AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE SEMENTES FLORESTAIS PELO TESTE DE TETRAZÓLIO

Transcrição

1 EIXO TEMÁTICO: Tecnologias AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE SEMENTES FLORESTAIS PELO TESTE DE TETRAZÓLIO Liamara Santos Masullo 1 Carla Américo 2 Fátima C. M. Piña-Rodrigues 3 RESUMO: O objetivo do estudo foi desenvolver metodologias para avaliação da qualidade de sementes para três espécies florestais que apresentem dificuldades de germinação, sendo selecionadas Platymiscium floribundum Vog.(Sacambu), Lonchocarpus muehlbergianus Hassl. (Embira-de-sapo) e Acacia polyphylla DC (Monjoleiro). O teste possibilita que o estado fisiológico de sementes que apresentem dormência ou lenta germinação seja conhecido com mais rapidez e eficácia. Para a realização dos testes, as sementes foram submetidas a diferentes tempos e concentrações (0,1, 0,5 e 1,0%) em solução de 2, 3, 5 trifenil cloreto de tetrazólio. As concentrações e tempo ideais para cada espécie foram as seguintes: Sacambu - concentração de 0,5 e 1,0% por 60 minutos; Embira-de-sapo - concentração de 0,1% por 5 horas e Monjoleiro concentração de 0,1% por 4 horas. Palavras-chave: Viabilidade. Análise de sementes. Coloração. 1. INTRODUÇÃO A produção de sementes para posterior produção de mudas é predominantemente limitada pelo tempo, e o estudo do comportamento destas é fundamental, pois, quando conservadas por determinados períodos e condições, podem perder sua capacidade germinativa. Contudo, no comércio este período pode ser excessivo, com a necessidade de estocar ou armazenar as sementes até que os testes padrões de germinação para avaliação de qualidade destas sejam concluídos. O emprego de testes rápidos para o controle de qualidade de sementes é ferramenta imprescindível para a avaliação da qualidade fisiológica de sementes, e por isso tem merecido permanente atenção dos tecnologistas, produtores e pesquisadores (DEMINICIS et al., 2009). Dentre estes, destaca-se o teste de tetrazólio (FRANÇA-NETO, 1999) que avalia a atividade das enzimas desidrogenases envolvidas no processo de respiração. Pela hidrogenação do trifenil cloreto de tetrazólio, é produzida nas células vivas uma substância vermelha, estável e não difusível, o trifenil formazan. Pela reação, é possível distinguir as partes vivas, coloridas de vermelho, daquelas mortas que mantêm a cor original (ABBADE; TAKAKI, 2014). A intensidade da coloração dos tecidos permite também determinar o grau de viabilidade da semente, segundo Roversi e Theisen (2005), com a formação de um vermelho carmim claro indicando tecido viável e um vermelho carmim intenso revelando tecidos em deterioração, em virtude da maior intensidade de difusão da solução de tetrazólio pelas membranas celulares comprometidas de tais tecidos. 1 Mestranda pelo Programa de Recursos Florestais, ESALQ/USP. <liamara.masullo@gmail.com>. 2 Mestranda pelo Programa de Pós-Graduação em Planejamento e Uso de Recursos Renováveis, UFSCar. 3 Professora associada da Universidade Federal de São Carlos. <fpina@ufscar.br>.

2 Para a realização do teste se fazem necessários procedimentos padronizados que assegurem a eficácia da coloração e que facilitem a penetração do sal. Procedimentos de pré-condicionamento são utilizados para promover a penetração da solução nos tecidos e são primordiais para a aplicação do teste de tetrazólio. Diversos são os estudos que visam a padronização destes procedimentos para espécies florestais, como Gleditschia amorphoides Sucará (FOGAÇA et. al, 2006); Peltophorum dubium - canafístula (OLIVEIRA et al.,2005a); Ceiba speciosa - Paineira (LAZAROTTO et al., 2011); Tabebuia serratifolia - ipê amarelo e T. impetiginosa - ipê-roxo (OLIVEIRA et al.,2005b), entre outros. Embora o teste apresente um princípio simples, requer treinamento dos analistas e aplica critérios bastante subjetivos, baseados na coloração dos tecidos e na localização e extensão das manchas coloridas. Quando as sementes são dormentes o teste de tetrazólio pode apresentar resultados maiores do que os observados no teste de germinação, enquanto para sementes duras, a barreira à penetração do sal nos tecidos pode levar a uma subestimação dos resultados (PIÑA-RODRIGUES; VALENTINI, 1995). Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi testar uma metodologia padronizada que permita avaliar a qualidade de sementes de espécies florestais com a utilização do teste de tetrazólio. 2. MATERIAIS E MÉTODOS A pesquisa foi conduzida no período de setembro de 2012 a agosto de 2013, no Laboratório de Sementes e Mudas Florestais (LASEM) da Universidade Federal de São Carlos em Sorocaba-SP. Para a escolha das espécies foram consideradas a sua utilização em programas de restauração e a existência de dormência e/ou germinação lenta e irregular, sendo Platymiscium floribundum Vog. (Sacambu), Lonchocarpus muehlbergianus Hassl. (Embira-de-sapo) e Acacia polyphylla DC. (Monjoleiro) as espécies selecionadas. De cada uma delas foram utilizadas sementes recém-colhidas ou sementes armazenadas em câmara fria por até dois anos. Para os experimentos foram conduzidos testes de germinação (TG) em câmara DBO testando as temperatura de 25 C, 30 C e variação de 20-30ºC e/ou os substrato vermiculita (previamente esterilizada a 105 C por 24 horas) e/ou sobre papel germiteste e acondicionadas em caixas plásticas tipo gerbox (Tabela 1). Para este teste as sementes foram previamente descontaminadas com imersão em detergente por 5 minutos e para a avaliação foram consideradas sementes como germinadas aquelas com emissão de raiz primária superior a 2 mm e as contagens foram realizadas a cada dois dias após as o início das germinações. Tabela 1. Tratamentos realizados nas sementes para o TG (SP=sobre papel; V= vermiculita). Espécie Substrato Temperatura ( C) Repetições Sementes/ repetição Platymiscium floribundum SP e V 25 e 30 C 4 25 Lonchocarpus muehlbergianus V 25, e 30 C 4 15 Acacia polyphylla V 25 e 30 C 4 15 Para a realização do teste de tetrazólio (TZ) foram utilizadas 25 sementes para cada uma das 4 repetições por tratamento, estas sementes foram pré-condicionadas de acordo com as necessidades

3 de cada espécie, sendo pré-umedecidas para reativação das suas atividades metabólicas e imersas no sal de tetrazólio (Tabela 2). Tabela 2. Tratamentos das sementes para o TZ (SP = sobre papel; A= Imersão em água; C.L = Corte Longitudinal). Préumedecimento Coloração Av ali Tempo Preparo para a Solução Tempo aç Espécie Tipo (h) coloração (%) (h) Temp. ( C) ão Platymiscium floribundum SP 24 Retirada do tegumento 0,1;0,5 e 1 0,5; 1 e 2 35 C.L Lonchocarpus muehlbergianus A 2 Retirada do tegumento 0,1 e 0,5 3, 5 e 6 35 C.L Acacia polyphylla A 24 Retirada do tegumento 0,1;0,5 e 1 4, 6 e 8 30 C.L O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema fatorial (substrato x temperatura para germinação) e (concentração x tempo para tetrazólio). Os dados foram transformados em percentuais e utilizados na análise de variância (ANOVA) e comparação de médias pelo teste de Tukey (ao nível de 5% de significância). Quando os dados não apresentaram normalidade na distribuição dos erros, verificado através do teste de Shapiro-Wilk, foi empregado o teste não paramétrico de Kruskal Wallis para a análise de variância e o teste de Bonferroni para a comparação das médias, ambos calculados por meio do programa PAST RESULTADOS E DISCUSSÃO No TZ, para P. floribundum, houve diferença significativa apenas entre os tempos testados (F= 6,07; p= 0,006) não apresentando diferença entre concentrações, sendo a menor taxa de sementes viáveis obtida nos ensaios de 30 minutos (Tabela 3). Este resultado indica que, somente após 60 minutos de exposição ao TZ foi possível obter coloração dos tecidos que viabilizaram a avaliação. As concentrações de 0,5 e 1,0% durante 60 minutos possibilitaram a melhor coloração dos tecidos, o que permitiu identificar com maior nitidez as suas condições fisiológicas. Apesar das concentrações não terem apresentado efeito significativo para P. floribundum, estudos realizados por Ferreira et al. (2007), para Schizolobium parahyba mostraram que a concentração de 0,05% da solução de tetrazólio permitiu coloração mais nítida dos embriões quando comparada à concentração de 0,1%, o que facilitou a análise visual da viabilidade. Isto evidencia a necessidade de que os métodos de tetrazólio sejam desenvolvidos espécie a espécie. No caso do sacambu, a recomendação seria a utilização da concentração de 0,5% por facilitar a visualização dos tecidos coloridos e permitir uma maior diferenciação entre eles. As sementes de Platymiscium floribundum, apresentaram alta taxa de germinação, à temperatura de 25 C e substrato vermiculita, contudo de acordo com teste de Wilcoxon, não houve diferença significativa nem entre temperaturas nem substratos (z= 1,06; p= 0,286). Os resultados encontrados pelo teste de germinação se aproximam daqueles encontrados no teste de tetrazólio após 60 minutos na solução sugerindo confiabilidade do método empregado para as análises das sementes.

4 Tabela 3. Porcentagem de sementes consideradas viáveis de Platymiscium floribundum detectadas pelo TZ e TG. Teste de Tetrazólio (TZ) Tempo em contato Concentração (%) com o sal (Minutos) 0,1 0,5 1 Média 30 53,7 B 56,7 B 61,7 B 57 B 60 66,7 A 68,3 A 68,3 A 68 A ,7AB 61,7AB 63,3AB 62 AB Teste de Germinação (TG) Substrato Temperatura ( C) Papel Vermiculita Média , Os dados encontrados nos testes com Lonchocarpus muehlbergianus não apresentou normalidade dos dados e por isso foi empregado o teste de Kruskal-Wallis (chi² = 9,043; p=0,0927) e o teste de Bonferroni para a comparação das médias. Neste foi possível verificar que não houve diferença significativa entre as concentrações e entre os tempos testados. Os resultados encontrados foram confrontados com os dados do teste de germinação e foi possível verificar que a concentração de 0,1% a 5 horas de exposição foi semelhante estatisticamente a todos os testes de germinação (Tabela 4), mostrando-se o mais eficaz daqueles testados. No TG à 25, 30 e C, as sementes apresentaram médias de germinação de 47%, 32% e 30% respectivamente (Tabela 4), estes resultados não apresentaram diferença significativa. Entretanto quando comparados ao teste tetrazólio, foi possível verificar que os testes de germinação a 30 C e C diferiram dos resultados encontrados pelo teste de tetrazólio. Assim o teste de germinação que melhor representa os resultados encontrados pelo teste de tetrazólio foi aquele utilizando temperatura de 25 C, que diferiram apenas do ensaio realizados a 0,5% e 3 horas. Os resultados indicam que o teste de tetrazólio foi mais eficiente do que o de para expressar a viabilidade potencial da espécie. Tabela 4. Porcentagem de sementes consideradas viáveis de Lonchocarpus muehlbergianus detectadas no TG e TZ. Teste de Tetrazólio (TZ) Tempo em contato com o sal (horas) Concentração (%) Média 0,1 63,46 Ac 59,26 Ac 59,62 Ac 60,78 0,5 78,85 A 75,00 Ac 73,08 Ac 75,64 Teste de Germinação (TG) Substrato Temperatura ( C) Vermiculita B Bc B Na análise estatística de Acacia polyphylla foi possível verificar que houve diferença significativa entre as concentrações testadas (F=4,87; p = 0,015), entretanto os tempos não apresentaram influência significativa. A concentração que apresentou as melhores taxas de viabilidade foi 1,0%, contudo a intensidade da coloração neste tratamento dificultou a análise visual das sementes, uma vez que os tecidos adquiriram coloração vermelha-intensa, inviabilizando a identificação de possíveis área necrosadas. Ao confrontar os resultados dos testes de tetrazólio com aqueles obtidos com o teste de germinação é possível verificar que teste realizado à 25 C foi semelhante estatisticamente a todos os

5 tratamentos avaliados através do TZ. Contudo quando verificados os testes de germinação realizados a C é possível verificar que este foi estatisticamente semelhante apenas aos tratamentos realizados com a concentração de 0,1%. Desta maneira, com os resultados obtidos se recomenda a utilização da concentração de 0,1% por um período superior a 4 horas para a execução do TZ em sementes de Acacia polyphylla, tratamento este que possibilita maior diferenciação dos tecidos. Tabela 5. Porcentagem de sementes consideradas viáveis de Acacia polyphylla detectadas no TG e TZ. Teste de Tetrazólio (TZ) Tempo em contato com o sal (horas) Concentração (%) Média 0,1 15 Bc 25 Bc 22 Bc 21 Bc 0,5 28 A 32 A 33 A 31 A 1 27 A 40 A 33 A 33 A Teste de Germinação (TG) Substrato Temperatura ( C) Vermiculita dc ABd 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS Para a espécie Platymiscium floribundum, é indicado o tratamentos das sementes com TZ em concentrações de 0,5 e 1,0% durante 60 minutos para que se possa obter os melhores resultados para a avaliação da viabilidade das sementes. O tratamento mais indicado para a aplicação do teste de tetrazólio para sementes de Lonchocarpus muehlbergianus foi a concentração de 0,1% em períodos de 5 horas de exposição ao sal. As sementes de Acacia polyphylla devem ser submetidas ao sal de tetrazólio em concentração de 0,1% por um período superior a 4 horas para a melhor coloração dos tecidos das suas sementes. REFERÊNCIAS ABBADE, L.C.; Takaki, M. Teste de tetrazólio para avaliação da qualidade de sementes de Tabebuia roseoalba (ridl.) sandwith - Bignoniaceae, submetidas ao armazenamento. Revista Árvore, Viçosa-MG v.38, n.2, p , DEMINICIS, B. B. et al. Dispersão natural de sementes: importância, classificação e sua dinâmica nas pastagens tropicais. Archivos de Zootecnia, v.58, p.35-58, FERREIRA, R.A.; OLIVEIRA, L.M. TONETTI, O.A.O; DAVIDE, A.C. Comparação da viabilidade de sementes de Schizolobium parahyba (VELL.) BLAKE Leguminosae Caesalpinioidae, pelo teste de germinação e tetrazólio. Revista Brasileira de Sementes, Lavras, v. 29, n.3, FRANCA-NETO, J.B. Testes de tetrazólio para determinação do vigor de sementes. In: KRZYZANOWSKI, F.C.; VIEIRA, R.D.; FRANÇA-NETO, J.B Vigor de sementes: conceitos e testes. Londrina: ABRATES, p.1-7. FOGAÇA, C.A; MALAVASI; M.M, ZUCARELI, C.; MALAVASI U. C. Aplicação do teste de tetrazólio em sementes de Gleditschia amorphoides Taub. Caesalpinacea. Revista Brasileira de Sementes, Curitiba, vol. 28, nº 3, p , 2006.

6 LAZAROTTO, M., PIVETA, G., MUNIZ, M. F. B., REININGER, L. R. S. Adequação do teste de tetrazólio para avaliação da qualidade de sementes de Ceiba speciosa. Semina: Ciências Agrárias, Londrina, v. 32, n. 4, p , OLIVEIRA, L. M.; CARVALHO, M. L. M.; DAVIDE, A. C. Teste de Tetrazólio para avaliação da qualidade de sementes de Peltophorum dubium (Sprengel) Taubert Leguminosae Caesalpinioideae. Cerne, Lavras, v. 11, n. 2, p , 2005a. OLIVEIRA, L. M. de; CARVALHO, M. L. M. de; NERY, M. C. Teste de tetrazólio em sementes de Tabebuia serratifolia Vahl Nich. e T. impetiginosa (Martius ex A. P. de Candolle) Standley - Bignoniaceae. Revista Ciência Agronômica, Lavras, v. 36, n. 2, p , 2005b. PIÑA-RODRIGUES, F. C. M.; VALENTINI, S. R. T. Teste de tetrazólio. In: SILVA, A.; PIÑA- RODRIGES, F. C. M.; FIGLIOLIA, M. B. (Coords.). Manual de análise de sementes florestais. São Paulo: Instituto Florestal, p (Série Registros, 14). ROVERSI, T.; THEISEN, G. Teste de tetrazólio. Informativo Fundacep, v.12, n.1, p.1-2, 2005.