EXTR01. EXTRAzol - Kit Extração RNA de amostras celulares e não celulares. Instruções de Uso

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1 EXTR01 EXTRAzol - Kit Extração RNA de amostras celulares e não celulares USO PRETENDIDO Instruções de Uso O produto <<EXTRAZOL>> é um sistema de extração de RNA contido em células a partículas virais livres contidas em amostras celulares e não celulares, como o sangue total (periférico e de medula óssea) coletado em EDTA ou citrato, buffy coat coletado em EDTA ou citrato, suspensões de monócitos, suspensões de granulócitos, gargarejo, swabs faríngeos diluídos, swabs nasais diluídos, lavado broncoalveolar fluidificado, aspirado broncoalveolar fluidificado, saliva fluidificada, escarro fluidificado, plasma coletado em EDTA, soro, fluido cefalorraquidiano, liquido amniótico, sobrenadante fecal, e sobrenadante de culturas. O produto tem como intenção de uso a extração de RNA de amostras celulares e não celulares. A extração de RNA deve ser usada para diagnósticos através de testes de amplificação de ácidos nucleicos com a DNA polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA polimerase termoestável). PRICÍPIOS DO MÉTODO O produto <<EXTRAZOL>> é um kit para extração de RNA baseado em lise por Guanidina. O procedimento envolve 4 fases: - Lise das amostras (aproximadamente 15 minutos) em um reagente de extração com um agente caotrópico (tiocianato de guanidina), e um detergente (sarcosinato de laurel sódio) e um agente redutor (2- mercaptoetanol); - solução de proteínas e DNA em uma fase orgânica de fenol / clorofórmio, separação realizada com centrifugação e remoção da fase orgânica; - Precipitação do RNA com etanol e coprecipitante inerte (poliacrilamida linear) e recuperação por centrifugação (aproximadamente 15 minutos); - Lavagem do pellet de RNA e diluição do mesmo em água ultrapura (aproximadamente 30 minutos). MATERIAIS FORNECIDOS O kit contém os seguintes componentes: - Reagente de extração <<EXTRAZOL>>, um frasco contendo 25 ml de solução a ser reconstituída adicionando-se um tampão acetato e fenol: o reagente reconstituído é suficiente para 50 extrações. 1

2 - Buffer Acetato, frasco contendo 2,6 ml, deve ser adicionado ao reagente de extração. - Fenol, um frasco contendo 25 ml, deve ser adicionado ao reagente de extração, - Microtubos de precipitação, 50 microtubos vazios de 1,5 ml para Biologia molecular para serem usados na precipitação de RNA. Microtubos são descartáveis. - Reagente de lavagem, um frasco contendo 15 ml de uma solução a ser reconstituída adicionando 45 ml de etanol absoluto, a reconstituição do reagente é suficiente para 50 extrações. - Água ultrapura, para uso em biologia molecular, aliquotados em 2 tubos, cada um contendo 1,9 ml. O kit permite 50 extrações incluindo controles positivo e negativo. COMPONENTE DESCRIÇÃO QUANTIDADE COMPOSIÇÃO Reagente Extrazol Tampão acetato Fenol Microtubos de precipitação Reagente de lavagem Água ultrapura Reagente de extração - deve ser reconstituído com tampão acetato e fenol 25 ml Tiocionato de Guanidina, Sarcosinato laurel de Sódio, 2 mercaptoetanol, Citrato de sódio, ácido clorídrico, Poliacrilamida Linear Acetato de sódio e ácido Acético Tampão acetato ph 4.0 2,6 ml Fenol saturado com água 25 ml Fenol Microtubos de 1,5mL, vazios para uso em Biologia 50 _ Molecular Reagente de lavagem, deve ser reconstituído em 45mL de etanol absoluto Água para Biologia Molecular Armazenar entre 2 e 8 C. MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS 15 ml _ 2 X 1,9 ml _ -Clorofórmio (extrapuro específico para analise, ACS equivalente) -Etanol absoluto (extrapuro específico para analise, ACS equivalente) -Câmara de fluxo laminar -Luvas descartáveis livre de talco ou similar, -Microtubos esterilizados de 1,5 ml 2

3 -Tubos tipo FALCON de 50 ml -Agitador tipo vórtex -Microcentrífuga de mesa (12000 a RPM) -Micropipetas e ponteiras com filtros ou de dispensação positiva (2-20 µl, 5-50 µl, µl, µl). - Gelo para incubação a 0 C PRODUTOS ACESSÓRIOS O reagente para extração de controle positivo não está incluso no kit. Para o desempenho analítico deste procedimento, os seguintes produtos da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. são recomendados: <<CPE-RNA - controle interno>> (código CTRRNA ou incluso em RECK>> código RK100) fago controle positivo de RNA sistema de extração de amostras não celulares, o produto permite 50 extrações. CUIDADOS E PRECAUÇÕES Este kit é para uso exclusivo in vitro. Cuidados e precauções especiais Manusear e descartar toda amostra biológica como se esta fosse capaz de transmitir agentes infecciosos. Evitar contato direto com a amostra biológica. Evitar respingos e aerossóis. O material que entrar em contato com as amostras biológicas deve ser tratado com hipoclorito de sódio 3% ou autoclavado a 121 C por uma hora e despois descarta-lo. Manusear todo reagente e todo material usado no ensaio como se o mesmo fosse capaz de transmitir agentes infecciosos. Evitar contato direto com os reagentes. Evitar respingos e aerossóis. O lixo deve ser tratado e descartado em concordância com os padrões apropriados de segurança. Materiais descartáveis, se combustíveis, devem ser incinerados. Lixos que contenham líquidos ácidos ou alcalinos devem ser neutralizados e depois descartados Usar roupas protetoras, luvas, óculos e proteção para o rosto. Nunca pipetar soluções com a boca. Não comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos nos locais de trabalho. Lavar as mãos com cuidado depois de manusear amostras e reagentes. Descartar lixo e reagentes conforme regulamentações vigentes. Seguir a regulamentações do kit enquanto correr o teste. Não usar o kit após a data de validade. Somente usar os reagentes inclusos no kit ou os recomendados pelo fabricante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar reagentes de kits produzidos por outros fabricantes. 3

4 Cuidados e precauções em Biologia Molecular Procedimentos de biologia molecular, como extração, transcrição reversa, amplificação e detecção de ácidos nucleicos, requerem pessoal treinado e qualificado para evitar-se liberação de resultados errôneos, especialmente devido à degradação de ácidos nucleicos contido nas amostras ou devido à contaminação das amostras por outros produtos de amplificação. São necessárias áreas separadas para extração / preparação de reações de amplificação e amplificação / detecção de amplificação. Nunca colocar produtos de amplificação na área de extração /preparação de reações de amplificação. É necessário dispor de jalecos, luvas e ferramentas exclusivas para a área de extração / preparação de reações de amplificação / detecção de produtos de amplificação. Nunca transferir jalecos, luvas e ferramentas da área designada para amplificação / detecção de produtos de amplificação para as áreas designadas para extração / preparação de reações de amplificação. As amostras devem ser usadas para exclusivamente este tipo de análise. Amostras devem ser manuseadas dentro da câmara de fluxo laminar. Os tubos contendo as amostras nunca devem ser abertos ao mesmo tempo. Pipetas usadas para manusear amostras devem ser exclusivas para este propósito. É necessário o uso de pipetas de dispensação positiva ou ponteiras contendo filtros. As ponteiras devem ser esterilizadas, livres de DNAses, RNAses, DNA e RNA. Reagentes devem ser manuseados dentro da câmara de fluxo laminar. Os reagentes requeridos para amplificação devem ser preparados na sua área e devem ser usados em uma única sessão. As pipetas usadas para manusear os reagentes devem ser usadas com este único propósito. É necessário o uso de pipetas de dispensação positiva ou ponteiras contendo filtros. As ponteiras devem ser esterilizadas, livres de DNAses, RNAses, DNA e RNA. Os produtos de amplificação devem ser manuseados em sua área para reduzirse ao máximo a dispersão dos mesmos pelos ambientes, na intenção de reduzir a s contaminações. Pipetas usadas para manusear os produtos de amplificação devem ser usadas para este único propósito. Cuidados e precauções específicas dos componentes LYSIS BUFFER 10X, não apresenta frases de risco (R) e requer os seguintes cuidados de segurança (S): S Não emite gases / fumaça / vapores / aerossóis. Evitar o contato com os olhos. CELL BUFFER 10X, não apresenta frases de risco (R) e requer os seguintes cuidados de segurança (S): S Não emana gases / fumaça / vapores / aerossóis. Evitar o contato com os olhos. TALC BUFFER, apresenta os seguintes riscos (R) e cuidados de segurança (S): Xi Irritante Contém Hidróxido de Potássio R36/38. Irritante para olhos e pele. 4

5 S26/27. Em eventual contato com os olhos, lavar imediatamente com água em abundância e procurar serviço médico. Usar luvas especiais. NEUTRAL BUFFER não apresenta frase de risco (R) e deve-se tomar os seguintes cuidados de segurança (S): S Não inalar gases / fumaça / vapores / aerossóis. Evitar o contato com os olhos. AMOSTRAS E CONTROLES Amostras Amostras biológicas celulares e não celulares podem ser usadas com este kit: - Sangue total (Periférico e de medula óssea) - Buffy coat coletado com EDTA ou citrato - Suspensões de monócitos - Suspensão de granulócitos - Gargarejo - Swab faríngeo diluído - Swab nasal faríngeo - Lavado broncoalveolar fluidificado - Aspirado broncoalveolar fluidificado - Gargarejo fluidificado - Escarro fluidificado - Fluido cefalorraquidiano - Plasma - Soro - Fluido amniótico - Sobrenadante fecal - Sobrenadante de cultura O volume da amostra para extração deve ser de 200 µl. Para volumes menores que 200 µl, adicionar solução fisiológica ou PBS esterilizado suficiente para completar 200 µl. Usuários de testes de amplificação Qualitativa, como Real Time Amplification, Duplex real Time Amplification e Monoreagent Duplex Real Time Amplification, são advertidos a observar sempre o volume de amostra usado na extração e o volume de água ultrapura usado para dissolver o RNA, com o intuito de possibilitar o cálculo da quantificação do alvo analisado. Os microtubos contendo as alíquotas de amostra transferidas para a extração devem ser marcados com a identificação da amostra com caneta de marcação permanente. Para otimizar a conservação de amostras celulares, é necessário desnatura-la em EXTRAZOL reagente reconstituído, assim ela deve ser congelada a -20 C por no máximo 30 dias ou a -70 C por um período maior. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. 5

6 Para uma otimização da conservação de amostras não celulares, é recomendado a divisão em pequenas alíquotas (com no mínimo 200 µl) e congela-los a -20 C por no máximo 30 dias ou a -70 C por períodos mais longos. Evitar ciclos repetitivos de congelamento e descongelamento. Quando usar amostras congeladas, descongelar as amostras no momento da extração, no sentido de prevenir a degradação do DNA. Substâncias interferentes Amostras não devem conter heparina já que este é um poderoso inibidor de DNA Polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA Polimerase termoestável) permitindo a liberação de resultados incorretos ou inválidos nos passos subsequentes à extração de DNA. As amostras não devem conter Ficoll ou dextrana, pois, estes são poderosos inibidores da enzima DNA Polimerase (como a transcriptase reversa e a DNA polimerase termoestável) permitindo a liberação de resultados errôneos ou inválidos nos passos subsequentes a extração de ácidos nucleicos. Qualquer efeito inibidor causado por drogas deve ser devido a presença dos mesmos na amostra inicial, devem ser avaliadas cada vez que usadas, de acordo com a intenção de uso do material extraído. Controle de qualidade É recomendado validar o procedimento de análise total de cada extração processando uma amostra negativa e uma amostra positiva. Para o controle negativo, usar uma amostra negativa que já tenha sido testada para o alvo analisado ou realizar uma extração de uma amostra de água bidestilada como amostra. Para o controle positivo, usar uma amostra que já tenha sido testada para o alvo ou então uma amostra referência. PROCEDIMENTO Reconstituição do Reagente EXTRAZOL (Deve ser realizada na área de extração / preparação de reação de amplificação) Antes de iniciar a extração das amostras, reconstituir o reagente EXTRAZOL adicionando 2,6 ml de tampão acetato (atentar: tampão acetato é considerado corrosivo) e 25 ml de Fenol (atentar: Fenol é considerado tóxico) ao frasco contendo 25 ml do reagente Extrazol (atentar: Reagente Extrazol é nocivo) anotando as alterações na etiqueta do reagente. O reagente Extrazol deve ser mantido de 2 C a 8 C por até 6 meses. COLETA, TRANSPORTE, ESTOCAGEM E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS (Deve ser realizada na área de extração / preparação de reação de amplificação) Atenção: amostras biológicas podem transmitir agentes infecciosos. 6

7 Sangue total (periférico ou de medula óssea) e buffy coat coletados em EDTA O sangue total (periférico ou de medula óssea) e o buffy coat coletados em EDTA ou citrato que são usados para extração de RNA devem ser coletados de acordo com os procedimentos de laboratório, transportados de 2 C a 8 C e estocados na mesma temperatura por no máximo 4 horas. A quantidade de leucócitos ideal para a extração de RNA deve estar entre e de células. A quantidade ótima é de células. Sangue total periférico e buffy coat não necessitam de pré-tratamento e devem ser usados diretamente na extração. Amostras de sangue total e sangue de medula óssea de pacientes neutropênicos requerem o seguinte pré-tratamento. a. Em um microtubo de centrifugação de 2 ml (não incluso no kit) transferir 1 ml de medula óssea e ou sangue total. b. Centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto a RPM. c. Com muito cuidado, remover o sobrenadante. d. Diluir o pellet celular contido no fundo do microtubo em solução fisiológica esterilizada ou PBS esterilizado, obtendo-se um volume final de 2 ml. e. Repetir os passos b e c. f. Diluir o pellet celular contido no microtubo em solução fisiológica esterilizada ou PBS esterilizado, obtendo-se um volume final de 200 µl. g. A extração deve ocorrer destes 200 µl de solução. Suspensão de monócitos ou leucócitos As suspensões de monócitos ou leucócitos que serão usadas para extração de RNA devem ser preparadas de acordo com os procedimentos de laboratório, diluindo em solução esterilizada ou PBS esterilizado, quantificado e estocado de 2 C a 8 C por no máximo 4 horas. A quantidade de leucócitos para extração de RNA deve estar entre e de células. A quantidade ótima deve ser de de células. As suspensões de linfomonócitos ou leucócitos podem ser usadas diretamente. Gargarejo As amostras de gargarejo que serão usadas na extração de RNA devem ser coletadas de acordo com os procedimentos de laboratório em solução fisiológica esterilizada, transportada de 2 C a 8 C e estocadas na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira, as mesmas podem ser estocadas a -20 C por no máximo 30 dias ou por períodos maiores estocando-as à -70 C. a. Em um tubo FALCON de 15 ml (não incluso no kit), transferir 5 ml do gargarejo. b. Centrifugar a temperatura ambiente por 10 minutos, c. Com cuidado remover o sobrenadante, deixando aproximadamente 200 µl no fundo do microtubo. O sobrenadante removido pode ser estocado em alíquotas de 200 µl a temperatura de -20 C ou -70 C. d. Diluir o pellet celular nos 200 µl do sobrenadante presente no microtubo. e. Realizar a extração dos 200 µl da suspensão. 7

8 Swab nasal ou faríngeo Amostras de Swabs faríngeos ou nasais que são usados para extração de RNA devem ser coletadas de acordo com os procedimentos de laboratório, diluindo o Swab em meio de transporte para cultura celular ou solução fisiológica esterilizada ou PBS esterilizado transportar em temperatura de 2 C a 8 C e estocá-lo na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira pode-se estoca-lo congelado a -20 C por 30 dias ou a -70 C por períodos mais longos. a. Em um microtubo de centrifugação de 1,5 ml (não contido no kit) transferir 1 ml da amostra diluída de swab nasal ou faríngeo. b. Centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto a RPM. c. Com cuidado remover o sobrenadante deixando aproximadamente 200 µl no microtubo. O sobrenadante removido pode ser estocado em alíquotas a -20 C a -70 C. d. Diluir o pellet nos 200 µl de sobrenadante restantes no microtubo, e. Realizar a extração dos 200 µl presentes no microtubo. Preparação de amostras de lavado broncoalveolar O lavado broncoalveolar que será usado no processo de extração de RNA deve ser coletado seguindo os procedimentos laboratoriais e em solução fisiológica esterilizada, transportadas a 2 C-8 C e estocadas na mesma temperatura por um máximo de 4 horas, outra forma permite o congelamento a -20 C por um período de 30 dias, e a -70 por períodos maiores. a. Em um tubo tipo FALCON de 15 ml (não contido no kit) transferir 5 ml da amostra de lavado broncoalveolar, b. Transferir 1:20 volumes (50 µl para cada ml de amostra) de DTT 1M (ditiotreitol, específico para biologia molecular, também não contido no kit) ao tubo contendo a amostra e misturar por inversão, c. Vórtex por 15 segundos e incubar de 2 C a 8 C por 10 minutos, d. Vórtex por 15 segundos e centrifugar a temperatura ambiente por 10 minutos a RPM, e. Com cuidado retirar o sobrenadante deixando aproximadamente 200 µl de solução restante. O sobrenadante removido pode ser estocado em alíquotas a -20 C ou -70 C, f. Diluir o pellet no fundo do tubo nos 200 µl de sobrenadante restantes. g. A extração deve ser realizada dos 200 µl se suspensão. Preparação de amostras de aspirado broncotraqueal, saliva e escarro O aspirado broncotraqueal, saliva e escarro que serão usados na extração de RNA devem ser coletados seguindo os procedimentos laboratoriais padrão, transportadas de 2 C a 8 C e estocadas na mesma temperatura por um período máximo de 4 horas, de outra forma a amostra pode ser estocada a -20 C por no máximo 30 dias, ou a -70 C por períodos mais prolongados. a. Em 1 microtubo de centrifugação de 1,5 ml (não contido no kit) transferir 600 µl da amostra de saliva, escarro ou Aspirado broncotraqueal b. Transferir 1: 20 volumes (5 µl para cada 100 µl de amostra) de DTT 1M (ditiotreitol, específico para Biologia Molecular, não contido no kit) para o microtubo e misturar por inversão. 8

9 c. Vórtex por 15 segundos e incubar de 2 C a 8 C por 10 minutos, d. Vórtex por 15 segundos e centrifugar a temperatura ambiente por 1 minuto a RPM, e. Com cuidado retirar o sobrenadante deixando aproximadamente 200 µl de solução. O sobrenadante removido pode ser estocado em alíquotas a -20 C por 30 dias ou a -70 C por tempo prolongado. f. Diluir o pellet no fundo do microtubo nos 200 µl de sobrenadante deixados no microtubo, g. A extração deve ser realizada dos 200 µl presentes no microtubo. Plasma coletado em EDTA As amostras de plasma que serão usadas na extração de RNA devem ser coletadas seguindo os procedimentos laboratoriais padrões, Transportadas de 2 C a 8 C e estocadas na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira as amostras podem ser estocadas a -20 C por até 30 dias ou a -70 C por períodos mais longos. Amostras de plasma não requerem pré-tratamento, e podem ser extraídas diretamente. Soro As amostras de soro que serão usadas na extração de RNA devem ser coletadas seguindo os procedimentos laboratoriais padrões, Transportadas de 2 C a 8 C e estocadas na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outra maneira as amostras podem ser estocadas a -20 C por até 30 dias ou a -70 C por períodos mais longos. Amostras de soro não requerem pré-tratamento, e podem ser extraídas diretamente. Liquido cefalorraquidiano (Fluido cérebro-espinhal) As amostras de fluido cérebro-espinhal que serão usadas para a extração de RNA deve ser coletada de acordo com os procedimentos laboratoriais padrões, impedindo a contaminação da amostra com o sangue do paciente, deve ser transportado de 2 C a 8 C e estocada na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outro modo, a amostra pode ser congelada a -20 C por no máximo 30 dias ou a - 70 C por períodos mais prolongados. Amostras de fluido cérebro-espinhal não requerem pré-tratamentos e podem ser usados diretamente na extração. Fluido amniótico As amostras de fluido amniótico que serão usadas para a extração de RNA devem ser coletadas de acordo com os procedimentos laboratoriais padrões, impedindo a contaminação da amostra com o sangue da mãe, e deve ser transportado de 2 C a 8 C e estocada na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outro modo, a amostra pode ser congelada a -20 C por no máximo 30 dias ou a - 70 C por períodos mais prolongados. Amostras de fluido amniótico não requerem pré-tratamentos e podem ser usados diretamente na extração. 9

10 Sobrenadante fecal As amostras de sobrenadante fecal que serão usadas para a extração de RNA devem ser coletadas de acordo com os procedimentos laboratoriais padrões e devem ser transportadas de 2 C a 8 C e estocada na mesma temperatura por no máximo 4 horas, de outro modo, a amostra pode ser congelada a -20 C por no máximo 30 dias ou a -70 C por períodos mais prolongados. a. Em um tubo tipo FALCON de 15 ml (não contido no kit) transferir 10mL de solução fisiológica esterilizada ou PBS esterilizado, b. Transferir aproximadamente 1grama de material fecal para o tubo e agitar por 15 segundos, c. Centrifugar a temperatura ambiente por 10 minutos a 2500 a 3000 RPM, d. Em um microtubo de centrifugação de 1,5 ml transferir 1 ml do sobrenadante. e. Centrifugar a temperatura ambiente por 10 minutos a RPM, f. Pegar 200 µl do sobrenadante e realizar a extração. O volume restante de sobrenadante deve ser estocado em alíquotas a -20 C ou -70 C. Sobrenadante de cultivo celular As amostras de sobrenadante de cultivo celular que serão usadas para a extração de RNA, devem ser estocadas de 2 C a 8 C por no máximo 4 horas, de outro modo, a amostra pode ser congelada a -20 C por no máximo 30 dias ou a -70 C por períodos mais prolongados. Amostras de sobrenadante de cultivo celular não requerem pré-tratamentos e podem ser usados diretamente na extração. Procedimento de extração (Deve ser realizado na área e extração / preparação de reações de amplificação) Antes de iniciar a extração é necessário: - Preparar uma placa com gelo para incubar as amostras em microtubos de 1,5 ml a temperatura de 0 C, - Quando precisar descongelar os tubos de <<CPE RNA - controle interno>> necessários para a sessão, lembrando que cada tubo é suficiente para 14 extrações. Agitar gentilmente, centrifugar por 5 segundos para retirar as gotas da tampa e manter em gelo, - Preparar um microtubo de 1,5 ml (não contido no kit) para cada uma das amostras testes, incluindo controle positivo e negativo, e identificá-los com uma caneta de marcação permanente, - Pegar o mesmo número de microtubos de precipitação (contidos no kit) e os identifique claramente com caneta de marcação permanente, - Em um tubo tipo FALCON de 50 ml (não contido no kit) preparar uma alíquota de etanol absoluto (cuidado: etanol absoluto é inflamável, não está contido no kit) transferir 0,5 ml de etanol para cada amostra teste, 0,5 ml para o controle negativo e 0,5 ml para o controle positivo, sempre com 1 ml a mais: anotar de forma clara com uma caneta de marcação permanente, 10

11 - Preparar outro tubo tipo FALCON de 50 ml (não contido no kit) para ser usado como descarte da extração, deve-se marcar claramente este tubo com caneta de marcação permanente. - Pegar o frasco de reagente EXTRAZOL e marcar que o mesmo já foi reconstituído, - Pegar o frasco de reagente de lavagem e marcar que o mesmo já foi reconstituído. Procedimento de extração (Deve ser realizado na área e extração / preparação de reações de amplificação) 1. Transferir 800 µl do Reagente de Extrazol reconstituído (cuidado: Reagente extrazol é tóxico) em um microtubo de centrifugação de 1,5mL (este não contido no kit). 2. Transferir 200 µl da amostra (cuidado: amostras biológicas devem transmitir agentes infecciosos) no microtubo de 1,5 ml que contém o reagente extrazol. Para testes com a amostras não celulares deve-se adicionar 10 µl de<< CPE RNA - controle interno>> ao tubo de extração. Vórtex imediatamente por 15 segundos. 3. Centrifugar a temperatura ambiente por 5 segundos a RPM. 4. Transferir 100 µl de Clorofórmio (cuidado: clorofórmio é nocivo, e não esta contido no kit) para o microtubo de 1,5 ml e agitar imediatamente por 15 segundos. 5. Colocar o microtubo no gelo por 15 minutos a 0 C. 6. Centrifugar por 15 minutos a RPM. 7. Durante a centrifugação, transferir 500 µl de etanol absoluto (cuidado: o etanol absoluto é inflamável, e não está contido no kit) para um microtubo de precipitação de 1,5 ml vazio (este está contido no kit). 8. Pagar 500 µl do sobrenadante que contém o lisado, cuidado para coletar a fase orgânica abaixo ou proteínas e DNA presente na interfase. Transferir o sobrenadante para o microtubo de precipitação contendo o etanol absoluto e agitar imediatamente por inversão 10 vezes. 9. Centrifugar* o microtubo de precipitação em temperatura ambiente por 10 minutos com velocidade de a RPM para coletar o RNA presente no pellet ou na parede do tubo. 10. Remover o sobrenadante com cuidado colocando-o no tubo de 50 ml identificado como lixo. O mesmo não deve ser descartado, pois será usado novamente em outro estágio da extração. NOTA: O RNA presente no fundo do microtubo ou na parede do mesmo, é raramente observado nesta fase da extração. 11. Transferir 1 ml do reagente de lavagem reconstituído dentro do microtubo de precipitação que contém o RNA e invertê-lo 10 vezes, 12. Centrifugar* o microtubo de precipitação a temperatura ambiente por 1 minuto a RPM. 11

12 NOTA: Colocar os microtubos na microcentrífuga com a dobradiça voltada para o lado de fora do rotor, isto facilita a identificação do pellet de RNA formado. 13. Remover o sobrenadante utilizando uma pipeta de largo volume, tomando cuidado para não drenar com a ponteira o pellet de RNA, que agora é visível no fundo do microtubo ou na parede do mesmo. Transferir o sobrenadante para o tubo de 50 ml identificado como lixo. 14. Centrifugar o microtubo de precipitação por 5 segundos a RPM. NOTA: Colocar os microtubos de precipitação com a dobradiça voltada para o lado externo do rotor, desta forma facilitará a observação do pellet formado no fundo do tubo ou na parede do mesmo. 15. Remova completamente o sobrenadante com uma pipeta de pequeno volume, tomando o cuidado de não drenar o pellet com a ponteira. Transferir o sobrenadante para o tubo de 50 ml identificado como lixo. Manter tubo contendo os descartado fechado até o momento de descartá-lo em um lixo específico. 16. Deixe que o microtubo de precipitação seque por no mínimo 5 minutos dentro da câmara de fluxo laminar. 17. Dissolver (hidratar) o RNA em um volume correto de água ultrapura como o descrito nas tabelas. NOTA: para dissolver o pellet proceda da seguinte maneira: - Adicionar a água ultrapura no mesmo lado da dobradiça do tubo. - Despejar de forma que a água escorregue até o pellet no fundo do tubo. - Deixar o pellet de RNA hidratando por 5 minutos a temperatura ambiente. - Agitar vigorosamente o microtubo em vórtex para dissolver o pellet. - Se necessário, pipetar o extrato com auxilio de pipeta e ponteira para que a solução torne-se mais homogênea. - Centrifugar a temperatura ambiente por 5 segundos para que o RNA fique todo no fundo do microtubo. NOTA: Os volumes de água ultrapura recomendados na tabela permitem o máximo de sensibilidade nos passos subsequentes do teste de diagnóstico. Os volumes recomendados quando usando amostras celulares permitem obter-se o RNA extraído com concentração em torno de 100ng / µl. Estas concentrações evitam que se adicionem concentrações excessivas de RNA no teste de transcrição reversa que podem produzir produtos não específicos e problemas de inibição. NOTA: O RNA extraído deve ser estocado a -20 C por no máximo 30 dias ou a -70 C por períodos mais prolongados. NOTA: Os ácidos nucleicos extraídos podem contaminar os passos subsequentes dos testes. Feche adequadamente ou descarte os ácidos nucleicos residuais e o lixo produzido. 12

13 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO Usar somente as seguintes amostras biológica humanas com este produto: sangue total (periférico ou medula óssea), leucócitos periféricos, monócitos, granulócitos, amostras cervicais, swabs uretrais, faríngeos, nasais, Lavado broncoalveolar, escarro, saliva, gargarejo, fluido amniótico, urina e liquido cefalorraquidiano. Heparina, mucoproteína ou hemoglobina não devem estar presentes no pellet do qual o DNA será extraído. Para evitar estes resultados, siga as instruções. Não realizar a extração com este produto em caso de presença de heparina no pellet: A heparina inibe a enzima DNA polimerase (TAQ Polimerase, por exemplo) comprometendo e distorcendo os resultados das etapas subsequentes da analise do DNA extraído. Não realizar a extração de DNA com este produto em caso de presença de mucoproteínas ou hemoglobina no pellet: As mucoproteínas e a hemoglobina inibem a enzima DNA polimerase (TAQ Polimerase, como por exemplo) comprometendo e distorcendo os resultados das etapas subsequentes da analise do DNA extraído. Qualquer fenômeno de inibição por drogas que pode estar contido na amostra inicial deve ser avaliado de acordo com o uso pretendido do kit de extração. Os resultados obtidos com este produto estão sujeitos a uma correta coleta, transporte, estocagem e preparação das amostras. Para evitar resultados errados é necessário tomar cuidados especiais durante estas fases e seguir as instruções cuidadosamente. Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado no processamento de amostras com potencial infeccioso e preparações químicas classificadas como perigosas para evitar acidentes com consequências potencialmente sérias ao usuário a outras pessoas. Este produto requer o uso de roupas especificas de trabalho e premissas de que avaliarão os processos com amostras potencialmente - infecciosas e preparações químicas classificadas como perigosas para evitar acidentes com consequências potencialmente sérias ao usuário a outras pessoas. Este produto deve ser manuseado por pessoal treinado em Biologia Molecular, como a extração, amplificação e detecção de ácidos nucleicos para impedir resultados errados em subsequentes estágios da análise conduzidos na extração de DNA das amostras com potencial consequências ao paciente. Este produto deve ser manuseado em áreas separadas para extração / preparação das reações de amplificação e amplificação / detecção dos produtos de amplificação para evitar resultados falso positivos em passos subsequentes da análise conduzida no DNA extraído evitando-se com sérias consequências ao paciente. Este produto requer roupas e instrumentos específicos para áreas de extração / preparação de reações de amplificação e amplificação / detecção de produtos de amplificação com intenção de evitar resultados falso positivos nos passos subsequentes da análise deste DNA extraído, evitando-se sérias consequências ao paciente. 13

14 CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO O método usado neste sistema de extração possibilita o uso de 200uL de amostra celular ou não celular e a recuperação do RNA com eficiência de aproximadamente 80% da amostra inicial. A eficiência da metodologia de extração, assim como a habilidade em recuperar o RNA das amostras, foi checada usando RNA genômico do bacteriófago MS2 adicionado a plasma coletado em EDTA. Os testes foram realizados usando-se como material de referência o RNA genômico do bacteriófago MS2, o qual teve sua concentração inicial mensurada por espectrofotometria. O RNA foi adicionado ao plasma coletado em EDTA obtido de amostras com titulação de 2000 cópias em 200uL e a diluição foi usada em 4 repetições e em 9 diferentes sessões para completar o procedimento de análise, extração, transcrição reversa e amplificação nested com RECK sistema de controle interno, com produtos e assessórios da Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. Os resultados estão resumidos na tabela a abaixo: AMOSTRAS 2000 cópias de RNA N DE SESSÕES N DE REPETIÇÕES MS2 POSITIVOS MS2 NEGATIVOS NOTA: Os dados completos e resultados dos testes para avaliação de desempenho do produto estão relatados na sessão 7 do arquivo técnico do produto EXTRAZOL, FTP EXTR01. SOLUÇÃO DE PROBLEMAS Falso Negativo Causas possíveis Degradação do RNA na amostra. Precipitação de sais da extração. Sem RNA no pellet. Perda do pellet de RNA. Degradação do RNA extraído. Extraído muito diluído. Soluções Usar uma nova amostra, estocar a amostra apropriadamente. Cuidadosamente, retirar os 500 µl do sobrenadante do microtubo teste. Cuidadosamente, misturar o Etanol absoluto e o sobrenadante retirado do microtubo teste. Cuidadosamente, drenar o reagente de lavagem no intuito de não remover o pellet. Usar plásticos livre de RNAses, trocar a alíquota de etanol absoluto, a água ultrapura e o reagente de lavagem. Extrair o RNA de uma nova alíquota de amostra e dissolver este RNA em um volume menor de água ultrapura. 14

15 Falso Positivo Causas possíveis Contaminação durante a extração da amostra. Contaminação dos reagentes preparados para a sessão. Contaminação da área de extração / preparação de reações de amplificação. Soluções Abrir um tubo de cada vez. Evitar respingar os conteúdos dos tubos testes, trocar as ponteiras. Usar uma nova alíquota de etanol absoluto, reagente de lavagem e água ultrapura. Limpar as superfícies e instrumentos com detergentes aquosos, lavar jalecos trocas tubos e ponteiras em uso. Dificuldade na desempenho do procedimento Causas possíveis Dificuldade da lise da amostra devido a viscosidade do DNA genômico ou presença de partículas sólidas suspensas. Proteínas e ou DNA presente no pellet de RNA. Pellet de RNA que secou por muito tempo. Soluções Drenar o lisado várias vezes dentro de uma seringa de 2,5mL com agulha, na intenção de fluidificá-la. Remover devagar e cuidadosamente o sobrenadante do microtubo teste contendo o lisado. Não remover a interfase. Usar um a seringa de insulina com agulha. Não extrair amostras com mais de 20 milhões de células. Deixar o líquido do microtubo de precipitação evaporar, mas não permita que o pellet seque. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CHOMCZYNSKI P., SACCHI N. (1987) Anal. Biochem. 162: IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR Biometrix Diagnóstica Ltda. Estrada da Graciosa, Curitiba PR - CEP: Tel.: (41) Fax: (41) DDG: biometrix@biometrix.com.br Website: CNPJ: /

16 INFORMAÇÕES DO FABRICANTE Nanogen Advanced Diagnostics S.P.A. C.so Torino, 89/d Buttigliera Alta (TO) - Itália RESPONSÁVEL TÉCNICA Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira CRQ/PR: Aprovação: 20/12/2013 X Maurício Cichon Laboratório Assinado por: Maurício Cichon 16