EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA RELATÓRIO FINAL

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1 EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA EMBRAPA RECURSOS GENÉTICOS E BIOTECNOLOGIA RELATÓRIO FINAL Identificação, caracterização e disponibilização de estirpes de Bacillus thuringiensis eficazes ao controle de lepidópteros desfoliadores da cultura do algodão ROSE GOMES MONNERAT SOLON DE PONTES BRASÍLIA NOVEMBRO 2003

2 1- RESUMO A utilização de agentes de controle biológico é uma alternativa viável, e bioinseticidas formulados à base de Bacillus thuringiensis vem apresentando resultados satisfatórios no controle de lepidópteros. Uma das vantagens do emprego desta bactéria é a sua ação restrita a insetos-alvo, não afetando o ser humano e não danificando o meio ambiente. A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia conta com um Banco de Germoplasma de Bacillus entomopatogênicos onde estão armazenadas 1375 estirpes de B. thuringiensis oriundas de diferentes regiões do Brasil. Este trabalho teve como objetivo selecionar as estirpes mais eficazes para controle de Spodoptera frugiperda, uma das principais pragas do algodão no Brasil. Para isso a eficácia das estirpes foi avaliada através de testes de patogenicidade contra Spodoptera frugiperda (Lep.: Noctuidae) efetuando-se de bioensaios seletivos. As que apresentaram alta atividade foram submetidas a novos bioensaios para determinação da CL 50. Das 1375 estirpes testadas, 31 causaram 100% de mortalidade em bioensaios seletivos. Destas, três estirpes apresentaram CL 50 inferiores ao padrão (Btk). A caracterização bioquímica e molecular indicou que as três estirpes apresentam composição protéica e perfil de genes cry distintos da estirpe padrão, que pode explicar a maior toxicidade dessas estirpes. Nos últimos meses de realização do projeto foram instaladas colônias de Alabama argilacea e Heliothis virescens e, como continuação do projeto, as estirpes selecionadas para S. frugiperda serão testadas contra esses dois insetos. Espera-se assim, identificar uma estirpe ativa, ao mesmo tempo, contra todas as lagartas que atacam o algodão.

3 2- Introdução A cultura do algodão está passando pela crise mais séria de sua história no Brasil. Os motivos são vários, vão desde fatores estruturais até conjunturais e agronômicos. Uma das principais conseqüências dessa crise é a drástica redução da área plantada, que passou de mil ha em 1982 para 668 mil ha em 1997, correspondendo a cerca de 85% de decréscimo no referido período. Os números que caracterizam essa crise são alarmantes: cerca de trabalhadores desempregados e importação de US$ 1,15 bilhão de torta, óleo, línter e fibra do algodão. Entre as dez principais culturas cultivadas no Brasil, a do algodão ocupa o sexto lugar mundial em superfície cultivada. A planta de algodão possui numerosas glândulas, denominadas nectários, que produzem uma secreção líquido-resinosa açucarada, que faz com que sua cultura seja uma das mais atrativas aos insetos. Os danos provocados por cada um deles podem variar de uma região para outra, e seu controle pode chegar a até 25% do custo da produção. Dentre os insetos desfoliadores associados ao algodoeiro, destacamse como pragas importantes (Figura 1): 1- Curuquerê - Alabama argilacea (Hueb., 1818 ) (Lepidoptera: Noctuidae) 2- Lagarta da maçã - Heliothis virescens (Fabr., 1781) (Lepidoptera: Noctuidae) 3- Lagarta rosada - Pectinophora gossypiella (Saund, 1844) (Lepidoptera - Gelechiidae) 4- Lagarta do cartucho do milho Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae)

4 a b c c d Figura 1: Larvas de Spodoptera frugiperda (a), Alabama argilacea (b), Heliothis virescens (c) e Pectinophora gossypiela (d) O curuquerê ataca as folhas, destruindo o limbo, as nervuras e os pecíolos. O severo desfolhamento que pode causar reduz a produção. Provoca, ainda, a maturação forçada das maçãs diminuindo a resistência das fibras. A lagarta da maçã destrói as maçãs e os botões florais, favorecendo ainda, a penetração de microrganismos através dos orifícios que forma. A lagarta rosada ataca inicialmente os botões florais, impede a abertura das pétalas, impossibilitando conseqüentemente a formação das maçãs. Estas, no entanto, quando formadas são igualmente atacadas e as fibras e as sementes são destruídas. A lagarta do cartucho do milho se alimenta das

5 folhas no seu estágio mais jovem e penetra nas maçãs e nos botões florais, causando grande destruição e dificultando o seu controle (Nakano et al., 1992). A principal forma de controle destes insetos tem sido feita pela utilização de produtos químicos (França, 1994), cuja aplicação exige um grande investimento, onerando ou mesmo inviabilizando em alguns casos a produção. Esses agrotóxicos, além de caros, causam danos ao meio ambiente e geram riscos de intoxicação ao homem. Segundo dados do IPM Working for Development, quase 25% de todos os pesticidas utilizados pela humanidade são gastos na cotonicultura, movimentando um mercado de US$ 7,5 bilhões/ano. A importância do controle de pragas do algodoeiro e o aumento da consciência da população para os efeitos diretos e indiretos dos pesticidas na saúde pública e no ambiente em geral, tem demandado novas formas de controle de pragas, que sejam mais econômicas e menos danosas ao ecossistema. Dessa forma, o desenvolvimento de novos produtos e variedades de plantas com resistência a pragas e/ou doenças são alternativas de controle que podem ser mais eficazes, além de evitar danos ao meio ambiente. No caso específico do controle de pragas, alternativas biológicas incluem a utilização de bactérias, fungos, vírus e até de substancias produzidas pelo próprio inseto. Esses agentes podem ser manipulados para o aumento da patogenicidade, ampliação do espectro de ação, produção industrial ou a incorporação de genes inseticidas em espécies vegetais levando a obtenção de plantas transgênicas. Dos vários agentes microbianos que possuem atividade entomopatogênica, se destaca o Bacillus thuringiensis (Berliner), bactéria de ampla distribuição geográfica, específica para controlar insetos. Uma das

6 grandes vantagens de sua utilização é sua inocuidade ao homem e animais domésticos, além de seu efeito não poluente ao ambiente. A atividade inseticida desta bactéria é devida a produção de inclusões protéicas cristalinas durante a fase de esporulação. Estas proteínas se denominam δ- endotoxinas ou cristal parasporal (Aronson, 1986). A maioria das cepas de B. thuringiensis pode sintetizar mais de um tipo de cristal (Lereclus et al., 1993), que podem estar formados por distintas δ-endotoxinas, relacionadas entre si. Relatos recentes citam o registro de mais de 120 toxinas diferentes produzidas por esta bactéria. Laboratórios em todo o mundo procuram estirpes com novas toxinas e outras características de patogenicidade, que possibilitem uma maior disponibilidade de princípios ativos que poderão ser usados para o estabelecimento de estratégias de controle. Existem atualmente no mercado produtos à base de B. thuringiensis que são empregados para o controle de algumas lagartas. No Brasil, o uso desses produtos é ainda restrito, pois, devido ao preço elevado do dólar, a sua utilização encarece muito o custo da produção. A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia conta com um projeto intitulado Banco de germoplasma de Bacillus entomopatogênicos onde estão armazenadas estirpes de B. thuringiensis isoladas a partir de amostras de solo, água e insetos mortos oriundos de diferentes regiões do Brasil. Testes de patogenicidade avaliam a eficácia deste material contra diferentes pragas da agricultura (Monnerat et al., 2001) e este trabalho tem demonstrado o potencial de algumas destas cepas. Podemos apontar como exemplo deste tipo de trabalho, o isolamento de uma estirpe de B. sphaericus altamente tóxica para larvas de mosquitos. Essa estirpe, batizada como S2 se mostrou 25% mais eficaz do que a estirpe 2362, recomendada pela Organização Mundial de Saúde contra Culex quinquefasciatus.

7 A eficiência desta coleção no controle das lagartas do algodão está sendo verificada para a identificação das estirpes mais eficazes. Como resultado final, espera-se disponibilizar estirpes nacionais de Bacillus thuringiensis com eficiência comprovada nas condições de campo brasileiras.

8 3- REVISÃO DE LITERATURA Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria gram positiva, da família Bacillaceae que produz no momento de sua esporulação inclusões protéicas cristalinas. Estas inclusões contém proteínas denominadas delta-endotoxinas que formam atualmente uma família de 110 membros, classificados em 22 grupos. Elas são produzidas sob a forma de protoxinas, as quais são transformadas em peptídeos tóxicos no intestino do inseto, pela ação do ph alcalino intestinal e de proteases. A toxina ativada causa a lise das células epiteliais e a morte das larvas (Aronson et al., 1986). Uma das vantagens da utilização de Bt é sua especificidade aos insetos sensíveis, seu efeito não poluente ao meio ambiente, sua inocuidade aos mamíferos e vertebrados e ausência de toxicidade às plantas (Whiteley & Schnepf, 1986; O.M.S., 1987). Produtos a base desta bactéria para o controle de pragas agrícolas são comercializados há mais de cinqüenta anos, sendo o seu mercado anual estimado em 100 milhões de dólares. Prevê-se que esta utilização vá aumentar na medida em que legislações de proteção ambiental mais rigorosas forem adotadas e produtos mais eficientes e baratos forem lançados (Dias, 1992). A primeira menção a doenças em insetos causada por este tipo de bactéria data de 1902, quando Ishiwata no Japão descreveu uma bactéria esporulante responsável pela mortalidade do bicho-da-seda, Bombix mori e a chamou de Bacillus sotto. Em 1911, Berliner, na Alemanha, redescreveu a mesma bactéria isolada a partir de lagartas da traça da farinha Anagasta kuhniella e, em 1915, a chamou de Bacillus thuringiensis, em homenagem a região de onde as lagartas foram coletadas (Whiteley & Schnepf, 1986; Dias, 1992).

9 As possibilidades de utilização do Bt foram logo reconhecidas em controle biológico, e em 1938 uma formulação a base desta bactéria, a Sporeína foi produzida na França (Weiser, 1986). A partir dos anos 1950, diversos países como a Rússia, a Checoslováquia, a França, a Alemanha e Estados Unidos começaram a produzir inseticidas biológicos à base de Bt (Weiser, 1986). Nos anos 60 foi isolada uma estirpe de Bt subsp. kurstaki, chamada HD-1 (Dulmage, 1970) que apresentou uma toxicidade de 2 a 200 vezes superior às estirpes normalmente utilizadas nos produtos comerciais. A partir de então, a procura por outras estirpes, possuidoras de novas toxinas foi estimulada e em 1977, Goldberg e Margalit isolaram uma estirpe eficaz contra Dípteros (Goldberg & Margalit, 1977). Alguns anos mais tarde, em 1983, uma outra estirpe foi identificada como patogênica contra Coleópteros (Krieg et al, 1983). No mundo inteiro, diversas estirpes de Bt foram isoladas e atualmente diversos laboratórios continuam procurando por outras novas. Existem várias coleções espalhadas pelo mundo e estima-se que existam estirpes conhecidas. Entre estas, existem algumas que são eficazes contra diversas ordens de insetos (lepidópteros, dípteros e coleópteros) e contra outros grupos de invertebrados (nematóides, ácaros e protozoários) (Edwards et al., 1988; Feiltelson et al., 1992; Crickmore, et al. 1995). Toxinas produzidas por Bacillus thuringiensis δ-endotoxinas Este grupo de toxinas, também chamado de proteínas Cry é um dos formadores do cristal protéico. Estas proteínas apresentam peso molecular variando de 65 a 138 kda. O processo de formação deste cristal está ligado à esporulação. Os estudos efetuados sobre a esporulação mostraram que o cristal é formado a partir do segundo estágio da esporulação e é liberado

10 quando as células são lisadas. As etapas da esporulação e biogênese do cristal seguem os seguintes passos: Estágio 1: A célula para seu crescimento e sua parede celular se modifica; Estágio 2: O septo de esporulação é formado e a cromatina é dividida em duas partes. Começa neste momento a aparição de uma estrutura condensada que é o cristal. Estágio 3: Formação do pré-esporo Estágio 4: Crescimento do esporo e formação do cortex. Estágio 5: Formação do envelope esporal que envolve o esporo. O cristal, fora deste envelope, continua seu crescimento. Estágio 6: Maturação do esporo, o cristal atinge seu tamanho máximo. Estágio 7: Ruptura da célula e liberação do cristal e do esporo. A classificação das proteínas Cry se baseia na similaridade das seqüências de aminoácidos (Crickmore et al., 1998). Existem mais de 190 diferentes genes cry e as proteínas Cry estão agrupadas em 40 classes. A atualização constante desta nova classificação se encontra disponível no site: WWW: Dentre as estirpes de B. thuringiensis, algumas apresentam um único gene codificador das proteínas Cry. Outras estirpes apresentam cinco genes diferentes, como é o caso da subespécie aizawai HD-137 e subespécie israelensis IPS-82. Esta última apresentou cinco genes codificadores da δ- endotoxina e um outro gene que codifica uma citolisina, todos localizados em um único plasmídeo de 72Mda (Bourgouin et al., 1988). As toxinas do tipo Cry1 têm 36 subgrupos representados por Cry1Aa,..., Cry1Ka (Crickmore et al., 1998). Algumas destas proteínas são ativas contra insetos da ordem Lepidoptera, como por exemplo, as toxinas Cry1C e Cry1D que apresentam atividade contra S. frugiperda e S. exigua (Bravo et al., 1998) e ainda, a toxina Cry1Cb, isolada de B. thuringiensis subsp. galleriae, com

11 massa molecular em torno de 130 kda e tóxica a S. exigua e Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) (Kalman et al., 1993). Cita-se, ainda a proteína Cry1E que apresenta distintas eficiências de controle em Spodoptera sp. (Loguercio et al., 2001). Algumas toxinas pertencentes ao grupo Cry1 podem apresentar atividade dupla contra lepidópteros e dípteros e contra lepidópteros e coleópteros, como é o caso das proteínas Cry1Ca e Cry1Ba (Bradley et al., 1995), respectivamente. Vale ressaltar que as proteínas Cry1Ab e Cry1Ca mostraram atividade contra mosquitos (Haider e Ellar, 1987; Smith et al., 1996). O grupo de proteínas do tipo Cry2 é formado por quatro membros: Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac e Cry2Ad (Crickmore et al., 2002). A toxina do tipo Cry2A foi isolada da subespécie kurstaki. A toxina do tipo Cry2B apresenta 89% de identidade com a Cry2A e é altamente tóxica contra Lymantria dispar (Lepidoptera: Lymantriidae), Heliothis virescens (Lepidoptera: Noctuidae) e T. ni e não apresentou toxicidade contra Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Portanto, a toxina do tipo Cry2 é produzida por estirpes de várias subespécies de B. thuringiensis, apresenta alta atividade larvicida para lepidópteros e baixa para dípteros (Dankocsik et al., 1990; Wu et al., 1991). Essas toxinas apresentam peso molecular de 65 kda e formam cristais cubóides (Hofte e Whiteley, 1989; Lereclus et al., 1989). O grupo das proteínas Cry3 apresenta quatro integrantes: Cry3Aa, Cry3Ba, Cry3Bb e Cry3Ca. Essas toxinas apresentam peso molecular de 73 a 75 kda (Crickmore et al., 2002) e produzem cristais rombóides. Krieg et al. (1983) descreveram a primeira estirpe produtora de gene cry3. Estas proteínas são tóxicas a insetos da ordem Coleoptera, como por exemplo, Lepitnotarsa decemlineata (Besouro da batata do Colorado) (Coleoptera: Chrisomelidae) (Donovan et al., 1988). A toxina Cry3Ba foi isolada de B. thuringiensis subsp. tolworthi (Sick et al., 1990), a proteína Cry3Bb é ativa

12 contra Diabrotica undecimpunctata (Coleoptera: Chrisomelidae), a proteína Cry3A contra o afídeo da batata, Macrosiphum euphorbiae (Hemiptera: Aphididae) e a proteína Cry3Ca foi isolada de B. thuringiensis subsp. kurstaki e apresentou toxicidade contra L. decemlineata superior as que as outras proteínas Cry3 apresentaram (Lambert et al., 1992). A classe Cry4 apresenta duas proteínas Cry4Aa e Cry4Ba. Essas proteínas são ativas contra dípteros. Os genes cry4a e cry4b foram isolados das estirpes de B. thuringiensis subsp. israelensis e codificaram proteínas de 128 e 135 kda, respectivamente, e, além disso, formam cristais complexos de forma ovóide (Hofte e Whiteley, 1989) ou composta (esférica ou retangular) (Lereclus et al., 1989). As proteínas Cry5 são ativas contra nematóides, ácaros e formigas e, ainda, mostram atividade contra coleópteros e lepidópteros. A proteína Cry5Aa e Cry5Ab foram isoladas de B. thuringiensis subsp. darmstadiensis e apresentam peso molecular de 152 e 142 kda, respectivamente (Crickmore et al., 2002). Ambas as toxinas são ativas contra nematóides e ácaros (Monnerat e Bravo, 2000). Já as proteínas Cry5Ac e Cry5Ba apresentam peso molecular de 135 e 140 kda (Crickmore et al., 2002), respectivamente e são eficazes contra himenópteros e coleópteros (Monnerat e Bravo, 2000). As toxinas Cry6 são ativas contra nematóides e ácaros (Monnerat e Bravo, 2000) e são formadas por dois integrantes: Cry6Aa e Cry6Ba (Crickmore et al., 2002). O grupo das proteínas Cry7 está representado por dois subgrupos: Cry7Aa e Cry7Ab. A toxina Cry7Aa apresenta peso molecular de 129 kda e atividade contra coleópteros e lepidópteros (Lambert et al., 1992). A toxina Cry7Ab codifica uma proteína de 130 kda e foi isolada de B. thuringiensis subsp. dakota (Crickmore et al., 2002) e é ativa contra coleópteros (Monnerat e Bravo, 2000).

13 As toxinas do grupo Cry8 são três: Cry8Aa, Cry8Ba e Cry8Ca. As proteínas Cry8Aa e Cry8Ba foram isoladas de B. thuringiensis subsp. kumamotoensis e codificam proteínas de 131 e 134 kda, respectivamente (Crickmore et al., 2002). A primeira apresenta atividade dupla para coleópteros e afídeos e a segunda apenas contra coleópteros (Monnerat e Bravo, 2000). A proteína Cry8Ca foi isolada de B. thuringiensis subsp. japonensis apresentou atividade contra um escarabeídeo, Anomala cuprea (Coleoptera: Scarabaeidae) (Hori et al., 1994; Sato et al., 1994), portanto é eficaz contra insetos da ordem Coleoptera e apresenta peso molecular de 130 kda. A classe Cry9 é formada por seis integrantes: Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Ca, Cry9Da, Cry9Ea e Cry9Eb. As proteínas Cry9Aa e Cry9Ba foram isoladas de B. thuringiensis subsp. galleriae, sendo que gene cry9aa apresenta atividade contra Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) e o gene cry9ca foi isolado de B. thuringiensis subsp. tolworthi e é efetivo contra Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Pyralidae) e Choristoneura fumiferana (Lepidoptera: Tortricidae) (Jansens et al., 1997), a proteína Cry9Ea foi isolada de B. thuringiensis subsp. aizawai (Ben-Dov et al., 1999) e todas apresentam peso molecular de 130 kda. A proteína Cry9Da foi isolada de B. thuringiensis subsp. japonensis e codifica uma proteína de132 kda (Crickmore et al., 2002) e é ativa contra escarabeídeos da Ordem Coleoptera (Wasano e Ohba, 1998). Algumas destas proteínas são também eficazes contra lepidópteros (Crickmore et al., 2002). O grupo das proteínas Cry10 é constituído por apenas um subgrupo: Cry10Aa. A toxina do tipo Cry10Aa foi isolada de B. thuringiensis subsp. israelensis e codifica uma proteína de 78 kda (Thorne et al., 1986). Da mesma forma que Cry10A, a toxina do tipo Cry11Aa, também, foi isolada a partir de B. thuringiensis subsp. israelensis e codifica uma proteína de 72 kda (Donovan et al., 1988). A proteína Cry11Ba foi isolada de B. thuringiensis

14 subsp. jegathesan e apresenta alta eficácia contra os mosquitos das espécies A. aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi (Diptera: Culicidae) (Delecluse et al., 1995) e a Cry11Bb foi isolada B. thuringiensis subsp. medellin e é altamente tóxica às larvas de A. aegypti, Anopheles albimanus e Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae) (Orduz et al., 1998). Estas proteínas apresentam peso molecular de 81 e 84 kda, respectivamente. Portanto, as proteínas do grupo Cry10 e Cry11 são ativas contra dípteros. Cry12Aa é uma toxina com atividade dupla contra nematoídes e ácaros (Monnerat e Bravo, 2000) e apresenta peso molecular de 142 kda, enquanto Cry13 é tóxica apenas para nematóides e apresenta uma proteína de 88kDa (Crickmore et al., 2002). A proteína Cry14Aa foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. sotto codifica uma proteína de 132 kda (Crickmore et al., 2002) e é ativa contra dípteros e coleópteros (Monnerat e Bravo, 2000). A toxina do tipo Cry15 apresenta atividade específica contra lepidópteros, codifica uma proteína de 34 kda e foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp thompsoni (Brown e Whiteley, 1992), Ressalta-se, contudo, que nem todos os cristais são oriundos da mesma espécie de bactéria. Por exemplo, as proteínas Cry16 e Cry17 cujos genes cry16aa e cry17aa foram isolados a partir da estirpe CH18 da bactéria anaeróbica Clostridium bifermentans subsp. malaysia e não de uma subespécie de B. thuringiensis. A proteína Cry16 apresentou atividade contra três insetos da ordem Diptera: A. aegypti, C. pipiens e A. stephensi, entretanto a proteína Cry17 não apresentou atividade significativa contra insetos da ordem Diptera. Estas toxinas apresentaram peso molecular de 71 e 72 kda, respectivamente (Barloy et al, 1996, 1998). As proteínas Cry18, do mesmo modo que as proteínas Cry16 e Cry17, não foram isoladas de nenhuma estirpe de B. thuringiensis. As proteínas Cry18Aa, Cry18Ba e Cry18Ca foram isoladas do cromossomo do patógeno obrigatório Bacillus popiliae e apresentaram peso molecular de 79, 76 e 78

15 kda, respectivamente (Crickmore et al., 1998). O gene cry18aa codifica uma proteína com atividade contra o coleóptero Melolontha melolontha L (Coleoptera: Scarabaeidae), que apresenta 40% de identidade com a proteína Cry2 de B. thuringiensis (Zhang et al., 1997). As proteínas Cry19 mostraram atividade contra dípteros e possuem dois integrantes: Cry19Aa e Cry19Ba. Cry19Aa foi isolada de B. thuringiensis subsp. jegathesan, com peso molecular de 75 kda (Rosso e Delecluse, 1997), enquanto a Cry19Ba foi isolada de B. thuringiensis subsp higo e apresenta peso molecular de 78 kda e apresenta atividade para C. pipiens, mas não para A. stephensi, além disso, possui 49% de identidade e 56% de similaridade com Cry19Aa (Hwang et al., 1998). Cry20Aa foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. fukuokaensis e mostrou atividade contra os dípteros A. aegypti e C. quinquefasciatus e codifica uma proteína de 86 kda (Lee e Gill, 1997). Cry21Aa e Cry21Ba são eficazes contra nematóides, enquanto Cry22Aa é eficaz contra himenópteros e apresenta peso molecular de 79kDa; já as proteínas Cry22Ab e Cry22Ba apresentam toxicidade a insetos da ordem Coleoptera (Crickmore et al., 2002). As proteínas Cry23 e Cry24 cujos alvos ainda não foram determinados, embora se saiba que elas são codificadas por um gene críptico. A proteína do tipo Cry25Aa foi isolada da estirpe de B. thuringiensis subsp. jegathesan é ativa contra dípteros e apresenta peso molecular de 76 kda (Crickmore et al., 2002). Cry26Aa e Cry28Aa foram isoladas de B. thuringiensis subsp. finitimus e não tiveram ainda sua atividade determinada (Wojciechowska et al., 1999). Cry27Aa foi isolada da estirpe de B. thuringiensis subsp. higo e apresenta peso molecular de 94 kda (Crickmore et al., 2002). Cry29Aa e Cry30Aa foram isoladas da estirpe B. thuringiensis subsp medellin e são eficazes contra insetos da ordem Diptera. As proteínas do tipo Cry31, Cry32 e Cry33 não tiveram seus alvos determinados até o momento.

16 As proteínas Cry32Aa, Cry32Ba e Cry32Ca foram isoladas de B. thuringiensis subsp. yunnanensis e a proteína Cry33Aa foi isolada da estirpe B. thuringiensis subsp. dakota (Crickmore et al., 2002). As proteínas do grupo Cry34 apresentam quatro integrantes: Cry34Aa, Cry34Ab, Cry34Ac e Cry34Ba com peso molecular de 14 kda. Já as proteínas Cry35Aa, Cry35Ab e Cry35Ac apresentam peso molecular de 44 kda. As toxinas do grupo Cry34 e Cry35 mostraram-se ativas contra o coleóptero Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae) (Crickmore et al., 2002; Ellis et al., 2002). As proteínas Cry36 e Cry38 são ativas contra insetos da ordem Coleoptera. A proteína Cry37 ainda não teve seu alvo determinado. As proteínas Cry39 e Cry40 foram isoladas da estirpe de B. thuringiensis subsp. aizawai e apresentaram atividade mosquitocida (Crickmore et al., 2002). As proteínas Cyt são constituídas pelos grupos Cyt1 e Cyt2. A classe Cyt1 possui três integrantes: Cyt1Aa, Cyt1Ab e Cyt1Ba os quais foram isolados, respectivamente, de estirpes de B. thuringiensis subsp. israelensis (Ward et al., 1988), B. thuringiensis subsp. medellin (Thiery et al., 1997) e B. thuringiensis subsp. neoboensis. Todas apresentaram peso molecular de 27 kda (Crickmore et al., 2002). A classe Cyt2 possui cinco integrantes: Cyt2Aa, Cyt2Ba, Cyt2Bb, Cyt2Bc e Cyt2Ca. As proteínas Cyt2Aa e Cyt2Ba foram isoladas, respectivamente, das estirpes de B. thuringiensis subsp. kyushuensis e B. thuringiensis subsp israelensis, ambas apresentaram peso molecular de 29 kda (Koni e Ellar, 1993). A proteína Cyt2Bb foi isolada de B. thuringiensis subsp jegathesan e apresenta peso molecular de 30 kda (Cheong e Gill, 1997). Todas essas proteínas são ativas contra insetos da ordem Diptera. Com relação a Cyt2Bc pouco se sabe e, até o momento, seu alvo ainda não foi determinado. Finalmente a Cyt2Ca apresenta atividade contra insetos da ordem Coleoptera e contra Ctenocephalides spp. (Siphonaptera: Pulicidae) (Crickmore et al., 2002).

17 α-exotoxina A α-exotoxina conhecida também como fosfolipase C, lecitinase ou fosfatidilcolina fosfohidrolase é uma enzima que possui atividade citolítica ao atuar sobre os fosfolipídeos que formam as membranas de diversos tipos celulares (Faust & Bulla Jr., 1982). Esta toxina é encontrada no sobrenadante de culturas e é altamente tóxica para certos insetos através de administração oral ou intra-hemocélica, causando degeneração e lise de hemócitos (Krieg, 1971). O gene correspondente a esta exotoxina já foi clonado e seqüenciado (Lechner et al, 1989). β-exotoxinas A β-exotoxina ou thuringiensina é uma toxina termoestável produzida por certas estirpes de Bt durante a fase vegetativa e secretada no meio de cultura. Ela é produzida em grande quantidade por estirpes do sorotipo H1 e em menores quantidades por algumas estirpes dos sorotipos H4a4b, H4a4c, H5, H9, H10, H11, H12 (Sebesta et al, 1981). A toxina do tipo I é um análogo do ATP e é composta de adenina, ribose, glicose e ácido fosfoalárico, com massa molecular de 701 daltons (Farkas et al, 1969). Esta toxina atua inibindo a ação da RNA polimerase, através da competição pelo ATP e é altamente tóxica para várias ordens de insetos, ácaros, nematóides e também vertebrados, com efeitos teratogênicos e mutagênicos (Sebesta et al, 1981). Assim, a partir de 1970, os produtos comerciais de Bt à base de linhagens do sorotipo H1 foram substituídos por outros à base de linhagens não produtoras de β-exotoxina (Sebesta et al, 1981). A β-exotoxina do tipo II é produzida por estirpes pertencentes ao sorotipo H8a8b (morrisoni), é um análogo do UTP e apresenta toxicidade superior à toxina do tipo I, principalmente para coleópteros (Levinson et al, 1990). Estes autores afirmaram que os

18 genes responsáveis pela síntese de β-exotoxina estão localizados em plasmídeos de 75 ou 110 MDa. Vip3A Uma nova classe de proteínas inseticidas, Vip3A, com atividade contra larvas de lepidópteros foi descrita por Estruch et al (1996). Essas proteínas são produzidas e secretadas por algumas estirpes durante a fase vegetativa e de esporulação, têm uma massa molecular predita de 88,5 kda, não têm homologia com proteínas conhecidas e apresentam atividade contra insetos pouco sensíveis à maioria das δ-endotoxinas, como Agrotis ipsilon, S. frugiperda e S. exigua. A clonagem e caracterização de dois genes homólogos, vip3a(a) e vip3a(b), de diferentes estirpes foram descritas (Estruch et al, 1996). Esta foi uma descoberta importante, pois atualmente não só se aproveitam a mistura de esporos e cristais obtidos após o cultivo de Bt, como também se poderá utilizar o sobrenadante das mesmas. Mecanismo de ação das proteínas Cry Os sintomas que são observados a partir do momento em que as larvas dos insetos susceptíveis ingerem os cristais e esporos são: parada alimentar, paralisia do intestino, vomito, diarréia, paralisia total e finalmente a morte (Gupta et al., 1985; Aronson et al., 1986). Estudos histopatológicos mostraram que as células colunares do intestino médio são afetadas inicialmente e em particular sua microvilosidade apical, que é totalmente destruída (Ebersold, et al., 1978, Percy & Fast, 1983). Os efeitos nas células caliciformes (Cioffi, 1984) são mais lentos, mas neste caso á citólise também foi observada (Gupta et al., 1985, Bravo et al., 1992). O mecanismo de ação das proteínas Cry é um processo de vários passos:

19 a) Solubilização Os cristais produzidos por Bt se solubilizam a ph alcalino (Gringorten et al., 1992); também é necessário um meio ambiente redutor, já que as pontes dissulfeto são abundantes na metade C-terminal das proteínas de 130 kda (Knowles, 1994). O intestino médio da maior parte das larvas de insetos susceptíveis (lepidópteros, dípteros e alguns coleópteros) se caracteriza por seu alto ph e condições redutoras (Knowles, 1994). Uma exceção é a proteína Cry3A que se dissolve tanto a ph ácido (3,9 a 4,2) como em ph alcalino (9,5 a 11,3) mas permanece insolúvel em ph neutro (Koller et al., 1992). Cry3A é ativo contra larvas de crisomelídeos cujo ph intestinal é ligeiramente ácido (Weltens et al., 1992), e neste caso supõe-se que devam existir outros fatores no conteúdo intestinal que promovam a solubilização desta toxina. b) Processamento A maior parte das proteínas Cry são produzidas como protoxinas que para serem ativadas devem ser processadas pelas proteases do intestino médio dos insetos liberando o fragmento tóxico, ficando desta forma um fragmento resistente a proteases de entre 55 e 65 kda. O alineamento das seqüências de aminoácidos dos membros da família Cry mostrou que as toxinas de 70 kda (Cry2, Cry3 e Cry 11) podem ser consideradas como formas naturais truncadas das proteínas de alto peso molecular (Höfte & Whiteley, 1989). O processamento é um fator que pode contribuir na determinação da especificidade. Um exemplo ilustrativo é o caso da toxina Cry1Ab da cepa IC1 de Bt var. aizawai, a qual é tóxica para lepidópteros (Pierris brassicae) quando se processa com tripsina, e ativa para os dípteros (Aedes aegypti) quando é tratada com suco gástrico destes mosquitos (Haider & Ellar, 1989).

20 Apesar de se conhecer com certo detalhe como ocorre o processamento das toxinas de Bt, não existe informação suficiente sobre as enzimas que estão envolvidas neste processo. O sequenciamento da extremidade N-terminal dos fragmentos tóxicos das toxinas Cry1, Cry2 e Cry4 sugere que as principais proteases envolvidas são enzimas do tipo da tripsina, a quimiotripsina e a termolisina (Dai & Gill, 1993). No caso dos coleópteros foi encontrado que as enzimas digestivas predominantes no intestino médio são do tipo cisteíno-proteases (Thie & Houseman, 1990) e é provável que estas sejam as proteínas envolvidas no processamento das toxinas do tipo Cry3. c) União ao receptor Após serem ativadas, as proteínas Cry se unem a sítios específicos localizados na microvilosidade das células colunares do intestino médio das larvas de insetos susceptíveis: lepidópteros (Hofman et al., 1988), coleópteros (Bravo et al., 1992) e dípteros (Ravoahangimalala et al., 1993). A união a estes sítios é a etapa determinante da alta especificidade das δ-endotoxinas (Van Rie et al., 1989) por isso diversos grupos de pesquisa tem dedicado um grande esforço a entender como ocorre este processo. A metodologia mais usada são os estudos cinéticos de união utilizando proteínas marcadas com isótopos radioativos e vesículas de membrana da microvilosidade apical (VMMA). Foi demonstrado que para haver toxicidade precisa haver união, mas que o fato de haver união não quer dizer que haja toxicidade (Wofsberger 1990 a ; Gould et al., 1992; Ihara et al., 1993; Estada & Ferré, 1994; Escriché et al., 1994, Lee et al., 1995 ; Wright et al., 1997).

21 1- União reversível e irreversível Os estudos de competição homóloga tem mostrado que a cinética de união das δ-endotoxinas as VMMA dos insetos susceptíveis é bifásica, composta de um passo reversível e outro irreversível (Hofmann et al., 1988; Van Rie et al., 1989). A interação inicial entre a toxina e seu sítio de união (união reversível) é um requisito para a toxicidade, mas não é suficiente. Os eventos posteriores tais como a união irreversível e a inserção na membrana parecem estar mais correlacionados com a toxicidade. 2- Natureza bioquímica do receptor Importantes esforços tem sido dirigidos a identificação, purificação e caracterização do receptor das proteínas Cry, na microvilosidade apical das células colunares do intestino médio. A metodologia mais empregada tem sido separar as proteínas VMMA em eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes e posteriormente transferi-las para papel de nitrocelulose. A união específica da toxina a alguma das bandas se revela com anticorpo anti-toxina e logo com um segundo anticorpo ou então, podese utilizar toxina marcada (biotina-estreptavidina ou 125 I). Esta evidencia sugere que o sítio que reconhece a toxina na proteína de união é um epítope muito pequeno ou então um carboidrato (Cioffi, 1984). Fazendo este tipo de experimentos se tem encontrado que para a maioria das toxinas Cry1 estudadas as moléculas as quais se unem com maior afinidade são glicoproteínas de entre 63 e 220 kda (Haider & Ellar, 1987; Oddou et al., 1991; Garczynski et al., 1991; Knowles et al., 1991; Indrasith & Hori, 1992). Se propõe que a interação inicial é a existente entre a toxina e o carboidrato do receptor, enquanto que a irreversível está associada com uma interação proteína-proteína (Liang et al., 1995). Este tipo de estudos é ainda insipiente para o caso dos coleópteros e dípteros. Se encontrou que no coleóptero Tenebrio molitor a molécula de

22 união é uma proteína de 144 kda (Belfiore et al., 1994). Uma banda de 148 kda e outra de 78 kda foram identificadas como as proteínas de união para a toxina Cry11Aa nas vesículas dos mosquitos Anopheles stephensi e Tipula oleraca (Feldmann et al., 1995) respectivamente. Os maiores avanços no esclarecimento da natureza bioquímica dos possíveis receptores para as proteínas Cry1, foram obtidos durante os três últimos anos. d) Inserção na membrana A fase irreversível da união das δ-endotoxinas na membrana é considerada como uma evidência de que as proteínas Cry se inserem na membrana para em seguida causar a destruição do tecido intestinal das larvas de insetos susceptíveis (Van Rie et al., 1989; Ihara et al., 1993; Liang et al., 1995). Com base no conhecimento que se tem sobre a inserção de outras toxinas bacterianas formadoras de poro (Li, 1992; Parker & Pattus, 1993) foi proposto dois modelos possíveis da inserção de toxinas Cry na membrana. Um primeiro modelo (modelo de "abre cartas"), propõe que as α-hélices 5 e 6 se inserem na membrana como conseqüência de uma mudança conformacional causado pelo receptor, sem maior participação das hélices e domínios restantes. O outro modelo ( modelo de guarda-chuva) sugere que após a união com o receptor, se insere a região α4-α5, enquanto que o resto das hélices se arranjam sobre a superfície da bicamada lipídica expondo para ela sua face hidrofóbica, ficando a molécula desta forma com forma parecida a um guarda-chuvas (Knowles, 1994).

23 e) Agregação Experimentos de proteção osmótica demonstram que após unir-se ao receptor e inserir-se na membrana, as proteínas Cry formam poros com um diâmetro de 1 a 2 nm (Knowles & Ellar, 1987). O tamanho destes poros e a aparição freqüente de múltiplos estados de condutância nos estudos da atividade das proteínas Cry em bicamadas lipídicas planas (Slatin et al., 1990; Schwartz et al., 1993; Grochulski et al, 1995; Schwartz et al., 1997) tem sido considerados como evidencias da formação de diversos estados de agregação das δ-endotoxinas. f) Formação do poro e Citólise Foi proposto que as proteínas Cry causam a morte das células epiteliais ao inativar o sistema que mantém o gradiente de ph (Wolfersberger, 1992) e por citólise osmótica (Knowles & Ellar, 1987). As toxinas Cry aumentam a permeabilidade das microvilosidades apicais a cátions, ânions, água e moléculas de maior tamanho. Isto causa um colapso na diferença de potencial e por tanto, perda da força motriz que dirige a entrada de aminoácidos ao interior celular, assim como a redistribuição dos cátions entre o lúmem e o citoplasma. Considera-se que o efeito mais devastador deste processo é a alcalinização do citoplasma, já que isto interfere no metabolismo celular normal, e tem como conseqüência final a destruição do epitélio intestinal (Harvey, 1992; Wolfersberger, 1992). Uma vez que as células colunares e caliciformes são destruídas, os esporos de Bt tem acesso a hemolinfa, meio onde se proliferam. Foi demonstrado que em alguns casos os efeito das proteínas Cry e dos esporos é sinergético (Johnson & McGaughey, 1996) e que alguns destes esporos contem toxina na superfície, o que assegura seu acesso a hemolinfa (Du & Nickerson, 1996). A conseqüência final da destruição do intestino médio e a proliferação de bactérias na hemolinfa é a morte das larvas por inanição e septicemia.

24 Utilização B. thuringiensis pode ser considerado como o agente biológico de maior potencial para o controle de insetos-praga florestais, agrícolas e vetores de doença, graças à especificidade das δ-endotoxinas aos insetos e invertebrados-alvo, e sua inocuidade aos vertebrados e meio ambiente, inclusive insetos benéficos e inimigos naturais (Krieg & Langenbruch, 1981), fazendo deste agente um componente-chave em estratégias de manejo integrado de pragas (Bravo & Quintero, 1993; Schnepf et al, 1998). Além disto, pesticidas à base de proteínas Cry têm baixo custo de desenvolvimento e registro, em relação a um novo inseticida químico sintético (Schnepf et al, 1998). Bioinseticidas à base de Bt têm sido usados em todo o mundo com sucesso há quase 4 décadas, correspondendo a cerca de 90% dos biopesticidas comercializados no mundo (Bravo & Quintero, 1993) e a 1,5-2,0% do mercado total de inseticidas (Dias, 1992), tendo sido responsável por um mercado de US$ 100 milhões em 1990 (Rigby, 1991). No início de 1998, havia aproximadamente 200 produtos à base de Bt registrados nos Estados Unidos (Schnepf et al., 1998), desenvolvidos por várias companhias tais como Abbott, Sandoz, Bactec, Novo Nordisk, Mycogen. Exemplos de produtos à base de Bt podem ser vistos na tabela. Os produtos contendo toxinas específicas para lepidópteros são, comercialmente, as mais importantes, pois a maioria dos biopesticidas à base de Bt usados para controlar pragas agrícolas é à base da estirpe HD-1 da subespécie kurstaki, a qual tem alta toxicidade e amplo espectro de ação dentro da ordem Lepidoptera (Navon, 1993). A maior parte do mercado de Bt (60-70%) é dirigida para o controle de pragas florestais (Lymantria dispar nos EUA e Choristoneura spp. no Canadá), através de pulverizações aéreas, sendo o principal pesticida usado nestas florestas (Navon, 1993; van Frankenhuyzen, 1993). Produtos à base de B.

25 thuringiensis subsp. israelensis são responsáveis por aproximadamente 20% deste mercado (Navon, 1993), sendo estes pesticidas muito efetivos e potentes no controle de mosquitos culicídeos e simulídeos, muitos dos quais vetores de doenças. Pesquisas visando obter produtos mais eficientes, mais estáveis e com espectro de atividade mais amplo estão sendo desenvolvidas usando tecnologias modernas como a do DNA recombinante. Já existem produtos engenheirados produtos com maior persistência em campo do que os convencionais. Um dos primeiros produtos de B.thuringiensis geneticamente engenheirados e aprovado para uso agrícola nos EUA foi o bioinseticida MVP (Mycogen, San Diego, CA), recomendado para o controle de P. xylostella e outros lepidópteros. Neste produto, o gene cry1ac é expresso em altos níveis em células de Pseudomonas fluorescens, onde os cristais permanecem encapsulados (processo denominado CellCap ), o que lhe confere maior persistência no campo (Gelernter & Schwab, 1993). Outros produtos, como o M-One Plus (Mycogen) à base da estirpe san diego, específica para o controle de coleópteros, desenvolvida usando o mesmo processo e recomendada para o controle Leptinotarsa decemlineata em batata, já estão à disposição. Há produtos geneticamente manipulados para criar combinações de genes, através da conjugação de estirpes distintas, com ação contra pragas diversas como coleópteros e lepidópteros, como por exemplo o produto Foil (Ecogen), recomendado para o controle do complexo de insetos da batata. Também já é possível a clonagem e expressão de genes de deltaendotoxinas vírus, algas e bactérias habitantes do solo e do sistema vascular de plantas, que servem como sistema de transporte. Como exemplo de vírus temos o Vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) com o gene cry1ab ou cry1ac de delta-endotoxina no seu genoma. Neste sistema,

26 as células do inseto expressam a toxina e a velocidade de ação do vírus é acelerada. A introdução do gene cry1ac de Btk já foi feita na bactéria endofítica Clavibacter xyli subsp. cynodontis a qual é usada para o controle de Ostrinia nubilalis em milho. Bactérias do solo, como Pseudomonas cepacia e fluorescens transformadas com genes de Bt passam a expressar toxinas e ter ação tóxica contra insetos na risosfera. Bradyrhizobium expressando, nos nódulos, toxina de B.t. subsp. tenebrionis são usados contra coleópteros que atacam raízes de plantas. Integração de Bacillus thuringiensis em Manejo Integrado de Pragas Bt é um agente de controle biológico que pode ser associado a outros agentes microbianos, como vírus, a substâncias como reguladores de crescimentode insetos e neem, com resultados geralmente aditivos ou sinergísticos. É um dos patógenos mais usados em associação com químicos, podendo ser usado com piretróides sintéticos, como endosulfan, fenvalerate e acephate, em estratégias de manejo integrado de pragas. Devido à importância de Bt em sistemas de manejo integrado de pragas, deve-se avaliar os efeitos deste patógeno sobre os inimigos naturais das pragas, representados por parasitóides e predadores naquele agroecossistema (Magalhães et al., 1998). Teoricamente, o parasitismo aumenta a suscetibilidade do hospedeiro ao patógeno, devido estresse causado. Existem, entretanto, relatos de aumento (sinergístico), diminuição (antagonístico) e ausência de alterações na suscetibilidade do hospedeiro (Magalhães et al., 1998). Monnerat (1995), por exemplo, verificou que larvas de Plutella xylostella parasitadas por Diadegma sp. tinham sua susceptibilidade a Bt diminuída, provavelmente devido a redução no consumo de alimento.

27 4- Materiais e Métodos Criação massal dos diferentes insetos a- lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda Estas lagartas foram criadas em insetário regulado a temperatura de 28 C, fotoperíodo de 12/12 horas e 60% de umidade ( Figura 2). A alimentação foi baseada em dieta artificial composta de feijão, levedo de cerveja, germe de trigo, vitaminas e sais minerais (Schmidt et al., 2001). Os ovos foram depositados em papel de filtro, esterilizados e colocados em dieta artificial. Após a eclosão as larvas se alimentaram da dieta (Figura 3) e após completarem o ciclo larval, as pupas foram coletadas e colocadas em gaiolas (Figura 4) onde copularam e ovipositaram no papel. Fig. 2: sala de criação de Spodoptera frugiperda

28 Figura 3: Larvas se alimentando da dieta após a eclosão. Figura 4: Gaiolas de adultos de Spodoptera frugiperda b- curuquerê, Alabama argilacea A criação desta lagarta foi feita na Embrapa Algodão e foi implantada na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia de acordo com a mesma metodologia. Esta lagarta foi criada em dieta natural, ou seja, folhas de algodão. Os ovos eram colocados sob a folha. Após a eclosão das larvas, estas se

29 alimentavam da folha, onde se desenvolviam durante toda a fase larval até a fase de pupa. Estas eram recolhidas e colocadas em gaiolas com novas folhas. Os adultos emergiam, copulavam e colocavam os ovos, recomeçando o ciclo. c- Heliothis virencens (lagarta da maçã) A criação da lagarta da maçã foi implantada a partir de larvas e ovos recebidos da empresa BUG Agentes de Controle Biológico. As larvas foram criadas em dieta artificial de forma semelhante a Spodoptera frugiperda. Seleção da(s) estirpe(s) de Bacillus thuringiensis eficazes para controle das lagartas a- Estirpes testadas As estirpes testadas estavam armazenadas no banco de germoplasma de Bacillus entomopatogênicos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia que, e sua maioria, foram provenientes de amostras de solo, água e insetos mortos coletadas no Brasil (Monnerat et al., 2001). b- Bioensaios Dois tipos de bioensaios foram realizados: o biensaio chamado seletivo, onde se testou a cultura final total da bactéria e que serviu para fazer uma pré-selação das estirpes e o bioensaio quantitativo, que serviu para determinar a Cl 50 (dose letal necessária para matar 50% da população testada), selecionando as estirpes mais tóxicas.

30 b-1- Contra a lagarta do cartucho do milho a) Bioensaio seletivo Os bioensaios foram realizados espalhando-se 150 µl da cultura de bacilos cultivados por 48 horas em meio NYSM (Yousten et al., 1984) na dieta distribuída previamente em copos descartáveis de 50 ml. A cultura bacteriana foi absorvida pela dieta e em seguida 10 larvas de segundo estágio foram colocadas em cada copo. Três repetições foram feitas e o mesmo número de copinhos foram deixados sem a bactéria, como testemunha (Figura 5). As leituras foram feitas a cada dois dias durante 6 dias sendo que 48 horas após o início do ensaio as larvas foram passadas para uma dieta livre do bacilo. Figura 5: Bioensaio de B. thuringiensis e larvas de S. frugiperda

31 b-) Bioensaio quantitativo Este bioensaio foi realizado da mesma forma que o seletivo, mas a cultura final das estirpes foi liofilizada e o bioensaio feito com diluições feitas a partir deste material. b-2- Contra a lagarta da maçã a) Bioensaio seletivo Os bioensaios foram realizados de maneira semelhante ao de S. frugiperda, ou seja, espalhando-se 150 µl da cultura de bacilos cultivados por 48 horas em meio NYSM (Yousten et al., 1984) na dieta distribuída previamente em copos descartáveis de 50 ml. A cultura bacteriana foi absorvida pela dieta e em seguida 10 larvas de segundo estágio foram colocadas em cada copo. Três repetições foram feitas e o mesmo número de copinhos foram deixados sem a bactéria, como testemunha. As leituras foram feitas a cada dois dias durante 6 dias sendo que 48 horas após o início do ensaio as larvas foram passadas para uma dieta livre do bacilo. b-3- Contra curuquerê a) Bioensaio seletivo Os bioensaios foram realizados de mergulhando-se folhas de algodão em soluções contendo a cultura de bacilos cultivados por 48 horas em meio NYSM (Yousten et al., 1984). Essas folhas ficaram imersas por 10 minutos após secarem 10 larvas de segundo estágio foram colocadas sobre cada folha. Três repetições foram feitas e o mesmo número de folhas foram deixados sem a bactéria, como testemunha. As leituras foram feitas a cada dois dias durante 6 dias sendo que 48 horas após o início do ensaio as larvas foram passadas para uma folha livre do bacilo.

32 Caracterização bioquímica das proteínas presentes nas estirpes A análise das proteínas presentes nas estirpes foi efetuada através de eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 10%) o que permitiu conhecer o perfil e a massa molecular das toxinas produzidas pelas estirpes. Para análise das proteínas de cada estirpe, as estirpes foram crescidas em meio NYSM (Yousten et al., 1984) a temperatura de 30 C por 48 horas em incubador rotativo a 200 rpm. Em seguida, 1 ml do cultivo foi centrifugado a g por 5 minutos. O sedimento foi ressuspendido em 100 µl de água MilliQ autoclavada e 25 µl de tampão de proteína 5X (1,5M Tris-HCl, ph 6,8, Glicerol, SDS, 2βmercaptoetanol, Azul de Bromofenol 0,5%). O material foi fervido durante cinco minutos e aplicado em gel de poliacrilamida SDS-PAGE numa concentração de 10%. O gel foi corado em solução Comassie Blue corante (40% metanol e 25% de Comassie blue 250-R) por 1 hora e descorado em solução descorante (40% metanol e 10% de ácido acético) até a visualização dos produtos. D- Caracterização molecular através da análise da presença de genes de toxinas através da reação em cadeia da polimerase (PCR) O DNA total das estirpes de B. thuringiensis tóxicas foi extraído segundo protocolo descrito por Bravo et al. (1998). Uma alçada de cada estirpe cultivada em meio ágar nutritivo a temperatura ambiente por 16 horas foi ressuspendida em 100 µl de Água MilliQ estéril. A suspensão foi colocada

33 no freezer por 1:00 hora, em seguida fervida por 10 minutos e centrifugada a g por 10 segundos. Para a realização da PCR, 15 µl do sobrenadante da cultura centrifugada foram transferidos para um tubo contendo 0,5 µm de cada primer, 0,2 mm de dntp, 1,5 mm de MgCl 2, tampão de Taq 1x e 2,5 U de Taq DNA polimerase em um volume total de 50 µl. Foram utilizados os oligonucleotídeos decritos por Ceron et al., 1994 e 1995 e Bravo et al., 1998, que detectam todos os genes cry. As reações foram realizadas sob as condições descritas pelos mesmos autores. Uma alíquota de 15 µl de cada produto de PCR foi submetida à eletroforese em gel de agarose, corado com brometo de etídio e visualizada em luz ultra-violeta. E- Caracterização ultraestrutural através de microscopia eletrônica Os cristais de B. thuringiensis foram purificados de acordo com o protocolo descrito por Thomas & Ellar (1983). As estirpes de B. thuringiensis foram submetidas a purificação do cristal após o cultivo em meio NYSM (Yousten et al., 1984) a 30 C por 48 horas a 200 rpm ou até compl etar esporulação total. Esse material foi transferido para tubo Falcon previamente esterilizado e centrifugado a g por 10 minutos. Observou-se a presença de cristais no sobrenadante, em caso afirmativo guardou-se o mesmo. O sedimento foi lavado 3 vezes em uma solução contendo água, 0,1mM de PMSF e 0,01% de triton e ressuspendido em 3 ml de tampão TTN (Triton 1%, Tris HCL 1M ph 8 e NaCl 5M). Em seguida, cada amostra foi

34 sonicada a 3 pulsos de 1 minuto, com 1 minuto de intervalo entre cada pulso. Durante esse processo as amostras foram mantidas no gelo. Foi preparado um gradiente de sacarose com as concentrações de 84%, 79%, 72% e 69%, sobre o qual cada uma das amostras foi colocada. O gradiente foi então centrifugado a g por 20 minutos a 4 C (ultracentrífuga Sorvall, modelo Combi Plus, rotor AH 628). Após a centrifugação as bandas contendo cristais foram recuperadas, diluídas em igual volume de água e centrifugadas a g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento ressuspendido em 1 ml de uma solução de triton 0,01%. Esse procedimento foi repetido 2 vezes. O sedimento final foi ressuspendido em 4 ml de solução de PMSF 0,1 mm e armazenado a -20 C. Para a microscopia de varredura, as amostras foram liofilizadas, depositadas sobre suportes metálicos, cobertas com ouro por 180 segundos, utilizando-se metalizador EMITECH modelo K550 e observadas em microscópio eletrônico de varredura Zeiss modelo DSM 962.

35 5- Resultados e Discussão A- Criação massal dos diferentes insetos a- lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda A criação foi instalada e forneceu insetos em número suficiente para a realização dos testes seletivos e de dose. b- curuquerê A criação foi instalada e forneceu insetos em número suficiente para a realização dos testes seletivos. c- Lagarta da maçã A criação foi instalada e forneceu insetos em número suficiente para a realização dos testes seletivos. Identificação da(s) estirpe(s) de Bacillus thuringiensis eficazes para controle da lagarta do cartucho do milho Foram testadas 1375 estirpes de B. thuringiensis. Destas, 31 causaram 100% de mortalidade a lagarta do cartucho do milho em bioensaios seletivos. Estas estirpes foram submetidas a bioensaios quantitativos e três confirmaram valores de CL 50 inferiores ao padrão B. thuringiensis estirpe HD- 1, utilizada no produto comercial Dipel. A tabela 1 apresenta os resultados obtidos com as 19 melhores estirpes.

36 Tabela 1: LC 50 das estirpes de B. thuringiensis contra S. frugiperda. Estirpes CL 50 (ng/cm 2 ) Intervalo de confiança (95%) Homologia S1905 1,87 0,38-2,37 A S0845 2,43 1,062-3,01 A S0550 2,71 2,05-3,37 A Btk 28,52 20,15-41,89 B S ,91 26,96-78,90 BC S ,26 34,87-135,26 BC S ,06 19,71-176,05 BC S234 90,24 39,32-144,30 BC S ,81 38,97-222,50 BC S ,70 46,27-501,19 C S ,65 144,40-244,11 C S ,92 51,29-532,67 C S ,92 79, ,88 C S ,42 101,15-527,72 C S ,42 197,27-772,31 C S ,67 361,92-754,42 C S ,70 387,22-699,79 C S ,44 389, ,77 C S ,10 421, ,99 C Caracterização bioquímica das proteínas presentes nas estirpes A análise das bandas permitiu a identificação do peso molecular das proteínas presentes nas estirpes ativas (Tabela 2).

37 Tabela 2: Perfil de proteínas das estirpes de B. thuringiensis ativas contra S. frugiperda. Estirpe Perfil protéico (kda) S S S S S S S S S S S S S HD

38 D- Caracterização molecular através da análise da presença de genes de toxinas através da reação em cadeia da polimerase (PCR) As reações efetuadas com os primers gerais e específicos permitiram a identificação de alguns dos genes presentes nas estirpes (Tabela 3). Tabela 3: Genes cry presentes em algumas das estirpes de B. thuringiensis do banco de germoplasma Estirpe S1905 S845 S550 S764 S1269 S1551 S234 S1533 S1548 S811 S711 S1537 S1540 HD-1 Genes cry cry1aa, cry1ab cry1aa, cry1ac cry1aa, cry1ab, cry2 cry1aa, cry1ab, cry1d cry1 cry1aa, cry1ab, cry2 cry1aa, cry1ab, cry1ac, cry1b cry1 cry1 cry1aa, cry1ab, cry1d, cry1i Cry1 cry1 cry1 cry1aa, cry1ab, cry1ac, cry1b Todas as estirpes tóxicas apresentaram resultados positivos para a presença do gene cry1, codificador da toxina de 130 kda, que estão relacionadas a toxicidade a lepidopteros. A presença de diferentes genes nas estirpes pode explicar a diferença de toxicidade encontrada.

39 E- Caracterização ultraestrutural através de microscopia eletrônica de varredura A caracterização morfológica das estirpes tóxicas foi parcialmente executada (Figuras 6, 7e 8). As estirpes analisadas apresentaram cristais bipiramidais, redondos e quadrados, típicos de B. thuringiensis. Cristais bipiramidais podem estar associados às proteínas do tipo Cry1, que apresentam atividade contra insetos da ordem Lepidoptera e Coleoptera, os cristais redondos podem estar associados com as proteínas do tipo Cry2 que apresentam atividade contra insetos da ordem Lepidoptera e Diptera e os cristais quadrados estão mais associados a atividades com Coleopteros. A estirpe de B. thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 utilizada como padrão apresentou os mesmos cristais que as estirpes (Figura 8).

40 S234 bp S550 bp r e S711 bp e Figura 6: Micrografia eletrônica de varredura da mistura esporos-cristais das estirpes de B. thuringiensis S234, S550, S711. bp-cristal bipiramidal; r: cristal redondo; e: esporo; (aumento de x)

41 S764 bp r q S811 r bp S997 bp Figura 7: Micrografia eletrônica de varredura da mistura esporos-cristais das estirpes de B. thuringiensis S764, S811, S997. bp: cristal bipiramidal; r: cristal redondo; q: cristal quedrado; e: esporo; (aumento de x)

42 e r bp Figura 8: Micrografia eletrônica de varredura da mistura esporos-cristais da estirpe de B. thuringiensis kurstaki utilizada como padrão. bp-cristal bipiramidal; r: cristal redondo; e: esporo; (aumento de x)