Arcabouços Compósitos Hidroxiapatita/Quitosana

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1 Arcabouços Compósitos Hidroxiapatita/Quitosana Ana Carolina B.M. Fook, Rossemberg C. Cardoso, Thiago B. Fidéles, Glória Tamires F.S.Furtado, Marcus Vinícius L. Fook Universidade Federal de Campina Grande- Departamento de Engenharia de Materiais. Campina Grande-PB. RESUMO O presente trabalho visa a preparação e caracterização de arcabouços tridimensionais compósitos HA/quitosana. A técnica freeze-drying foi empregada nesse estudo e os resultados demonstraram a efetividade desse método. Esta avaliação envolveu o estudo das propriedades estruturais, químicas e morfológicas dos arcabouços, de forma a direcionar a pesquisa a aplicação sugerida. Os resultados das análises de difração de raios X (DRX) e espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) confirmaram a formação da hidroxiapatita (HA) monofásica e a presença das bandas características da HA e da quitosana na composição estudada. O estudo microestrutural realizado por microscopia eletrônica da varredura (MEV) revelou a formação de microcanais orientados longitudinalmente com poros interconectados com poros de tamanhos variados e majoritariamente maiores que 100µm, sendo, portanto considerados materiais com potencial para aplicação em engenharia de tecidos ósseos. Palavras-chave: Engenharia de tecidos, quitosana, hidroxiapatita, arcabouços, freeze-drying. INTRODUÇÃO Todo ano, milhões de pessoas sofrem com defeitos ósseos decorrentes de traumas, tumores ou doenças relacionadas aos ossos e, é claro muitos estão morrendo devido à insuficiência de tecido ósseo ideal [1]. Com o envelhecimento da população e a expectativa de vida prolongada, há uma crescente demanda por enxertos ósseos ou materiais sintéticos que potencialmente possam substituir, reparar ou regenerar tecidos ósseos perdidos, lesados ou doentes [2]. A engenharia de tecidos utiliza arcabouços porosos temporários projetados para estimular resposta celular específica a nível molecular e que tem por função sustentar e direcionar a formação do tecido ósseo evitando uma segunda intervenção cirúrgica para extração do implante [3,4]. Uma tentativa em desenvolver um material substituto ósseo é a combinação de polímeros com minerais para resultar em um material com a tenacidade e flexibilidade do polímero e com a resistência e dureza da carga mineral. As vantagens desses compósitos incluem o aumento do potencial osteogênico pela inclusão da hidroxiapatita bioativa e matriz polimérica agindo como um aglutinante para evitar a migração de hidroxiapatita [5]. O biopolímero quitosana é considerado um material funcional apropriado para aplicações biomédicas por sua alta biocompatibilidade, biodegradabilidade, não-antigenicidade e propriedades de adsorção [6]. A similaridade química com a fase mineral dos tecidos ósseos tornou a hidroxiapatita um dos materiais mais biocompatíveis conhecidos, osteocondutor, bioativo, permitindo a proliferação de fibroblastos, osteoblastos e outras células ósseas [7]. A composição e a arquitetura do arcabouço desempenham papéis cruciais na capacidade de colonização das células. Considerando a máxima eficiência o material deve ser biocompatível, bioreabsorvível, cujos produtos da dissolução sejam metabolizados pelo organismo, osteocondutor e, de preferência osteoindutor [8]. Quanto à arquitetura, um arcabouço deve ser tridimensional e altamente poroso com uma rede de poros interconectados para crescimento celular/tecidual e

2 transporte de nutrientes e resíduos metabólicos [9]. A porosidade aumenta a área superficial disponível para a justaposição osso-implante e a osseointegração, consequentemente, o período de ligação interfacial entre o implante e o osso é reduzido [10-11]. Este estudo objetivou a produção e caracterização de arcabouços compósitos HA/quitosana para utilização como enxertos ósseos ou como arcabouços para engenharia de tecidos. MATERIAIS E MÉTODOS Os arcabouços compósitos HA/Quitosana foram preparados utilizando o processo de separação de fase sólido-líquido e subseqüente sublimação do solvente, também conhecido como liofilização. Recentemente, o processo freeze drying (ou freeze casting) tem atraído grande atenção como um bom candidato para fabricação de arcabouços, por possibilitar a obtenção de estruturas porosas com canais porosos interconectados tridimensionalmente. Essa arquitetura é produzida pela remoção do solvente/veículo congelado da estrutura via sublimação [12]. O pó de hidroxiapatita foi adicionado e misturado em agitador magnético por 2 horas as solução de quitosana (2%m/v), utilizando apenas a composição contendo 30% em massa de biopolímero no compósito. O produto obtido foi vertido em moldes em formatos retangulares e rapidamente transferidos para um freezer a -50 C para solidificar o solvente e induzir a separação das fases sólido-líquido. As misturas solidificadas foram mantidas nessa temperatura por 24 horas, desmoldadas e em seguida transferidas para o recipiente do liofilizador. As amostras foram finalmente liofilizadas durante 24 horas, resultando em materiais esponjosos que foram armazenadas em um dissecador até a etapa de caracterização. A escolha dessa composição se deve a composição do tecido ósseo que é descrita consistindo de aproximadamente 30% em massa de colágeno reforçado por uma fase mineral nanométrica finamente dispersa (~70% em massa) de cristais apatíticos de fosfato de cálcio (CaP) [13]. A identificação e a pureza das fases presentes foi realizada por análise por difração de raios X (XRD-6000 Shimadzu). As características químicas dos grupos funcionais das amostras foram analisadas por espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR, Spectrum 400 Perkin Elmer). A morfologia dos compósitos foi caracterizada usando microscopia eletrônica de varredura (MEV, TM 1000 HITACHI). RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 1a apresenta o difratograma de raios X da hidroxiapatita sintética utilizada na preparação dos arcabouços. Pela comparação do difratograma padrão disponível no banco de dados ICDD (Ficha 9-432), observa-se a presença dos picos característicos da hidroxiapatita. A Figura 1b apresenta o difratograma obtido do pó de quitosana, pode-se observar um comportamento típico de polímeros semicristalinos, com picos de base largas que são encontrados em = 10º e = 20º (pico mais intenso), caracterizando a presença de uma fase cristalina, e uma ampla faixa abaixo dos picos, onde predomina a forma amorfa do material. Os padrão de DRX do arcabouço compósito HA/QUI está apresentado na Figura 1c. Os resultados revelaram os picos típicos da HA e o correspondente decréscimo do pico da quitosana ( = ~ 20 ).

3 HA 500 Quitosana (a) 0 (b) 1400 HA/QUI (c) Figura 1: Difratograma de raios X da HA sintética (a) quitosana (b) e do scaffold compósito HA/QUI (c). De acordo com o espectro do arcabouço compósito liofilizado apresentado na Figura 2c, observa-se bandas características dos componentes HA (Fig.2a) e quitosana (Fig.2b). A presença sutil de um ombro em 3320 cm -1 na composição 70HA/30QUI é atribuído a estiramentos dos grupos funcionais OH e NH 2. A banda encontrada na região de 1648 cm -1 é característica da amida I (C=O) da gelatina, a banda em 1552 cm -1 é também atribuída a amida I (O=C-NH) da quitosana atribuída a deformações do grupo NH 2 e a banda na região de 1416 cm -1 é característica do grupo metil ( ) da quitosana [14]. As bandas na região 1017 cm -1 apresentadas no espectro correspondem às vibrações de estiramentos e flexões dos grupos características da hidroxiapatita. As modificações apresentadas nos espectros revelam o nível de interação entre elas, tais como, diminuição da intensidade de absorção e deslocamentos no número de onda quando comparadas com os espectros de cada fase separademente. Os grupos funcionais reativos dos biopolímeros agem como um sítio ativo para ligação com a HA, através de ligação ou quelação com íons de carga oposta, cálcio e fosfato.no caso da quitosana, o seu grupo amino (-NH 2 ) que se transforma em NH + 3, sendo positivamente carrregado, forma um complexo com o grupo fosfato (PO 4 ) da HA [15].

4 HA sintética 0,20 Quitosana C-O OH H 2 O H H 2 O OH 0,15 0,10 0,05 O-H;N-H C=O N-H C-H C-O-C C-O-C 0,00 (a) (b) ;P-O-H O-H;N-H C=O-O ; Amida I Amida II C=O-O C-O-C HA/QUI O-H (c) Figura 2: Espectros vibracionais de IV da HA sintética (a) quitosana (b) e scaffold compósito HA/QUI (c). A Figura 3 apresenta as micrografias do arcabouço compósito 70HA/30QUI. A formação de uma microestrutura orientada longitudinalmente pode ser observada no compósito, que consiste em microcanais paralelos (Fig. 3a) com macroporos interconectados de tamanhos variados na ordem de µm (Fig. 3c). Essa orientação longitudinal ocorre na direção de crescimento do gelo durante o processo de liofilização. As imagens revelam partículas de hidroxiapatita, em sua grande maioria, homogeneamente dispersas e agregadas a estrutura fibrosa da quitosana. a) b) C) Figura 3: Micrografias do arcabouço compósito 70HA/30QUI: (a) x80, (b)x500 e (c) x1000. As setas indicam a interconectividade dos poros.

5 A interconectividade é a característica principal da porosidade que tem se confirmado ao longo de vários estudos, como sendo responsável pela manutenção e crescimento do tecido ósseo, pelo transporte de nutrientes e drenagem de líquidos intersticiais [16-18]. A presença de poros maiores que 100 µm demonstra que os arcabouços compósitos HA/quitosana são materiais em potencial para aplicação na regeneração óssea, uma vez que os poros são suficientemente extensos para acomodar células [19,20]. CONCLUSÕES O método Freeze Drying utilizado no estudo demonstrou ser efetivo para obtenção de arcabouços porosos para regeneração tecidual; Na análise por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) foi confirmada a presença das bandas características da HA e da quitosana na composição estudada; O estudo microestrutural dos arcabouços realizado por MEV revelou a formação de microcanais orientados longitudinalmente com poros interconectados. Os arcabouços apresentaram poros de tamanhos variados e majoritariamente maiores que 100µm, sendo, portanto considerados materiais em potencial para aplicação em engenharia de tecidos ósseos. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a CAPES pelo apoio financiero. REFERÊNCIAS [1]Swetha, M, Sahithi,K., Moorthi, A., Srinivasan, N., Ramasamy, K., Selvamurugan, N. International Journal of Biological Macromolecules 2010; 47:1-4. [2]Zhang, F., Chang, J., Lu, J., Lin, K., Ning, C. Acta Biomaterialia 2007; 3; [3]Luo, Y. et al. Three-Dimensional Scaffolds. Principles of Tissue Engineering, 3 ed., [4]Armentano, I., Dottori,M., Fortunati, E, Mattioli, S., Kenny, J.M., Polymer Degradation and Stability 2010;1-21. [5]Muzzarelli, C.; Muzzarelli, R.A.A.Journal of Inorganic Biochemistry 2002; 92: [6]Thein-Han, W.W.; Misra, R.D.K. Acta Biomaterialia 2009; 5: [7]Volkmer, T. M., Breuer, D., Santos, L. A. Avaliação da Microestrutura de Blocos Porosos Obtidos por Gelcasting de Espumas. IN: Congresso Latino Americano de Órgãos Artificiais e Biomateriais, [8]Sengers, B.G.,Taylor, M., Please, C.P., Oreffo, R.O.C. Biomaterials 2007; 28: [9]Buckley, C.T., O Kelly, K.U. Topics in Bio-Mechanical Engineering 2004; [10]Vercik, L. C. O., Assis, C.M., Lia Fook, M.V., Santos, M.L., Guastaldi, A.C.Eclética Química 2003; 28: [11]Campos1, S. D., Campos1, É. A., Silveira, C. B., Bini, R. A. Cerâmica 2005; 51: [12] Lee E.J., Koh Y.H., Yoon B.H., Kim H.E., Kim H.W. Materials Letters 2007; 61: [13]Leeuwenburgh, S.C.G., Ana, I.D., Jansen, J.A. Acta Biomaterialia 2010; 6: [14]Wang, L., Wang, A. J Hazard Mater 2007; 147: [15] VERMA, D., KATTI, K.S., KATTI, D.R. Effect of biopolymers on structure of hydroxyapatite and interfacial interactions in biomimetically synthesized hydroxyapatite/biopolymer nanocomposites. Annals of Biomedical Engineering, v. 36, [16] Ratner, B. D. et al. An introduction to materials in medicine. San Diego: Academic Press, [17]Liebschner, M.A.K.; Wettergreen, M.A. Topics in tissue Engineering; Ashammakhi ε Ferretti, USA, [18]Yaszemski, M.J.; Payne, R.F.; Hayes, W.C.; Lander, R.; Mikos, A.G. Biomaterials 1996; 17: [19] Thomson R.C., Yaszemski M.J., Powers J.M., Mikos A.G., Biomaterials 1998; 19: [20] Narbat, M.K.; Orang, F. Hasht Jin, M.S.; Goudarzi, A. Iranian Biomedical Journal 2006; 10: