UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE COLETIVA MARIANA LINHARES ALMEIDA AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA DIABETES MELLITUS TIPO II NA EFICÁCIA DA TERAPIA PERIODONTAL BÁSICA SOBRE OS PARAMETROS CLÍNICOS E MICROBIOLÓGICOS DA SALIVA NA DOENÇA PERIODONTAL NATAL 2017

2 MARIANA LINHARES ALMEIDA AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DA DIABETES MELLITUS TIPO II NA EFICÁCIA DA TERAPIA PERIODONTAL BÁSICA SOBRE OS PARAMETROS CLÍNICOS E MICROBIOLÓGICOS DA DOENÇA PERIODONTAL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do Título de Mestre em Saúde Coletiva, área de concentração em Odontologia. ORIENTADOR: Profº. Dr. Bruno César De Vasconcelos Gurgel NATAL 2017

3 Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia Biblioteca Setorial de Odontologia Profº Alberto Moreira Campos. Almeida, Mariana Linhares Avaliação da Influência da Diabetes Mellitus Tipo II Na Eficácia da Terapia Periodontal Básica Sobre os Parâmetros Clínicos e Microbiológicos da Doença Periodontal / Mariana Linhares Almeida f. : il. Orientador: Prof. Dr. Bruno César De Vasconcelos Gurgel Dissertação (Mestrado em Saúde Coletiva) Universidade Federal do rio Grande Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa da Pós Graduação em Saúde Coletiva. Natal, Doenças periodontais Dissertação. 2. Dissertação. 3. Diabetes Mellitus Dissertação. 4. Reação em cadeia da polimerase. Dissertação I. Gurgel, Bruno César de Vasconcelos. II. Título. RN/UF/BSO Black D64

4 DEDICATÓRIA Dedico essa conquista aos meus pais, os principais responsáveis por eu ter chegado até aqui, que não mediram e não medem esforços para que eu consiga realizar meus sonhos!

5 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por sempre criar as melhores oportunidades na minha vida. Aos meus pais, por todo amor, carinho e confiança depositados em mim, espero sempre deixá-los orgulhosos. Aos meus irmãos, Marina e Dayvid, e por sempre me acompanhar. A minha sobrinha, Lara, por ser a única capaz de não me deixar com peso na consciência por passar algum tempo com ela quando não precisava fazer alguma coisa do Mestrado. E a todos da minha família por sempre torcerem por mim. Ao meu namorado Bemvenuto Júnior por estar sempre presente e ser um dos meus maiores torcedores. Pela compreensão, carinho e incentivo de sempre. Os últimos cinco anos com certeza foram mais simples por ter você, e espero que nos próximos anos você continue ao meu lado. Desejo que a sua paciência e empatia continuem pelos próximos anos. Você foi a pessoa que compartilhou comigo os momentos de tristezas e alegrias, e a quem confio e compartilho todos os meus sonhos. Ao meu orientador Bruno César de Vasconcelos Gurgel pela paciência e parceria. Grande parte das minhas conquistas e realizações profissionais aconteceram sob sua orientação, iniciada em 2013 ainda como aluna de iniciação científica. Com certeza, eu não estaria vivendo esse momento se não fosse pela confiança depositada ao longo desses anos. Peço desculpas pelos prazos perdidos e espero cumprir com todas as minhas pendências. As minhas amigas Luísa Brasil e Thereza Raquel, por terem participado de toda caminhada, mesmo longe ou seguindo caminhos diferentes sempre estiveram presentes. A Eduardo e Janaína que ajudaram na construção desse trabalho, principalmente nos atendimentos clínicos, e foram também responsáveis por manter esse trabalho vivo até esta pesquisa.

6 A Professora Poliana Mendes Duarte e Tamires Szeremeske de Miranda por disponibilizarem as dependências do Laboratório de Pesquisa em Odontologia II, da Universidade de Guarulhos e me auxiliarem na etapa laboratorial desse estudo. Aos alunos da graduação que participaram do projeto de atendimento a pacientes diabéticos, especialmente Priscilla, Éric, Guilherme, Carol, por ajudarem nos atendimentos e tornarem as quartas-feiras a noite mais divertidas. A todos os pacientes que se disponibilizaram a participar do estudo, sem vocês nada seria possível. Aos meus companheiros de Mestrado, Lorena, Yriu, Israel, Angélica, Lidya, Samuel, Karyna e Anderson por compartilharem as agonias e estresses, mas também os melhores momentos das disciplinas. Aos funcionários do Departamento de Odontologia por sempre se receberem com carinho, e abriam as clínicas para que pudessem realizar os atendimentos, mesmo nas férias. Ao Programa de Pós-graduação em Saúde Coletiva UFRN e Mestres que integram o programa, por ter disciplinas que me proporcionaram momentos de reflexão e mudanças de paradigmas, que contribuíram não só para o crescimento profissional, como também o pessoal. mestrado. A CAPES por oferecer a oportunidade de me dedicar verdadeiramente ao Aos membros da banca, tanto de qualificação, como de defesa, por aceitarem o convite de participar. A todos que direta ou indiretamente fizeram parte da minha formação.

7 RESUMO A relação entre a doença periodontal (DP) e a diabetes mellitus (DM) é bidirecional, porém, existe a necessidade de maiores evidências em relação ao tratamento periodontal básico sobre os aspectos clínicos e a presença de bactérias em pacientes com e sem diabetes. Dessa forma, portanto, o presente estudo teve por objetivo avaliar a influência da diabetes mellitus tipo II na eficácia do tratamento periodontal básico através dos parâmetros clínicos e microbiológicos da saliva. Foram tratados 51 pacientes entre 30 e 65 anos através da técnica Full Mouth Disinfection (FMD), sendo 17 do grupo diabético (GD) e grupo não diabético (GND). Esses pacientes foram avaliados antes do início do tratamento periodontal, aos 6 e 12 meses após a sua conclusão. No exame periodontal foram avaliados o Índice de Sangramento a Sondagem (ISS), Índice de Placa Visível (IPV), Profundidade de Sondagem (PS), Recessão Gengival (RG) e Nível Clínico de Inserção (NCI). Os parâmetros sanguíneos avaliados foram glicose em jejum e hemoglobina glicada (HbA1C) apenas para o GD. As amostras de saliva foram coletadas antes da realização de cada exame periodontal. Foi realizada a quantificação das espécies bacterianas Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, e Tannerella forsythia através da técnica Reação em cadeia da polímeras em tempo real (PCR real-time). Os resultados mostraram quanto aos parâmetros clínicos que houve uma melhora significativa para ISS, IPV e PS para ambos os grupos, enquanto que para o NCI apenas para o GD (p=0,023). Em relação aos parâmetros microbiológicos, não houve diferenças entre o grupo com diabetes e sem diabetes nos períodos avaliados, apenas a espécie Tanerella forsythia apresentou diferença estatística significativa no período de 12 meses (p=0,004), com maior mediana para o grupo GND. Na análise intragrupo, apenas o GD apresentou diferença estatística para todas as espécies avaliadas (p<0,05), na qual houve redução após o tratamento, mas aumento após a avaliação de 6 meses. A espécie Porphyromonas gingivalis aumentou significativamente após 12 meses, nesse período de avaliação obteve mediana maior que o baseline. A diabetes não influenciou na resposta do tratamento periodontal, ambos os grupos apresentaram melhora dos parâmetros clínicos avaliados. Palavras-chave: Doenças periodontais. Diabetes Mellitus. Reação em cadeia da polimerase.

8 ABSTRACT The relationship between periodontal disease (PD) and diabetes mellitus (DM) is bidirectional, however, there is a need for more evidence regarding basic periodontal treatment on clinical aspects and the presence of bacteria in patients with and without diabetes. Thus, the present study aimed to evaluate the influence of type II diabetes mellitus (DM) on the efficacy of basic periodontal treatment through the clinical and microbiological parameters of saliva. Fifty-one patients were treated between 30 and 65 years of age using the "Full Mouth Disinfection" (FMD) technique, 17 in the diabetic group (DG) and non-diabetic group (NDG). These patients were evaluated before the beginning of the periodontal treatment, at 6 and 12 months after its conclusion. In the periodontal examination, the Bleeding on Probing (BOP), Visible Plaque Index (VPI), Probing Depth (PD), Gingival Recession (RG) and Clinical Attachment Level (CAL) were evaluated. The blood parameters evaluated were fasting glucose and glycated hemoglobin (HbA1C) only for DG. Saliva samples were collected before each periodontal examination. Quantification of the bacterial species Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis, and Tannerella forsythia through the real-time polymer chain reaction (PCR) technique was performed. The results showed that the clinical parameters showed a significant improvement for ISS, IPV and PS for both groups, whereas for NCI only for GD (p = 0.023). Regarding the microbiological parameters, there were no differences between the group with diabetes and no diabetes in the evaluated periods, only Tanerella forsythia presented a statistically significant difference in the 12-month period (p = 0.004), with a higher median for the NDD group. In the intragroup analysis, only the DG presented statistical difference for all species evaluated (p <0.05), in which there was reduction after treatment, but increase after the evaluation of 6 months. The species Porphyromonas gingivalis increased significantly after 12 months, in this period of evaluation it obtained median higher than baseline. Keywords: Periodontal diseases. Diabetes Mellitus. Polymerase chain reaction.

9 LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Cronograma das avaliações Figura 2 Fluxograma da perda de pacientes no período de 12 meses Figura 3 Fluxograma das amostrar de saliva no período de 12 meses.. 39 Quadro 1 Descrição dos estudos com objetivo de verificar o efeito da terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com diabetes tipo Quadro 2 Variáveis independentes do estudo Quadro 3 Variáveis dependentes do estudo... 31

10 LISTA DE TABELA Tabela 1 Sequência de Primers, perfil de amplificação e comprimento estimado do produto final da Reação em Cadeia de Polimerase para espécies bacterianas Tabela 2 Parâmetros periodontais de todos os sítios [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline, com 6 e 12 meses pós terapia Tabela 3 Porcentagem de sítios com profundidade de sondagem até 3 mm, maior que 3 e menor que 6mm e maior que 6 mm [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline e com 6 e 12 meses pós terapia Tabela 4 Parâmetros periodontais dos sítios doentes [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline, com 6 e 12 meses pós terapia Tabela 5 Quantidade de bactérias das espécies do complexo vermelho na saliva [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline e com 6, e 12 meses pós terapia... 40

11 LISTA DE ABREVIATURAS µl Microlitros AGEs Produtos Finais de Glicação Avançada DM Diabetes Mellitus DP Doença Periodontal FMD Full Mouth Desinfection GD Grupo Diabético GND Grupo Não Diabético HbA1c Hemoglobina Glicada HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes IFNγ Interferon gama IL Interleucina IPV Índice de Placa Visível ISS Índice de Sangramento a Sondagem mm Milímetros NCI Nível Clínico de Inserção ng Nano grama ºC Graus Celsius OPG Osteoprogerina PS Profundidade de Sondagem RACR Raspagem e Alisamento Corono-Radicular RANK Receptor ativador do fator Kappa-β RANKL Ligante de RANK real-time PCR Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real RG Recessão Gengival TNF-α Fator de Necrose Tumoral alfa

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA DIABETES MELLITUS DOENÇA PERIODONTAL RELAÇÃO ENTRE AS DOENÇAS PERIODONTAIS E A DIABETES MELLITUS EFEITO DO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO ALTERAÇÕES DAS ESPÉCIES MICROBRIANAS DA SALIVA OBJETIVOS GERAL ESPECIFICOS METODOLOGIA CONSIDERAÇÕES ÉTICAS POPULAÇÃO E AMOSTRA Critérios de Inclusão e exclusão Critérios de Inclusão e exclusão dos pacientes Cálculo do tamanho da amostra COLETA DE DADOS Exame Clínico Periodontal Coleta da Saliva Tratamento Periodontal Básico pelo Full Mouth Disinfection (FMD) Purificação e Extração do DNA bacteriano Avaliação Microbiológica por meio do real-time PCR QUADRO DE VARIÁVEIS ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA PARÂMETROS CLÍNICOS ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÂNCIAS ANEXOS

13 11 1 INTRODUÇÃO Uma das doenças que mais cresce na população mundial é a DM. Atualmente, ela atinge mais de 400 milhões de adultos e é uma das principais causas de morte no mundo (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2016). Essa doença causa complicações em diversas partes do corpo, como a neuropatia e a retinopatia. O ambiente bucal também não está excluído e a DP é tida como a sexta complicação da Diabetes (LÖE, 1993). Essa relação entre a doença periodontal e a diabetes é bidirecional, e determinados mecanismos associados a etiopatogenia das duas condições têm sido propostos para explicar como uma doença pode afetar a outra (TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Os mecanismos celulares e moleculares relacionados à destruição periodontal são comuns a outras complicações diabéticas e estão associados a resposta inflamatória alterada dos pacientes com DM (MESIA et al., 2016; VELEA et al., 2013). Os estudos tentam mostrar essa relação através de alterações na microbiota, mudanças nos níveis de mediadores pró-inflamatórios e o estresse celular causado pelos produtos finais de glicação avançada (AGEs) (KUDIYIRICKAL; PAPPACHAN, 2015; TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Na DM, a resposta imune é prejudicada que pode retardar a cicatrização, e ocorre um aumento exacerbado da produção de citocinas pró-inflamatórias frente o estímulo bacteriano, na qual que leva a destruição tecidual mais intensa, e a simples presença da DP já pode alterar os níveis dessas citocinas em níveis locais e sistêmicos (MESIA et al., 2016). Dessa maneira, pacientes com DM parecem ser mais susceptíveis à inflamação gengival do que pacientes sem diabetes, mesmo apresentando os mesmos níveis de biofilme (KARJALAINEN; KNUUTTILA, 1996). Já foi demonstrado que o tratamento periodontal convencional é capaz de reduzir consideravelmente a quantidade de periodontopatógenos subgengivais (PEDRAZZOLI et al., 1991; ALI; LIE; SKAU, 1992; HAFFAJEE et al., 1997; COLOMBO et al., 2005). Entretanto, as diferenças específicas da microbiota da doença periodontal de pacientes diabéticos e não diabéticos não são bem estabelecidas (EBERSOLE et al., 2008). Existem métodos de biologia molecular que auxiliam na identificação de periodontopatógenos e mostram vantagens em relação aos métodos de cultura.

14 12 Uma das técnicas é real-time PCR, que é uma técnica sensível e específica que permite detectar e quantificar DNA em uma única etapa, e garante maior precisão em relação a outras técnicas de biologia molecular. É possível identificar espécies bacterianas, vírus e pontos de mutações gênicas em diferentes tipos e quantidades de amostras, no entanto, etapas prévias são necessárias (ZHANG et al., 2016; HEID et al., 1996). Muitos estudos utilizam real-time PCR na identificação de patógenos periodontais em amostras do biofilme subgengival em pacientes com DM e DP (HINCAPIÉ et al., 2014; MIRANDA et al., 2014; Al-NOWAISER et al., 2014; MIRANDA et al., 2017). Outros estudos observaram a presença das bactérias periodontopatogênicas na saliva, e mostraram correlação positiva com a DP (UMEDA et al., 2004; KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009; SAYGUN et al., 2011). Porém não se sabe qual o comportamento dessas bactérias na saliva após o tratamento periodontal. Com isso, existem ainda lacunas na literatura que estabelecem essa relação entre a DM e a doença periodontal, tanto em relação aos aspectos clínicos como microbiológicos relacionados ao tratamento. Por essa razão, é necessário conhecer a influência da DM na resposta do tratamento periodontal básico, por meio da desinfecção de boca completa, sem o uso de antibióticos sistêmicos, sobre os parâmetros clínicos periodontais e microbiológicos da saliva.

15 13 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 DIABETES MELLITUS A Diabetes Mellitus é uma desordem endócrina na qual há um defeito na produção ou na ação do hormônio insulina secretado pelo pâncreas. Defeitos nesse metabolismo causam níveis elevados de glicose no sangue, que traz diversas consequências ao organismo ( AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 20017). A hiperglicemia crônica gera AGEs que provocam problemas macro e microvasculares (QUADROS et al., 2007). A consequência disto está relacionada com as cinco complicações mais comuns da DM que são: as doenças cardiovasculares, nefropatias, retinopatias, neuropatias e problemas na cicatrização, todas essas doenças são oriundas das alterações macro e microvasculares. (LITWAK et al., 2013; PATALONE et al., 2015) Esta doença é classificada em quatro tipos: diabetes tipo I e II, diabetes gestacional e outros tipos de diabetes. A tipo I é aquela na qual o organismo produz pouca ou nenhuma insulina, enquanto na diabetes tipo II pode ser ocasionada por um defeito progressivo na produção e secreção da insulina, e/ou por um problema no receptor que dificulta a sua utilização e pode causar resistência à insulina. Já a diabetes gestacional é diagnosticada durante a gestação, e outros tipos de diabetes que é causada por defeitos genéticos ou por uso de medicamentos (imunossupressores, por exemplo) (AAD, 2015). A diabetes tipo 2 é a mais comum, e está associada a fatores de risco como obesidade, sedentarismo e dieta inapropriada. No entanto, isso a torna o tipo mais fácil de ser prevenido. Intervenções com dieta saudável e exercícios regulares tornam o controle glicêmico mais eficiente do que o uso de medicamentos para as pessoas com alto risco de desenvolver a doença (WHO, 2016). Para ser estabelecido o diagnóstico da DM, o exame sanguíneo de glicose em jejum deve apresentar valores 126 mg/dl, e a hemoglobina glicada (HbA1c) deve ser 6,5% (AAD, 2017). Porém, para pacientes adultos que já estão em tratamento da doença, os valores da HbA1c devem permanecer <7,0%, enquanto a glicose em jejum não deve ser >130mg/dL. Para estabelecer a severidade da doença a partir desses exames sanguíneos, outros fatores devem ser levados em consideração. É importante analisar a idade do paciente, presença de outras

16 14 morbidades, duração da doença desde o seu diagnóstico e estabelecimento de complicações vasculares. (AAD, 2015; PANTALONE et al., 2015). 2.2 DOENÇA PERIODONTAL A doença periodontal é uma doença inflamatória de caráter infeccioso, na qual o fator etiológico primário é o biofilme dentário, composto por bactérias especificas que invadem o ambiente subgengival e promovem a destruição do tecido de proteção e sustentação do dente (LÖE, 1965; SOCRANSKY, 1977). As doenças periodontais mais comuns são a gengivite e periodontite. Nesta última ocorre a formação de bolsa, perda do ligamento periodontal e reabsorção óssea que leva a perda de inserção do dente, e é uma das principais causas de perda dentária em adultos (PAGE; SCHROEDER, 1976). O biofilme periodontopatogênico é uma comunidade de microrganismos complexa, que se desenvolve em ambientes anaeróbios, e é predominantemente composto por bactérias Gram-negativas. Socransky (1998) analisou o biofilme subgengival e demonstrou que as bactérias se organizam em complexos microbianos que interagem. A presença do complexo vermelho e algumas espécies do complexo laranja foram associadas a maior profundidade de sondagem, e estão presentes no complexo vermelho as espécies Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola e Tanerella forshytia (SOCRANSKY et al., 1998; GROSSI et al., 1994). A presença dessas bactérias é importante para o estabelecimento da doença, mas a destruição tecidual é causada tanto pelos produtos bacterianos produzidos, como pela resposta imune do hospedeiro frente a essa agressão (DESHMUKH; JAWALI; KULKARNI, 2011; SOCRANSKY et al., 1984). Nesse contexto, nem todos os indivíduos são susceptíveis ao desenvolvimento da doença, é necessário que os microrganismos driblem o sistema de defesa inicial, para que uma grande resposta inflamatória seja gerada e cause a destruição dos tecidos (YETKIN et al., 2009). A doença periodontal pode ser influenciada por diversos fatores modificadores locais e sistêmicos, que intensificam a progressão da doença (MEALEY; OATES, 2006; SOSKOLNE; KLINGER, 2001). Um exemplo é a diabetes, em que pacientes com essa condição sistêmica tem mais chances de ter problemas periodontais do que pacientes saudáveis. Por essa razão, a doença periodontal é

17 15 dita como a sexta complicação mais comum ocasionada pela diabetes (LÖE, 1993; SOSKOLNE; KLINGER, 2001). Ao longo dos anos, muitas mudanças ocorreram na forma de diagnosticar a doença periodontal (DYE, 2011). Para a gengivite é necessário utilizar índices que mensurem a inflamação gengival, enquanto na periodontite, é preciso avaliar a PS e o NCI (HAFFAJEE; SOCRANSKY; GOODSON, 1983). Contudo, independente disto, a doença periodontal precisa ser tratada, e a remoção do biofilme patogênico é necessária para que não ocorra a recolonização da superfície dentária por este (LINDHE et al., 1984). O tratamento periodontal não cirúrgico é realizado através da raspagem e alisamento corono-radicular (RACR) e, associado a orientação de higiene, é capaz de diminuir a inflamação, melhorar os parâmetros clínicos promovendo o ganho de inserção (LLAMBES et al., 2005; STANKOA; HOLLA, 2014). Também é necessário monitorar os fatores que podem interferir na doença periodontal, para isso, pacientes com fatores de risco devem ter controles periódicos mais frequentes (WILSON JR et al., 1984). 2.3 RELAÇÃO ENTRE AS DOENÇAS PERIODONTAIS E A DIABETES MELLITUS A relação entre a DP e a DM revela uma doença sistêmica modificando uma doença bucal, e está relação tem sido descrita como bidirecional. No entanto, os mecanismos pelos quais essas interações ocorrem ainda não estão definidos (TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013; DA CRUZ et al., 2008). Estudos com grandes amostras mostram a diabetes como um fator de risco para a doença periodontal (COHEN; ROSE; MINSK, 1998). Pacientes com controle glicêmico alterado têm maior susceptibilidade em desenvolver a DP, e esta progride mais rápido nesses pacientes (MENG, 2007; NISHIMURA et al., 2005; STEGEMAN, 2005; DESHPANDE et al., 2010). Os estudos tentam mostrar essa relação através de alterações na microbiota, mudanças nos níveis de mediadores pró-inflamatórios, e o estresse celular causado pelos AGEs (KUDIYIRICKAL; PAPPACHAN, 2015; TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Porém, diferenças metodológicas nos estudos impedem conclusões definitivas. Nesse contexto, Ebersole et al. (2008) avaliaram espécies bacterianas presentes em amostra de biofilme subgengival de pacientes com e sem diabetes tipo II, encontraram uma possível influência da diabetes na microbiota

18 16 periodontal, já que patógenos como P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans eram mais frequentes em pacientes com diabetes. Miranda et al. (2017) mostraram níveis mais elevados das bactérias periodontopatogênicas no biofilme subgengival em pacientes com pobre controle glicêmico (HbA1C 8%). Entretanto, outros estudos não encontram esse tipo de associação (CRUZ et al., 2008; LALLA et al., 2006). Muitos estudos com mediadores inflamatórios, como Interleucina (IL) -1β, IL-6, Fator de Necrose Tumoral alfa (TNF-α) e Interferon gama (IFNγ), apresentaram-se mais elevados em pacientes com diabetes quando comparados com aqueles que só tinha a doença periodontal (DUARTE et al., 2007; COLE et al., 2008; ANDRIANKAJA et al., 2009; MESIA et al., 2016). O TNF-α está associado a perda de inserção periodontal quando se apresenta em níveis elevados (BOYCE et al., 2005), e ainda pode induzir uma resistência à insulina, que dificulta o controle glicêmico (FERNANDEZ-REAL; RICART, 2003), porém não foi encontrado diferenças nos níveis de TNF-α entre pacientes diabéticos e não diabéticos (TAKEDA et al., 2006; NAVARRO-SANCHEZ; FARIA-ALMEIDA; BASCONES-MARTINEZ et al., 2007; MESIA et al., 2016). Nesse cenário em que níveis alterados de mediadores inflamatórios afetam diretamente a resposta do hospedeiro, um dos principais sistemas do metabolismo ósseo relacionado a doença periodontal é o Receptor ativador do fator Kappa-β (RANK), o ligante de RANK (RANKL) e a Osteoprogerina (OPG) (REINHARTDT et al., 2010; BUDUNELI; BUDUNELI; KÜTÜKÇÜLER, 2009). Em uma situação de saúde, a OPG funciona com um receptor para RANKL, para que este não se ligue a RANK e ative a osteoclastogenese, dessa forma não há reabsorção óssea. Na periodontite é visto níveis elevados de RANKL e diminuição nos níveis de OPG (TANAKA et al., 2005). Dessa maneira, Ribeiro et al. (2011) avaliaram os níveis de citocinas (TNF-α, INFγ, IL-4, IL-23, IL-17) e fatores relacionados metabolismo ósseo (RANKL e OPG) do fluido gengival de pacientes com periodontite crônica e com o diagnostico ou não de diabetes tipo II. Esses autores encontraram que os pacientes que tinham diabetes e DP, principalmente os com pobre controle glicêmico, tinham níveis mais elevados dos fatores estudados. (RIBEIRO et al., 2011) Outro mecanismo que pode estar associado as interações entre DM e DP são os AGEs (GROSSI; GENCO, 1998; PERRINO, 2007). Os AGEs estão relacionados a formação de trombos, que causam complicações microvasculares, por se depositarem nas paredes dos vasos quando ligadas ao colágeno (SCHMIDT

19 17 et al., 1999). Além disso, podem se ligar as células fagocitárias diminuindo tal função, isso torna a resposta imune deficiente e facilita a multiplicação dos patógenos periodontais (SCHMIDT et al., 1996). Foi observado também que os fibroblastos possuem receptores de membranas para AGEs (RAGEs), e quando os AGEs estão ligados a essas células podem dificultar a formação do colágeno, que diminuem a resistência do periodonto, tornando-o mais susceptível a infecção por periodontopatógenos (BASCONES-MARTINEZ et al., 2011; TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013). Portanto, no paciente com diabetes, a patogenicidade do biofilme também irá causar uma resposta inflamatória no hospedeiro, mas esta será mais intensa, e dessa forma os níveis sistêmicos elevados de citocinas podem dificultar o controle glicêmico (TAYLOR; PRESHAW; LALLA, 2013; PERRINO, 2007; MEALEY; OATES, 2006). Nesse contexto, Demmer et al. (2013) avaliou por cinco anos pacientes sem diabetes, mas com doença periodontal, e relacionou o aumento progressivo dos níveis de HbAc1 com a doença periodontal. No entanto, o controle da doença periodontal parece não fazer parte da rotina de pacientes com a DM (DUNNING, 2009). 2.4 EFEITO DO TRATAMENTO PERIODONTAL NÃO CIRÚRGICO O quadro 1 mostra a síntese dos estudos nos últimos 10 anos que têm como objetivo verificar o efeito do tratamento periodontal não cirúrgico nos parâmetros clínicos periodontais, parâmetros glicêmicos e parâmetros microbiológicos em pacientes com Diabetes tipo II. A maioria dos estudos apresentados nesse quadro não apresenta diferenças significativas para os parâmetros clínicos entre os grupos quando comparados os diabéticos e não diabéticos. Entretanto, quando analisado os níveis de Glicose em Jejum e Hemoglobina glicada, após o tratamento periodontal, os estudos não apresentam conclusões semelhantes. A remoção mecânica do cálculo e biofilme é essencial para a melhora dos parâmetros periodontais, independente da condição sistêmica que o paciente apresenta. Entretanto, como a DM e a DP estão intimamente ligadas, o tratamento dos pacientes que apresentam essas condições é indispensável, além de que existem diferenças na resposta do tratamento periodontal se o paciente apresenta bom ou pobre controle glicêmico (GROSSI et al., 1997; KNOWLES et al., 1979).

20 18 Quirynen et al. (1995) descreveram o tratamento periodontal através da técnica Full Mouth Disinfection, que consiste em raspagem e alisamento radicular em uma única sessão associado ao uso da clorexidina, dessa maneira diminuiria a reinfecção dos sítios periodontais antes da finalização do tratamento. Esses autores encontraram melhora nos parâmetros clínicos e menores proporções de bactérias patogênicas no grupo teste (QUIRYNEN et al. 1995). Outros estudos, que utilizaram pacientes diabéticos, também compararam essa técnica e obtiveram melhora clínica dos parâmetros avaliados (CRUZ et al., 2008; SANTOS et al., 2009; MOEINTAGHAV et al., 2012; RAMAM et al., 2014) Nesse sentido, Ramam et al. (2014) trataram pacientes diabéticos com FMD ou apenas com instrução de higiene oral. Os autores mostraram melhora dos parâmetros clínicos dos pacientes que receberam essa a FMD, e ainda observaram redução estatística significativa nos níveis de HbAc1 nos pacientes da terapia não cirúrgica. Eles concluíram que a utilização do FMD em pacientes com diabetes com alto risco de infecção, alterações vasculares e resposta inflamatória deficiente é benéfica porque ajuda a minimizar o risco de reinfecção dos sítios tratados (RAMAN et al., 2014). Em indivíduos com a doença com bom controle, a resposta clínica e microbiológica ao tratamento periodontal parece ser semelhante à de indivíduos saudáveis (TSALIKIS et al., 2014; OLIVER; TERVONEN, 1994). Tsakilis e colaboradores (2014) utilizaram metodologia semelhante a Nowaiser e colaboradores (2014), contudo, estes não avaliaram o controle glicêmico dos pacientes, mas observaram diferença entre os grupos tratados quando em um deles foi utilizado a doxiciclina sistêmica (AL-NOWAISER et al., 2014). De outro modo, quando havia um bom controle da DM no baseline, diferenças entre os grupos não foram encontradas nos parâmetros clínicos e microbiológicos, mesmo com o uso do antibiótico sistêmico. (TSALIKIS et al., 2014). Já Miranda et al. (2014) utilizaram o tratamento não cirúrgico associado ao uso de amoxicilina e metronidazol, e além de avaliar o controle glicêmico e parâmetros periodontais, avaliaram também os níveis bacterianos de sete espécies associadas a doença periodontal. Foi observado que os parâmetros clínicos melhoram para os grupos com ou sem uso dos antibióticos, mas o grupo teste obteve os melhores resultados, inclusive para as espécies bacterianas (MIRANDA et

21 19 al., 2014). Contudo é importante avaliar o efeito microbiológico sem o uso de antibióticos, para analisar o real efeito do tratamento periodontal. 2.5 ALTERAÇÕES DAS ESPÉCIES MICROBIANAS DA SALIVA Dentro das mais diversas funções, a saliva faz parte do sistema imune por apresentar lisoenzimas e íons de tiocianato, tornando-a bactericida. Além disso, a saliva apresenta diversos biomarcadores que podem auxiliar no diagnóstico precoce de algumas doenças (ZHANG et al., 2016). Nesse contexto, é possível identificar microrganismos presentes no ambiente bucal, que já são em torno de 700 microrganismos, alguns ainda não cultiváveis. Porém, ao utilizar métodos biomoleculares, é possível identificar até novas espécies (PEREIRA et al., 2012; TANNER; IZARD, 2005). Uma dessas técnicas é o real-time PCR (Reação em cadeia da polmerase em tempo real, em inglês Polymerase Chain Reaction), que facilita a quantificação da expressão gênica em diversos tipos de amostras (HEID et al., 1996). Através dessa técnica, Yasunaga et al. (2016) avaliaram o microbioma salivar, em pacientes saudáveis, para identificar espécies que em altas quantidades estão relacionadas a baixa susceptibilidade a cárie. Existem relatos na literatura sobre a presença das bactérias típicas do ambiente subgengival na saliva (UMEDA et al., 2004; KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009; SAYGUN et al., 2011). Alguns estudos transversais de base populacional mostram associação da presença das bactérias do complexo vermelho com níveis avançados de perda de inserção (KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009). Em 2005, Sakamoto e colaboradores correlacionaram a presença de bactérias na saliva com profundidade de sondagem aumentada, e observaram maior quantidade de Porphyromonas gingivalis e Tanerella forsythia em pacientes com periodontite crôninca. Porém, pouco se sabe a respeito da presença de bactérias típicas do ambiente subgengival na saliva de pacientes diabéticos após o tratamento periodontal.

22 Quadro 1 - Descrição dos estudos com objetivo de verificar o efeito da terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com diabetes tipo II. Autor Objetivo Amostra Métodos Variáveis Resultados (Parâmetros Clínicos Periodontais) Cruz et al Kudva et al Santos et al Koromantzo s et al Avaliar as mudanças clínica e metabólicas após 3 meses de FMD em pacientes com e sem DM. Avaliar as mudanças clínicas e metabólicas após terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com e sem DM tipo II. Comparar os efeitos clínicos e metabólicos do FMD com o PMSRP em pacientes com DM tipo II e DP. Avaliar o efeito da terapia periodontal não cirúrgica sobre o controle glicêmico de pacientes com DM tipo II e DP moderada e severa GT:10 pacientes com DM GC: 10 pacientes sem DM GT:15 pacientes com DM GC: 15 pacientes sem DM 36 pacientes com diabetes: GC: 18 (FMD) GT: 18 (PMSRP) 60 pacientes: GT: 30 pacientes RACR em 2 sessões GC: 30 pacientes Apenas Raspagem supragengival e Profilaxia OHO e FMSRP; (Quirynen et al.) Avaliação: 3 meses. FMSRP; Avaliação: 3 meses. FMSRP (24h) e PMSRP (em até 21 dias); Avaliação: 3 e 6 meses. RACR; Raspagem supragengival ; Profilaxia. Avaliação: baseline, 1, 3 e 6 meses IPV; ISS; PS; NCI; RG. HbA1c e Glicose em Jejum. IPV; ISS; PS. HbA1c. IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c. PS; NCI; ISS; IG HbA1c Não houve diferença significativa entre os grupos em nenhum parâmetro analisado. Mas a PS, a RG e o NCI tiveram melhoras significativas dentro do mesmo grupo para ambos os grupos Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo. Todos os parâmetros melhoraram depois de 6 meses do tratamento no GT quando comparado a GC; Resultados (hemoglobina glicada (HbA1c) e glicose em jejum) Não houve melhoras quanto ao nível de HbA1c e da glicose em jejum (p 0.05; ANOVA). Redução significativa nos níveis de HbA1c nos pacientes com diabetes tipo II. Não houve alterações quanto ao nível de HbA1c após as terapias. Houve redução significativa nos níveis de HbA1c para o GT. 20 Resultados (Bactérias no biofilme) Não avaliado Não avaliado Não avaliado Não avaliado

23 Chen et al Cirano et al Haseeb et al Moeintaghav i et al Avaliar as mudanças clínicas e metabólicas após terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com DM tipo II. Avaliar o potencial do FMUD (Onestage, Full mouth, ultrassonic debridement) como tratamento para pacientes com diabetes tipo II e periodontite crônica e severa. Comparar a condição periodontal em pacientes com diabetes tipo II bem controlados e mal controlados com indivíduos sem DM. Avaliar as mudanças clínicas e metabólicas após terapia periodontal não cirúrgica em pacientes com DM tipo II. 134 pacientes com diabetes: GT1: RACR em 4 sessões + raspagem subgengival GT2: RACR em 4 sessões + profilaxia supragengival GC: Nenhum tratamento periodontal. GT: 16 pacientes com DM GC: 15 pacientes sem DM GT1: 40 pacientes com diabetes bem controlados; GT2: 40 pacientes com diabetes pobremente controlados; GC: 40 indivíduos sem diabetes. GT: 22 (FMD) GC: 18 (sem tratamento periodontal). RACR em 4 sessões; raspagem subgengival; profilaxia supragengival ; Avaliação: 1.5, 3 e 6 meses. FMUD (única sessão de 45 minutos); Avaliação: 3 e 6 meses. Observaciona l, transversal, sem intervenções. FMD e nenhum tratamento periodontal (durante o estudo) Avaliação: 3 meses. HbA1c e Glicose em Jejum. IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c e Glicose em Jejum. PS; NCI; RG. HbA1c. IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c e Glicose em Jejum. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo. Não houve diferença entre os grupos em nenhum parâmetro clínico. Pacientes com diabetes tiveram resposta clínica similar aos não com diabetes. PS e NCI significativamente maior em pacientes com diabetes pobremente controlados em comparação aos outros grupos. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo e intergrupo. IPV; ISS; PS; NCI pioraram significativamente no grupo sem tratamento. Redução significativa nos níveis de HbA1c nos pacientes que receberam a terapia periodontal não cirúrgica. Apesar de haver melhoras nos níveis glicêmicos em ambos os grupos, não houve diferença significativa entre eles. Não houve alterações quanto ao nível de HbA1c e dos níveis de glicose em jejum após as terapias. Sem alterações significativas entre os grupos. Os níveis de HbA1c diminuíram significativamente apenas no grupo que recebeu o FMD. 21 Não avaliado Não avaliado Não avaliado Não avaliado

24 Engebretson et al Santos et al Avaliar o efeito da terapia periodontal não cirúrgica nos níveis de HbA1c em pacientes com diabetes tipo II. Avaliar o efeito da clorexidina no protocolo FMD em pacientes com DM tipo 2 pobremente controlada e com DP. 514 pacientes com diabetes: GT: 257 (RACR em 4 sessões + clorexidina) GC: 257 (Nenhum tratamento durante o estudo) 38 pacientes com DM e DP: GC: 19 (FMSRP + clx 0.12%) GT: 19 (FMSRP + placebo) RACR em 4 sessões + clorexidina. Avaliação: 3 e 6 meses FMSRP + clx 0.12% (FMD) e FMSRP + placebo Avaliação: 3,6 e 12 meses IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c e Glicose em Jejum. IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c e Glicose em Jejum. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após a terapia no grupo que recebeu o tratamento, havendo diferença significativa entre os grupos. Todos os parâmetros clínicos melhoraram após as terapias, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo. Não houve melhoras após seis meses nos níveis de HbA1c no grupo que recebeu tratamento periodontal. Houve melhora após 12 meses, mas sem significância estatística. 22 Não avaliado Não avaliado Raman et al Miranda et al Comparar os efeitos clínicos e metabólicos da terapia periodontal não cirúrgica com a instrução de higiene oral (IHO) em pacientes com e sem DM tipo II. Avaliar o efeito clinico e microbiológico do uso de MTZ e AMX como adjuntos da RACR em pacientes com DP e DM tipo II 40 pacientes com diabetes tipo II: GT: 20 (FMD) GC: 20 (IH0) 58 pacientes com DP e DM tipo II: GT: 29 (RACR+AMX+MTZ) GC: 29 (RACR) IHO e FMD; (Quirynen et al.) Avaliação: 2 e 3 meses. RACR com Metronidazol e Amoxicilina / RACR Avaliação: Baseline, 3, 6, 9 e 12 meses IPV; ISS; PS; NCI. HbA1c. IPV; ISS; PS; NCI Glicose em jejum, HbA1c. 7 especies: Complexo vermelho e 4 do laranja Houve diferença significativa entre os grupos para o IPV após 2 meses, sendo melhor no grupo que recebeu a terapia periodontal não cirúrgica. Após 3 meses, todos os parâmetros clínicos melhoraram, havendo diferença significativa intragrupo, mas sem diferença significativa intergrupo. Houve melhora dos parâmetros para ambos os grupos nos períodos avaliados, mas o GT apresentou médias menores quando comparados ao GC nos períodos após a terapia. Houve redução nos níveis de HbA1c nos pacientes de ambos os grupos, mas foi significativa apenas no grupo que recebeu a terapia periodontal não cirúrgica. Não houve diferenças estatísticas entre os grupos, e nem em cada grupo após o tratamento. Não avaliado Ambas terapias mostraram redução em todas as espécies com 3 e 12 meses em comparação ao baseline. As espécies do complexo vermelho e P. intermedia reduziram mais no GT.

25 Tsalikis et al Nowaiser et al Hincapié et al Avaliar o uso sistêmico de doxiciclina nos parâmetros clínicos, e microbiológicos de pacientes com DP e DM tipo II com bom controle glicêmico Avaliar o uso sistêmico de doxiciclina nos parâmetros clínicos e microbiológicos de pacientes com DP e DM tipo II Avaliar as mudanças na frequência de periodontopatóge nos em pacientes com DM tipo II com o uso do tratamento não cirúrgico e azitromicina. 66 pacientes com DP e DM tipo II: GT: 33 (DOX) GC: 33 (PLA) 68 pacientes com DP e DM tipo II: GT: 35 (DOX) GC: 33 (PLA) 90 pacientes com DP e DM tipo II: AZRACR: 28 PLARACR: 31 AZPROF: 31 RACR com uso ou não de doxiciclina Avaliação: baseline, 3 e 6 meses RACR com uso ou não de doxiciclina Avaliação: baseline, 45 dias, 3 e 6 meses RACR com azitromicina; RACR com placebo; Profilaxia com azitromicina. Avaliação: baseline, 3, 6 e 9 meses. PS; NCI; RG; ISS HbA1c P. gingivalis T. forsythia T. denticola P. intermedia A. actinomycetemc omitans IP; IG; ISS; PS; NCI. P. gingivalis T. forsythia P. intermedia A. actinomycetemc omitans IP; ISS; PS; NCI. HbAc1. P. gingivalis T. forsythia T. denticola A. actinomycetemc omitans Houve melhora da PS, ISS, NCI para amos os grupos, mas sem diferença entre eles. O IG do GT melhorou mais após 6 meses do que o GC. Houve melhora do NCI dos grupos AZRACR e PLRACR, não foi visto alteração do grupo que só recebeu a profilaxia e a azitromicina. Não houve alterações nos níveis HbAc1 para amobos os grupos e nem diferença entre eles. Não avaliado Houve redução de HbAc1 apenas no grupo que recebeu tratamento completo (AZRACR) 23 Não foi encontrada diferença entre os grupos, mas houve redução dos níveis dessas bactérias com 3 ou 6 meses. Redução da população de P. gingivalis, T. forsythia e P. intermedia foi melhor no GT na avaliação de 3 meses. Houve redução de P. gingivalis, T. denticola e A. actinomycetemcomitan após 3 meses, mas aumento progressive até 9 meses. T. forsythia aumentou após 3 meses em todos os grupos, mas o grupo placebo teve a maior frequência nos 9 meses. IPV: Índice de Placa Visível; ISS: Índice de Sangramento à Sondagem; PS: Profundidade de Sondagem; NCI: Nível Clínico de Inserção; RG: Recessão Gengival; HbA1c: Hemoglobina glicada. Fonte: Dados da Pesquisa. Natal/RN, 2017.

26 24 3 OBJETIVOS 3.1 GERAL Avaliar a influência da Diabetes Mellitus tipo II na eficácia do tratamento periodontal básico pela técnica do Full Mouth Disinfection através dos parâmetros clínicos periodontais e microbiológicos da saliva em pacientes com Periodontite Crônica. 3.2 ESPECÍFICOS Comparar os parâmetros clínicos e a quantidade de bactérias presentes na saliva entre os pacientes que tem ou não diabetes mellitus tipo II. Avaliar o efeito da terapia sobre os aspectos clínicos periodontais e sobre as espécies bacterianas encontradas na saliva ao longo de 12 meses.

27 25 4 METODOLOGIA 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS Esta pesquisa tem características de uma coorte, por se tratar de um estudo longitudinal, e de ensaio clínico não randomizado, por ter realizado o tratamento periodontal, contudo ambos os grupos receberam o mesmo tipo de tratamento. Este estudo originou-se da pesquisa intitulada Resposta Clínica Periodontal e Controle Glicêmico em pacientes com diabetes tipo II portadores de Periodontite Crônica ao tratamento periodontal Full Mouth Desinfection, que teve como objetivo avaliar a efetividade da resposta clínica periodontal e o controle glicêmico em pacientes com DM tipo II portadores de periodontite crônica com a realização do tratamento periodontal não cirúrgico (FMD), e comparar esses resultados com pacientes não diabéticos. Esta pesquisa foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN), sendo aprovada com o protocolo 403/2011, CAAE: (Anexo A). Os pacientes foram incluídos nesse estudo após a assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice A). 4.2 POPULAÇÃO E AMOSTRA Foram considerados para participar da pesquisa pacientes com mais de 18 anos. Para o grupo de pacientes com diabetes, buscou-se pacientes que já tinham diagnóstico médico de diabetes. Essa busca foi feita no próprio Departamento de Odontologia da UFRN e em centros de saúde como o Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL) e o Centro Clínico da Ribeira da cidade de Natal. Todos estes são centros de referências no atendimento odontológico ou no tratamento e acompanhamento de pacientes com Diabetes.

28 Critérios de Inclusão e exclusão Critérios de Inclusão e exclusão dos pacientes Grupo Diabético (GD): Possuir o diagnóstico médico de diabetes mellitus tipo II de acordo com a Associação Americana de Diabetes (AAD); Possuir o diagnóstico clínico de periodontite crônica de acordo com a Academia Americana de Periodontia (1999), e segundo Lopez; Smith; Gutierrez, (2002): presença de quatro ou mais dentes com no mínimo um sítio com profundidade de sondagem (PS) maior ou igual a 4mm e nível clínico de inserção (NCI) maior ou igual a 3 mm em cada dente; Grupo Não Diabético (GND): Possuir o diagnóstico clínico de periodontite crônica de acordo com a Academia Americana de Periodontia (1999) e segundo Lopez; Smith; Gutierrez, (2002) e: presença de quatro ou mais dentes com no mínimo um sítio com profundidade de sondagem (PS) maior ou igual a 4mm e nível clínico de inserção (NCI) maior ou igual a 3 mm em cada dente; Foram excluídos os pacientes que apresentaram maiores complicações sistêmicas, como doença cardiovascular, Alzheimer, doenças pulmonares ou cerebrais e outras síndromes metabólicas. Também foram excluídos aqueles que utilizavam anti-inflamatórios, antibióticos ou imunossupressores nos últimos seis meses anteriores ao início da pesquisa; fumantes durante os últimos 05 anos; que estavam grávidas ou amamentando e que utilizavam aparelho ortodôntico Cálculo do tamanho da amostra O cálculo amostral determinou que 18 indivíduos em cada grupo seriam suficientes para avaliar uma diferença mínima de 1mm na alteração do NCI dos sítios doentes entre o grupo GD e GND em 12 meses, tendo o cálculo poder de 80%, intervalo de confiança de 95% e desvio padrão de 1. Entretanto, o processo

29 27 de amostragem foi não probabilístico, utilizando uma amostra por conveniência, delimitada através dos critérios de inclusão e exclusão. 4.3 COLETA DE DADOS Os pacientes participaram de uma primeira consulta a fim de verificar os critérios de inclusão e exclusão. Quando o mesmo foi inserido na pesquisa, foi realizada a anamnese e solicitado o primeiro exame sanguíneo para confirmar o diagnóstico da Diabetes. Durante a anamnese, perguntava-se ao paciente diabético como ele controlava seus níveis glicêmicos, questionando o uso de medicamentos. O exame sanguíneo foi realizado para verificar o hemograma, glicose em jejum e Hemoglobina Glicada e confirmar o diagnóstico de DM nos dois grupos, os exames foram entregues antes da realização de cada consulta do baseline, e para o GD a cada retorno era solicitado novos exames. Em seguida, foram realizados o exame periodontal e o tratamento necessário no baseline, seis e 12 meses após o exame inicial para ambos os grupos, e duas sessões de manutenção com 3 e 9 meses. A figura 1 mostra o cronograma das avaliações e o que foi realizado em cada etapa do estudo. Figura 1 - Cronograma das avaliações Baseline 3 meses 6 meses 9 meses 12 meses T0 Manutenção T1 Manutenção T2 T0: Anamnese + Coleta de material biológico + Exame Periodontal + Protocolo Full mouth Desinfection (FMD) + Apresentação do primeiro exame sanguíneo + Solicitação de novo exame sanguíneo, apenas para pacientes do grupo teste. T1, T2: Coleta de material biológico + Exame Periodontal + Terapia de manutenção, quando necessária + Apresentação do exame anterior + Solicitação de novo exame sanguíneo (apenas para pacientes do grupo teste) Exame Clínico Periodontal Em relação ao exame clínico periodontal, os dados foram anotados numa ficha clínica (Apêndice B) e as variáveis examinadas estão discriminadas abaixo: 1) Índice de sangramento à sondagem (ISS) (MUHLEMAN; SON, 1971): é registrada a presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de sangramento até 30 segundos transcorridos da sondagem realizada até o fundo do sulco/bolsa

30 28 periodontal, verificado com a utilização da sonda Carolina do Norte. Esses escores foram transformados em porcentagem para futura análise estatística. Considerou-se 100% quando o todos os sítios do paciente apresentavam escore 1, sendo feita uma regra de três simples para as demais associações. 2) Índice de placa visível (IPV) (AINAMO; BAY, 1975): quantidade de biofilme na região adjacente ao tecido gengival. Foi registrado através de análise visual a presença (escore 1) ou ausência (escore 0) de biofilme após secagem da superfície dental com ar comprimido. O mesmo procedimento de transformação para porcentagem utilizado para o ISS foi feito para o IPV. 3) Profundidade de sondagem (PS): distância em milímetros (mm) da margem gengival ao fundo da bolsa periodontal, verificada com a sonda Carolina do Norte; 4) Recessão gengival (RG): distância em milímetros (mm) da junção cemento-esmalte ou da cervical do dente à margem gengival/mucosa (COX; ZARB, 1987). 5) Nível clínico de inserção (NCI): distância em milímetros (mm) da junção cemento-esmalte ao fundo da bolsa ou sulco periodontal, verificada com a sonda Carolina do Norte. Foi calculado através da somatória da profundidade de sondagem e a recessão gengival Coleta da Saliva As amostras de saliva foram colhidas antes dos exames periodontais nos períodos avaliados. Uma amostra de saliva por paciente foi coletada em microtubos estéreis vazios, tipo eppenddorf. De acordo com a metodologia descrita por Sakai et al. (2007), os pacientes depositaram a saliva, de forma não estimulada, diretamente em microtubos estéreis dentro de um período de 1 a 5 minutos. Em seguida, os microtubos foram armazenados a -20ºC sem adição de outras substâncias até o momento da extração do DNA bacteriano Tratamento Periodontal Básico pelo Full Mouth Disinfection (FMD) Segundo o protocolo proposto por Quirynen et al. (1995), a abordagem terapêutica é realizada em até 24 horas, realizando a raspagem ultrassônica

31 29 associada à raspagem e ao alisamento com instrumentos manuais, com o tempo aproximado de 1 hora por quadrante. Imediatamente após a instrumentação, a desinfecção foi realizada seguindo a ordem: escovação da língua por 1 minuto com gel de clorexidina a 1%; irrigação subgengival dos sítios periodontalmente comprometidos (PS > 3mm) com gel de clorexidina a 1% com auxílio de uma seringa sem ponta ativa; bochecho com solução de clorexidina a 0,12% por 1 minuto (sendo 10 segundos de gargarejo, numa tentativa de alcançar as tonsilas) e, adicionalmente, os pacientes foram instruídos a fazer esse mesmo bochecho de 12 em 12 horas, durante 14 dias. Nos retornos a cada três meses, foi realizada a terapia de manutenção, em que os pacientes recebiam uma nova orientação de higiene oral e, se necessário, nova raspagem e alisamento radicular, sem o uso da clorexidina. Contudo, a coleta de dados só foi realizada nos períodos de avaliação do baseline, 6 e 12 meses após a terapia Purificação e Extração do DNA bacteriano Foram utilizados 150µl da amostra saliva para a extração do DNA bacteriano. Para realizar o protocolo, foi utilizado o kit de purificação de DNA e RNA completo da MasterPureTM (Epicentre, Madison, WI, EUA). Após a obtenção dos 150 µl da saliva em microtubo tipo eppendorfs estéril, foi adicionado 150 µl de Tissue&Cell concentrado e 1 µl de Proteinase K. Em seguida as amostras foram levadas ao banho maria na temperatura de 63ºC, onde permaneceram por 20 minutos, e a cada 5 minutos era feito a agitação da amostra utilizando o vórtex. Depois de resfriar as amostras no gelo por 5 minutos, foi adicionado 1 µl RNAse, feito um vórtex, e levado a estufa por 30 minutos para ativação da enzima. Logo, foi adicionado 100 µl de MPC Protein e levado a centrífuga refrigerada a 4ºC, na rotação de 14 mil rpm por 10 minutos. Após a centrífuga, o DNA não bacteriano foi decantado no fundo do microtubo, e o sobrenadante era removido e colocado em um novo microtubo com 500 ml de Isopropanol e levado a centrífuga nas mesmas configurações. Esse processo formou o pellet contendo o DNA bacteriano. O isopropanol foi descartado e foi colocada a mesma quantidade de Etanol absoluto para iniciar o processo de lavagem e purificação do DNA bacteriano. Em seguida, a amostra foi novamente

32 30 levada a centrífuga nas mesmas configurações por 2 min. Após esse processo, o etanol absoluto foi descartado e o etanol 70% adicionado e centrifugado também por 2 min. Depois do processo de lavagem com os álcoois, o último foi descartado e as amostras foram levadas para a estufa para que qualquer resquício de álcool fosse evaporado. As amostras foram então diluídas em 10 µl de Água DEPC e foi realizada a quantificação do DNA através do espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Para a amostra final ser considerada viável foi necessário ter a concentração mínima 20 ng/µl. Após a finalização desta etapa, as amostras foram armazenadas a -20ºC até o momento da realização do real-time PCR Avaliação Microbiológica por meio do real-time PCR As espécies de bactérias que foram analisadas foram as do complexo vermelho: Treponema denticola, Porphyromonas gingivalis e Tannerella forsythia através da técnica PCR real-time utilizando o LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). As reações de amplificação de cada amostra foram feitas em um volume final de 10 µl, e tinham que ter pelo menos 2,5 µl de DNA bacteriano isolado (20 ng/µl). Foi realizada também uma reação de mistura contendo os iniciadores, o FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics GmbH), e o DNA isolado. A quantificação absoluta da espécie-alvo em cada amostra foi verificada por meio de curvas-padrões preparadas com as estirpes de referência descritas na Tabela 1. A determinação do teor de DNA nos controles foi baseada no tamanho do genoma de cada uma das espécies e o peso médio de um par de nucleotídeos (Dolezel et al., 2003). Com base nas curvas padrões, a pontuação obtida das amostras individuais foi convertida no número de células bacterianas. O nível de detecção foi definido como 10 5 bactérias. Todo o protocolo microbiológico foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Odontologia II, da Universidade de Guarulhos. Tabela 1 - Sequência de Primers, perfil de amplificação e comprimento estimado do produto final da Reação em Cadeia de Polimerase para espécies bacterianas. Espécie/ estirpe Sequência Perfil de Compriment Amplificação o do Produto

33 31 de referência [temperatura(º C)/tempo(s)] da PCR (bp) P. gingivalis/ ATCC Nonnenmacher et al. (2004) 5 TGCAACTTGCCTTACAGAGGG 3 ACTCGTATCGCCCGTTATTC 95/10, 57/10, 72/ T. forsythia/ ATCC Al-Hebshi et al. (2010) 5 GATAGGCTTAACACATGCAAGTC 3 GTTGCGGGCAGGTTACATAC 95/10, 57/10, 72/4 99 T. denticola/ ATCC GACGCAAACGCATTAAGTG 3 GACGCAAACGATTAAGTG 95/10, 56/10, 72/ QUADRO DE VARIÁVEIS Os quadros 2 e 3 apresentam a relação de variáveis dependentes e independentes do estudo, respectivamente, de acordo com a sua classificação e categorização. Quadro 2 - Variáveis independentes do estudo Variáveis Classificação Categorização Descrição Diabetes Mellitus tipo II Periodontite Crônica Qualitativa Nominal Mutuamente Exclusiva Qualitativa Nominal Mutuamente Exclusiva Quadro 3. Variáveis dependentes do estudo. 0 Ausência 1 Presença 0 Ausência 1 Presença Condição Crônica que afeta o modo como o corpo processa o açúcar no sangue (glicose). Doença inflamatória de caráter infeccioso que atinge o periodonto de proteção e sustentação. Variáveis Classificação Categorização Descrição Sexo Idade Período Quantidade de bactérias presente na saliva Qualitativa Nominal Mutuamente Exclusiva Quantitativa discreta Qualitativa Ordinal Quantitativa Contínua 0 Feminino 1 Masculino Não categorizada T0 baseline T1 6 meses T2 12 meses Não categorizada Diferença física e constitutiva do homem e da mulher. Tempo transcorrido desde o nascimento. Períodos de avaliação periodontal Quantidade de bactérias verificadas através do método de PCR Distância, em milímetros (mm), da Profundidade de Quantitativa Não margem da gengiva/mucosa ao Sondagem Contínua categorizada fundo da bolsa ou sulco periodontal. Recessão Gengival Quantitativa Não Distância em milímetros (mm) da

34 32 Nível Clínico de Inserção Índice de Sangramento a Sondagem Índice de Placa Visível Porcentagem de Sítios Número de dentes perdidos Número de sítios afetados Parâmetros Sanguíneos Contínua categorizada junção cemento-esmalte ou da cervical do dente à margem gengival/mucosa Quantitativa Contínua Quantitativa Contínua Quantitativa Contínua Quantitativa contínua Quantitativa discreta Quantitativa discreta Quantitativa discreta Não categorizada Não categorizada Não categorizada Não categorizada Não categorizada Não categorizada Não categorizada Em milímetros (mm), será obtida pela distância da junção cementoesmalte ao fundo do sulco ou bolsa periodontal. Presença de sangramento após a sondagem periodontal transformado em porcentagem Verificar a presença de biofilme em todas as faces dos dentes adjacentes a gengiva transformado em porcentagem. Porcentagem de sítios com profundidade de sondagem 3mm e >3 mm Número de dentes perdidos ao final do tratamento Quantidade de sítios com profundidade de sondagem 4 mm no baseline Exames sanguíneos de Glicose em jejum e Hemoglobina glicada para verificar níveis de glicose no sangue 4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados foram armazenados em um programa Estatístico SPSS 17.0 (Statistical Package for Social Science). Inicialmente, uma análise descritiva dos dados foi realizada para uma avaliação da distribuição da normalidade dos dados. Foram realizados testes não paramétricos diante da ausência de normalidade dos dados. A análise foi dividida entre os parâmetros clínicos e microbiológicos. Para parâmetros clínicos, foi realizada uma análise de todos os sítios e outra apenas com os sítios doentes (PS 4mm e NCI 3mm) (LOPEZ; SMITH; GUTIERREZ, 2002). Foram aplicados o teste de Mann-Whitney para análise inter-grupo em cada tempo, e o teste de Friedman para análise intra-grupo entre todos os períodos estudados, caso este obtivesse diferença significativa, o teste de Wilcoxon era realizado para identificar entre quais os períodos existiu a diferença, com penalização do p valor multiplicado pelo número de comparações. Além disso, também foi avaliado se havia diferença estatisticamente significativa durante todo o período do estudo e o baseline. Para isso, criou-se uma nova variável delta ( ) para cada variável analisada indicando a diferença entre o inicial (baseline) e o final (12 meses), por exemplo PS = PS12meses PSbaseline,

35 33 sendo estas comparadas entre GD e GND. Para todos os testes foi pré-estabelecido um nível de significância de 5% (alpha=0,05). 5 RESULTADOS 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA Para este estudo foram tratados 70 pacientes que preencheram os critérios de inclusão, sendo 29 pertencentes ao GD e 41 ao GND. Ao longo do tempo houve perdas de pacientes, finalizando com 18 pacientes no GD e 36 pacientes no GND, após 12 meses de acompanhamento. O quantitativo em relação às perdas pode ser acompanhado no fluxograma presente na Figura 2. Os motivos para essas perdas consistiram de causas financeiras, motivos pessoais, resolução do problema principal nas primeiras consultas e também o próprio descaso com o tratamento empregado. Figura 2 - Fluxograma da perda de pacientes no período de 12 meses.. Inicialmente, havia 18 mulheres e 08 homens no GD, e 27 mulheres e 12 homens no GND. Ao final do período de 12 meses, o GD constituiu-se por 12 mulheres e 06 homens, enquanto que o GND possuía 25 mulheres e 11 homens. Não foi encontrada associação significativa entre os grupos com relação ao sexo (p=0,536). GND apresentou uma mediana de 11 dentes perdidos, enquanto que GD apresentou mediana de 16, não havendo diferença entre os grupos quanto a esta característica (p=0,159).

36 34 Com relação à idade dos pacientes, a média de idade dos pacientes no grupo diabético foi de 59,50 ± 9,16 anos e no GND foi de 45,86 ± 12,38 anos, e houve diferença significativa entre os grupos (p<0,001). Por essa razão, foi criada uma nova variável Faixa Etária, em que os indivíduos foram separados a partir da mediana de 51 anos para os dois grupos, estabelecida através da análise descritiva de todos os pacientes independente do grupo. Com isso, foram criadas duas categorias: 51 anos e >51 anos. Todas as variáveis foram analisadas através do teste de Mann- Whitney para verificar se havia diferenças entre os grupos para cada categoria da Faixa Etária. Não foram encontradas diferenças significativas para nenhuma das variáveis (p>0,05), portanto, a idade não apresentou influência sobre as variáveis estudadas. Ao analisar o grupo dos pacientes com diabetes ao longo do tempo, não houve alteração significativa em relação à hemoglobina glicada durante os períodos avaliados, a qual oscilou entre 7,4% no baseline, 7,79%, 7,3% após 6 e 12 meses do FMD, respectivamente (p=0,937). Da mesma maneira, significância estatística não foi encontrada para a glicose em jejum, sendo a mediana de 97 mg/dl no baseline e nos períodos de 6 e 12 meses, 104 mg/dl e 102,9 mg/dl respectivamente (p=0,667). 5.2 PARÂMETROS CLÍNICOS Com relação aos parâmetros clínicos, as análises foram feitas com todos os sítios dos pacientes para possibilitar uma avaliação geral da condição de saúde bucal do indivíduo, e apenas dos sítios doentes com PS 4mm (LOPEZ; SMITH; GUTIERREZ, 2002). Na avaliação intergrupo de todos os sítios (Tabela 2), observou-se que não houve diferença significativa ao longo do tempo para a maioria das variáveis analisadas nos períodos isolados. Para a recessão gengival foi encontrada diferença significativa no baseline (p1=0,037), e as medianas do grupo GND são menores do que o GD. Ao analisar a diferença entre os grupos para o T0-T12 de todos os parâmetros não foram encontradas diferenças (p3>0,05). A análise intragrupo (Tabela 2) mostrou uma redução estatisticamente significativa na profundidade de sondagem, no índice de placa visível e no índice de sangramento à sondagem em ambos os grupos no decorrer dos períodos avaliados, em comparação com o baseline (p2<0,05). Com relação ao nível clínico de inserção,

37 35 houve redução estatística apenas para o grupo GD (p2=0,026). Não foram observadas alterações estatisticamente significativas no tocante a recessão gengival em ambos os grupos (p > 0.05). Na análise da porcentagem de sítios com PS até 3 mm e > 3 mm (Tabela 3), não se observou diferença significativa entre os grupos durante os 12 meses (p1>0,05). Na análise intragrupo, observou-se uma diferença significativa (p2 < 0,05) em relação aos períodos analisados em todas as categorias para ambos os grupos, havendo aumento do número de sítios com PS 3 mm, e redução dos sítios com PS > 3 mm. Tabela 2 - Parâmetros periodontais de todos os sítios [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline, com 6 e 12 meses pós terapia. Grupo Diabético Grupo não Diabético Parâmetro Período P 1 (n=18) (n=36) ISS (%) Baseline 38,61(25,25-60,29)a 33,33(17,95-53,85)a 0,663 6 Meses 18,97(14,58-42,03)b 23,53(15,33-34,31)b 0, Meses 19,95(09,33-41,67)b 21,01(12,67-28,57)c 0,646 T12-T0 -[17,54(22,87-0,0)] -[16,05(30,28-1,84)] P 2 0,002 0,001 P 3 0,869 IPV (%) Baseline 65,05(32,92-78,51)a 44,83(26,02-58,16)a 0,071 6 Meses 35,99(10,74-52,16)b 22,00(15,38-46,43)b 0, Meses 24,62(11,39-49,69)b 19,51(10,53-30,49)b 0,240 T12-T0 -[27,96(36,18-8,24)] -[23,45(37,82-9,09)] P 2 <0,001 <0,001 P 3 0,660 PS (mm) Baseline 2,45(2,24-3,29)a 2,44(2,14-3,16)a 0,963 6 Meses 2,09(1,89-2,69)b 2,35(2,14-2,63)a 0, Meses 1,99(1,76-2,57)c 2,17(2,02-2,67)b 0,106 T12-T0 -[0,47(0,62-0,23)] -[0,31(0,64-0,02)]

38 36 P 2 <0,001 <0,001 P 3 0,080 RG (mm) Baseline 1,43(0,67-2,43)a 0,66(0,14-1,64)a 0,037 6 Meses 1,68(0,88-2,45)a 0,68(0,20-1,56)a 0, Meses 1,57(0,84-2,48)a 0,86(0,26-1,72)a 0,244 T12-T0 0,09[(-0,15)-0,71] 0,04[(-0,07)-0,26] P 2 0,229 0,101 P 3 0,790 NCI (mm) Baseline 3,65(1,44-4,75)a 2,48(0,83-3,71)a 0,102 6 Meses 3,67(1,56-5,26)a 2,11(0,92-3,85)a 0, Meses 3,23(1,57-5,15)a 2,06(0,86-3,61)a 0,275 T12-T0-0,28[(-0,71)-0,10] -0,16[(-0,51)-0,19] P 2 0,023 0,512 P 3 0,457 Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativa dentro do grupo nos períodos avaliados pelos testes de Friedman (P 2 ) e Wilcoxon (p<0.05). P 1 indica o valor de P entre os grupos nos períodos avaliados pelo teste de Mann-Whitney. Tabela 3 - Porcentagem de sítios com profundidade de sondagem até 3 mm, maior que 3 e menor que 6mm e maior que 6 mm [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline e com 6 e 12 meses pós terapia. % de sítios com PS: Período Grupo Diabético (n=18) Grupo não Diabético (n=36) 3 mm Baseline 92,13(60,27-97,81)a 87,71( ,94)a 0,449 6 Meses 97,84(79,03-100)b 95,00(84,38-99,30)b 0, Meses 98,12(88,75-100)b 95,06(85,76-99,24)c 0,282 T12-T0 7,50(1,79-13,61) 7,41(0,62-20,04) P 2 <0,001 <0,001 P 3 0,890 P 1 > 3 mm Baseline 7,87(2,18-39,72)a 12,29(3,05-32,84)a 0,465

39 37 6 Meses 2,16(0,0-20,97)b 4,99(0,69-15,61)b 0, Meses 1,88(0,0-11,25)b 4,94(0,76-14,23)c 0,290 T12-T0 -[7,50(13,61-1,79)] -[7,41(20,04-0,62)] P 2 <0,001 <0,001 P 3 0,912 Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativa dentro do grupo nos períodos avaliados pelos testes de Friedman (P 2 ) e Wilcoxon (P <0.05). P 1 indica o valor de P entre os grupos nos períodos avaliados pelo teste de Mann-Whitney. Os mesmos pacientes foram analisados também em relação apenas aos sítios periodontais doentes. A média da quantidade de sítios afetados para cada grupo foi de 16,36 para o GD e de 25,82 para o GND, sem diferença estatística entre os grupos (p=0,139). Na avaliação intergrupo dos sítios doentes (Tabela 4), percebe-se que não houve diferença significativa ao longo do tempo em relação do ISS entre os grupos (p1>0,05). Entretanto, houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos no que diz respeito ao IPV no baseline (p1=0,006) e 12 meses (p1=0,043); bem como à PS no baseline (p1=0,022). Também houve diferença estatística para RG nos três períodos avaliados (p1<0,05), enquanto que para NCI houve apenas no período de 12 meses (p1=0,034). Em todos esses casos, as piores medianas foram para o GD, exceto no baseline da PS. No entanto, ao avaliar o T0-T12 dos parâmetros dos sítios doentes, apenas o nível clínico de inserção apresentou diferença significativa entres os grupos (p=0,008). Verificou-se que o GD apresentou maior perda de inserção após 12 meses, enquanto o GND ganhou após os períodos avaliados. Tabela 4 - Parâmetros periodontais dos sítios doentes [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline, com 6 e 12 meses pós terapia. Parâmetro Período Grupo Diabético Grupo não Diabético P 1 ISS (%) Baseline 76,5(64,2-98,0)a 80,0(50,0-89,1)a 0,823 6 Meses 33,3(10,5-61,8)b 37,5(29,2-59,6)b 0, Meses 55,8(24,0-68,2)b 34,8(18,2-51,9)b 0,101 T12-T0 -[28,9(55,0-1,34)] -[36,4(66,39-12,03)] P 2 0,022 <0,001

40 38 P 3 0,774 IPV (%) Baseline 100(82,2-100)a 85,71(50,0-100)a 0,006 6 Meses 71,0(17,5-97,0)b 36,36(26,31-76,0)b 0, Meses 50,0(38,1-73,3)b 32,60(10,0-50,0)b 0,043 T12-T0 -[50,0(61,9-12,7)] -[50,0(66,7-19,27) P 2 0,019 <0,001 P 3 0,914 PS (mm) Baseline 4,43(4,00-4,87)a 5,33(4,40-5,85)a 0,022 6 Meses 3,38(2,51-3,73)b 3,54(3,00-4,40)b 0, Meses 3,28(2,38-4,00)b 3,18(2,73-3,92)c 0,971 T12-T0 -[1,59(1,77-1,03)] -[1,45(2,49-1,30)] P 2 0,002 <0,001 P 3 0,279 RG (mm) Baseline 1,50(0,65-2,75)a 0,67(0,00-2,00)a 0,047 6 Meses 2,33(1,07-3,29)b 0,81(0,33-2,00)a 0, Meses 2,50(1,21-3,03)b 0,81(0,36-1,89)a 0,005 T12-T0 0,77(0,03-1,27) 0,08[(-0,16)-0,54] P 2 0,045 0,079 P 3 0,073 NCI (mm) Baseline 5,50(4,92-7,41)a 5,81(4,75-7,38)a 0,953 6 Meses 4,99(4,50-7,09)a 4,49(3,55-5,45)b 0, Meses 5,58(4,10-7,07)a 4,09(3,49-4,77)b 0,034 T12-T0-0,82[(-1,12)-0,33] -[1,5(2,48-0,94) P 2 0,066 <0,001 P 3 0,008 Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativa dentro do grupo nos períodos avaliados pelos testes de Friedman (P 2 ) e Wilcoxon (p<0.05). P 1 indica o valor de P entre os grupos nos períodos avaliados pelo teste de Mann-Whitney.

41 39 A análise intragrupo (Tabela 4) mostrou uma redução estatisticamente significativa para todos os parâmetros, exceto NCI, para o GD. Foi possível verificar que ao longo do tempo a maioria dos parâmetros clínicos diminuem, exceto a RG que aumentou. Para o grupo GND, houve redução estatística significativa na PS, no IPV, ISS e no NCI. 5.3 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA Para a análise da saliva, foram utilizadas as amostras de saliva com quantidade de DNA viável de 56 pacientes com amostras. O quantitativo em relação às perdas pode ser acompanhado no fluxograma presente na Figura 3. Os principais motivos para essas perdas consistiram, além do abandono de tratamento, a degradação do DNA e quantidade insuficiente de DNA bacteriano após a extração. Figura 3 - Fluxograma das amostras de saliva no período de 12 meses. Com relação a analise microbiológica, na análise intergrupo da saliva (Tabela 5), não foi observada diferença significativa para Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola em nenhum dos períodos avaliados (p>0,05). Diferença significativa foi observada apenas para a espécie Tanerella forsyhtia com 12 meses de acompanhamento, em que a maior mediana foi também do grupo GND (mediana GND=4,93; mediana GD= 3,04; p=0,007). Para a saliva, na análise intragrupo, as espécies Treponema denticola e Tanerella forsyhtia apresentaram diminuição da mediana de forma estatisticamente significativa após 12 meses (p=0,020/p=0,049, respectivamente), porém, não foram encontradas diferenças quando analisados os tempos isoladamente. Já para a

42 40 Porphyromonas gingivalis, houve um aumento na mediana em relação a sua quantidade após 12 meses para ambos os grupos, mas este aumento teve significância estatística apenas para GD (p=0,012). Tabela 5 - Quantidade de bactérias das espécies do complexo vermelho na saliva [mediana (Q25 Q75)] para os grupos no baseline e com 6, e 12 meses pós terapia. Grupo Diabético Grupo não Parâmetro Período P 1 (n=14) Diabético (n=28) Porphyromonas gingivalis (log10) Baseline 0,66(0, )a 2,75(0,00-3,80)a 0,085 6 Meses 0,00(0, )a 0,22(0,00-3,25)a 0, Meses 1,81(0, )a 2,84(0,00-4,00)a 0,838 T12-T0 0,03[(-0,45)-0,96] 0,0[(-0,80)-1,20] P 2 0,020 0,178 P 3 0,815 Treponema denticola (log10) Baseline 5,32(0, )a 5,22(0,00-6,80)a 0,367 6 Meses 0,00(0, )a 4,96(0,00-6,73)a 0, Meses 0,24(0, )a 5,18(0,00-22,4)a 0,093 T12-T0-0,19[(-5,25)-0,26] 0,0[(-0,15)-5,63] P 2 0,049 0,234 P 3 0,085 Tanerella forsythia (log10) Baseline 4,10(2, )a 4,89(3,38-5,42)a 0,112 6 Meses 2,92(2, )a 4,73(3,39-5,20)a 0, Meses 3,04(2, )a 4,93(3,89-5,20)a 0,004 T12-T0-0,13[(-1,69)-0,40) 0,0[(-0,63)-0,60] P 2 0,012 0,488 P 3 0,254 Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativa dentro do grupo nos períodos avaliados pelos testes de Friedman (P 2 ) e Wilcoxon (P <0,05). P 1 indica o valor de P entre os grupos nos períodos avaliados pelo teste de Mann-Whitney. 6 DISCUSSÃO Este estudo avaliou a influência da diabetes mellitus tipo II na eficácia do tratamento periodontal por meio dos parâmetros clínicos periodontais e da presença

43 41 de periodontopatógenos na saliva. No entanto, essa condição sistêmica pareceu não influenciar em como o periodonto responde ao tratamento periodontal, visto que a maioria dos parâmetros clínicos melhoraram 12 meses após o tratamento quando os pacientes se apresentam bem controlados. No Brasil, a DM atinge aproximadamente 16 milhões de pessoas, e 6% do total das mortes são associadas a essa doença (WHO, 2016). No ano de 2013, 7% da população feminina apresentava diagnóstico de DM, enquanto o sexo masculino era 5,4% (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2014). Neste estudo, houve também uma maior frequência de mulheres em ambos os grupos, mas sem diferença entre eles (p=0,536). Essa prevalência do sexo feminino pode estar associada ao fato dos homens procurarem menos os serviços de saúde (TUDIVER; TALBOT, 1999). Com relação a idade, que é um fator que interfere na doença periodontal e na diabetes, pois ambas as doenças têm efeito cumulativo nos tecidos (BOKHARI et al., 2015; WING et al., 1987), esse estudo não apresentou diferença entre os grupos (p>0,005) quando a idade foi estratificada, portanto, não foi uma variável que influenciou nos resultados encontrados. A AAD (2017) recomenda que pacientes enquadrados com alto risco de desenvolvimento da diabetes deve realizar os testes de diagnóstico em qualquer faixa etária e, a partir de 45 anos, para qualquer pessoa. Dessa maneira, o número de adultos assintomáticos e sem o diagnóstico tende a diminuir (AAD, 2017). Segundo Hasseb et al. (2012), os pacientes diabéticos com pobre controle glicêmico apresentam mais perda de inserção do que aqueles que são bem controlados ou saudáveis, sem diferenças quando comparado o bem controlado com o saudável. O presente estudo mostrou que não houve diferenças entre os grupos para os parâmetros avaliados ao longo do tempo (p3>0,05). No entanto, o grupo de pacientes diabéticos apresentavam-se bem controlados, pois ao final do tratamento obtiveram mediana de 7,3% para HbA1C e 102,9 mm/dl para glicose em jejum, sendo esses valores indicados como bom controle segundo Associação Americana de Diabetes (AAD, 2017). Diversos estudos mostram que não existem diferenças nos parâmetros clínicos se um bom controle glicêmico é efetuado. (KUDVA; TABASUM; GARG, 2010; CIRANO et al., 2012; HASSEB et al., 2012). O tratamento periodontal realizado pela técnica do Full Mouth Desinfection foi efetivo para ambos os grupos. Após 12 meses da terapia inicial, tanto os

44 42 pacientes do GD como do GND apresentaram melhoras significativas nos parâmetros de ISS, IPV e PS. Isso significa que a atividade da doença provavelmente diminuiu, podendo-se afirmar que houve um controle da doença periodontal de todos os grupos. Nesse contexto, foi feita a análise da porcentagem dos sítios com 3 mm ou menos, e acima de 3 mm. Pode-se perceber que após 12 meses do tratamento, mais de 90% dos sítios estavam com PS 3 mm para ambos os grupos; isto indica a importância do tratamento periodontal independente da condição sistêmica apresentada. Entretanto, a quantidade de sítios saudáveis no baseline foi superior a 70%, o que caracteriza neste caso, a doença periodontal como uma Periodontite Crônica Localizada (ARMITAGE, 1999). Porém, tendo em vista ser a doença periodontal sítio-específica, foi necessário realizar a análise apenas dos sítios doentes para conhecer sobre a severidade e sítio-especificidade desta doença. Na análise dos sítios doentes, não houve diferença entre o número de sítios afetados nos grupos (p=0,139), mas houve diferenças em relação a análise de todos os sítios. Os parâmetros clínicos ISS, IPV e PS continuaram com redução estatística significativa para ambos os grupos (p<0,005). No grupo diabético aumentou significativamente a recessão gengival após 12 meses. Esse aumento da RG é caracterizado como uma sequela do tratamento periodontal, que pode acontecer devido a diminuição do processo inflamatório no tecido gengival que diminui o edema na região (JATI; FURQUIM; CONSOLARO, 2016). Devido ao aumento da RG e diminuição da PS, neste mesmo grupo, o NCI não mostrou diferença após o tratamento. Já no GND, apesar do discreto aumento da RG, houve uma redução significativa do NCI associada a diminuição contínua da profundidade de sondagem ao longo dos 12 meses. O grupo GND apresentou maior profundidade de sondagem no baseline do que o grupo GD, que com o tratamento reduziu na avaliação de 6 e 12 meses. Na avaliação final não apresentou diferenças em relação ao GD. Mesmo com a diferença no baseline, ao analisar a diferença da redução ao longo do tempo da PS entre os dois grupos, esta não foi significativa (p3=0,279). Apesar disso, o NCI mostrou-se diferente entre os grupos (p3=0,008), em que o grupo GD apresentou maior mediana, provavelmente devido ao aumento da RG neste grupo. Por essa razão, não se pode creditar essa diferença apenas a influência da condição sistêmica estudada, mesmo o grupo GD apresentando

45 43 maiores medianas em outras variáveis. Outros fatores, como a dificuldade regenerativa desses pacientes causados pela interferência dos AGEs na síntese do colágeno, a diferença do tamanho da amostra dos grupos, e a diferença estatística para recessão gengival entre os grupos no início do estudo podem influenciar este resultado. Mesmo assim, os parâmetros clínicos dos sítios doentes, para os dois grupos, não se apresentam dentro dos padrões para serem considerados saudáveis, visto que o ISS e o IPV, por exemplo, se apresentam maiores que 30% em ambos os grupos depois do tratamento periodontal, porém no GD, as medianas do IPV foram maiores que o GND antes e após o tratamento. Outros estudos também obtiveram níveis elevados de biofilme após o tratamento (BOTERO et al., 2013; SANTOS et al., 2013; MOENTAGHAVI et al., 2012). Isso demonstra a importância da motivação do paciente e a necessidade de orientação de higiene nos retornos periódicos da terapia de suporte periodontal, para que o resultado da remoção dos depósitos de biofilme imediatamente após terapia seja mantido pelo paciente com o controle diário. Independente das pequenas diferenças entre os grupos, é importante ressaltar a importância do tratamento periodontal não cirúrgico. Neste estudo, a maioria dos parâmetros, seja de todos os sítios presentes ou apenas daqueles doentes, mostraram melhoras após a primeira avaliação e permaneceram após 12 meses. Diversos estudos com diferentes métodos de tratamento mostram a melhora dos parâmetros quando a raspagem supragengival e subgengival estão associadas, quando comparados a nenhum tratamento ou quase nenhum (KOROMANTZOS et al., 2011; CHEN et al., 2012; MOEINTAGHAV et al., 2012; ENGEBRETSON et al., 2013; HINCAPIÉ et al., 2014). Engebretson et al. (2013) avaliaram 514 pacientes, sendo 257 sem tratamento periodontal durante o estudo. Foi observada melhora de todos os parâmetros do grupo que recebeu o tratamento e diferença significativa entre os grupos (ENGERBRETSON et al., 2013). Já Hincapié et al. (2014) avaliaram o uso da Azitromicina associado ao tratamento periodontal. No entanto, um grupo de 31 pacientes receberam apenas profilaxia e o uso dos antibióticos, e este não obteve melhora do NCI após 9 meses de avaliação (HINCAPIÉ et al., 2014). Esses autores avaliaram também a presença das bactérias periodontopatogênicas no biofilme, e observaram a redução de P. gingivalis, T. denticola e A. actinomycetemcomitans

46 44 após 3 meses de avaliação, mas um aumento progressivo em todos os grupos. Entretanto, a frequência de detecção dessas bactérias foi similar entre os grupos estudados (HINCAPIÉ et al., 2014). Nesse contexto, o presente estudo buscou avaliar a presença das bactérias do complexo vermelho na saliva dos pacientes estudados. Idealmente, seria necessária a avaliação do biofilme das bolsas periodontais desses pacientes, além da saliva. Porém, no início do presente estudo, as amostras de biofilme foram coletadas em cones de papéis absorventes e colocadas em 0.5 ml de TE (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 7.6). Após a extração de DNA, nenhuma das amostras possuíam a quantidade de DNA suficiente para detecção na técnica do real-time PCR. Um dos fatores atribuídos a este acontecimento é a diluição do DNA bacteriano na grande quantidade de TE (10 mm Tris-HCl, 1 mm EDTA, ph 7.6) utilizada no momento da coleta. Por essa razão, uma nova coleta foi realizada em novos pacientes utilizando curetas para remoção do biofilme subgengival, mas até a finalização dessa dissertação não havia número suficiente de amostras para serem analisadas estatisticamente. Na análise da saliva, não foi observada diferença entres os grupos quando avaliada a diferença entre os períodos estudados (p3>0,05). Ao avaliar cada período isoladamente, apenas a espécie T. forsythia apresentou mediana maior para o GND, em 12 meses, e foi estatisticamente significativa (p1=0,004). Esta espécie foi mais facilmente detectada nas amostras de saliva, e isso acontece porque essas bactérias podem se desenvolver em outros ambientes da boca (UMEDA et al., 1998; KÖNÖNEN et al., 2007; VAN ASSCHE et al., 2009). Esta espécie permaneceu detectável em amostras de saliva e da língua de pacientes mesmo após a extração de todos os dentes (VAN ASSCHE et al., 2009). No grupo GND, todas as espécies do complexo vermelho reduziram após 6 meses, no entanto voltaram a aumentar com 12 meses, mas sem significância estatística. Já no GD, as espécies T. denticola e T. forsythia reduziram significativamente após o tratamento, voltaram a aumentar com 12 meses, mas sem ultrapassar os valores iniciais (p2<0,05). No entanto, para P. gingivalis, na última avaliação, o valor mais do que dobrou em relação ao baseline (p2<0,05). A recolonização bacteriana nos sítios periodontais já foi observada em outro trabalho (ZIJNGE et al., 2010), apesar das amostras do presente estudo serem da saliva, a presença das bactérias estudadas nesse ambiente está associada a

47 45 presença da doença periodontal (UMEDA et al., 2004; KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009; SAYGUN et al., 2011). Saygun et al. (2011) encontraram maiores quantidades de bactérias nos pacientes que tinham algum tipo de doença periodontal, seja gengivite ou periodontite, do que naqueles pacientes que tinham o periodonto saudável (SAYGUN et al., 2011). Estudos de base populacional também detectaram diferentes níveis de periodontopatógenos na saliva, de acordo com a condição periodontal, e sugerem este método de avaliação como auxiliar no diagnóstico periodontal, especialmente, quando se trata de grandes amostras, porque a coleta de saliva é um método fácil e rápido, e não necessita de um cirurgião-dentista experiente para tal (KÖNÖNEN et al., 2007; PAJU et al., 2009). A Porphyromonas gingivalis foi a única bactéria que após o tratamento cresceu mais do que os níveis detectados no baseline. Essa espécie é uma das mais relacionadas com a reabsorção do osso alveolar porque tem vários fatores de patogenicidade associados à sua fisiologia. Essa espécie é capaz de evadir-se da resposta imune, e por essa razão, persiste em ambientes com grande resposta inflamatória (HOLT; EBERSOLE, 2005). Nos pacientes com DM, a resposta inflamatória é exacerbada, e mesmo em condição de saúde periodontal, apresenta níveis de citocinas mais elevados (BEZERRA et al., 2015). Sawamoto et al. (2005) mostraram correlação entre a presença dessas bactérias na saliva e níveis aumentados de profundidade de sondagem. No entanto, neste estudo após 12 meses, a profundidade de sondagem diminuiu tanto na avaliação de todos os sítios como na avaliação dos sítios doentes, o que leva a comprovar a eficácia do tratamento periodontal não cirúrgico e das sessões de retorno para reavaliação e controle. Contudo, a saliva pode funcionar como um meio de transmissão de adultos para crianças se detectada a presença dessas bactérias (UMEDA et al., 2004; PETIT et al., 1994). Por essa razão, o tratamento deve virar rotina daqueles pacientes que apresentam a doença periodontal, mesmo que controlada. Nesse sentido, Umeda et al. (2004) avaliaram crianças e seus pais a fim de investigar a presença de bactérias periodontopatogênicas em crianças e sua relação com os parâmetros clínicos e a presença das bactérias nos pais dessas crianças. Eles sugeriram a transmissão familiar de algumas espécies, como T. forsythia, que foram detectadas em níveis mais elevados em crianças das quais os pais já tinham estas no ambiente bucal. Entretanto, os estudos que avaliam as amostras de saliva não são longitudinais, e não há resultados na literatura de como essas bactérias se

48 46 comportam após o tratamento periodontal e nem em pacientes com comprometimento sistêmico. Mesmo com os resultados do presente estudo, é necessário que as pesquisas dessas espécies bacterianas após diferentes técnicas de tratamento continuem, para buscar entender qual o melhor método de reduzir os níveis bacterianos em pacientes sistemicamente comprometidos e como a presença dessas bactérias na saliva podem interferir na condição geral de saúde bucal.

49 47 7 CONCLUSÃO A diabetes não influenciou na resposta do tratamento periodontal, ambos os grupos apresentaram melhora dos parâmetros clínicos avaliados. após o tratamento com a técnica Full Mouth Disinfection e terapia de manutenção periodontal.

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58 56 ANEXOS Anexo A Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa

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60 58 APÊNDICES Apêndice A Termo de Consentimento Livre e Esclarecido UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE Esclarecimentos TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDOO Este é um convite para você participar da pesquisa Avaliação Clínica e microbiológica do tratamento periodontal não-cirúrgico de pacientes diabéticos e não diabéticos que é coordenada por Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel. Sua participação é voluntária, o que significa que você poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade. Essa pesquisa procura avaliar o efeito da limpeza do tártaro e da placa bacteriana na melhora da saúde da boca em pacientes com diabetes e saudáveis que possuam inflamação na gengiva e perda de osso ao redor dos dentes, procurando observar a quais as bactérias presentes e, naqueles com diabetes, observar também a quantidade de açúcar no sangue. Além disso, busca avaliar se há presença de sangramento na gengiva ou pus antes e após o tratamento. Caso decida aceitar o convite, você será submetido(a) ao(s) seguinte(s) procedimentos: raspagem de tártaro e da placa bacteriana; coleta da placa bacteriana com cone de papel absorvente, da saliva e das células da bochecha quatro vezes; exame de sangue, exame clínico periodontal quatro vezes e as informações sobre os hábitos alimentares e uso de medicamentos serão anotadas em uma ficha. Os riscos envolvidos com sua participação são: incômodos como sensibilidade ou desconforto durante o exame da sondagem ou na limpeza, só que a única forma de se realizar o exame é com o procedimento de sondagem da gengiva e o tratamento da gengiva é realizado com a limpeza. Os incômodos serão minimizados através do procedimento de sondagem e de limpeza realizados de forma suave, com anestesia quando necessário, não gerando danos à sua gengiva. Você terá os seguintes benefícios ao participar da pesquisa: Manter a saúde da gengiva, tirando todo o tártaro e placa bacteriana e conhecer como isso influencia no controle da diabetes. Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar os voluntários. Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa, você será ressarcido, caso solicite. Em qualquer momento, se você sofrer algum dano comprovadamente decorrente desta pesquisa, você terá direito a indenização. Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para Dr. Bruno César de Vasconcelos Gurgel, no endereço Departamento de odontologia, Av.Senador Salgado Filho 1787, Lagoa Nova, Natal,RN-Brasil ou pelo telefone (84) , Ramal:411 ou para a Angélica Oliveira de Assis no celular (84) Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN, no endereço Praça do Campus, Campus Universitário, CP 1666, Natal, , Brasil, cepufrn@reitoria.ufrn.br; ou pelo telefone :

61 59 Consentimento Livre e Esclarecido Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa Avaliação Clínica e microbiológica do tratamento periodontal não-cirúrgico de pacientes diabéticos e não diabéticos. Participante da pesquisa: Pesquisador responsável: Nome: Assinatura: Endereço profissional: Departamento de odontologia, Av.Senador Salgado Filho 1787, Lagoa Nova, Natal,RN-Brasil, telefone (84) Comitê de ética e Pesquisa Endereço: Praça do Campus Universitário, Lagoa Nova. Caixa postal 1666, CEP Natal/RN, telefone: (84)

62 60 Apêndice B Ficha Clínica IDENTIFICAÇÃO DO PACIENTE UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Nome Idade Data de Nascimento Gênero Profissão Endereço Telefone Celular RG F CPF Anamnese 1. Está sob tratamento médico? Sim Não 2. Está tomando alguma medicação no momento?qual (is) Sim Não 3. Já teve alguma doença grave? Qual (is) Sim Não 4. Já foi operado alguma vez? Qual (is) Sim Não 5. Existe algum caso de diabetes ou câncer na família? Sim Não Que doença e grau de parentesco? 6. Tem ou teve alguma (s) das seguintes doenças infecto-contagiosas: Hepatite Sífilis Tuberculose Outras 7. Já tomou anestesia local para tratar ou extrair dentes? Sim Não Em caso afirmativo, teve alguma reação? Sim Não 8. Alguma vez tomou penicilina ou outro antibiótico? Sim Não Em caso afirmativo, teve alguma reação? Sim Não 9. Apresenta alguma alteração de pressão arterial ou distúrbio cardíaco? Sim Não 10. Tem ou teve algum tipo de sangramento oral? Região Sim Não 11. Está grávida? Sim Não 12. Consome bebida alcoólica? Tipo Frequência Sim Não 13. É fumante? Há quanto tempo? Sim Não 14. Sente sensação de boca seca, dificuldade de engolir alimentos secos ou necessidade de beber líquidos nas refeições? Sim Não 15. Tem algum outro problema que julgue importante? Sim Não

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