Técnicas Físicas aplicadas ao Estudo de Sistemas Biologicamente Relevantes. Leandro R. S. Barbosa M. Teresa Lamy Thais A. Enoki

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1 Técnicas Físicas aplicadas ao Estudo de Sistemas Biologicamente Relevantes Leandro R. S. Barosa M. Teresa Lamy Thais A. Enoki Curso de Verão IFUSP 011 1

2 Introdução à Fluorescência M. Teresa Lamy Grupo de Biofísica IFUSP Curso de Verão IFUSP 011

3 Técnicas espectroscópicas Interação da radiação eletromagnética com a matéria Asorção Asorção/Emissão Espalhamento Em iomoléculas: estrutura e dinâmica função

4 Luminescência Emissão de fótons de estados eletrônicos excitados UV e visível fluorescência singleto singleto 10-8 s fosforescência tripleto singleto s Cromóforos - moléculas que asorvem luz Fluoróforos - moléculas que fluorescem Geralmente possuem elétrons delocalizados/duplas ligações/anéis

5 Diagrama de Jalonski S conversão interna (~10-1 s) S 1 ( fluor ~ 10-9 s) cruzamento inter-sistema sorção (10-15 s) fluorescência k R T 0 (fosf ~ 10-3 s) fosforescência S 0

6 Fluorescência sulfato de quinina, fluoresceína, rodamina, rometo de etídio luz ranca luz UV espectros de emissão

7 Fluorescência: primeiras oservações 1565 infusão da madeira Lignum ephriticum (. Monardes) Herschel 1845 oservação de fluorescência em uma solução de quinino água tônica (Wikipedia)

8 Fluorescência: primeira oservação rigorosa Stokes (185) Quinino Asorve luz no ultra-violeta: as = 350 nm Emite no visível: em = 450 nm

9 Energia Excitado as em Fundamental Coordenada 9

10 Fluoróforos naturais (Lakowicz, 1999)

11 Fluoróforos naturais em Proteínas Green Fluorescent Protein (GFP) Água-viva ioluminescente Aequorea victoria. Cromóforo formado espontaneamente por enovelamento da cadeia polipeptídica, e ciclização (Ser-65, Tyr-66, Gly-67) Inserção do gen para GFP em células e uso da proteína como sonda. 11

12 Interação da radiação eletromagnética com a matéria modelo semi-clássico radiação: onda EM matéria: estados quantizados de energia 1

13 Interação de partícula com carga q e massa m com EM B xa A E t gauge de.a Coulom, no vácuo 0 0 Η Η' 1 m p qa para um átomo hidrogenoide 1 m e i ea Ze 4 o r onda plana monocromática A(w, r, t) Ao(w) cos(k.r wt w) E(w, r, t) wao(w) sin(k.r wt w) B(w, r, t) Ao (w)(kx)sin(k.r wt w) i(k.r wtw) A(w, r, t) A (w) [e cc] o Η para campos fracos, desprezando termos em A Ze e i A. m 4 r m e o e H o H perturção

14 - Sistema de dois níveis - Teoria de Perturção em 1a ordem - Em t = 0, sistema no estado a a P P a taxa de asorção de radiação asorção W w a a W a Regra de uro de Fermi dpa ea o( w dt m E Ea W emissão estimulada a ) e ik.r. I( w) a densidade de energia o w A o ( w) W 4 e I( w ik.r e. m c 4 o w ) a

15 Aproximação de dipolo elétrico k. r A( w, r,t) 1 k e e r ik. r ik.r A 1 r e. a o ik. r ( w) e i. im. a. 1 r (i) [r, H 1 a (i) (Ea E p imw r i(k.rwtw) 1 r r 1 p o ] ) p r a a r r a W W 4 e I( w c 4 o e r 4 3c a e 4 o ). er I( w ) r r momento de dipolo elétrico de transição para EM não polarizada W B B B I( w r coeficientes de Einstein para asorção e emissão estimulada de radiação B a ) a

16 I o di(y) I(y) Espectroscopia óptica de asorção y concentração de moléculas I t Asorância = dy I y C'dy o e 'Cy I log I I t característica da molécula Lei de Lamert-Beer o t A yc taxa com que a energia é removida da radiação (asorvida) di( ) ahb dt a (Ea e di( ) dt di( ) I( ) C W a a E a I( ) )/ kt hb h c B r a I( ) a hb dy medidas de modelos a a 0 W I( )

17 Espectroscopia óptica de emissão Coeficiente de Einstein para a emissão espontânea W B B 4 3c I( w ) e 4o r Se existissem somente B a e B, no equilírio termodinâmico: a B a I() = B I() Taxa de transição induzida por unidade de densidade de radiação incidente A emissão espontânea pode ser deduzida da QED, ou da elegante discussão feita for Einstein em 1916 B a B A a a = mas, a e (E a E ) / kt e h / kt Postulou, portanto, a existência de A, independente de I(), tal que: A d dt a B a I() = B I() + A fluorescência

18 a 1 B A I( ) Espectroscopia óptica de emissão Considerando que as moléculas estão em equilírio com a radiação à temperatura T: I() = distriuição de Planck para o corpo negro a 1 A B e h / kt 8h 3 1 c 3 e h / kt A B 8h 3 A k R c 3 lemrando: A B r r d dt a r

19 Intensidade ormalizada Fluorímetro de estado estacionário amostra lâmpada monocromador de excitação monocromador de emissão cm -1 ) fotomultiplicadora água DLPC 0 o C Água DLPC 0 o C 0.6 Prodan H 3 C H 3 C nm) C 19

20 Asorância ormalizada Intensidade ormalizada Grande sensiilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo asorção Prodan emissão 1.0 Água Metanol Acetonitrila 0.8 Diclorometano Clorofórmio 0.6 Ciclohexano cm -1 ) Água Metanol Acetonitrila Diclorometano Clorofórmio Ciclohexano nm) nm) ome Fórmula m(d) n (g/cm 3 ) f * Ciclohexano C 6 H 1.0 ~ Clorofórmimo CHCl Diclorometano CH Cl Acenonitrila C H f 1 n 1 n 1 1 Metanol CH 3 H Água H

21 Grande sensiilidade da fluorescência ao meio onde encontra-se o fluoróforo Longo tempo de vida do estado excitado ( ~ 10-9 s) o espectro de fluorescência é muito mais sensível ao meio do que o espectro de asorção (Lakowicz, 1999)

22 Por que estudar o efeito do solvente? Auxiliar o estudo da estrutura do fluoróforo no estado fundamental e excitado Conhecer o microamiente onde se encontra o fluoróforo - Trp em uma proteína: exposto ao meio aquoso ou no seu interior? - penetração de moléculas na memrana lipídica Modelo de Lippert - fluoróforo esférico - solvente meio contínuo - não são consideradas interações moleculares específicas 1 n 1 ( m ha 1 n 1 as em ) ( m ) 3 Usa o modelo de Clausius- Mosotti para molécula esférica (r = a), polar, em dielétrico: = polarizailidade eletrônica e molecular n = polarizailidade eletrônica

23 Modelos de memranas iológicas vesículas unilamelares vesículas multilamelares

24 Sondas fluorescentes incorporam-se à icamada lipídica Estudo das interações: peptídeo/memrana proteína/memrana fármacos/memrana DA/memrana

25 normalized fluorescence intensity Fluoróforo em memranas lipídicas (Vequi-Suplicy, Benatti, Lamy, JF 006) H 3 C Laurdan H 3 C exc = 340 nm C o C 70 o C o C DPPG o C 40 o C P P H H H H P P T m (CH (CH 3 ) ) DMPG DMPG PCSL 5-PCSL (nm) T m ~ 41 o C H H 1- SASL 1- SASL

26 I em (normalized) I em (normalized) Estudo da interação peptídeo/memrana H H CH CH CH C 3 C C C C H H H H H H CH C C H H CH 3 S CH CH H C C H C CH C H C H C H H CH CH C H C C H H H C H CH H CH CH CH CH H C C H H C H H C H C H C H H3 CH CH CH CH C C H C H -MSH H C CH 3 3 CH C C C H H H Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1,0 a) Aqueous solution 357 nm 34 nm exc = 96 nm 1,0 ) DMPG dispersion 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0, 0, 0,0 0, (nm) (Fernandez et al., 003) (nm)

27 Anisotropia de fluorescência Asorção de foton: momento de dipolo é criado no fluoróforo (momento de dipolo de transição) Z X Radiação polarizada I Momento de Dipolo de Asorção I Y e Momento de Dipolo de Emissão r a er

28 Campo Elétrico da luz incidente Excitação é foto-seletiva não ocorre asorção e dipolo elétrico de asorção a r er a asorção máxima asorção cos A

29 Anisotropia de fluorescência (experimento) anisotropia experimental A A I I // // I I vv vv I I GI GI vh vh Sensiilidade do detector à polarização G I I hv hh

30 Anisotropia de fluorescência Se a molécula está parada: A 0 5 3cos 1 Ao anisotropia fundamental Momento de Dipolo de Asorção Momento de Dipolo de Emissão

31 Anisotropia de fluorescência Se a molécula gira durante o tempo de vida do estado excitado: Fornece informações acerca da moilidade da molécula no meio.

32 Despolarização da emissão: mede movimento do fluoróforo Fluoróforo pode girar durante o tempo de vida do estado excitado Dipolo de emissão t = 0 Dipolo de asorção Dipolo de emissão t > 0 Emissão: tem componente perpendicular à asorção anisotropia A I I // // I I

33 anisotropy Anisotropia de fluorescência Laurdan em icamadas lipídicas T m Em =480 nm DLPC DPPG DPPG T m ~ 41 o C DLPG T m ~ 0 o C Temperature ( o C)

34 Contagens Fluorímetro com resolução temporal Semiespelho amostra Laser pulsado monocromador fotomultiplicadora fotomultiplicadora partida Conversor tempoamplitude chegada a a - KKA-0 - RKK3-0 c - RKK c tempo (ns) 34

35 contagens Fluorímetro com resolução temporal Cinética do decaimento do estado excitado I(t) : função de decaimento, após excitação por um pulso de luz tempo (ns) 35

36 Counts Fluorescência resolvida no tempo - k R decaimento radiativo - k CI conversão interna - k is cruzamento intersistemas - k q (Q) supressão (quenching)... outros processos MSH in water Time (ns) a k R k R (t) (0) e t / exp A k R exp 1/ k T d dt k R k CI k IS k q I ( t) e t exp k T

37 Contagens Fluorescência resolvida no tempo Decaimentos complexos: multiexponencial t t 1 1 I( t) A e e Tempo (ns) Critério de ajuste:

38 Counts Interação Trp/memrana tamém pode ser monitorada pelo aumento do tempo de vida do estado excitado do fluoróforo fluorescência resolvida no tempo -MSH Maior taxa de desexcitação não radiativa do fluoróforo (conversão interna, k CI ) por interação com moléculas de H 1 (ns) (ns) 3 (ns) in water in DMPG em H em DMPG exp I k T Time (ns) ( t ) i i e t 1/ k k k k k T R ι CI IS q Em DMPG, maior exp e maior rendimento quântico F = I em /I as = k R /k T = exp / R

39 Supressão de Fluorescência Supressão Estática Formação de complexos não fluorescentes Supressão Dinâmica (ou colisional) Colisões durante o tempo de vida do estado excitado F Q F Q F Q F Q Mede acessiilidade/distância do fluoróforo às moléculas supressoras F

40 Supressão Colisional Fluoróforo excitado interage (curto alcance) com átomo ou molécula supressora F* F Q Aumenta taxa de transições não-radiativas para o estado fundamental. Diminui intensidade Diminui tempo de vida 40

41 Supressão Colisional F* Intensidade: F o = k R / (k R + k R ) Tempo de vida: o = 1/ (k R + k R ) F* F Q Intensidade: F = k R / (k R + k R +k q [Q]) Tempo de vida: = 1/ (k R + k R +k q [Q]) Stern-Volmer F k 0 o q 1 [ Q ] F k k R R 41

42 Emission Intensity Counts Supressão Colisional Wavelenght (nm) F 0 1 K [ Q SV ] F Time / ns 0 1 K [ Q d ] K SV K d k R k q k R k q o 4

43 43 ) )( ( q f q f D D R R k ] [ 1 0 Q K d o q R R q d k k k k K Supressão Colisional Processo difusão Taxa de colisões o d q o K k k

44 Supressão Colisional MSH em agregados micelares 6 1 ( CH )n Supressão por alquilpiridinio CH 3 n = 1,,3,5,8 e 9 -MSH k q (10 8 M -1 s -1 ) EP + HP + DP + tampão SDS SDS-PE LUTRL agregados: menor difusão da sonda e do supressor (A.P.Romani and A.S.Ito, Biophys Chem 009) 44

45 ... Fluorescência Deslocamento espectral Anisotropia de fluorescência Intensidade de fluorescência Tempos de vida de fluorescência Tempos de correlação rotacional Efeitos de solventes Supressão de fluorescência Transferência de energia Excitação multi-fótons Microscopia de fluorescência Correlação de fluorescência Detecção de Molécula Única

46 Agradecimentos especiais: Amando S. Ito (FFCL-RP-USP) Cássia Marquezin (IF-UFG) Cintia C. Vequi-Suplicy (IFUSP) 46

47 Biliografia Physics of Atoms and Molecules B.H. Bransden, C.J. Joachain Principles of Fluorescence Spectroscopy J.R. Lakowicz Molecular Fluorescence: Principles and Applications B. Valeur -. Série dos livros de Topics in Fluorescence Spectroscopy Ed. J.R. Lakowicz 47