções de amplificação dos cdna Possíveis causas Excesso de RNA extraído na reacção. Excesso de cdna ou reagentes de transcrição reversa na reacção de amplificação. Retirar e distribuir com atenção o produto de transcrição reversa na reacção de amplificação. Soluções Estimar a concentração do RNA extraído, não superar uma concentração de 40 ng / µl (1 µg de RNA em total) na reacção de transcrição reversa. Não exceder com a quantidade de produto da reacção de transcrição reversa que é transferida na reacção de amplificação. SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 9/11 SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 10/11

6 SIGNIFICADO DOS SÍMBOLOS Número do catálogo. Limite superior de temperatura. Código do lote. Para utilizar antes do (último dia do mês). Dispositivo médico diagnóstico in vitro. Conforme os requisitos da Directiva Europeia 98\79\CE relativo aos dispositivos médicos diagnósticos in vitro. Conteúdo suficiente para "N" teste. Atenção, consultar as instruções de uso. Fabricante. SCH mbrk200_pt 28/05/13 Revisão 03 Pág. 11/11