Estudos de fluorescência estacionária e resolvida no tempo de anestésicos locais e de antibióticos da classe das fluoroquinolonas

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1 Fabrício Casarejos Lopes Luiz Estudos de fluorescência estacionária e resolvida no tempo de anestésicos locais e de antibióticos da classe das fluoroquinolonas Tese de Doutorado Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Física do Departamento de Física da PUC-Rio como parte dos requisitos parciais para obtenção do título de Doutor em Física. Orientadora: Profa. Sônia Renaux Wanderley Louro Rio de Janeiro Outubro de 29

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3 Fabrício Casarejos Lopes Luiz Estudos de fluorescência estacionária e resolvida no tempo de anestésicos locais e de antibióticos da classe das fluoroquinolonas Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Física do Departamento de Física do Centro Técnico Científico da PUC-Rio. Aprovada pela Comissão Examinadora abaixo assinada. Profa. Sônia Renaux Wanderley Louro Orientadora Departamento de Física PUC-Rio Profa. Eliane Wajnberg CBPF Profa. Letícia Regina de Souza Teixeira UFMG Prof. Marco Cremona Departamento de Física PUC-Rio Profa. Maria Teresa Moura Lamy USP Prof. Jaime Fernando Villas da Rocha UNIRIO Prof. José Eugenio Leal Coordenador Setorial do Centro Técnico Científico PUC-Rio Rio de Janeiro, 19 de outubro de 29

4 Todos os direitos reservados. É proibida a reprodução total ou parcial do trabalho sem autorização da universidade, do autor e da orientadora. Fabricio Casarejos Lopes Luiz Graduou-se em Física na UERJ (Universidade do Estado do Rio de Janeiro) em 22. É mestre em Física pela UERJ, na área de Cosmologia, tendo obtido o título em 25. Ficha Catalográfica Luiz, Fabrício Casarejos Lopes Estudos de fluorescência estacionária e resolvida no tempo de anestésicos locais e de antibióticos da classe das fluoroquinolonas / Fabrício Casarejos Lopes Luiz ; orientadora: Sônia Renaux Wanderley Louro f. ; 3 cm Tese (Doutorado em Física) Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 29. Inclui bibliografia 1. Física Teses. 2. Biofísica. 3. Anestésicos. 4. Fluorquinolonas. 5. Na. 6. K-ATPase. 7. Espectroscopia. 8. Fluorescência. 9. Fluorescência resolvida no tempo. I. Louro, Sônia Renaux Wanderley. II. Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro. Departamento de Física. III. Título. CDD: 53

5 Ao meu filho Josué M. Casarejos.

6 Agradecimentos A minha orientadora, professora Sônia Renaux Wanderley Louro pela confiança e dedicação neste trabalho de pesquisa. Ao Prof. Carlos Frederico Fontes, do Instituto de Bioquímica Médica da UFRJ, pelas discussões e por ter cedido as membranas de Na +,K + -ATPase. À banca, pelos comentários e sugestões enriquecedoras. E a todos que me acompanharam nesta trajetória tão infinda: minha mãe Lourdes, meu pai Josué, Tio Ari, Tia Isabel, Tia Cida, minhas irmãs Patrícia e Priscila, Alberto Bertolazzi, Tadeu Dal Acqua, Jaime Roch, Ivan Engel, Otavio Castro, João Roberto, Ricardo Rosa, Gabriel Grossi, Jefferson Gonçalves, Mazinho da Silva, Marcus B2, Sérgio Castanheira, Gabriel Gomes, Ricardo Fiorini, Mila Tiso, Mônica Coelho, Germana Reis, Diego Moura, Rodrigo Motta, Leandro di Bartolo, Elmer Chevara, Bruno Lastorina.

7 Resumo Luiz, Fabrício Casarejos Lopes; Louro, Sônia Renaux Wanderley (Orientadora). Estudos de fluorescência estacionária e resolvida no tempo de anestésicos locais e de antibióticos da classe das fluoroquinolonas. Rio de Janeiro, p. Tese de Doutorado Departamento de Engenharia Elétrica, Pontifícia Universidade Católica do rio de Janeiro. Durante as últimas décadas tem-se acentuado o desenvolvimento de técnicas de fluorescência e suas aplicações em biociências e biotecnologia. Dada sua alta sensibilidade de detecção, tais técnicas têm-se tornado ferramentas importantes em muitas áreas de pesquisa tais como diagnósticos médicos, análise genética, mapeamento estrutural de células, estudos de fármacos, caracterização de complexos de fármacos com metais, análise da interação de fármacos com proteínas, lipídeos e DNA. Os anestésicos locais são fármacos que bloqueiam reversivelmente a condução nervosa quando aplicados a uma região circunscrita do corpo. Entretanto, possuem uma variedade de efeitos nos sistemas biológicos que não somente os efeitos de anestesia. Os antibióticos fluorquinolonas são agentes antimicrobianos sintéticos utilizados clinicamente há mais de 3 anos. Além de sua atividade antibacteriana, algumas fluorquinolonas vêm sendo aplicadas no desenvolvimento de drogas anticancerígenas e anti-hiv. O ph local de muitos meios biológicos tem grande influência nas propriedades espectroscópicas de muitos fármacos. Suas constantes de ionização, pk a, podem ser obtidas experimentalmente através de medidas espectroscópicas tais como absorbância, intensidade de fluorescência e parâmetros da fluorescência resolvida no tempo. Neste trabalho estudamos a partir da técnica de fluorescência estacionária e fluorescência resolvida no tempo os anestésicos locais dibucaína e tetracaína. Estudamos também os antibióticos norfloxacina e levofloxacina e seus respectivos complexos com ouro. Determinamos os tempos de vida de fluorescência e descrevemos ainda como as propriedades espectrais de fluorescência que se alteram em função do ph. Nos estudos de decaimento da fluorescência, desenvolvemos expressões para os fatores pré-exponenciais e as intensidades fracionárias de fluorescência como função do ph para amostras fluorescentes que sofrem transição ácido-base. Mostramos que os valores de pk a são aparentemente deslocados e obtivemos as expressões para o deslocamento. Determinamos as constantes de ionização, pk a, a partir da fluorescência estacionária e de parâmetros associados aos tempos de vida e testamos as expressões teóricas nos resultados experimentais. Os valores obtidos foram coerentes para as constantes de ionização dos fármacos dibucaína, levofloxacina e norfloxacina. Acredita-se que a ação dos anestésicos locais deve-se à interação das moléculas do anestésico com lipídeos e/ou proteínas de membrana. Uma análise desta interação mostra-se necessária para se investigar a difusão do anestésico na membrana e seu efeito na organização e dinâmica dos lipídeos e proteínas que constituem a membrana. Investigamos a interação da dibucaína e tetracaína com membranas enriquecidas em Na,K-ATPase e a incorporação do fármaco à membrana. Determinamos as constantes de associação. O valor obtido para a dibucaína foi de M -1 e para a tetracaína M -1. Estudamos a acessibilidade dos triptofanos por supressão de fluorescência do triptofano pela dibucaína, obtivemos uma acessibilidade de 9% para os triptofanos e uma constante de supressão dinâmica de M -1. Palavras-chave Biofísica, anestésicos, fluoroquinolonas, Na,K-ATPase, espectroscopia, fluorescência, fluorescência resolvida no tempo.

8 Abstract Luiz, Fabrício Casarejos Lopes; Louro, Sonia Renaux Wanderley (Advisor). Steady state and time resolved fluorescence studies of local anesthetics and fluoroquinolone antibiotics. Rio de Janeiro, p. Doctorate Thesis Departamento de Engenharia Elétrica, Pontifícia Universidade Católica do rio de Janeiro. During the last decades the development of fluorescence techniques and their applications in bioscience and biotechnology has been accentuated. Due to high sensitivity, such techniques have become important tools in many research areas such as medical diagnosis, genetic analysis, structural mapping of cells, drug investigation, characterization of drug-metal complexes, analysis of drugs interaction with proteins, lipids and DNA. The local anesthetics are drugs that reversibly block the nervous impulse when applied to a limited region of the body. However, they possess a variety of additional effects in the biological systems. The fluoroquinolone derived antibiotics are synthetic antimicrobial agents that have been used clinically for more than 3 years. In addition to their antibacterial activity, some fluoroquinolones have been applied in the development of anticancer drugs and anti-hiv. The local ph of many biological environments has great influence in the spectroscopic properties of many drugs, including local anesthetics and fluoroquinolones. The ionization constants of the drugs, pk a, can be experimentally obtained via spectroscopic parameters such as absorbance, fluorescence intensity, and time-resolved fluorescence parameters. In this work we studied the local anesthetics dibucaine and tetracaine using steady state and time resolved fluorescence techniques. We also studied the antibiotics norfloxacin and levofloxacin and their complexes with gold. We determined the fluorescence lifetimes and described how the spectral fluorescence properties alter as a function of the ph. In the studies of fluorescence decay, we developed expressions for the pre-exponential factors and the fractional fluorescence intensities as a function of the ph for a fluorophore undergoing an acid-base transition. We showed that the pk a values are apparently shifted and obtained the expressions for the pk shifts. We determined the ionization constants, pk a from steady state fluorescence and from parameters associated with the lifetimes, and we tested the theoretical expressions using the experimental results. The observed pk shifts for dibucaine, levofloxacin and norfloxacin were found to agree with the theoretical expressions. The action of local anesthetics is believed to involve the interaction of the anesthetic molecules with lipids and/or membrane proteins. An analysis of this interaction is necessary to examine the anesthetic diffusion in the membrane and its effect in the organization and dynamics of the membrane lipids and proteins. We investigated the interaction of dibucaine with Na,K-ATPase enriched membranes, and the incorporation of the drug in the membrane. We determined the binding constants. The obtained values were M -1 for dibucaine and M -1 for tetracaine. We also studied the accessibility of the tryptophan residues using the fluorescence quenching by dibucaine. We obtained a dynamic quenching constant of M -1. Keywords Biophysics, local anesthetics, fluoroquinolones, Na +,K + -ATPase, spectroscopy, fluorescence, time-resolved fluorescence.

9 Sumário 1. Introdução Objetivos Estrutura dos capítulos Introdução à Fluorescência O fenômeno da fluorescência Fluorescência resolvida no tempo Supressão de Fluorescência Transferência de Energia Membranas Biológicas Os limites das células A Bicamada Lipídica A mobilidade dos lipídeos na membrana O Modelo do Mosaico Fluido Bombas e Canais de Membrana Fármacos - Anestésicos Locais e Fluoroquinolonas Introdução aos Anestésicos Locais Equilíbrio de Ionização da Dibucaína Introdução aos Antibióticos Fluoroquinolonas Equilíbrio de Ionização das Fluoroquinolonas Norfloxacina e Levofloxacina Materiais e Métodos Materiais Equipamentos Métodos Síntese dos complexos de NF e Lev com ouro Correções de espalhamento em fluorescência estacionária Efeitos de filtro interno no sistema Dib-triptofano Determinação da constante de associação através de métodos espectroscópicos Supressão de fluorescência Acessibilidade do supressor Resultados e Discussão I - Obtenção do pk a a partir da fluorescência estacionária e resolvida no tempo Equilíbrio de ionização Obtenção da constante de ionização a partir de parâmetros espectroscópicos...75

10 6.3 Parâmetros espectroscópicos associados ao decaimento da fluorescência e obtenção da constante de ionização Resultados e Discussão II: Fluorescência da Dibucaína, Norfloxacina e Levofloxacina Espectros de fluorescência estacionária da Dib Fluorescência resolvida no tempo da dibucaína Absorção ótica e fluorescência estacionária da NF e AuNF Fluorescência resolvida no tempo da NF Fluorescência resolvida no tempo da AuNF Fluorescência resolvida no tempo da NF e AuNF em DMSO Absorção ótica e fluorescência estacionária da LEV e AuLEV Fluorescência resolvida no tempo da LEV Fluorescência resolvida no tempo da AuLEV Resultados e Discussão III - Interação dibucaína-membrana e tetracaínamembrana Espectros de Fluorescência Estacionária da Dibucaína em Membrana A determinação da constante de dissociação da Dib e TTC em membrana Fluorescência resolvida no tempo da dibucaína em membrana Supressão de fluorescência e transferência de energia - interação da Dib com resíduos de triptofano em membrana Fluorescência Estacionária Acessibilidade dos resíduos de triptofano equação de Stern -Volmer modificada Fluorescência Resolvida no Tempo Conclusão Referências bibliográficas...148

11 Abreviações AG AL Dib FQ Lev NF TTC anestésicos gerais anestésicos locais dibucaína fluorquinolona levofloxacina norfloxacina tetracaína

12 1 Introdução Durante os últimos vinte anos tem se acentuado o uso das técnicas de microscopia de fluorescência, espectroscopia de fluorescência e fluorescência resolvida no tempo em ciências multidisciplinares de biotecnologia (Bashford et al., 1979, Vanderkooi, 1984, Louro et al.,1994, Ladokhin et al., 2, Baruah et al., 26, Zelent et al., 26, Lakowicz, 26, Lu et al., 27). Dada a alta sensibilidade de deteção das técnicas de fluorescência, elas têm se tornado ferramentas essenciais em muitas áreas de pesquisa tais como diagnósticos médicos, sequenciamento de DNA, análise genética, mapeamento estrutural de células, determinação de constantes de ionização de fármacos, caracterização de complexos de fármacos com metais, análise da interação de fármacos anfifílicos com proteínas de membrana e lipídeos, determinação da localização de moléculas intracelulares. O desenvolvimento de agentes que permitem a realização de intervenções cirúrgicas sem dor é de fundamental importância para as áreas biomédicas (Goth, 1976). Os agentes anestésicos são divididos na farmacologia em dois grandes grupos, os anestésicos locais (AL) e os anestésicos gerais (AG). Os AL são comumente utilizados para induzir a anestesia local sem produzir inconsciência. Estes fármacos são amplamente administrados na clínica médica e odontológica, promovendo o efeito físico-químico da anestesia local com intensidade muitas vezes suficiente à dispensa do uso de AG. Os antibióticos fluoroquinolonas são agentes antimicrobianos sintéticos utilizados clinicamente há mais de 3 anos. Além de sua atividade antibacteriana (Vilchez et al., 21), algumas fluoroquinolonas vêm sendo aplicadas no desenvolvimento de drogas anticancerígenas e anti-hiv. Elementos metálicos estão sempre presentes em todos os organismos e suas funções farmacológicas nos processos biológicos não podem ser negligenciadas (Turel et al., 1996, Song et al., 24, 25, Wang et al., 28, Yegorova et al., 27). Deste modo, o estudo de complexos de fármacos com metais mostra-se essencial para se compreender a eficácia de muitos fármacos.

13 12 A estrutura química de muitas moléculas com aplicação farmacológica envolve um grupo amida ou amina terciária e anéis aromáticos. As aminas terciárias têm um pk a próximo do ph fisiológico (Louro et al., 1994). Os anéis aromáticos são os responsáveis pelas propriedades de fluorescência, as quais variam em função do estado de ionização da molécula e de seu meio. Muitos processos biológicos ocorrem na superfície de membranas ou conjuntamente em seu interior hidrofóbico. Devido aos grupos ionizáveis dos lipídeos, a superfície das membranas biológicas frequentemente apresenta-se carregada, permitindo assim a formação de diferentes ligações de espécies moleculares que possuem grupos ionizáveis carregados ou não carregados. Frequentes trabalhos têm sido realizados em fármacos no intuito de analisar seus efeitos funcionais nos sistemas biológicos (Franks et al., 1982, Kutchai et al., 21, Sakagushi et al.,26, Cassuto et al., 26). Por outro lado, técnicas experimentais têm sido aplicadas para investigar as propriedades físico-químicas dos fármacos, seus efeitos na organização conformacional da bicamada lipídica e na diminuição da liberdade de movimento das moléculas do próprio anestésico quando ligadas à membrana (Lee A. G., 1976, Ohki, 1984, Barriviera et al., 25, Ragsdale et al., 1994). Para se analisar as interações de fármacos ionizáveis com sistemas biológicos o primeiro passo é conhecer a concentração das espécies carregadas e não carregadas envolvidas em função do ph. Neste sentido, o modelo físico adotado para o nosso sistema experimental associado aos anestésicos locais assumirá que somente duas espécies cromóforas estão envolvidas no equilíbrio iônico do hidrogênio e que a formação de agregados pode interferir nas propriedades espectroscópicas, incluindo os valores dos tempos de vida de fluorescência associados a cada espécie. O comprimento de onda do máximo de emissão de muitos fármacos varia dependendo da polaridade e da rigidez do meio ambiente local. A associação de peptídeos e proteínas a membranas freqüentemente resulta em mudanças no espectro de fluorescência. Tais mudanças podem ser utilizadas para se estudar o particionamento das moléculas entre a membrana e o meio aquoso. Contudo, dois pontos devem ser considerados em tais estudos: a escolha de um parâmetro espectral relacionado à ligação do fluoróforo e a correção do espalhamento da luz. O parâmetro espectroscopicamente observável deve ser preferencialmente uma função de resposta linear, ou seja, a mudança fracionária no parâmetro deve

14 13 coincidir com a mudança fracionária na quantidade de uma espécie molecular particular, tal como ligação versus não ligação ou incorporação versus não incorporação. Em nosso modelo, esperamos que o espectro de fluorescência do fármaco na ligação seja acompanhado de um deslocamento espectral para o azul, o que indicará a incorporação do fármaco à membrana, dado que a membrana é um meio hidrofóbico com constante dielétrica efetiva menor que o meio aquoso, e de um aumento da intensidade inicial de fluorescência (Lakowicz, 26). 1.1 Objetivos Neste trabalho de pesquisa estudaremos os anestésicos locais dibucaína (Dib) e tetracaína (TTC) e os antibióticos norfloxacina (NF) e levofloxacina (LEV) e seus respectivos complexos com ouro (AuNF) e (AuLEV) a partir da técnica de fluorescência estacionária e fluorescência resolvida no tempo. Determinaremos os tempos de vida de fluorescência e as constantes de ionização, pk a. Descreveremos ainda como as propriedades espectrais de fluorescência se alteram em função do ph. Investigaremos a interação da dibucaína com membranas enriquecidas com enzima Na,KATPase, a incorporação do fármaco à membrana. Determinaremos a constante de associação, a disponibilidade dos triptofanos e supressão de fluorescência do triptofano pela dibucaína. Desenvolveremos expressões para os fatores pré-exponenciais e as intensidades fracionárias associadas aos tempos de vida de fluorescência como função do ph para amostras fluorescentes, para obter a constante de equilíbrio da transição ácido base. Este trabalho inaugura a utilização do fluorímetro resolvido no tempo no Departamento de Física da PUC Rio. Assim, uma abordagem didática e sistemática foi realizada na apresentação dos resultados experimentais. 1.2 Estrutura dos capítulos No capítulo 2 temos uma introdução aos conceitos de fluorescência utilizados neste trabalho de pesquisa. No capítulo 3 temos uma introdução sobre

15 14 membranas biológicas com ênfase em sua composição e estrutura. No capítulo 4 temos uma descrição dos fármacos estudados neste trabalho. No capítulo 5 apresentamos os materiais, equipamentos e métodos que foram empregados nas medidas experimentais e análises dos resultados. No capítulo 6 apresentamos os resultados e discussões sobre o modelo matemático correto para os fatores pré-exponenciais e as intensidades fracionárias do decaimento da fluorescência como função do ph para amostras fluorescentes na transição ácido base. No capítulo 7 apresentamos os resultados e discussões sobre as propriedades de fluorescência da dibucaína, norfloxacina e levofloxacina. No capítulo 8 apresentamos os resultados e discussões sobre a interação da dibucaína em membrana e tetracaína em membrana.

16 2 Introdução à Fluorescência 2.1 O fenômeno da fluorescência Luminescência é a emissão de luz por alguma substância, ocorrendo a partir de estados eletrônicos excitados. Para escrever esse capítulo consultamos principalmente os excelentes livros de Valeur, 22, e Lakowicz, 26. A luminescência é formalmente dividida em duas categorias, a fluorescência e a fosforescência, dependendo da natureza do estado excitado. Fluorescência é a emissão de luz a partir de um estado excitado singleto, no qual o elétron excitado não muda a orientação de spin, continuando desemparelhado. Consequentemente, o retorno ao estado fundamental é permitido e ocorre rapidamente via emissão de um fóton. A taxa de emissão de fluorescência é tipicamente da ordem de 1 8 s -1, então o tempo de vida de fluorescência típico é da ordem de 1-9 s. Como iremos ver adiante, o tempo de vida (τ) de um fluoróforo é a média de tempo que ele passa no seu estado excitado antes de retornar ao estado fundamental. Para melhor visualizarmos a escala de tempo de vida de nanossegundos dos fluoróforos é importante contextualizarmos com respeito à magnitude da velocidade da luz. Neste sentido, temos que a luz trafega 3 cm em 1 ns. Fosforescência é a emissão de luz a partir de um estado excitado tripleto, no qual o elétron excitado muda a orientação de spin ficando emparelhado com o elétron que permaneceu no orbital fundamental. Deste modo, temos que as transições para o estado fundamental são proibidas e as taxas de emissão são mais lentas, estando compreendidas na faixa de s -1. Deste modo, o tempo de vida da fosforescência é da ordem de milissegundos segundos. Contudo, grandes tempos de vida são possíveis. A emissão de fosforescência não é comumente observada em soluções fluidas à temperatura ambiente. Isto porque existem muitos processos de desativação os quais competem com a emissão, tais como decaimento não radioativo e processos de supressão.

17 16 Os fluoróforos são divididos em duas grandes classes os intrínsecos e os extrínsecos. Fluoróforos intrínsecos são aqueles que emitem luz naturalmente. Já os extrínsecos são aqueles adicionados à amostra para desempenharem a função sonda. Os fluoróforos emitem luz geralmente na faixa de comprimentos de onda do espectro visível, ou seja, entre o infravermelho e o ultravioleta. Figura 2.1 Indicação das freqüências e dos comprimentos de onda do espectro eletromagnético. Em compostos orgânicos, o fenômeno da fluorescência ocorre tipicamente em estruturas aromáticas. Alguns dos fluoróforos típicos são a quinina, a fluoresceína, a rodamina, o POPOP. A quinina, encontrada na água tônica, foi o primeiro fluoróforo estudado e foi o responsável por estimular o desenvolvimento dos primeiros espectrofluorímetros que surgiram somente em 195. Muitos fluoróforos são encontrados nos dias atuais. Hidrocarbonetos aromáticos polinucleares, tais como o antraceno e o perileno, são também fluorescentes. Em proteínas o fluoróforo dominante é o grupo do triptofano que absorve próximo de 28 nm e emite próximo de 34 nm. Em contraste às moléculas orgânicas aromáticas, átomos são geralmente não fluorescentes em fases condensadas. Uma exceção notável é o grupo dos lantanídeos.

18 17 Figura 2.2 Emissão fluorescente da fluoresceína em meio aquoso. Laboratório de biofísica e síntese, Instituto de Física, Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro. Uma característica importante da técnica de fluorescência é a alta sensibilidade de observação. Dada esta sensibilidade, a fluorescência foi utilizada em 1877 para comprovar que os rios Danúbio e Reno eram conectados por correntezas subterrâneas. Esta conexão foi demonstrada adicionando-se fluoresceína no rio Danúbio. Após um período de sessenta horas, resíduos verdes fluorescentes apareceram em um pequeno rio que desaguava no rio Reno. Espectros de fluorescência são geralmente apresentados como espectro de emissão. Um espectro de emissão é uma curva de intensidade de fluorescência (I) versus comprimento de onda (λ) em nanômetros ou número de onda (cm -1 ). O comportamento do espectro de emissão é altamente sensível à estrutura química dos fluoróforos e à polaridade do solvente no qual estão dissolvidos. O espectro de emissão pode, por exemplo, ser deslocado para o azul se o grupo fluorescente for se aprofundando em uma proteína, bicamada lipídica ou membrana natural. Por outro lado, pode sofrer um deslocamento para o vermelho se um dado grupo fluorescente de uma proteína for desenovelado.

19 18 Os processos os quais ocorrem entre a absorção e a emissão da luz são ilustrados pelo Diagrama de Jablonski, também conhecido como Diagrama de Perrin-Jablonski (Fig. 2.3). Tais diagramas existem em uma variedade de formas e ilustram os vários processos moleculares que ocorrem em estados excitados. Os diagramas foram assim nomeados em homenagem ao professor Alexander Jablonski ( ), considerado como o pai da espectroscopia de fluorescência. Dentre as suas contribuições podemos citar sua definição do termo anisotropia para descrever a emissão polarizada de soluções. Os diagramas de Jablonski são ferramentas essenciais para a descrição dos processos quânticos envolvidos na absorção e na emissão da luz, tais como absorção de fóton, conversão interna, cruzamento intersistema, fosforescência, transições tripleto-tripleto e fluorescência. Com o diagrama podemos melhor visualizar as interações de supressão, energia de transferência e interação com o solvente. Os estados eletrônicos singletos, o fundamental, o primeiro e o segundo são descritos por S, S 1 e S 2, respectivamente. Em cada um destes níveis energéticos eletrônicos dos fluoróforos pode existir um conjunto de níveis energéticos vibracionais, denotados por, 1, 2,... As transições entre estados são descritos como linhas verticais para ilustrar a natureza instantânea da absorção da luz. As transições ocorrem em um tempo da ordem de 1-15 s, um tempo muito pequeno para o deslocamento do núcleo. O que é conhecido como princípio de Franck-Condon. À temperatura ambiente, a energia térmica não é suficiente para ocasionar uma população significativa dos estados vibracionais excitados. A absorção de fótons ocorre por moléculas com energia vibracional mais baixa. Após a absorção da luz, um fluoróforo é excitado para algum nível vibracional mais alto de seus estados de singleto S 1 e S 2 e, então, vários processos ocorrem. Conversão interna de energia é uma transição não radiativa entre dois estados eletrônicos de mesma multiplicidade de spin. Em solução, este processo é seguido por uma relaxação vibracional em direção ao mais baixo nível vibracional do estado eletrônico fundamental. O excesso de energia vibracional pode ser transferido para o solvente durante colisões entre as moléculas excitadas e as moléculas do solvente. A conversão interna ocorre em um tempo de 1-12 s ou menos e seus tempos de vida de fluorescência são da ordem de 1-8 s. A conversão interna é completada anteriormente à emissão.

20 19 Cruzamento intersistema é uma transição não radiativa entre dois níveis vibracionais isoenergéticos pertencentes a estados eletrônicos com diferentes multiplicidades. Moléculas no estado S 1 podem experimentar uma conversão de spin para o primeiro estado de tripleto, T 1. A emissão de T 1 é denominada de fosforescência e é deslocada para comprimentos de ondas maiores (energias menores) comparados à fluorescência. A transição de T 1 para o estado fundamental de singleto é proibida. Como resultado, a taxa constante de emissão para o tripleto é de várias ordens de magnitude menores que aquelas da fluorescência. Moléculas contendo átomos metálicos, tais como brometos e iodetos são freqüentemente fosforescentes. Os átomos metálicos facilitam o cruzamento intersistema e desta maneira aumentam o rendimento quântico de fosforescência. Cruzamento intersistema reverso, T 1 S 1, pode ocorrer quando a diferença de energia entre os estados S 1 e T 1 for pequena e quando o tempo de vida de T 1 for grande o suficiente. Este processo provoca a fluorescência atrasada, onde o espectro é o mesmo da fluorescência comum, no entanto o tempo de vida de decaimento de fluorescência é maior devido à permanência da molécula no estado tripleto T 1 antes da emissão de S 1. Em soluções concentradas, a colisão entre duas moléculas no estado T 1 pode fornecer energia suficiente para permitir que uma delas retorne ao estado S 1. Este processo é chamado de aniquilação tripleto-tripleto. Por outro lado, uma vez que a molécula é excitada e atinge o estado T 1, ela pode absorver fótons com outros comprimentos de onda, dado que as transições tripleto-tripleto são permitidas. A emissão de fluorescência resulta de um equilíbrio térmico dos estados excitados, isto é, dos estados vibracionais de níveis energéticos mais baixos de S 1. Já o retorno ao estado fundamental ocorre para o nível do estado fundamental excitado vibracional mais alto, o qual então rapidamente (1-12 s) alcança seu equilíbrio térmico. Uma vez excitado o fluoróforo é levado ao nível vibracional mais alto do estado eletrônico excitado, S 1. O excesso de energia é rapidamente dissipado, em um tempo da ordem de 1-12 s, levando o fluoróforo ao mais baixo nível vibracional de S 1. Por causa desta rápida relaxação, os espectros de emissão são independentes do comprimento de onda de excitação. No entanto, exceções existem, tais como os fluoróforos que existem em dois estados de ionização, cada qual exibindo distintos espectros de absorção e emissão. Por outro lado, algumas moléculas são

21 2 conhecidas por emitirem do nível S 2, mas tal emissão é rara e não são observadas em moléculas biológicas. Uma interessante conseqüência da emissão dos mais altos estados vibracionais fundamentais é que o espectro de emissão é tipicamente uma imagem espelho do espectro de absorção da transição S S 1. Esta similaridade ocorre devido ao fato de que a excitação eletrônica não altera significativamente a geometria do núcleo. Assim, o espaçamento dos níveis energéticos vibracionais do estado excitado é similar ao do estado fundamental. Como resultado, a estrutura vibracional vista no espectro de emissão e de absorção são similares. O espectro de alguns compostos, tais como o perileno, mostram uma significativa estrutura devido aos níveis energéticos vibracionais individuais do estado fundamental e do estado excitado. Outros compostos, por outro lado, podem apresentar um espectro desprovido de estrutura vibracional. Embora a regra da imagem espelho seja frequentemente válida, muitas exceções a esta regra ocorrem. Deste modo, mesmo que o espectro de absorção de um dado fluoróforo seja desprovido de estrutura vibracional, seu espectro de emissão pode apresentar esta estrutura. Tais desvios da regra da imagem espelho indicam um rearranjo diferente da geometria do núcleo no estado excitado comparado ao estado fundamental. Devido ao longo tempo de vida do estado S 1, deslocamentos do núcleo podem ocorrer antes da emissão de fluorescência. Em reações de estado excitado de complexos e exciplexes também podem ocorrer rearranjos geométricos que impliquem no desvio da regra da imagem espelho. Abaixo temos os tempos característicos dos processos associados à absorção e a emissão de fótons: Processo Tempo característico (s) Absorção 1-15 Relaxação vibracional Tempo de vida do estado excitado S Cruzamento intersistema Conversão interna Tempo de vida do estado excitado T

22 21 Um exame do diagrama de Jablonski (Fig. 2.3) nos revela que a energia de emissão é menor que a energia de absorção. Deste modo, dizemos que a fluorescência ocorre em energias menores ou comprimentos de onda maiores. Este fenômeno foi primeiramente observado por G. G. Stokes. A diferença de energia entre a excitação e a emissão é observada de maneira universal para todas as moléculas fluorescentes em solução. Outra propriedade da fluorescência é que o mesmo espectro de emissão pode ser observado para diferentes comprimentos de onda de excitação. O espectro de emissão de um fluoróforo independe do comprimento de onda da excitação. O tempo de vida de fluorescência e o rendimento quântico são talvez as mais importantes características de um fluoróforo. O rendimento quântico é a razão do número de fótons emitidos pelo número de fótons absorvidos. Substâncias com um grande rendimento quântico, aproximando-se da unidade, tais como a fluoresceína, apresentam uma emissão visivelmente brilhante. O tempo de vida determina o tempo disponível para o fluoróforo interagir com ou difundir-se no meio, e assim disponibilizar a informação de sua emissão. O significado do rendimento quântico e do tempo de vida de fluorescência pode ser melhor visualizado a partir do diagrama de Jablonski. Figura 2.3 Diagrama de Jablonski modificado. (A) absorção de um fóton, (S ) estado fundamental de singleto, (S n ) estado excitado de singleto, (S 1 ) primeiro estado excitado de singleto, (RV) relaxação vibracional, (CI) conversão interna, (CSI) cruzamento intersistemas, (T n ) estado excitado de tripleto.

23 A partir do diagrama acima podemos definir a taxa de emissão radiativa de um fluoróforo dada por Γ e não radiativa dada por k nr 22. Tanto a taxa de emissão radiativa, quando a não radiativa são responsáveis pela despopulação do estado excitado. A fração de fluoróforos que decaem através da emissão de fótons, e assim o rendimento quântico, é dada por: Γ Φ = (2.1) Γ + k nr Da equação (2.1) concluímos, naturalmente, que quanto menor a taxa não radiativa, maior o valor do rendimento quântico, de modo que Φ 1. Deste modo, o rendimento quântico pode ser tão próximo da unidade quanto menor for a taxa de decaimento não radiativo. No entanto, o rendimento quântico é sempre menor que a unidade devido à perda de Stokes. Por conveniência, todos os possíveis processos não radiativos foram agrupados a uma única taxa k nr. 2.2 Fluorescência resolvida no tempo Medidas de fluorescência podem ser classificadas em dois tipos: no estado estacionário e resolvidas no tempo. Medidas no estado estacionário são aquelas realizadas com uma iluminação e observação constantes. A amostra é iluminada com um feixe contínuo de luz e a intensidade ou espectro de emissão é então registrado. Quando a amostra é exposta à luz, o estado estacionário é alcançado quase que imediatamente. Já o segundo tipo de medidas, as resolvidas no tempo, é utilizado para medir intensidades e tempos de decaimento de fluorescência. Para estas medidas a amostra é exposta a um pulso de luz, onde a largura do pulso é tipicamente mais curto que o tempo de decaimento da amostra. Esta intensidade de decaimento é registrada com um sistema de alta velocidade de detecção que permite medir a intensidade e a anisotropia em uma escala de tempo de nanossegundos. É importante ressaltar que podemos estabelecer uma relação entre as medidas de estado estacionário e as medidas de fluorescência resolvida no tempo. A observação do estado estacionário é tida como uma média do fenômeno resolvido no tempo sobre a intensidade de decaimento da amostra. Muitos

24 fluoróforos dispõem de tempo de vida de subnanossegundos. Devido às curtas escalas de tempo da fluorescência, medidas da emissão de fluorescência resolvida no tempo requerem uma ótica e uma eletrônica sofisticada. No entanto, apesar das dificuldades experimentais, a técnica da fluorescência resolvida no tempo tem sido cada vez mais utilizada. Dada uma solução diluída de espécies fluorescentes com concentração [A] (em mol L -1 ), um pulso de luz no tempo t = leva certo número de moléculas, A, ao estado excitado de singleto S 1 através da absorção de fótons. Estas moléculas excitadas então retornam ao estado S, através dos processos radiativos, não radiativos e cruzamento intersistema. A taxa de despopulação do estado excitado pode ser descrita com a equação diferencial dada por: 1 d[ A*] s s 1 = ( kr + knr )[ A*] (2.2) dt Integrando a equação (2.2) obtemos a evolução no tempo da concentração de moléculas no estado excitado, [ 1 A *]. Deste modo, temos: 23 1 A*] = [ A*] 1 [ t exp τ s (2.3) onde [ 1 A *] é a concentração de moléculas no estado excitado no tempo t = e τ s é o tempo de vida do estado excitado S 1, dado por: 1 τ s = (2.4) k + k s r s nr A intensidade de fluorescência é definida como a quantidade de fótons emitida por unidade de tempo por unidade de volume. Assim podemos escrever: s k A* r A + fóton (2.5) A intensidade de fluorescência i F no tempo t após a excitação da amostra por um pulso de luz no tempo igual a é proporcional, em cada tempo, à concentração instantânea de moléculas no estado excitado, [ 1 A*] ; o fator de proporcionalidade é dado pela taxa radiativa = s 1 = s 1 t i F ( t) kr [ A*] kr [ A*] exp (2.6) τ s onde i F (t) é a resposta do sistema, o qual diminui de acordo com uma função exponencial. Cabe ressaltar que, para o caso de uma medida de intensidade de s k r :

25 fluorescência, a quantidade medida é proporcional a i F, onde o fator de proporcionalidade depende das condições experimentais. A medida de fluorescência será denotada por I F. O tempo de decaimento de fluorescência τ s é a propriedade mais importante de uma molécula fluorescente, porque define a janela temporal em que podemos observar o fenômeno dinâmico do sistema. Após a excitação, uma fração de moléculas do sistema pode alcançar o estado excitado tripleto, de onde retornarão ao estado fundamental via processo radiativo, emissão de fótons, e processos não radiativos. A concentração de moléculas no estado tripleto decai exponencialmente com um tempo característico τ T, o qual representa o tempo de vida do estado tripleto. Deste modo, podemos escrever: 1 τ T = (2.7) k + k T r T nr O rendimento quântico de fluorescência Φ é a fração de moléculas no estado excitado que retornam ao estado fundamental S com emissão de fótons. Assim, temos: s r s nr F s kr s Φ F = = kr τ s (2.8) k + k Por outro lado, o rendimento quântico de fluorescência é a razão do número de fótons emitidos (ao longo de toda a duração do decaimento) pelo número de fótons absorvidos. De acordo com a equação (2.6), a razão de i F (t) pelo número de fótons absorvidos é dada por: i F ( t) = s t k r exp (2.9) 1 [ A*] τ s onde a integração desta relação em toda a duração do decaimento (matematicamente de zero a infinito) nos fornece o rendimento quântico, de modo que: 24 [ 1 s if t dt = k r A ( ) 1 *] τ s = Φ F (2.1) Na fluorescência estacionária os espectros de emissão e excitação são registrados com o uso de um espectrofluorímetro. A fonte de luz é uma lâmpada

26 emitindo um fluxo de fótons constante. Sendo N o número de fótons incidentes durante um intervalo de tempo por unidade de volume da amostra com concentração do fluoróforo [A] (N e [A] em mol L -1 ), temos que α N representa a quantidade de fótons absorvidos por unidade de volume e o processo de 25 1 Ka excitação em questão é dado por A + hυ 1 A*, onde k a s. Sob iluminação contínua, a concentração [ 1 A*] permanece constante. Deste modo, dizemos que o sistema está no estado estacionário. Medidas realizadas nestas condições são chamadas de medidas de estado estacionário. A taxa temporal de mudança de [ 1 A*] é dada por: 1 d [ A*] s s 1 = = ka α N ( kr + knr )[ A*] (2.11) dt onde k a α N representa o número de fótons absorvidos por unidade de volume por unidade de tempo. Podemos reescrever a equação (2.11) em termos de α I, onde I representa a intensidade de luz incidente (em mols de fótons por litro por segundo). A concentração constante de [ 1 A*] é dada por: [ 1 A*] = α I s s k r + knr (2.12) A quantidade de fótons fluorescentes emitidos por unidade de tempo e por unidade de volume, ou seja, a intensidade de fluorescência do estado estacionário e dada por: i k α Φ (2.13) s s 1 r F = kr [ A*] = I = α I s s kr + knr A equação acima mostra que a intensidade de fluorescência do estado estacionário por fóton absorvido i F α I é o próprio rendimento quântico de fluorescência. F 2.3 Supressão de Fluorescência A intensidade de fluorescência pode ser diminuída por muitos processos. Tais diminuições em intensidade são chamadas de supressão. A supressão resulta do encontro difusivo entre fluoróforo e supressor durante o tempo de vida do estado excitado do fluoróforo. Uma grande variedade de interações moleculares

27 26 pode resultar no fenômeno da supressão. Dentre elas temos as reações de estado excitado, rearranjos moleculares, transferência de energia, formação de complexos no estado fundamental e supressão colisional ou dinâmica. Por outro lado, outro tipo de supressão, a supressão aparente, pode ocorrer devido à alta densidade ótica na excitação e emissão da amostra. A supressão de fluorescência tem sido estudada como um fenômeno fundamental e como fonte de informação sobre muitos sistemas bioquímicos. Tais aplicações bioquímicas são devidas às interações moleculares que resultam na supressão. Tanto a supressão estática quanto a supressão colisional ou dinâmica requerem contato entre o fluoróforo e supressor. No caso da supressão colisional, o supressor se difundirá no fluoróforo durante o tempo de vida de seu estado excitado. Após o contato, o fluoróforo retorna ao estado fundamental sem a emissão de um fóton. Em geral, a supressão colisional ocorre sem nenhuma alteração permanente na molécula, ou seja, sem reação fotoquímica. Já na supressão estática um complexo não fluorescente no estado fundamental é formado entre o fluoróforo e o supressor. Contudo, em ambos os casos, estático e dinâmico, para que ocorra o fenômeno da supressão o fluoróforo e o supressor devem estar em contato. Tal condição de contato implica em numerosas aplicações da supressão. Se considerarmos um fluoróforo ligado a uma proteína ou a lipídeos de membrana, por exemplo, se a proteína ou a membrana for impermeável ao supressor, e o fluoróforo estiver localizado no interior da macromolécula, nenhuma supressão estática poderá ocorrer. Por esta razão a supressão de fluorescência pode ser usada para revelar a localização de fluoróforos em proteínas e membranas, a acessibilidade dos fluoróforos aos supressores, assim como sua permeabilidade a supressores. Há uma variedade muito grande de substâncias que agem como supressores de fluorescência. Um dos mais conhecidos supressores colisionais é a molécula de oxigênio. Dependendo do tipo da amostra em investigação é frequentemente necessário remover o oxigênio dissolvido para se obter resultados confiáveis nas medidas de fluorescência estacionária e resolvida no tempo. Outros supressores eficientes são os aromáticos, halogênios, acrilamida, aminas alifáticas, dietilanilina, compostos halogênios, purinas, pirimidinas, etc. Na supressão colisional ou dinâmica, a diminuição da intensidade fluorescência é descrita pela equação de Stern-Volmer:

28 F F = + k τ [ Q] = 1 K [ Q] (2.14) 1 q + Nesta expressão F e F são as intensidades de fluorescência na ausência e presença do supressor, respectivamente, k q é a constante bimolecular de supressão; τ é o tempo de vida do fluoróforo na ausência do supressor, K D é constante de supressão de Stern-Volmer e [Q] é a concentração de supressor. A constante de supressão bimolecular, k q, nos informa a eficiência da supressão e a acessibilidade dos fluoróforos aos supressores. As medidas de supressão são geralmente representadas em um gráfico de F /F versus [Q]. Deste modo, esperase que F /F seja linearmente dependente da concentração de supressor. Um ajuste linear é indicado quando existe uma classe única de fluoróforos, estando todos acessíveis ao supressor. É importante ressaltar que a observação de um ajuste linear de Stern-Volmer não prova que a supressão colisional de fluorescência tenha ocorrido. Por outro lado, se duas populações de fluoróforos estão presentes e uma delas não está acessível ao supressor, temos que o gráfico de Stern-Volmer desvia-se da linearidade e novas considerações devem ser inseridas na equação (2.14). Outra importante característica da supressão colisional é a equivalência entre diminuição da intensidade de fluorescência e do tempo de vida, ilustrada pelas equações: τ = 1 + k [ Q q τ ] (2.15) τ De modo que, F = τ (2.16) F τ A diminuição do tempo de vida ocorre devido à diminuição da população do estado excitado devido à desexcitação por colisão. Já a supressão estática não diminui o tempo de vida porque somente moléculas fluorescentes são observadas e os fluoróforos que não formaram complexos possuem o mesmo tempo de vida τ. O fenômeno da supressão pode também ocorrer como resultado da formação de um complexo não fluorescente entre o fluoróforo e o supressor. Neste sentido, o complexo absorve luz e retorna imediatamente ao estado fundamental sem a D 27

29 28 emissão de fóton. Quando isso ocorre dizemos que a supressão é estática e é descrita por: F F = 1+ K [ Q] (2.17) S Note que a dependência de F /F de [Q] é linear, o que é idêntico para a supressão dinâmica, exceto pelo fato de que a constante de supressão agora é a própria constante de associação. A distinção entre supressão estática e supressão dinâmica pode ser realizada através da dependência distinta em função da temperatura, da viscosidade e através de medidas de tempo de vida. Em temperaturas elevadas temos uma difusão rápida, o que implica em um aumento da supressão colisional, em uma dissociação das ligações fracas, diminuindo a quantidade de complexos, em uma diminuição da supressão estática. A realização de medidas de tempo de vida é a forma mais definitiva de distinguir supressão estática e dinâmica. A supressão estática remove a fração de fluoróforos da observação, pois os complexos formados são não fluorescentes. A fração de fluoróforos que não formaram complexos possui então um tempo de vida τ. Para a supressão estática τ /τ = 1. Em contraste com a supressão dinâmica onde τ /τ = F /F. Outro método para distinguir supressão estática de supressão dinâmica é examinando o espectro de absorção do fluoróforo. Supressão colisional afeta somente os estados excitados dos fluoróforos e, portanto, não altera o espectro de absorção. Em contraste, a formação de complexos no estado fundamental frequentemente resulta em uma perturbação no espectro de absorção do fluoróforo. Em muitas situações a fluorescência pode ser suprimida por ambos os tipos de supressão: dinâmica, colidindo com o supressor, e estática, formando complexos. Neste caso, a equação de Stern-Volmer é modificada e possui um termo não linear, de segunda ordem em [Q]. O que resulta em uma concavidade positiva na curva. Deste modo, temos: F F = 1+ K [ Q] (2.18) onde K = ( K + K ) K K [ Q] depende da concentração de supressor. app D S + D S app Proteínas contêm muitos resíduos de triptofano que estão localizados em meios distintos. Deste modo, podemos fazer uso da supressão para avaliar a

30 29 acessibilidade das proteínas ao supressor. Neste caso, a equação de Stern-Volmer modificada é dada por: F 1 1 = + F F f K [ Q] f a a a (2.19) onde K a é a constante de supressão de Stern-Volmer da fração acessível, [Q] é a concentração de supressor e f a é a fração da fluorescência inicial acessível ao supressor, dada por: f F a a = (2.2) Fb + F a onde F a e F b são as intensidade de fluorescência totais na ausência do supressor do fluoróforos acessíveis e inacessíveis, respectivamente. A intensidade de fluorescência observada para um fluoróforo é proporcional à sua concentração no estado excitado, [F*]. Sob iluminação contínua, temos que a população de fluoróforos excitados é estabilizada, de modo que, d [ F*] dt =. Na ausência e na presença do supressor as equações diferenciais que descrevem [F*], são: d[ F*] = f ( t) γ [ F*] = (2.21) dt d[ F*] = f ( t) ( γ + kq [ Q]) [ F*] = (2.22) dt onde f(t) é a função de excitação constante, e γ = τ -1 é a taxa de decaimento do fluoróforo na ausência do supressor. Na ausência do supressor a população do estado excitado decai com uma taxa γ = (Γ+ k nr ), onde Γ e k nr são as taxas de decaimento radiativas e não radiativas, respectivamente. No entanto, na presença do supressor temos uma taxa de decaimento adicional dada por k q [Q]. Dividindo a equação (2.21) pela equação (2.22), temos: [ F*] [ F*] γ + kq [ Q] = = 1+ kqτ [ Q] (2.23) γ A equação de Stern-Volmer pode ser obtida considerando a fração de fluoróforos excitados que decaem por emissão em relação ao total. Essa fração F/F é dada pela razão da taxa de decaimento na ausência do supressor, γ, pela taxa de decaimento total na presença do supressor γ + k q [Q], de modo que:

31 F F γ 1 = = (2.24) γ + k Q] 1+ K τ [ ] q [ q Q A equação (2.24) é justamente a equação de Stern-Volmer. Como a supressão colisional é um processo que diminui a população do estado excitado, podemos expressar os tempos de vida na ausência e na presença do supressor por: 1 τ = γ (2.25) 1 τ = ( γ + k q [ Q]) (2.26) Assim, temos que os tempos se relacionam através: τ = 1+ k q τ [ Q] (2.27) τ Transferência de Energia Transferência ressonante de energia na fluorescência (FRET) é um fenômeno eletrodinâmico que pode ser explicado através da física clássica. A FRET ocorre entre um doador (D) e uma molécula receptora (A) no estado fundamental. As moléculas doadoras tipicamente emitem em comprimentos de onda que se sobrepõem ao espectro de absorção da molécula receptora. A transferência de energia é um processo que não envolve a emissão e reabsorção de fótons, ou seja, não é o resultado da emissão de um D sendo absorvida por um A. O termo transferência de energia ressonante (RET), portanto, mostra-se mais adequado, ao invés de FRET. Para que a FRET ocorra não é necessário que A seja fluorescente. A teoria da RET baseia-se no conceito do fluoróforo como um dipolo oscilante, o qual pode trocar energia com outro dipolo que possua uma freqüência de ressonância similar. Note que o fenômeno da RET é similar ao de osciladores acoplados. A taxa de RET depende da extensão da sobreposição entre os espectros de emissão do D e de absorção do A, do rendimento quântico do D, da orientação relativa entre os dipolos e da distância entre as moléculas do D e A. RET é comumente utilizada em todas as aplicações da fluorescência, incluindo diagnósticos médicos, análise de DNA, escaneamento ótico. O uso mais comum da RET é a determinação da distância entre dois sítios de uma macromolécula.

32 Por outro lado, RET também é usada para estudar sistemas macromoleculares mais complexos onde há uma distribuição de doadores e receptores. A transferência de energia pode ser influenciada pela presença pela difusão do par D_A durante o tempo de vida de fluorescência do D. Embora esta influência possa ser observada nas medidas de fluorescência estacionária, tais sistemas são usualmente estudados através da fluorescência resolvida no tempo. A distância em que a RET possui uma eficiência de 5% é chamada de distância de Frster, que se encontra na faixa de 2 a 6 angstrons em soluções aquosas. A taxa de transferência de energia, K t (r), de um D para um A é dada por: K 6 1 R t ( r) = τ D r (2.28) onde τ D é o tempo de decaimento do D na ausência do A, R é a distância de Frster e r é a distância entre o D e o A. Assim, a taxa de transferência de energia é igual à taxa de decaimento do doador, 1/τ D, quando D está a uma distância, r, igual à distância de Frster, R, com a eficiência na transferência de 5%. Deste modo, quando r = R a intensidade de emissão de fluorescência do D deverá diminuir em 5% da intensidade na ausência do A. Note que a taxa de transferência depende fortemente da distância e é proporcional a r -6. Distâncias de Frster na faixa de 2 a 9 angstroms são convenientes para se estudar macromoléculas biológicas, dado que estas distâncias são comparáveis ao tamanho das biomoléculas e às distâncias entre os sítios de proteínas. Determinadas condições que influem na distância D A influem consequentemente na taxa de transferência de energia. Deste modo, podemos usar a RET como uma régua espectroscópica para quantificar distâncias entre D A. A eficiência da transferência de energia, E, é definida como a fração de fótons absorvidos pelo D os quais são transferidos para o A. Esta fração é dada por: kt ( r) E = (2.29) 1 τ + k ( r) D T onde k T (r) é a taxa de transferência de energia e τ D é o tempo de vida do doador na ausência do A. Substituindo a equação (2.28) na equação (2.29), de modo a expressar a eficiência em termos do raio de Frster R e da distância entre o D e A, temos: 31

33 6 R E = (2.3) 6 R + r 6 Esta equação mostra que a eficiência de transferência de energia é fortemente dependente da distância. Por outro lado, podemos expressar a eficiência em termos da intensidade de fluorescência do D na ausência, F D, e na presença, F DA, do A. Assim, temos que: E F F DA = 1 (2.31) D A eficiência pode ser também calculada diretamente dos tempos de vida do D na ausência, τ DA, e na presença, τ D, de A. Deste modo: E τ τ DA = 1 (2.32) D Cabe salientar que estas equações são válidas somente para pares de D A que estão separados por uma distância fixa, caso típico de marcadores de proteínas. Entretanto, uma distância fixa única entre doadores e receptores não é encontrada em misturas de doadores e receptores solução, ou para receptores dispersos aleatoriamente em membranas. Modelos mais complexos são necessários nestes casos. Modelos que geralmente se baseiam em taxas médias de RET sobre uma distribuição espacial de pares de D A. 32

34 3 Membranas Biológicas 3.1 Os limites das células Figura. 3.1 Estrutura de uma célula animal. (modificada de Biologia Molecular da Célula, 4ª edição, Alberts, B., Bray, D., Lewis,J., Artmed editora, 24.) Os limites das células são formados por membranas celulares biológicas, as barreiras que definem o interior e o exterior de uma célula (Berg et al., 24, Johnson et al., 24). Estas barreiras impedem que as moléculas geradas dentro da célula vazem para fora e que moléculas indesejadas se difundam para dentro. A membrana plasmática engloba a célula e mantém as diferenças essenciais entre o citosol e o ambiente extracelular. A espessura da maioria das membranas está compreendida entre 6 nm e 1 nm. No interior de células eucarióticas, as membranas do retículo endoplasmático, o aparelho de Golgi, a mitocôndria e outras organelas limitadas por membranas mantêm as diferenças características entre os conteúdos de cada organela e os do citosol. A especialização funcional no decurso da evolução esteve intimamente ligada à formação dos compartimentos intracelulares. Sistemas específicos evoluíram para permitir o endereçamento de proteínas selecionadas para dentro de

35 34 determinadas membranas internas, ou através delas e, daí, para organelas específicas. Membranas internas e externas possuem características essenciais em comum. As membranas são tão diversas em estrutura quanto em função, servem para inúmeras funções indispensáveis à vida. Apesar das suas funções diferenciadas, todas as membranas biológicas têm uma estrutura geral comum: cada uma é um filme muito fino de moléculas lipídicas e protéicas mantidas unidas principalmente por interações não covalentes. As membranas são estruturas dinâmicas nas quais proteínas nadam em um mar de lipídeos. Os componentes lipídicos da membrana formam uma barreira de permeabilidade. As proteínas componentes agem como um sistema de bombas e canais que dotam à membrana a permeabilidade seletiva. As moléculas protéicas que atravessam a bicamada lipídica servem de mediadores para praticamente todas as outras funções da membrana. São necessárias muitas proteínas de membrana diferentes para que uma célula possa funcionar e interagir com o ambiente que a envolve. De fato, estima-se que aproximadamente 3% das proteínas que são codificadas no genoma de uma célula animal sejam proteínas de membrana. 3.2 A Bicamada Lipídica Os lipídeos são biomoléculas insolúveis em água, muito solúveis em solventes orgânicos, tal como o clorofórmio. Eles têm varias funções biológicas: servem como alimento energético, como armazenamento altamente concentrado de energia, como moléculas sinalizadoras e como componentes estruturais de membranas. Notoriamente, dentre as propriedades mais significativas dos lipídeos, estão suas propriedades hidrófobas. Estas propriedades são devidas principalmente ao seu componente principal, os ácidos graxos. Ácidos graxos são cadeias hidrocarbonadas, com vários comprimentos e grau de insaturação, que terminam em carboxilas, grupamentos ácidos. Em sistemas biológicos, no entanto, os ácidos graxos contêm um número par de átomos de carbono, tipicamente entre 14 e 24. Aqueles com 16 e 18 carbonos são os mais comuns.

36 35 Figura 3.2 Três visões de uma membrana celular. (A) Uma micrografia eletrônica da membrana plasmática de uma célula vermelha do sangue vista numa seção transversal (B e C). Visões bi e tridimensionais da membrana celular. (modificada de Biologia Molecular da Célula, 4ª edição, Alberts, B., Bray, D., Lewis,J., Artmed editora, 24) Os fosfolipídeos são abundantes em todas as membranas biológicas. Uma molécula de um fosfolipídeo é feita de quatro tipos de componentes: ácidos graxos, uma estrutura à qual se prendem estes ácidos, um fosfato e um álcool unido ao fosfato. As cadeias dos ácidos graxos fornecem uma barreira hidrófoba, ao passo que o restante da molécula tem propriedades hidrófilas que permitem a interação com o meio aquoso. Os fosfolipídeos derivados do glicerol são chamados de fosfoglicerídeos. Um fosfoglicerídeo é constituído de um glicerol, ao qual se prendem duas cadeias de ácidos graxos e um álcool fosforilado. Os fosfolipídeos encontrados nas membranas celulares são modificados no grupo fosfato. A bicamada lipídica ficou estabelecida definitivamente como a base universal da estrutura das membranas celulares. É facilmente visível por meio de microscopia eletrônica, apesar de que técnicas especializadas, como difração de raios X e microscopia eletrônica de criofratura, sejam necessárias para revelar os detalhes da sua organização. A estrutura de bicamada pode ser atribuída às propriedades especiais das moléculas lipídicas, que fazem com que elas se agrupem espontaneamente em camadas duplas, mesmo sob condições artificiais simples. A formação das membranas é uma conseqüência da natureza anfipática anfifílica das moléculas, ou seja, moléculas que contêm tanto uma porção hidrófila quanto uma hidrófoba. Os fosfolipídeos são comumente ilustrados

37 36 contendo duas partes, um corpo hidrofílico e uma cauda hidrofóbica. Os fosfolipídeos geralmente agrupam-se em três formas distintas em solução. As lâminas de bicamadas, as micelas vesículas com um interior hidrofóbico e os lipossomos vesículas com interior aquoso (Fig. 3.3). Figura 3. 3 Representação das secções da estrutura de micela, lipossoma e bicamada de fosfolipídeos. ( A estrutura favorecida para a maioria dos fosfolipídeos e glicolipídeos em meios aquosos é uma estrutura de bicamada, em vez de uma micela. O motivo é que as cadeias de ácidos graxos de um fosfolipídeo ou glicolipídeo são muito volumosas para se adaptarem no interior de uma micela. Em contraste, os sais de ácidos graxos - tais como o palmitato de sódio, um constituinte do sabão - formam micelas prontamente. A formação de bicamadas em vez de micelas é de importância biológica crítica. Uma micela é uma estrutura limitada, geralmente com menos de 2 nm de diâmetro. Por outro lado, uma lâmina bimolecular pode ter dimensões macroscópicas, de até um milímetro 1 6 nm. Fosfolipídeos e moléculas similares são constituintes importantes de membranas, porque formam prontamente extensas lâminas bimoleculares. A formação de bicamadas lipídicas é um processo de automontagem. Em outras palavras, a estrutura do agregado é intrinsecamente dependente da estrutura das moléculas lipídicas constituintes. O crescimento de bicamadas lipídicas a partir de fosfolipídeos é um processo rápido e espontâneo na água. As interações hidrófobas são as principais forças diretoras da formação de bicamadas lipídicas. Além disso, a força atrativa de van der Waals entre as caudas hidrocarbonadas favorecem o empacotamento

38 37 das caudas. Finalmente, há as atrações eletrostáticas e as pontes de hidrogênio entre as cabeças polares e moléculas de água. Deste modo, as bicamadas lipídicas são estabilizadas por todo o conjunto das forças que participam das interações moleculares dos sistemas biológicos. Como as bicamadas lipídicas são mantidas juntas por muitas interações não covalentes de reforço predominantemente hidrófobas, elas são estruturas cooperativas. Estas interações hidrófobas têm três conseqüências biológicas significativas: (1) as bicamadas lipídicas têm uma tendência inerente a serem extensas; (2) as bicamadas lipídicas tendem a fechar-se sobre si mesmas para que não haja bordas com cadeias hidrocarbonadas expostas, o que resulta na formação de compartimentos e (3) as bicamadas lipídicas são auto-selantes porque um orifício em uma bicamada é energeticamente desfavorável. 3.3 A mobilidade dos lipídeos na membrana As membranas plasmáticas não são estruturas rígidas, estáticas. Pelo contrário, os lipídeos e muitas proteínas de membrana estão em constante movimento lateral, em um processo denominado de difusão lateral, proporcionando uma fluidez à membrana. O coeficiente de difusão dos lipídeos em várias membranas é em torno de 1 µm 2 s -1. Esta velocidade significa que uma molécula lipídica pode se locomover de uma extremidade de uma bactéria para outra em um segundo. A ordem de grandeza do coeficiente de difusão observado indica que a viscosidade da membrana é cerca de cem vezes maior do que a da água, bem próxima do azeite de oliveira. Por outro lado, as proteínas variam muito em sua mobilidade lateral. Algumas proteínas são quase tão móveis quanto os lipídeos, ao passo que outras são virtualmente imóveis. Os lipídios também podem girar em torno de seu próprio eixo, apresentar movimentos de flexão por causa das cadeias de hidrocarbonetos e migrar de uma monocamada para outra. Embora a difusão lateral possa ser rápida, a rotação espontânea de lipídeos de uma face de uma membrana para a outra é um processo bem lento. O deslocamento de uma molécula de uma superfície da membrana para a outra é chamado de difusão transversa, ou flip-flop. Uma molécula de fosfolipídeo leva cerca de 1 9 mais

39 38 tempo para fazer flip-flop através de uma membrana do que para se difundir por uma distância de 5 Ǻ na direção lateral. As barreiras de energia livre para difusão transversa de moléculas de proteínas são ainda maiores do que para lipídeos, porque as proteínas têm regiões polares mais amplas. De fato, não foi observada a difusão transversa de uma molécula de proteína. O colesterol, abundante na estrutura de membranas de células animais, é um lipídeo com uma estrutura bem diferente da dos fosfolipídeos. É um lipídeo com núcleo esteróide, constituído de quatro anéis hidrocarbonados ligados. Uma cauda hidrocarbonada está ligada em uma extremidade do esteróide, e uma hidroxila na outra. Nas membranas, a molécula é orientada paralela às cadeias de ácidos graxos dos fosfolipídeos, e a hidroxila interage com as cabeças de fosfolipídeos próximas. 3.4 O Modelo do Mosaico Fluido Figura 3. 4 Modelo em mosaico fluido (Singer, S. J.; Nicolson, G. L., Science 175: 723, 1972.) Com base nas propriedades dinâmicas das proteínas nas membranas, S. Jonathan Singer e Garth Nicolson propuseram, em 1972, o conceito de um modelo em mosaico fluido para a organização global das membranas biológicas (Fig. 3.4). A idéia do modelo é organizar as membranas como soluções bidimensionais de

40 39 lipídeos orientados e de proteínas globulares. A bicamada lipídica tem um duplo papel: é um solvente para proteínas integrantes de membrana e também é uma barreira de solubilidade. As proteínas de membrana são livres para difundirem lateralmente na matriz lipídica, a menos que sejam restritas por interações especiais. As proteínas de membranas podem ser classificadas como sendo periféricas ou integrantes, dependendo da dissociabilidade da proteína. As proteínas integrantes de membrana interagem amplamente com as cadeias lipídicas. A maior parte das proteínas integrantes de membrana conhecidas atravessa a bicamada lipídica. As proteínas periféricas de membranas ligam-se primariamente às cabeças polares dos lipídeos, por interações eletrostáticas e pontes de hidrogênio. Estas interações polares podem ser rompidas pela adição de sais ou por alteração do ph. Não obstante a variedades de tipos de membranas, algumas características comuns das membranas podem ser enunciadas: (1) As membranas são constituídas principalmente de lipídeos e proteínas. Sua proporção de massas vai de 1:4 a 4:1. As membranas também contêm glicídeos que se ligam aos lipídeos e às proteínas; (2) Os lipídeos de membranas são moléculas relativamente pequenas que tem tanto uma porção hidrófila quanto uma hidrófoba. Estes lipídeos formam espontaneamente bicamadas fechadas em meios aquosos. Estas bicamadas lipídicas são barreiras ao fluxo de moléculas polares; (3) Proteínas específicas exercem funções distintas nas membranas. Elas funcionam como bombas, canais, receptores, transformadores de energia e enzimas. As proteínas de membrana são embutidas em bicamadas lipídicas, as quais criam ambientes adequados a sua ação; (4) As membranas são montagens não covalentes. As moléculas de proteínas e de lipídeos que as constituem são mantidas juntas por muitas interações não covalentes, interações que são cooperativas; (5) As membranas são assimétricas. As duas faces das membranas biológicas sempre diferem uma da outra; (6) As membranas são estruturas fluidas. As moléculas lipídicas difundemse rapidamente no plano da membrana, assim como as proteínas, a menos que sejam ancoradas por interações específicas. Em contraste, as moléculas de

41 4 lipídeos e proteínas não giram facilmente através da membrana. As membranas podem ser consideradas como soluções bidimensionais de proteínas e lipídeos orientados. 3.5 Bombas e Canais de Membrana A bicamada lipídica das membranas biológicas é intrinsecamente permeável a íons e moléculas polares. Contudo, sua permeabilidade seletiva é conferida por duas classes de proteínas de membrana, as bombas e os canais. Abaixo temos uma ilustração da bomba de Na + -K + ATPase. Figura 3. 5 Bomba de Na + -K + ATPase. (modificada de Biologia Molecular da Célula, 4ª edição, Alberts, B., Artmed editora, 24.) As bombas utilizam uma fonte de energia livre como o ATP ou a luz para impulsionar o transporte termodinamicamente desfavorável de íons ou moléculas. A ação das bombas é um exemplo de transporte ativo. A concentração de K + é tipicamente de 1 a 2 vezes maior no interior celular que no exterior, enquanto que com Na + ocorre o inverso. Estas diferenças de concentração são mantidas por uma bomba chamada de bomba de Na + -K + ATPase ou, simplesmente, de bomba de Na +, que é encontrada na membrana plasmática de todas as células animais. A bomba de Na +, K + -ATPase opera como um antiporte, bombeando Na + ativamente para fora da célula contra seu acentuado gradiente eletroquímico, e bombeando K + para o interior. Devido ao fato de a bomba hidrolisar ATP para

42 41 bombear Na + para o meio extracelular e K + para o meio intracelular, ela também é conhecida como uma bomba Na +, K + -ATPase. O gradiente de Na + produzido pela bomba dirige o transporte da maioria dos nutrientes para células animais e também apresenta um papel fundamental na regulação do ph citosólico. A bomba também regula o volume celular pelos seus efeitos osmóticos, evitando assim o rompimento de muitas células animais. Ela controla a concentração de soluto dentro da célula regulando, portanto, a osmolaridade - tonicidade - que pode fazer uma célula murchar ou inchar. Uma vez que a bomba Na + -K + move três íons carregados positivamente para o exterior celular para cada dois que bombeia para dentro, ela é eletrogênica. Esse efeito eletrogênico da bomba raramente contribui mais do que 1% para o potencial de membrana. Sendo os outros 9% dependentes da bomba Na + -K + apenas indiretamente. Canais iônicos, por outro lado, permitem aos íons fluírem rapidamente pelas membranas num sentido termodinamicamente favorável. A ação dos canais ilustra o transporte passivo ou a difusão facilitada. As proteínas de canal formam poros hidrofílicos através das membranas no estado conformacional aberto. Os grupos polares parecem revestir a parede do poro, enquanto que as cadeias de aminoácidos hidrofóbicos interagem com a bicamada lipídica. O poro afunila para dimensões atômicas em uma região em que a seletividade iônica do canal é grandemente determinada. Figura 3.6 Canal iônico típico flutuando entre as conformações aberta e fechada. (modificada de Biologia Molecular da Célula, quarta edição, Alberts, B. et al., Artmed editora, 24.) Duas propriedades importantes distinguem canais iônicos de simples poros aquosos. Primeiro, eles mostram seletividade a íons, permitindo a passagem de alguns íons inorgânicos, mas não de outros. A segunda distinção importante entre

43 42 os canais iônicos e os poros aquosos simples é que os canais iônicos não estão abertos continuamente, eles são controlados, o que lhes permite abrir por um breve tempo e então fechar novamente. Os dois fatores que determinam se uma molécula cruzará uma membrana são: a permeabilidade da molécula em uma dupla camada lipídica e a disponibilidade de uma fonte de energia. Determinadas moléculas podem passar pela membrana porque se dissolvem na bicamada lipídica. Tais moléculas são denominadas de lipófilas. Tais moléculas passarão através de uma membrana a favor de seu gradiente de concentração, num processo dito de difusão simples. De acordo com a segunda lei da termodinâmica, as moléculas movem-se espontaneamente de uma região de maior concentração para uma de menor concentração. Portanto, um aumento de entropia impulsiona o transporte através da membrana. Na maioria dos casos um canal iônico abre em resposta a um estímulo específico. Os principais estímulos conhecidos por causar a abertura de canais iônicos são: mudança de voltagem através da membrana, nos canais controlados por voltagem, um estresse mecânico, nos canais controlados mecanicamente ou a ligação de um ligante, nos canais controlados por ligantes. O ligante pode ser tanto um mediador extracelular, especificamente um neurotransmissor, canais controlados por transmissor, ou um mediador intracelular, como um íon, canais controlados por íons, ou um nucleotídeo, canais controlados por nucleotídeo.

44 4 Fármacos - Anestésicos Locais e Fluoroquinolonas 4.1 Introdução aos Anestésicos Locais O primeiro anestésico local (AL) identificado foi a cocaína. Estima-se que a cocaína é consumida pela humanidade há pelo menos cinco mil anos. Entretanto, a planta da qual a substância é proveniente, a coca, natural dos altiplanos andinos, já era utilizada por civilizações pré-incaicas florescidas no século X a.c. Os incas entendiam que a Mama Coca, tal qual a denominavam, fora um presente dos deuses para que os homens, ao mascar suas folhas, pudessem suportar a fome, a fadiga e elevar o espírito (Escohotado, 25). Figura Arbusto Erytroxylon coca (à esquerda). Estrutura química do anestésico cocaína (3 benzoiloxi 8 metil - 8- azabiciclo [3.2.1] octano-4-carboxílico ácido metil éster) purificado das folhas do Erytroxylon coca (à direita). No intuito de se pesquisar as propriedades psicotrópicas da Erythroxylon coca, Niemann em 186 e Von Anrep 188 isolaram a cocaína e descreveram a sua ação como AL. No entanto, foi somente em 1884 que Carl Koller e Sigmund Freud reconheceram o significado clínico da cocaína no alívio da dor em vários procedimentos biomédicos (Goth, 1976). Os benefícios da cocaína foram largamente difundidos e, em um período de um ano, o fármaco passou a ser amplamente administrado em vários procedimentos médicos e odontológicos (Yagiela, 1998). Contudo, devido aos efeitos adversos, grau de toxicidade e

45 dependência química, a cocaína foi aos poucos sendo substituída por outros anestésicos mais apropriados. 44 Figura 4.2 Anúncio sobre analgésico para dores de dente, Em 1892, Einhorn e seus colaboradores começaram a pesquisar o uso de anestésicos locais que não causassem dependência. Desde então outros fármacos eficazes na prática clínica foram descobertos. O segundo AL obtido foi a procaína sintetizada pelo próprio Einhorn em 194. Este foi o primeiro AL administrado adequadamente com o uso de injeção. Como nenhum fármaco é atualmente isento de toxicidade potencialmente grave e efeitos adversos, muitas pesquisas de novos e mais adequados AL desde então têm sido realizadas (Yagiela, 1998). Muitos outros AL de grande importância foram descobertos. A lidocaína, atualmente o anestésico mais popular em odontologia, foi o primeiro anestésico do grupo amida a ser sintetizado, em 1943, por Nils Löfgren, e pode ser considerado como o protótipo inaugurador da família dos AL. Os AL podem ser classificados de acordo com sua especificidade química ou, ainda, com base em seus usos clínicos (Goth, 1976). Os AL abrangem uma variedade de moléculas de diferentes estruturas químicas (Gupta, 1991; Lochynski et al., 22). A molécula de um AL típico é dividida em três partes: um grupo aromático, uma cadeia intermediária e um grupo terminal de amina secundária ou terciária. Todos os três componentes são determinantes para a atividade anestésica. A parte aromática confere propriedades lipofílicas à molécula. O grupo amino fornece hidrossolubilidade. A porção intermediária é importante tanto para separar espacialmente as extremidades lipofílicas e hidrofílicas do AL, quanto para conferir a ligação química entre a cadeia de hidrocarboneto central e a porção

46 aromática (Goth, 1976). Tal ligação química intermediária nos permite classificar os AL em dois grupos, os ésteres (- COO -) e as amidas (- NHCO -). 45 Ésteres do Ácido Benzóico Cocaína Tetracaína - Pontocaína Piperocaína - Meticaína Hexilcaína - Ciclaína Etil aminobenzoato - Benzocaína Butacaína - Butin Ésteres do Ácido Meta-Aminobenzóico Ciclometicaína - Surfacaína Metabutoxicaína - Primacaína Ésteres do Ácido p-aminobenzóico Procaína - Novocaína Butetamina - Monocaína Cloroprocaína - Nesacaína Amidas Lidocaína - Xilocaina Dibucaína - Nupercaína Mepivacaína - Carbocaína Prilocaína - Citanest Bupivacaína - Marcaína A importância clínica desta classificação se justifica na duração do efeito do AL e especialmente no risco de reações alérgicas. Os grupos éster ou amida de uma molécula determinam suas características de degradação metabólica. Os ésteres são hidrolisados por enzimas encontradas amplamente no plasma sanguíneo e diferentes tecidos, o que acarreta em uma menor duração no efeito. Já as amidas sofrem metabolismo hepático, proporcionando uma maior duração na ação e ainda uma diminuição no risco de alergias. Os AL possuem várias aplicações clínicas dependendo de suas propriedades farmacológicas. Algumas destas aplicações são: (1) anestesia por infiltração e bloqueamento procaína, cloroprocaína, hexilcaína, lidocaína, mepivacaína, bupivacaína, piperocaína, prilocaína, propoxicaína, tetracaína, butetamina, metabutetamina, isobucaína, meprilcaína e pirocaína; (2) anestesia superficial benzocaína, benoxinato, butacaína butil aminobenzoato, cocaína, ciclometicaína, dibucaína, dimetisoquin, diperodon, diclonina, hexilcaína, lidocaína, fenacaína, piperocaína, pramoxine,

47 46 proparacaína, tetracaína, benzil álcool, fenol, e etil cloride; (3) anestesia espinhal - tetracaína, procaína, dibucaína, lidocaína, mepivacaína, e piperocaína; (4) anestesia epidural e caudal - lidocaína, prilocaína, mepivacaína, cloroprocaína, piperocaína e tetracaína; (5) anestesia intravenosa lidocaína e procaína (Fuchs & Wannamacher, 1998). Abaixo temos uma tabela com alguns dos AL existentes. Anestésico Abreviação R 1 R 2 X Estrutura Química Benzocaína Cloroprocaína Procaína Tetracaína Bupivacaína Mepivacaína Lidocaína Prilocaína Dibucaína Por constituírem moléculas anfifílicas os AL têm grande afinidade pelas membranas celulares. Sua ação é capaz de bloquear de forma reversível a condução do estímulo nervoso através dos canais de sódio. Em membranas excitáveis eles inativam os canais de sódio voltagem-dependente, impedindo assim o influxo de íons necessários à despolarização da membrana (Covino &

48 47 Vassalo, 1985). O mecanismo de ação de um AL se dá pelo bloqueamento da sensação de dor através da interferência com a propagação dos impulsos nervosos periféricos. Neste mecanismo, tanto a produção, quanto a condução dos potenciais de ação são inibidas. Dados eletrofisiológicos indicam que os AL não alteram significativamente o potencial de repouso normal da membrana nervosa, e sim diminuem certas respostas dinâmicas à estimulação nervosa (Yagiela, 22). Os efeitos dos AL no fluxo iônico são de grande interesse. Muitos estudos enfatizam a relação entre estes fármacos, os íons de cálcio e efeitos no fluxo de sódio. Existem vários sítios na membrana nervosa onde os AL podem interferir na permeabilidade do sódio. Neste sentido, fármacos capazes de bloquear a condução nervosa podem ser caracterizados de acordo com seus respectivos sítios de ação. Há muitas teorias que buscam descrever o mecanismo de ação dos AL. No entanto, podemos enquadrá-las em duas hipóteses de ponto de partida em comum. 1) A hipótese protéica propõe que a ação do AL se dá por sua interação direta e específica com a proteína de membrana canal de Na + causando um bloqueio de sua condutância (Ragsdale et al., 1994). Esta hipótese sustenta-se na idéia de que existem receptores específicos para os AL na membrana nervosa, sendo estes os próprios canais de Na +. Foi proposta largamente para explicar a ação dos anestésicos amino terciários, tais como a procaína. 2) A hipótese lipídica também conhecida como teoria da expansão da membrana, propõe que o mecanismo de ação se dá pela interação não específica do anestésico com os componentes lipídicos da membrana (Lee, 1976; Smith et al., 1991). Deste modo, as alterações causadas pela interação dos AL com os fosfolipídeos nas propriedades estruturais e dinâmicas da matriz lipídica provocariam alterações conformacionais no canal de sódio, explicando desta forma a sua inativação. Analisando a interação dos AL com apenas a fase lipídica membranar observaram-se efeitos de expansão da bicamada e de diminuição na temperatura principal de transição de fase, fatores esses que aumentariam a fluidez e a permeabilidade da membrana (de Paula & Schreier, 1996). A incorporação do anestésico pela fase lipídica provocaria uma expansão da área superficial das monocamadas (Skou, 1954) e das bicamadas (Seelig, 1987). Tal expansão é favorecida pela diferença entre o comprimento da molécula do anestésico - mais curto - e o dos fosfolipídios. Assim, abaixo do seu ponto de inserção, o anestésico

49 48 criaria um volume livre, que seria compensado com uma mudança conformacional das cadeias lipídicas adjacentes, diminuindo o comprimento total da bicamada, bem como a sua expansão lateral (Trudell, 1977; Gallová & Balgavý, 1997). É geralmente aceito que tanto a interação com os lipídeos quanto com as proteínas de membrana pode levar à inativação do canal iônico neural. Contudo, dado que o movimento transbicamada da molécula de anestésico para o lado citoplasmático das membranas excitáveis é uma condição para a sua ação, a análise da interação do anestésico com os lipídeos de membrana parece ser um primeiro passo. As propriedades lipofílicas dos AL são essenciais para a penetração em barreiras anatômicas existentes entre o local de administração e seu local de ação. Já as propriedades hidrofílicas asseguram que, uma vez injetada em concentração adequada, a droga não se precipitará com a exposição ao líquido intersticial (Morgan, 1996). Os dois fatores que mais afetam a ação do AL são o ph do meio biológico, ou seja, o ph do tecido em questão e o pk a do anestésico. Os AL são bases orgânicas fracas, pouco solúveis em água. As soluções anestésicas comerciais são preparadas como sais ácidos. Tais sais são hidrossolúveis, possuem uma maior estabilidade e são geralmente obtidos por adição de acido clorídrico (Yagiela, 22). Contudo, a acidez tecidual diminui a eficácia do anestésico no bloqueamento da transmissão nervosa. Os produtos da inflamação tecidual diminuem o ph do tecido afetado, retardando assim o início da anestesia local. Potência de um AL a potência de um anestésico é a capacidade que sua molécula tem de interferir na estrutura dos canais iônicos e assim inibir seu funcionamento. A potência está relacionada às interações diretas com as proteínas de membrana e com a lipofilia do AL. Algumas propriedades importantes são: quanto maior a ligação com as proteínas plasmáticas, menor será a potência e menor a sua toxidade; quanto maior for a lipofilia (coeficiente de partição octanol: água), maior será a potência (melhor penetração na membrana); quanto maior a fração não ionizada, maior é a facilidade de penetração na membrana, maior potência (menor latência). Por fim, temos que os AL são fármacos que bloqueiam reversivelmente a condução nervosa periférica quando aplicados a uma região circunscrita do corpo

50 49 (Ragsdale et al., 1994). Entretanto, os AL possuem uma variedade de efeitos nos sistemas biológicos que não somente os efeitos de anestesia provenientes do bloqueio nervoso. Os AL têm sido aplicados, por exemplo, para inibir a polimeração de microtúbulos, para proteger células vermelhas do sangue da hemólise, para suprimir a proliferação de células cancerígenas (Sakagushi et al., 26), como agente antiinflamatório (Cassuto, et al, 26). 4.2 Equilíbrio de Ionização da Dibucaína A dibucaína pode existir em três estados de ionização dependendo do ph do meio (Fig. 4.3). Assim, em solução aquosa, podemos ter três espécies moleculares, ou seja, a dicatiônica, a monocatiônica e a neutra. Figura Estrutura molecular da Dib nas espécies dicatiônica, monocatiônica e neutra, respectivamente. Vanderkooi (1984) em seu trabalho analisa os espectros de absorção, espectros de emissão de fluorescência e os tempos de vida de fluorescência para todos os três estados de ionização do anestésico. O pk a do grupo aromático N

51 5 (pk 1 ) é muito baixo, com seu valor em torno de 1.77, enquanto que o pk a para a amina terciária (pk 2 ) se encontra na faixa alcalina, com seu valor em torno de Em suas medidas de absorção ótica da dibucaína em seus três estados de ionização o autor observa que a desprotonação do N aromático causa uma alteração apreciável no espectro. Por outro lado, a desprotonação da amina terciária N causa pequenas alterações no espectro na banda de 3 a 35 nm. 4.3 Introdução aos Antibióticos Fluoroquinolonas Os fármacos da família das quinolonas são classificados em três gerações. A primeira geração, composta pelos antibióticos ácido nalidixíco, ácido piromídico, cinoxacina e rosoxacina, possui ação sobre as enterobactérias. Contudo, esta geração não apresenta atividade antipseudomonas ou Gram-positivos, com seu uso limitado ao trato urinário (Wang et al., 28). A segunda geração, composta pela norfloxacina e ácido pipemídico, amplia seu campo de ação contra pseudomonas, com atividade para trato urinário e intestinal. A terceira geração, composta pela levofloxacina, ciprofloxacina, pefloxacina, ofloxacina, lomefloxacina, fleroxacina, enoxacina e difloxacina, atua contra Gran-negativos incluindo pseudomonas e estafilococos, estendendo assim sua aplicação para tratamentos sistêmicos. Por fim, com a descoberta das quinolonas da quarta geração, composta pela esparfloxacina, temafloxaxina, tosufloxacina e clinafloxacina o campo de ação compreende estreptococos hemolíticos, pneumococos e anaeróbios (Vieira, 27). Como descrito acima, a cada nova geração de quinolonas há uma maior ação antimicrobiana, maior potência antibactericida e maior número de propriedades farmacológicas. As quinolonas possuem excelente distribuição nos vários tecidos e fluidos corporais. A atividade bactericida das quinolonas inibe a ação das subunidades A da DNA-girase, enzima responsável pela divisão da dupla cadeia do DNA cromossômico (Zhang et al., 27). Estes antibióticos são comumente utilizados no tratamento clínico de várias infecções, tais como infecções urinárias, infecções do tecido liso, infecções respiratórias, infecções de junta óssea, infecções recorrentes ou crônicas por pseudomonas na fibrose cística, otite média, meningite, prostatite, sinusite e outras (Vilchez et al., 21). Além

52 51 disso, também são aplicados no tratamento e prevenção doenças veterinárias e produção de alimentos para animais (Barbosa et. al., 1998). As fluoroquinolonas (ou ácidos piridinocarboxílicos) são membros das quinolonas que possuem flúor em sua estrutura. Abaixo temos a estrutura molecular da primeira quinolona e da primeira fluoroquinolona sintetizadas a apresentarem atividade antibacteriana. Figura 4.4 Estrutura molecular da primeira quinolona sintetizada, ácido nalidíxico (esquerda), no ano de 1962; estrutura molecular da primeira fluoroquinolona sintetizada (direita), flumequina, no ano de 1973 O comportamento in vivo destes fármacos é fortemente afetado por suas propriedades físico químicas, em particular suas propriedades de ionização em função do ph e sua capacidade para formar complexos com íons metálicos (Drakopoulos & Ioannou, 1997, Park et al., 22). De fato é bem conhecido que as fluoroquinolonas são capazes de formar complexos com certos cátions multicarregados. Muitos autores têm pesquisado os complexos formados entre quinolonas e cátions tais como Al 3+, Mg 2+, Fe 3+, Ca 2+ e Cu 2+. O principal objetivo destes estudos é o de compreender o mecanismo de ação destes complexos. A presença de centros carregados em muitos fármacos pode ser essencial para a sua atividade biológica e sua passagem através de membranas celulares. A constante de dissociação pode ser um parâmetro chave para compreender e quantificar diversos processos químicos, tais como a taxa de reação, atividade biológica e mecanismos de transporte (Barron et. al., 2). Muitos fármacos possuem grupos ionizáveis e as fluoroquinolonas exibem características zwiteriônicas em ph neutro. A característica zwiteriônica representa um tipo de soluto com interações intra- e intermoleculares que influenciam diretamente suas propriedades físicoquímicas (Pistos et al., 25). Muitos estudos têm sido realizados sobre a interação destes fármacos com ácidos nucléicos. Tais estudos

53 52 não só fornecem informações sobre a farmacologia, a farmacocinética e a função toxicológica, mas também as propriedades fluorescentes das fluoroquinolonas (Wang et al., 28). Elementos metálicos desenvolvem um papel muito importante em processos como divisão celular, síntese de proteínas e atividade de enzimas. O estudo de complexos de elementos metálicos com fármacos e da interação destes complexos com proteínas e membranas biológicas se apresenta como uma necessidade fundamental para se compreender a aplicação destes complexos na prevenção e tratamento de doenças (Barbato et. al. 27). A norfloxacina, assim como outras fluoroquinolonas, possui dois sítios de coordenação com metais de transição. Norfloxacina é coordenada a ions Ag(I) e Au(III) através do átomo de N do anel piperidina, mas Cu(II) é coordenado através dos átomos de oxigênio da carbonila e do grupo carboxílico (Refat, 27). Figura Estrutura proposta para o complexo de NF com Au (III) em solvente orgânico DMSO. 4.4 Equilíbrio de Ionização das Fluoroquinolonas Podemos encontrar as fluoroquinolonas (Q) nas formas: protonada, H 2 Q + (em meio ácido), na forma não carregada zwiteriônica HQ ± (em meio neutro ou fracamente ácido), e como um ânion Q (em meio alcalino). As constantes macroscópicas de ionização se referem aos prótons 3-carboxil e 7-piperazina. O equilíbrio protolítico das fluoroquinolonas para os meios ácido, neutro e alcalino está representado na Fig. 4.4.

54 53 Figura 4.6 Equilíbrio protolítico das fluoroquinolonas nos meios ácido (H2Q+), neutro (H2Q±) e alcalino (Q-), da esquerda para a direita, respectivamente (Barbosa et al., 1999). O comportamento das fluoroquinolonas é fortemente influenciado por suas propriedades fisico-químicas, em particular podemos ressaltar as constante de ionização pk a e o coeficiente de partição K p. A atividade antibacteriana destes fármacos, por exemplo, é dependente do ph. A diminuição progressiva da atividade química em ph baixo é muitas vezes atribuída à baixa penetração da espécie catiônica na membrana celular (Popovic et. al., 1998). Devido aos seus grupos ionizáveis, muitas moléculas biologicamente ativas estão completamente ou parcialmente ionizadas em ph fisiológico. O exame detalhado do equilíbrio de ionização de fármacos em solução é essencial para compreender sua atividade. A constante de ionização e o coeficiente de associação do fármaco constituem dados fundamentais para compreender sua absorção biológica e seus receptores e transportadores em nível molecular (Barbosa et al., 1999). 4.5 Norfloxacina e Levofloxacina Norfloxacina (NF) e Levofloxacina (Lev) são fluoroquinolonas zwiteriônicas com ação antibactericida com administração oral. Suas fórmulas podem ser expressas por C 16 H 18 FN 3 O 3 e C 18 H 2 FN 3 O 4, respectivamente. Suas estruturas aparecem nas Figs. 4.7 e 4.8.

55 54 Figura Estrutura química da Norfloxacina, 1-ethyl-6-fluoro-1,4-dihydro-4-oxo-7-(1- piperazinyl)-3-quinolinecarboxylic acid (Borrego et al., 1996), à esquerda; estrutura química da Levofloxacina, (3S)-9-fluoro-3-methyl-1-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-oxo-2,3-dihydro- 7H-[1,4]oxazino[2,3,4-ij]quinoline-6-carboxylic acid, à direita. Tanto a NF quanto a Lev possuem dois grupos funcionais aceitadores de prótons correspondendo a dois equilíbrios químicos de ionização. O grupo carboxílico, que se encontra na posição 3, protona-se em meio ácido. Já o grupo associado ao N 4 do anel piperazina na posição 7 desprotona-se em meio alcalino (Drakopoulos & Ioannou, 1997).

56 5 Materiais e Métodos 5.1 Materiais Reagentes Dibucaína (Dib), tetracaína (TTC), norfloxacina (NF) e levofloxacina (Lev) foram obtidas de Sigma e utilizadas sem purificação. Os complexos de NF e Lev com ouro (AuNF e AUNor) foram sintetizados no Lab. da Prof. Letícia Teixeira (Lachter et al.). Foram utilizados os seguintes tampões: - Tampão universal (borato, citrato, fosfato.67 M em Na) foi preparado a partir de uma solução estoque de 1 ml contendo 34.4 ml de Na OH 1N, volumes de H 3 PO 4 1N e de ácido cítrico 1N padronizados para 1 ml da solução de NaOH 1N e, finalmente, 354 g de ácido bórico (Louro et. al., 1994). O ph do tampão era ajustado adicionando-se alíquotas de HCl 1M à solução estoque previamente diluída. - Tampão Tris 3 mm, ph 7.4. O ph era ajustado com pequenas quantidades de soluções concentradas de HCl. Água Milli-Q foi utilizada em todas as preparações. Soluções estoques concentradas dos anestésicos foram preparadas em etanol. Amostras de Dib e TTC para fluorescência foram preparadas no tampão indicado, na concentração de 1 µm. Nos experimentos de associação a membranas foi utilizado tampão tris (ph 7.4) e as amostras de Dib e TTC na concentração de 1 µm foram tituladas com membrana em concentrações crescentes (de 2 a 5 µg/ml). Soluções estoques concentradas dos antibióticos e seus complexos com ouro foram preparadas em solvente orgânico DMSO. Amostras de NF, AuNF, Lev e AuLev para fluorescência foram preparadas em tampão universal na concentração de 6 e 7 µm.

57 56 A Proteína Na +, K + - ATPase Membranas contendo Na +,K + -ATPase foram preparadas no Instituto de Bioquímica Médica do laboratório LERPA estrutura e regulação de proteínas e ATPases - Universidade Federal do Rio de Janeiro, a partir de rim de porco, conforme procedimento descrito em (Cortes et al, 26, Jorgensen, 1974, Jensen, 1984) e gentilmente cedidas pelo Prof. Carlos Frederico Fontes. A suspensão estoque de membranas com concentração de 1 mg/ml em proteína e atividade aproximada de 4 µm Pi mg -1 min -1, foi separada em alíquotas de 4 µl e armazenada em freezer a 15 C. A partir de alíquotas descongeladas no mesmo dia do experimento, amostras com diferentes concentrações de proteína foram preparadas, adicionadas diretamente em cubetas de quartzo para a realização das medidas. 5.2 Equipamentos phmetro Para medidas de ph foi utilizado o phmetro Cole-Parmer Chemcadet , com um eletrodo semimicro combinado Ag/AgCl. Espectrofotômetro Espectros de absorção ótica na faixa de 22 8 nm foram obtidos em temperature ambiente (25 C) com um espectrofotômetro de diodo HP 8452A. Espectrofluorímetro estacionário As medidas de fluorescência foram feitas no sistema de Fluorescência PTIQM-1 equipado com controlador de temperatura, operando majoritariamente com todas as fendas em 4 nm e potência de lâmpada de 4 W. A taxa de varredura utilizada foi de 1 nm/seg. Todas as medidas foram realizadas com concentrações e comprimentos de onda de excitação em valores de absorbância menor que,1 de modo a evitar os efeitos de filtro interno.

58 57 Fluorímetro resolvido no tempo A medição da fluorescência resolvida no tempo exige equipamentos sofisticados, pois em geral os tempos de vida de fluorescência são muito curtos, variando na faixa de centenas de picosegundos a nanosegundos. O equipamento modular de fluorescência resolvida no tempo TCSPC 5 U Horiba Jobin Ivon IBH se baseia na técnica de contagem de fóton único correlacionada no tempo (TCSPC Time Correlated Single Photon Counting). O equipamento possui um sistema de bombeamento com uma lâmpada pulsada que possibilita medidas de tempos de vida < 1ps. Além disso, possui também um conjunto de 11 entre lasers e LED de estado sólido (NanoLEDs) com pulsos de curta duração (<2ps) e com taxa de repetição de 1 MHz, que cobrem uma larga parte do espectro desde 28 nm até 65 nm. O sistema é controlado por computador através de um software Windows compatível. Abaixo, nas Figs. 5.1 e 5.2, temos a descrição do equipamento com duas visualizações Figura 5.1 1: Computador, 2: DataStation Hub (Controlador de NanoLEDs, monocromadores, polarizadores, lentes e detector de fótons TBX), 3: Fonte e controle para o detector MCP, 4: Fonte e controle para lâmpada de Xenônio, 5: Fonte e controle para lâmpada NanoFlash.

59 Figura 5.2 1: NanoLEDs (283nm; 33nm; 559nm), LASERs (372nm; 45nm; 43nm; 64nm), 2: Lâmpada de Xenônio, 3: Lâmpada NanoFlash de Hidrogênio, 4: Controle da abertura (slit) e monocromador de excitação, 5: Polarizador de excitação, 6: Câmara da amostra com opção de medidas em função da temperatura, 7: Polarizador de emissão, 8: Controle da abertura (slit) e monocromador da emissão, 9: Detector (Picosecond photon detection TBX-4), 1: Detector MCP-PMT (Microchannel Plate Photomultiplier Tube). Análise em fluorescência resolvida no tempo Para a determinação dos tempos de vida e dos demais parâmetros da fluorescência resolvida no tempo foi utilizado o modelo multi-exponencial dado por: t N ( t) = A + α exp (5.1) i i onde A é uma constante associada ao ruído, τ i são os tempos de vida das espécies presentes na amostra e α i são os fatores pré-exponenciais. Para ajustar as curvas de decaimento medidas utilizamos dois módulos de análise, o individual e o global. Na análise individual, o programa DAS6 - Horiba Jobin Ivon nos permite realizar ajustes com até cinco exponenciais, ou seja, considerando cinco tempos de vida na equação (5.1). A parametrização é realizada através de uma avaliação criteriosa do χ 2, da distribuição dos resíduos e do comportamento coerente dos parâmetros para com o nosso modelo teórico. Já na análise global o programa nos τ i

60 59 permite realizar ajustes com até quatro exponenciais tendo τ 1, τ 2, τ 3 e τ 4 únicos para todas as curvas de decaimento. O ajuste é feito de modo iterativo entre as curvas de decaimento de tempo de vida. Abaixo, temos um exemplo de ajuste realizado. Figura 5.3 Exemplo de ajuste realizado com o módulo de análise global. No quadro em evidencia à esquerda temos os resultados do ajuste. À direita acima temos uma das curvas de decaimento com o ajuste multi-exponencial. À direita abaixo temos a distribuição dos resíduos. 5.3 Métodos Síntese dos complexos de NF e Lev com ouro Os complexos de Au(III) foram obtidos por (Lachter et al., 29), dissolvendo-se,25 mmol dos ligantes Nor e Lev, em aproximadamente 4 ml de metanol. Após a dissolução completa dos ligantes,,25 mmol de HAuCl 4 foram adicionados, os quais foram solubilizados previamente em metanol. A mistura permaneceu sob refluxo e agitação por aproximadamente 24 horas. Os