Capítulo III RESULTADOS E DISCUSSÕES. Capítulo III

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1 Capítulo III RESULTADOS E DISCUSSÕES Capítulo III 56

2 3 Resultados e Discussões Introdução Neste trabalho de pesquisa foram desenvolvidos estudos de caracterização de pós biocerâmicos nanoestruturados de fosfato de cálcio e nanocompósitos fosfato de cálcio/sio 2 n, obtido pelo processo via úmida utilizada pelo grupo de Cerâmicas e Materiais Biocompatíveis, apresentado também por [BELLINI, 2007]. Os resultados apresentados nesta parte do trabalho estão relacionados ao método de síntese e a caracterização morfológica, mineralógica dos pós biocerâmicos obtidos, da calcinação a C/2h e tratados térmicamente a C/2h. O estudo para determinação da superfície de área foi realizado sobre os pós calcinados C/2h, matriz óssea de fosfato de cálcio e e nanocompósito 5%, 10% e 15% de SiO 2 n, utlizando o método de simulação numérica com correção Gaussiana. Serão apresentado também nesta parte do trabalho, os resultados do estudo complementar de citotoxidade e viabilidade celular in vitro. Sendo que os testes préliminares de citotoxidade in vitro forma realizados com ajuda do Institut de Recherche en Biomécanique et Biomatériaux de l École Polytechnique de Montreal Canadá. 3.1 Caraterização Física por Difratometria de Raios-X Os resultados apresentados da caracterização física por difratometria de raios-x estão relacionados as fases cristalinas do pó de fosfato de cálcio (matriz óssea) e dos pós nanocompósitos fosfato de cálcio/sio 2 n, obtidos da calcinados a 900 o C por 2 horas, e dos tratados térmicamente a 1300ºC por 2 horas Estudo dos Pós Calcinados C/2h Para os pós obtidos da calcinação a 900 o C/2h observou-se a presença da estrutura cristalina de fosfato tricálcico na fase β para as diferentes composições, conforme ilustrado pelos espectros na figura 3.1. Constatou-se, da análise dos espectros da figura 3.1, a presença da fase fosfato tricálcico β para todos os pós. Cada pico foi devidamente indexado com o seu respectivo plano de difração. A identificação dos picos foi feita com o uso do banco de dados do 57

3 difratômetro e também com as referências [LI, 2007; AYED, 2006; DACULSI, 2003; SANTOS, 2002], indicando fosfato tricálcico na fase β no sistema romboedral, fase encontrada no tecido ósseo em cálculos dentário e urinário, cáries dentárias e na calcificação de tecido mole. Figura 3.1 Espectros de difratometria de raios X para os pós biocerâmicos nanoestruturados obtidos da calcinação a 900ºC/2 horas (CPS em função de 2θ). 58

4 3.1.2 Estudo dos pós Tratados C/2h Para os pós obtidos do tratamento térmico a 1300 o C/2h observou-se a presença da estrutura cristalina de fosfato tricálcico na fase α e β para as diferentes composições, conforme ilustrado pelos espectros na figura 3.2. Constatou-se, da análise dos espectros da figura 3.2, a presença da fase fosfato tricálcico α e β para todos os pós. Cada pico foi devidamente indexado com o seu respectivo plano de difração. A identificação dos picos foi feita com o uso do banco de dados do difratômetro e também com as referências [LI, 2007; AYED, 2006; DACULSI, 2003; SANTOS, 2002], indicando fosfato tricálcico na fase α no sistema romboedral e β no sistema ortorômbico, para as diferentes composições, fases encontradas no tecido ósseo em cálculos dentário e urinário, cáries dentárias e na calcificação de tecido mole.. 59

5 Figura 3.2 Espectros de difratometria de raios X para os pós biocerâmicos obtidos do tratamento térmico a 1300ºC/2h (CPS em função de 2θ). 60

6 3.2 Caracterização Morfológica Os estudos de caracterização morfológica, foram realizados utilizando a técnica de microscopia eletrônica de varredura, através do sistema de elétrons secundários (SE), os resultados apresentados estão relacionados à morfologia do pó de fosfato de cálcio (matriz óssea) e dos pós nanocompósitos fosfato de cálcio/sio 2 n, obtidos da secagem em evaporador rotativo, calcinados a 900 o C por 2 horas, e dos tratados térmicamente a 1300ºC/2h Partículas Nanométricas de SiO 2 n As micrografias representadas pelas figuras 3.3 (a) e 3.3 (b), ilustram a forma esférica das nanopartículas de SiO 2n, utilizadas neste estudo, observa-se que as nanopartículas apresentam diâmetro médio d<100nm e interconectadas em formato de corrente, configuração típica para nanopartículas [KECSKES, 2003; TOMIYAMA, 2003]. 3.3 (a) 3.3 (b) Figura 3.3 (a) e (b) Micrografia ilustrando a morfologia do pó de SiO 2n aglomeradas em forma de correntes 61

7 Matriz de Fosfato de Cálcio (Matriz Óssea) e Nanocompósitos Retirados do Rotoevaporador Os resultados aqui apresentados se referem primeiramente aos estudos realizados sobre os pós da matriz óssea de fosfato de cálcio e nanocompósitos fosfato de cálcio/sio 2 n obtidos da secagem em evaporador rotativo, após passarem pelo processo de moagem almofariz/pistilo e peneiramento na malha #200µm, revelaram uma morfologia formada por nanopartículas aglomeradas (Figura 3.4(a) e 3.4(b)), sendo o tamanho médio das nanopartículas d<20nm. Verifica-se também que com o acréscimo das nanopartículas de SiO 2n a morfologia da matriz não se altera, sendo formada também por nanopartículas aglomeradas, como observado nas micrografias 3.4(c), 3.4(d) e 3.4(e), onde também observa-se nas micrografias 3.4(c) e 3.4(e) a presença de aglomerados das nanopartículas de SiO 2n apontado pelas setas. Conforme observado nos resultados obtidos da síntese do pós, pode-se considerar que o método via úmida é promissor na produção de pós nanoestruturados de fosfato de cálcio e nanocompósitos de SiO 2 n. 62

8 3.4 (a) 3.4 (b) 3.4 (c) 3.4 (d) 3.4 (e) Figura 3.4 (a) e (b) Micrografias do pó de fosfato, (c), nanocompósito 5% de SiO 2n, (d), nanocompósito 10% de SiO 2n e (e) nanocompósito 15% de SiO 2n todos obtidos da secagem em rotoevaporador. 63

9 3.3.3 Matriz de Fosfato de Cálcio (Matriz Óssea) e Nanocompósitos C/2h Os resultados obtidos sobre os pós de fosfato de cálcio e nanocompósitos obtidos da calcinação C/2h, após passarem pelo processo de moagem almofariz/pistilo e peneiramento na malha #200µm, revelaram uma morfologia formada por finas partículas aglomeradas com tamanho médio das partículas inferior a 200nm (Figura 3.5 (a) e 3.5 (b)). As micrografias 3.5 (c) e 3.5 (d) mostram o nanocompósito de 5% de SiO 2n e evidenciam uma morfologia formada por nanopartículas com tamanho médio inferior a 100nm, aproximadamente metade das dimensões das partículas da matriz óssea. A micrografia 3.5 (e) mostra o nanocompósito de 10% de SiO 2n e evidencia uma morfologia formada por nanopartículas com diâmetro médio também inferior a 100nm, como no caso do nanocompósito 5%, os diâmetros das nanopartículas dos nanocompósitos 5% e 10% se mostraram praticamente os mesmos. Finalmente a micrografia 3.5 (f) mostra o nanocompósito de 15% de SiO 2n e evidencia uma morfologia formada por nanopartículas com diâmetro médio próximo a 50nm. A diferença do tamanho das nanopartículas da matriz óssea em relação aos nanocompósitos pode ser explicado, pela presença da segunda fase (SiO 2n ), dispersa dentro do pó de fosfato de cálcio (Figuras 3.4 (c), 3.4 (e)). A presença da fase SiO 2n na forma de nano-partículas, dentro do pó de fosfato de cálcio, em posição inter-intragranular, pode inibir sensivelmente o processo de difusão superficial associado a cinética de germinação e coalecencia de grãos da matriz óssea e influenciando no processo de densificação do nanomaterial. 64

10 3.5 (a) 3.5 (b) 3.5 (c) 3.5 (d) 3.5 (e) 3.5 (f) Figura 3.5 (a) e (b) Micrografias da matriz de fosfato, (c) e (d) nanocopósito 5% de SiO 2n, (e) nanocopósito 10% de SiO 2n e (f) nanocopósito 15% de SiO 2n, todos obtidos da calcinação C por 2 horas. 65

11 Matriz de Fosfato de Cálcio (Matriz Óssea) e Nanocompósitos C/2h Os resultados obtidos sobre os pós de fosfato de cálcio e nanocompósitos obtidos do tratamento térmico C/2hs, após passarem pelo processo de moagem almofariz/pistilo e peneiramento na malha #200µm, revelaram uma morfologia para a matriz óssea de fosfato de cálcio formada por partículas com tamanho inferior a 2,5µm., Outra observação foi a não constatação das nanopartículas de sílica dispersas em posição intergranular na matriz óssea, o que vem indicar, que grande parte do refoço se encontra em posição intragranular na matriz óssea. Constatou-se também, o inicio da sinterização do pó biocerârmico apresentando uma morfologia formada por grãos equi-axial, mostrando o empescoçamento e a coalescência dos grãos conforme pode se visto nas Figuras 3.6 (a) e 3.6 (b). 3.6 (a) 3.6 (b) Figura 3.6 (a) Micrografia ilustrando a morfologia da matriz de fosfato de calcio obtida do tratamento térmico a C/2h (b) nanocompósito 15% de SiO 2n também obtido do tratamento térmico C/2h. 3.4 Caracterização da Superfície de Área Os estudos de caracterização da superfície de área foram realizados com ajuda da técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura, sobre os pós calcinados biocerâmicos 66

12 nanoestruturados de fosfato de cálcio, figura 3.7 (a) e nanocompósito 5%, 10% e 15% SiO 2n, figura 3.7 (b), (c) e (d) respectivamente. Sendo o objetivo, obter o resultado para os valores de superfície de área, utilizando o método de simulação numérica. Foram medidas pontualmente as nanopartículas sobre as micrografias, como exemplificado nas figuras 3.7 (a) e (b). As medidas foram realizadas cuidadosamente com o auxílio de uma régua milimetrada e calibrada pelo inmetro, seguindo as extremidades da imagem de cada nanopartícula medida. Os resultados das medidas estão representados nas Tabela 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 constata-se haver uma redução nos tamanhos médios das nanopartículas com o aumento percentual das nanopartículas de sílica. Constatou-se que para o caso da matriz fosfato de (Figura 3.7 (a)), um tamanho médio das nanopartículas da ordem de 177nm e um desvio padrão de 46nm, para o pó nanocompósito 5% (Figura 3.7 (b)) um tamanho médio de 67nm e um desvio padrão de 20nm, para o pó nanocompósito 10% (figura 3.7 (c)) um tamanho médio de 62nm e um desvio padrão de 20nm e finalmente para o pó nanocompósito 15% (figura 3.7 (d)) um tamanho médio de 46nm e um desvio padrão de 21nm. Com estes resultados pode-se realizar o estudo da superfície de área dos nano-pós biocerâmicos pelo método de simulação numérica com correção Gaussiana. Abaixo seguem as micrografias 3.7 (a-d) onde obteve-se os resultados apresentados nas tabelas (a) 67

13 3.7 (a) 3.7 (b) 3.7 (c) 3.7 (d) Figura (a) Micrografia ilustrando a morfologia do pó da matriz fosfato de cálcio calcinado a C/2h - (b) Micrografia ilustrando a morfologia do pó nanocompósito 5% calcinado a C/2h - (c) Micrografia ilustrando a morfologia do pó nanocompósito 10% calcinado a C/2h - (d) Micrografia ilustrando a morfologia do pó nanocompósito 15% calcinado a C/2h 68

14 Tabela 3.1. Ilustrando os valores das medidas em nm obtidas sobre as partículas da Figuras 3.7(a). Valores em nm sobre a micrografia 3.7 (a), com 153 medidas Média Desvio padrão 177 nm 46 nm 69

15 Tabela 3.2. Ilustrando os valores das medidas em nm obtidas sobre as partículas da 7a 7b Figuras 3.7 (b). Valores em nm sobre a micrografia 3.7 (b), com 153 medidas Média Desvio padrão 67 nm 20 nm 70

16 Tabela 3.3. Ilustrando os valores das medidas em nm obtidas sobre as partículas da Figuras 3.7 (c). Valores em nm sobre a micrografia 3.7 (c), com 153 medidas Média Desvio padrão 62 nm 20 nm 71

17 Tabela 3.4. Ilustrando os valores das medidas em nm obtidas sobre as partículas da Figuras 3.7 (d). Valores em nm sobre a micrografia 3.7 (d), com 153 medidas Média Desvio padrão 46 nm 21 nm Com os valores obtidos da média e do desvio padrão fez-se um estudo da superfície de área das nanopartículas supondo uma distribuição Gaussiana das nanopartículas, estes cálculos foram realizadas numéricamente com auxílio do Maple, que podem ser vistos detalhadamente nos anexos II, III, IV e V. 72

18 Utilizou-se da equação 2.4 para obtermos a superfície de área em m 2 /g, S. f M = G (Eq. 2.4) D( nm). Da Com a equação (Eq. 2.4), pode-se utilizar somente o diâmetro médio ( D ) das nanopartículas, diretamente em nm, a densidade D a do material em g/cm 3, que para o nosso caso do pó de fosfato de cálcio e do nanocompósito calcinado C/2h, considerou-se de 2,77 g/cm 3 [XU, 2007] e o fator Gaussiano adimensional. Então para a (Figura 3.7 (a)) temse: S M = , = 11,5m 2 / g 177 2,77 (Eq. 3.5), e encontra-se um valor para a superfície de área especifica de 11,5 m 2 /g, para o pó de fosfato de cálcio, que pode ser vista mais detalhadamente no anexo II. Para o pó nanocompósito 5% conforme valores obtidos sobre a micrografia (Figura 3.7 (b)), S M = , = 29,8m 2 / g (E.q 3.6) 67 2,77 encontrou-se um valor para a superfície de área especifica de 29,8 m 2 /g, que pode ser vista mais detalhadamente no anexo III. Para o pó nanocompósito 10% conforme valores obtidos sobre a micrografia (Figura 3.7 (c)), S M = , = 31,8m 2 / g 62 2,77 (E.q 3.7) 73

19 encontrou-se um valor para a superfície de área especifica de 31,8 m 2 /g, que pode ser vista mais detalhadamente no anexo IV. Para o pó nanocompósito 15% conforme valores obtidos sobre a micrografia (Figura 3.7 (d)), S M = , = 39,8m 2 / g 46 2,77 (E.q 3.8) encontrou-se um valor para a superfície de área especifica de 39,8 m 2 /g, que pode ser vista mais detalhadamente no anexo V. Este método de simulação permitiu determinar a superfície de área para as nanopartículas dentro dos valores típicos encontrados na literatura [CUNHA, 2006; KECSKES, 2003; INFRAMAT, 2002], Os pós nanoestruturados de fosfato de cálcio e nanocompósitos, tendem a apresentar superfície de área elevada, o que tem demonstrado ser um ponto favorável na regeneração e reconstituição óssea [KECSKES, 2003]. 3.7 Resultados dos Testes In Vitro O estudo complementar de citotoxicidade e viabilidade celular in vitro foram realizados através do teste MTT em tempos deculturas de 24, 48 e 72 horas, para todas as composições de pós nanoestruturados. Este trabalho foi realizado em parceria com o Groupe de Recherche en Biomécanique et Biomatériaux de l Institut de l École Polytechnique de Montreal Canadá e teve como objetivo avaliar a viabilidade celular e a biocompatibilidade dos pós nanoestruturados. Os testes in vitro, foram realizados sob as diferentes composições de pós nanoestruturados obtidos da calcinação C/2h e do tratamento térmico a C/2h. Foram realizados três experimentos para cada composição. Os resultados desse estudo mostram em seus histogramas (figura 3.9, 3.10 e 3.11) para as diferentes composições de pós nanoestruturados obtidos da calcinação a C/2h e do tratamento térmico C/2h, uma boa viabilidade celular e biocompatibilidade, com índice médio de resposta da viabilidade celular, para os pós nanoestruturados obtidos da calcinação C/2h, acima de 80% e para os obtidos do tratamento térmico a C/2h, também observou-se uma melhoria significativa da viabilidade celular em função do 74

20 tempo, atingindo um valor médio superior a 100%. Isto vem indicar que tanto para os pós nanoestruturados obtidos da calcinação como para os pós obtidos do tratamento térmico, fornecem formas de morfologias adequadas para aplicações em regeneração de tecido ósseo. Tudo indica que estes pós nanoestruturados com morfologia equi-axiais, tem grande potencial em aplicações ortopédicas, traumatológicas e odontológicas na regeneração precoce de tecidos ósseos. Os testes sempre foram comparados com um grupo de controle, sendo que o resultado do primeiro teste in vitro, realizado para as diferentes de pós nanoestruturados, estão representadas pela figura 3.8. Constata-se neste histograma um aumento na viabilidade celular em função do tempo e os valores do índice de viabilidade celular flutuam entre 80 e 100%. Figura 3.8 Primeiro teste de viabilidade celular in vitro para os pós nanoestruturados nos períodos de 24, 48 e 72 horas em relação ao grupo de controle No segundo teste (figura 3.9), observa-se novamente, que a viabilidade celular aumenta em função do tempo de cultura. No entanto, observou-se uma diminuição da viabilidade celular, se comparado com o primeiro teste (figura 3.9). Mesmo com essa redução, os valores do índice da viabilidade celular ainda flutuam entre 60 e 80%. Neste caso, a diferença é muito pequena e pode estar relacionado ao controle e manutenção das células durante o teste, o que pode ter inibido o resultado da viabilidade celular. 75

21 Figura 3.9 Segundo teste de viabilidade celular in vitro para os pós nanoestruturados nos períodos de 24, 48 e 72 horas em relação ao grupo de controle No terceiro e último teste ilustrado na figura 3.10, observou-se uma variação do comportamento da viabilidade celular em função do tempo para as diferentes composições de pós nanoestruturados, isto se deve, provavelmente, ao sistema de controle e manutenção das culturas durante os testes. Contudo, observa-se que o índice de viabilidade celular médio, para as diferentes composições de pós nanoestruturados continuaram superior a 100% para todos os testes. Figura 3.10 Terceiro teste de viabilidade celular in vitro para os pós nanoestruturados nos períodos de 24, 48 e 72 horas em relação ao grupo de controle Os resultado do teste préliminar de citotoxidade e viabilidade celular 76

22 evidenciaram, que a superficie de área das nanopartículas e a superfície de microporos, são dois fatores importantes em estudos de viabilidade celular, osseoindução, osseointegração e da regeneração de tecido ósseo. Conforme observado para os pós calcinados a 900ºC/2h, apresentaram uma superfície de área elevada, já para os pós obtidos do tratamento térmico a 1300º/C2h uma superficie de microporos importante, se compar os resultatos do teste de citotoxidade e viabilidade celular entre estas duas condições, observa-se, que os resultados foram bastante semelhantes. 3.8 Conclusão e Sugestões para Novos Trabalhos Em relação a síntese de pós nanoestruturados concluiu-se que: O método de síntese dos pós nanoestruturados se mostrou eficiente na obtenção de pós com morfologia nanométrica, formada por nanopartículas aglomeradas, com dimensões inferiores a 20nm para o caso da matriz óssea de fosfato de cálcio e nanocompósitos; Observou-se que, durante a síntese dos pós nanocompósitos, não houve nenhuma alteração da morfologia das nanopartículas de sílica constatando somente uma distribuição das mesmas dentro da matriz óssea de fosfato de cálcio; Para os pós obtidos da calcinação C/2h observou-se uma morfologia formada por nanopartículas aglomeradas com tamanho d<200nm para as diferentes composições de pós nanoestruturados de fosfato de cálcio e nanocompósitos; Os pós recuperados do tratamento térmico e a C/2h observou-se uma coalesência considerável da morfologia das partículas iniciando o empescoçamento das mesmas, indicando o inicio da densificação do matriz óssea de fosfato de cálcio e a formação de uma microporosidade interconectada com superfície de microporos elevada, o que favorece a osseoindução, a ósseointegração, a absorção do biomateriol pela estrutura óssea formação de um novo tecido ósseo; Os resultados de difratometria de raios X obtidos sobre o pó da matriz óssea de fosfato de cálcio e dos nanocompósitos recuperados calcinados a 900ºC/2h, constatou-se em seus espectros de raios X a formação da fase de trifosfato de cálcio-β. Para os pós obtidos do tratamento térmico a 1300ºC/2h, constatou-se além da fase β também a fase α do trifosfato de cálcio para todas as composições. Os estudos realizados utilizando a microscopia eletrônica de varredura, sobre os pós nanoestruturados obtidos da síntese, evidenciaram uma morfologia formada por finas 77

23 partículas aglomeradas, constatando para o caso dos pós nanocompósitos a presença da sílica nanométrica dispersa dentro do pó da matiz óssea de fosfato de cálcio (Figura 3.5(c) e 3.5(e)). Já para os pós obtidos da calcinação, constatou-se uma fina morfologia das partículas com forma equi-axiais e tamanho inferior a 200nm, para o caso da matriz óssea de fosfato de cálcio (Figura 3.6(a) e 3.6(b)), para os pós nanocompósitos constatou-se uma redução do tamanho das nanopartículas para aproximadamente 100nm (figuras 3.6(c) e 3.6(d)).Os pós tratados termicamente a 1300ºC/2h, apresentaram uma morfologia formada partículas equi-axiais com tamanho médio inferior a 2,5µm, para as diferentes composições, outra observação foi o inicio da densificação dos pós conforme pode-se notar pela formação empescoçamento entre as partículas. Os resultados do estudo de superfície de área pelo método de simulação numérica permitiu determinar os valores aproximados da superfície de área dos pós calcinados C/2h nanoestruturados, observando para o pó da matriz óssea de fosfato de cálcio uma superfície de área da ordem de 11,5 m 2 /g, para o pó nanocompósito 5% - 29,8m 2 /g, para o pó nanocompósito 10% - 31,8 m 2 /g e finalmente para o pó nanocompósito 15% - 39,8 m 2 /g. Os testes in vitro realizados sobre os pós calcinados e tratados termicamente, evidenciaram uma boa viabilidade celular e biocompatibilidade. Constatando para os diferentes testes um indice de viabilidade celular superior a 80%, indicando a boa biocompatíbilidade dos pós nanoestruturados em estudo. Sugestões para novos Trabalhos Otimizar o método de distribuição da sílica dentro da matriz cerâmica de fosfato de cálcio, afim de evitar a formação de aglomerados; Otimizar o método de simulação numérica comparativamente com BET para determinação de superfície de área especifica de pós nanoestruturados, utilizando um software para medir o diâmetro médio das nanopartículas; Dar continuidade dos testes de viabilidade celular e de biocompatibilidade in vitro e implementação in vivo. 78