Bio-insecticidas de Bacillus thuringiensis

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1 1 Bio-insecticidas de Bacillus thuringiensis a) Composição A bactéria de Bacillus thuringiensis (Bt, abreviatura comum, embora sem valor oficial) durante o seu desenvolvimento (Fig. 1), o qual foi iniciado pela reprodução (crescimento vegetativo) através de sucessivas divisões celulares, apresenta-se no final da esporulação como um esporângio (célula-mãe) composto por um esporo e um cristal proteico (Fig. 2). Fig. 1 - Ciclo de vida de uma célula de Bacillus thuringiensis (Bt). Sporulation Fig. 2 - Esporângio (célula-mãe) de Bt no final da esporulação, contendo um esporo (E) e um cristal proteico (C). A célula-mãe é lisada (parte-se a membrana celular), libertando-se o esporo e o cristal proteico.

2 2 Os bio-insecticidas, em pó, à base de Bt são compostos por esporos e cristais proteicos, desses esporângios, aos quais foram adicionados adjuvantes, sendo o produto final obtido por secagem. b) Modo de acção A acção tóxica dos bio-insecticidas de Bt realiza-se através do cristal proteico. Contudo, esta acção tóxica só acontece após a dissolução desse cristal, o que só é possível em meio alcalino (ph superior a 8) e por intervenção de enzimas. A dissolução do cristal proteico resulta na libertação das proteínas δ-endotoxinas (delta-endotoxinas), essas sim já com acção tóxica. Portanto, o insecto ingere o cristal proteico de Bt, o qual é dissolvido no intestino pela acção das enzimas (Fig. 3), dos sucos digestivos alcalinos (ph bastante vulgar nos insectos, principalmente nos lepidópteros). As δ-endotoxinas, resultantes desta dissolução, ao ligarem-se a receptores das células do epitélio intestinal, provocam aí desequilíbrios osmóticos, resultando numa paragem da alimentação e paralisia intestinal. Alguns insectos morrem logo nesta primeira fase, confinada ao aparelho digestivo. A maioria dos insectos, no entanto, morre quando a ruptura do epitélio intestinal, por lesões, no seguimento do referido desequilíbrio osmótico, provoca a septicemia: entrada de bactérias, sucos e conteúdos intestinais na hemolinfa. As bactérias de Bt são ingeridas como esporos, os quais começam ainda a germinar no sistema digestivo do insecto. Na hemolinfa, após a sua passagem pelas lesões ocorridas no epitélio intestinal, as células da bactéria reproduzem-se por divisão celular.

3 3 Fig. 3 - Modo de acção do cristal proteico (A) e do esporo (B) de Bt, ingeridos pelo insecto. c) Sintomas A acção das δ-endotoxinas no epitélio intestinal provoca uma paragem da alimentação alguns minutos ou horas (tempo dependente da dose) após a ingestão do bioinsecticida. Deste modo, o estrago causado pelas larvas termina nesse momento. Contudo, estas continuam vivas durante mais 2 a 4 dias. A larva começa por apresentar uma cor acinzentada antes do escurecimento que antecede a morte. Os órgãos internos sofrem ruptura, o interior do insecto torna-se viscoso e com cheiro putrefacto, mas o tegumento permanece intacto. Depois, o cadáver murcha, seca e enrija. d) - Especificidade e Classificação A classificação do Bt é complexa e motivo de controvérsia. A classificação que a seguir se descreve foi o mais simplificada possível, para que o assunto seja mais

4 4 compreensível, não correspondendo sempre aos critérios seguidos por determinados autores, embora baseando-se principalmente em Figueiredo (1997). Quadro 1 - Classificação das subespécies de Bt, com maior interesse para a limitação de pragas, em função da posse de diferentes genes codificadores de cristais proteicos. Subespécie de Bt kurstaki Subclasse de genes codificadores de cristais proteicos Cry 1A (a,b,c) Cry 2A Cry 2B Ordem de insectos limitados Lepidópteros Dípteros (só pelo Cry 2A) aizawai Cry 1A (a,b) Cry 1C Cry 1D Cry 1E Lepidópteros tenebrionis Cry 3A Coleópteros israelensis Cry 4 Dípteros Existe uma especificidade de toxicidade de determinados cristais proteicos relativamente a diferentes ordens de insectos (lepidópteros, coleópteros e dípteros). Esta relação é expressa através de uma classificação dos genes que originam esses cristais, em classes (Cry1, Cry2, Cry3, Cry4,...) e subclasses, à qual corresponde uma classificação do Bt em subespécies (kurstaki, aizawai, tenebrionis, israelensis,...) em função da sua posse dessas subclasses de genes. As subespécies de Bt ainda se dividem em estirpes, pelas diferentes composições em genes. O bio-insecticida comercial à base de Bt mais comum, desde a descoberta dos seus genes de cristais proteicos, nos EUA em 1970, foi o da subespécie de Bt kurstaki classificada então como da estirpe HD-1, possuindo as subclasses dos genes Cry

5 5 1A(a,b), Cry 2A e Cry 2B. Dois grandes exemplos de marcas comerciais, mais conhecidas, são as antigas formulações designadas como Dipel (da Abbott) e Thuricide (antes da Sandoz e actualmente da Agrisense). A formulação de bio-insecticidas de Bt só com uma subespécie representou a primeira geração deste tipo de insecticidas biológicos. Bio-insecticida Turex Turex é o bio-insecticida de Bt, actualmente homologado em Portugal, que possui um maior espectro de acção sobre lagartas, uma maior potência e uma melhor protecção contra a sua degradação pela radiação ultravioleta. a) Composição Turex é pioneiro da segunda geração de bio-insecticidas à base de Bt, por ser um conjugado de duas subespécies: kurstaki e aizawai. Deste modo, é tóxico para um mais amplo leque de espécies de lepidópteros do que os Bts de primeira geração, como, por exemplo, os só da estirpe HD-1 da subespécie kurstaki. Por exemplo, os lepidópteros do género Spodoptera spp. são limitados principalmente pelas proteínas, do cristal, originadas pelo gene Cry 1C, o qual está presente no Bt da subespécie aizawai, não estando no da kurstaki. Assim, o Turex ao apresentar as propriedades de ambas as subespécies, já limita também este grupo de pragas, enquanto os Bts só com kurstaki não o conseguem satisfatoriamente. O processo laboratorial que origina este conjugado de duas subespécies, no Turex, é considerado natural por as moléculas de DNA não serem modificadas, mas sim unicamente transferidas. A nova estirpe do Turex (Fig. 4), classificada como GC-91, resulta da transferência de plasmídeos com moléculas de DNA da estirpe HD-191, da subespécie kurstaki, com o gene Cry 1A(c), para a estirpe HD-135, da subespécie aizawai, esta já com os genes Cry 1A(a), Cry 1C e Cry 1D.

6 6 Transconjugation : creation of Turex / Agree Bt aizawai HD 135-S4 cry 1C Toxin genes on plasmids cry 1Ac Bt kurstaki HD 191 cry 1D cry 2 Exchange of plasmids Turex / Agree Transconjugant Bta Transconjugant Bta recipient with desired cry genes from Btk donor Hybrid progeny Selective media Genetic analysis Protein analysis Strain GC91 cry1d cry1c cry1ac cry2 Fig. 4 Processo de conjugação das duas subespécies de Bt - kurstaki e aizawai que origina o bio-insecticida Turex A lagarta-do-tomate, Helicoverpa armigera, é limitada sobretudo pela proteína, uma δ-endotoxina, originada pelo gene Cry 1A(c), o qual, através deste processo de conjugação, está presente em alto teor no Turex, daí também a extrema eficácia deste bio-insecticida contra esta praga. b) Potência O Turex possui uma potência de UI/mg T. ni (Unidades Internacionais de Toxicidade), correspondente a 3,8 % de substância activa. Outro importante motivo adicional para ser mais eficaz do que as antigas formulações de Bts, atrás referidas, só com UI/mg.. c) Rapidez da acção Uma lagarta pára de se alimentar (causar estragos) entre cerca de 30 minutos a 2 horas, após a ingestão da dose letal. A morte ocorre entre 2 a 5 dias, em função das espécies. A eficácia é superior nos primeiros instares larvares.

7 7 d) Protecção Turex contém uma substância que protege os esporos e as endotoxinas da sua degradação pela radiação ultravioleta. Para além disso, Turex tem uma formulação especialmente estudada para aumentar o seu poder de aderência às plantas e, deste modo, prolongar o seu efeito. e) Período de acção Pelo menos 10 dias. f) Intervalo de segurança Turex não deixa resíduos nas culturas e está isento de classificação toxicológica, sendo o seu intervalo de segurança zero dias, pelo que é altamente recomendável para aplicações próximo da colheita. Turex é virtualmente não tóxico para o Homem e meio ambiente. g) Adição de açúcar É conveniente adicionar açúcar na calda, de modo a acelerar a ingestão de substância activa na dose letal. De um modo geral, tem sido suficiente a aplicação de 1 Kg de açúcar para 1Kg de Turex, correspondendo a 1 ha. Contudo, a eficácia poderá ser superior para concentrações maiores. h) Concentração e dose Em aplicações de alto volume (1000 litros / ha) usar a concentração de 100 gr por 100 litros de calda. Independentemente do volume de calda usado, a dose é de 1 Kg por hectare. Esta pode, contudo, ser superior em casos que se pretenda acelerar a ingestão de substância activa letal sem o recurso a açúcar, nomeadamente na vinha no combate à traça-da-uva, atingindo então uma dose até 1,5 Kg / ha. i) Compatibilidade de aplicação com outros produtos A sua aplicação é compatível com a maioria dos insecticidas, fungicidas e fertilizantes líquidos.

8 8 Somente ter especial cuidado em não aplicar em conjunto com produtos alcalinos ou contendo metais pesados, como o cobre, por exemplo. Assim nunca misturar com calda bordalesa e outros fungicidas cúpricos. j) Águas alcalinas Quando as águas são alcalinas (as calcárias, por exemplo), convém adicionar ácido fosfórico na calda, em doses baixas, próximas das para uma ligeira fertirrigação. l) Armazenamento O armazenamento do produto embalado deverá ser ao abrigo da luz e húmidade, numa temperatura inferior a 35 o C. Nestas condições, pode conservar-se durante 2 anos. Após a abertura da embalagem o produto deverá ser usado nos dias próximos. Contra traça-da-uva (Lobesia botrana) a) Momento de pulverização O momento de pulverização de Bt, como luta curativa contra L. botrana, na 2ª e 3ª gerações da praga, pode ser decidido de dois modos: i) - Através da observação semanal da intensidade do ataque da praga, a qual deve começar, em cada geração, pelo menos, sete dias após a primeira captura de adultos na armadilha sexual. Tal observação deverá manter-se enquanto houver capturas, o que poderá teoricamente durar mais seis semanas na 2ª geração. Pulverizar logo que tenha sido ultrapassado o nível económico de ataque. ii) - Na eventualidade de não ser possível observar a intensidade do ataque, para se verificar se foi ultrapassado o nível económico de ataque, pulverizar desde sete dias após o primeiro dia da captura de adultos nas armadilhas, com uma periodicidade de dias, até já não haver mais capturas. É óbvio que o primeiro método é o recomendável!

9 9 Ainda há quem recorra ao método de pulverizar no momento em que se verifica terem os voos da 2ª e 3ª gerações já atingido o seu pico, o que só se detecta após este ter ocorrido, ou seja, quando as capturas na armadilha sexual começam a baixar. Contudo, este método não é seguro por não haver correspondência entre a intensidade do ataque e a evolução das capturas. Apesar disso, será melhor do que agir totalmente às cegas... É conveniente salientar que apesar de os insecticidas de Bt serem mais eficazes logo no início do primeiro instar larvar, sendo ideal que a pulverização dos mesmos ocorra imediatamente antes da eclosão das larvas, esse facto não impede que sejam eficazes também quando se atingiu o nível económico de ataque, determinado em cachos com perfurações ou lagartas, dado estas não ficarem sempre dentro de um bago e no seu percurso até penetrarem noutro bago, do mesmo cacho, poderem ingerir uma dose letal do bio-insecticida. Com efeito, cerca de 30 minutos a duas horas após a ingestão de uma dose letal deste bio-insecticida a larva não se alimenta mais, terminando os estragos. Contudo, para que as larvas de instares mais desenvolvidos ingiram uma dose letal mais rápidamente convém aumentar a dose de insecticida de Bt, o que no caso do Turex, poderá ir até 1,5 kg /ha. A outra solução seria aumentar a dose de açúcar de 1 kg por ha até 1kg por 100 litros de calda, mas convém evitar tal para que não haja desenvolvimento de fungos nos cachos. Deste modo, pode-se considerar como um meio de luta biológica curativa (em função da presença já de larvas), embora se assim se desejar possa também ser aplicado preventivamente (antes da eclosão das larvas e em função do número de cachos ainda só com posturas viáveis). b) Molhar bem os cachos O local de desenvolvimento da traça-da-uva são os cachos, pelo que constitui um total desperdício a pulverização de Bt sobre as parras, o que se verifica ser uma tendência dos aplicadores, influenciados pela pulverização frequente de fungicidas contra o míldio e o oídio. Deve-se ter a máxima atenção em molhar bem os cachos, para que as larvas da praga possam ingerir o bio-insecticida à base de Bt, durante o seu período de deambulação, antes de penetrarem nos bagos.

10 10 Se se efectuar desparra, o ideal será pulverizar após esta. c) Ensaio sobre Turex na Bairrada em 2000 Em 2000, a Estação de Avisos da Bairrada, da Direcção Regional de Agricultura da Beira Litoral, realizou um ensaio sobre a eficácia do Turex no combate à 3ª geração da traça-da-uva (Lobesia botrana) com resultados extremamente satisfatórios. A casta foi cabernet sauvignon. À parcela tratamento pulverização de Turex coube m 2 e à parcela testemunha m 2, constituindo as duas o total da vinha. A avaliação da intensidade do ataque baseou-se na observação de 100 cachos por parcela, por semana. A pulverização do bio-insecticida foi em 24/8, após se ter constatado que o número de cachos atacados (7%) estava a aproximar-se do nível económico de ataque ( 10%). A dose foi de 1 kg / ha, adicionando-se 1kg de açúcar à calda de 1000 litros/ha. Na parcela testemunha não foi pulverizado nenhum insecticida durante a 3ª geração. Quadro 2 Resultados do ensaio sobre o bio-insecticida Turex no combate à 3ª geração de Lobesia botrana, na Bairrada em 2000, tendo a pulverização do bio-insectida sido em 24/8. Data Capturas nas armadilhas Posturas Parcela testemunha Larvas vivas Cachos com perfurações Posturas Parcela Turex Larvas vivas Cachos com perfurações 06/07 Instalação / / / / / / / /

11 11 08/ / / / / Nos resultados apresentados no Quadro 2 é de salientar que em 14/9, aquando da observação das primeiras larvas vivas na parcela Turex, após a pulverização deste bio-isecticida há já 21 dias, estas eram do primeiro e segundo instares, enquanto as da parcela testemunha incluíam também larvas de instares mais avançados. Deste modo, considerando que uma larva do segundo instar, da 3ª geração de L. botrana, dificilmente poderá atingir 11 dias, a persistência do Turex foi superior a 10 dias (21-11). É de realçar que este bio-insecticida foi eficaz já com uma intensidade de ataque da praga de pelo menos 7% (cachos com perfurações), demonstrando claramente a viabilidade deste meio de luta de um modo curativo e não só preventivo. Contra lagarta-do-tomate (Helicoverpa armigera) Pulverizar nos primeiros instares larvares, antes da larva penetrar no tomate. Quando as larvas já tiverem atingido instares mais desenvolvidos convém aumentar a dose do bioinsecticida (até mais 50%) ou adicionar mais açúcar às caldas (até 1kg/100 litros), para que aquelas ingiram uma dose letal mais rapidamente. O estado fenológico de posturas máximas ocorre no máximo de flores abertas, sendo os locais de postura principalmente no terço superior da planta, nas proximidades das flores, sobre pontas de crescimento e nas folhas mais recentes. Deste modo, para além das capturas de adultos em armadilhas, para detectar os períodos de risco, deve-se estar atento à presença de larvas, naquelas condições, para que o seu combate seja logo nos primeiros instares.

12 12 Contra traça-da-oliveira (Prays oleae) Eficaz unicamente na geração antófaga (época de floração), em virtude de, entre as duas gerações causadoras de prejuízo, ser a única em que a larva se alimenta também no exterior dos órgãos vegetais, neste caso, botões florais, e, consequentemente, poder ingerir o bio-insecticida. Tal sucede apesar de antes dessa ingestão, logo após a eclosão, a larva penetrar de imediato no interior dos órgãos vegetais (botões florais), à semelhança do ocorrido na geração carpófaga (frutos). Em ensaios realizados em Trás-os-Montes, em 1997, o bio-insecticida Turex atingiu uma taxa de mortalidade de 81%. Este nível de mortalidade é considerado suficiente, por si só. Para além disso, os auxiliares ao não terem sido eliminados, por pulverizar-se um bio-insecticida para eles completamente inofensivo, poderão ainda aumentar a mortalidade de P. oleae. O bio-insecticida de Bt deverá ser pulverizado com especial incidência sobre os botões florais, quando estes surgirem e no caso de se justificar um tratamento contra P. oleae. A estimativa do risco consiste na observação semanal de 10 cachos florais em 20 árvores (200 observações no total), para detectar larvas vivas. Esta observação semanal começará com o início da captura de machos nas armadilhas sexuais, instaladas no olival aquando do aparecimento dos botões florais (Abril/Maio). No mínimo, não se deverá deixar de efectuar a referida observação no período da abertura das flores, com 10 a 20% das flores abertas. O nível económico de ataque (NEA), em protecção integrada, é de 10% dessas inflorescências atacadas com larvas vivas. Em agricultura biológica poder-se-á considerar o NEA de 4 a 8%. Contra traça-do-limoeiro (Prays citri) A pulverização de Bacillus thuringiensis é recomendada na limitação de Prays citri (traça-do-limoeiro). Em Portugal, a cooperativa Frutoeste tem realizado ensaios, em limoeiro, com razoável eficácia.

13 13 Apesar da larva penetrar no interior do botão floral através da base do chorion do ovo, sem sair ao exterior, ou penetrar naquele imediatamente após a eclosão para o exterior, pelo facto de uma larva se alimentar de diversos botões florais e, seguidamente, de frutos em início de desenvolvimento, tem que ingerir tecidos vegetais situados no exterior dos órgãos, ainda que ligeiramente. Deste modo, a pulverização de um larvicida de ingestão, como um bio-insecticida à base de Bt, pode reduzir significativamente as populações desta praga.