OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA EXTRAÍDA DE RESÍDUO ÓSSEO DE FRANGO.

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1 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE HIDROXIAPATITA EXTRAÍDA DE RESÍDUO ÓSSEO DE FRANGO. F. L. CAVALCANTE 1, P. B. V. PINHEIRO 2, E. B. DUARTE 3, J. P. O. LIMA 2, M. S. FILHO 3 e M. F. ROSA 3 1 Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-Graduação em Química 2 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Ceará 3 Embrapa Agroindústria Tropical para contato: fabiolima2008@hotmail.com RESUMO. As apatitas são objeto de grande número de pesquisas em função de sua elevada biocompatibilidade. Nesse contexto, o desenvolvimento de processos que possibilitem a obtenção de fosfatos de cálcio a partir de subprodutos de baixo custo e largamente disponíveis, são de fundamental importância. No presente trabalho, estudou-se a obtenção de hidroxiapatita (HA), a partir do resíduo ósseo de frango, visando sua utilização na formulação de bionanocompósitos. Os ossos passaram por um pré-tratamento, visando a remoção dos constituintes orgânicos a fim de se obter HÁ purificada. O material de partida foi caracterizado por Análise Elementar, Determinação do Teor de Lipídeos, Proteínas e cinzas. HA, por sua vez, foi caracterizada através de Análise Elementar, Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e Difratometria de Raios X (DRX) e Espectroscopia de Energia Dispersiva (EDS). Os teores de proteínas, lipídeos e cinzas foram respectivamente de 36,66%, 24,95% e 33,27%. O FTIR confirmou a presença de bandas referentes ao estiramento dos grupos PO 4 3-, e estiramento O-H, bem como picos associados à presença de carbonato. O teor de carbonato obtido na HA foi de 5,0%, percentual normalmente relatado como indicativo de boa resistência mecânica e bioatividade. Palavras-chave: bioapatita, biomateriais, ossos de frango, indústria avícola. 1. INTRODUÇÃO A hidroxiapatita tem sido amplamente estudada nas últimas décadas em função de suas propriedades físico-químicas adequadas a reparação do tecido ósseo. Sua biocompatibilidade, resulta principalmente de sua similaridade química com a fase inorgânica dos tecidos calcificados, o que lhe confere propriedades como osteocondução e

2 bioatividade, não produzindo reações imunológicas ou inflamatórias. Entre as formas de obtenção da HÁ destacam-se o isolamento, sendo mais comumente extraída de ossos animais; síntese a partir de reação com um precursor de Ca e íons fosfato; Síntese in situ com o auxílio de moléculas de origem biológica e síntese utilizando biomembranas. O isolamento de bioapatita a partir de osso xenógeno apresenta algumas vantagens em relação aos demais, sendo a similaridade morfológica, estrutural e química com o osso humano uma das mais citadas, também deve-se considerar o fato de que ossos xenógenos são uma matéria prima barata e largamente disponível (ŠUPOVÁ, 2014). O Brasil, no início deste ano, se consolidou como o 2º maior produtor de carne de frango, ficando atrás apenas para os EUA, desfrutando em função disto, de alta disponibilidade de resíduo ósseo da cadeia avícola de corte. Ossos e carcaças desqualificadas apresentam-se como potenciais fontes de proteínas e minerais, sendo em geral destinados a compor ingredientes de ração animal, no entanto, o desenvolvimento de processos que viabilizem a utilização destes resíduos como matéria prima para a produção de materiais de maior valor agregado fortalece a cadeia produtiva gerando emprego e renda. Os ossos, de uma forma geral, são compostos basicamente de colágeno, apatita e lipídeos, composição esta que varia segundo alguns fatores, tais como espécie e idade do animal (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PROTEÍNA ANIMAL, 2015). O termo apatita aplica-se a uma gama de compostos com uma fórmula geral de A 10 (BO 4 ) 6 Z 2 (ou M 5 (XO 4 ) 3 X), onde A é geralmente um cátion metálico divalente (Ca 2+, Sr 2+, Ba 2+, Pb 2+ ou Cd 2+ ), BO 4 um ânion trivalente com B geralmente sendo um metal (PO , AsO 4 ou MnO 3-4 ) e X um ânion monovalente (F -, Cl -, OH - ou Br - ). O nome específico de cada apatita depende dos elementos ou radicais A, B e X. Nestes termos, a hidroxiapatita estequiométrica é caracterizada por apresentar a estrutura cristalina de apatita, onde A é cálcio (Ca 2+ ), BO 4 tem B como fósforo (PO 3-4 ) e X é o radical hidroxila (OH - ). A hidroxiapatita estequiométrica apresenta relação Ca/P molar de 1,67, relação mássica Ca/P de 2,15 e sua fórmula química, Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2, possui 39,9% em peso de Ca, 18,5 % de P e 3,38 % de OH (APARÍCIO E GINEBRA, 2015). No entanto, a

3 hidroxiapatita estequiométrica difere da biológica em relação à estequiometria, composição e cristalinidade, e consequentemente nas propriedades físicas e mecânicas. As apatitas biológicas são geralmente cálcio deficientes, sendo portanto, não estequiométricas, geralmente menos cristalinas, por vezes carbonatadas e consequentemente de maior solubilidade, já que a maior quantidade de carbonato diminui o tamanho do cristal, aumentado a área superficial e assim a solubilidade (IBUKI, 2014) O presente trabalho teve como objetivo o isolamento de bioapatita proveniente de resíduo ósseo de frango de corte utilizando o método hidrotérmico alcalino e sua posterior caracterização quanto à morfologia e composição química. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Reagentes Nas etapas de pré-tratamento foram utilizados hidróxido de sódio P.A. (Dinâmica, com pureza >99,5%). Cloreto de Sódio P.A. (Dinâmica, com pureza >99,5%). Acetona P.A. (Vetec Química Fina) e Éter diétilico P.A. (Vetec Química Fina). 2.2 Extração da bioapatita Os ossos de frango foram obtidos em um abatedouro local e em seguida separados manualmente dos resíduos de carne. Secos em estufa com circulação de ar durante 24 h, em seguida congelados até o momento das análises. Os ossos descongelados foram imersos em solução de NaCl 2% (m/v) na proporção de 1:10 de massa de ossos para solução e autoclavados durante 30 min a 120 ºC, ao final do processo, os ossos foram separados da solução por decantação e secos em estufa

4 com circulação de ar por 16 h. Em seguida, os ossos foram triturados em moinho analítico e imersos em uma mistura de acetona:éter (3:2) na proporção de 1:2, de massa de ossos para volume de solução. A mistura foi deixada em repouso durante 24 h, em seguida filtrada e os ossos levados a secagem em estufa com circulação de ar durante 3h. Os ossos desengordurados foram triturados novamente e desproteinizados em solução de NaOH 4% (m/v) nas proporções de 1:20 e 1:40 (m/v), ambas proporções durante 24h, obtendo-se assim, as amotras 1 e 2 respectivamente. Ao final do processo, o material inorgânico foi filtrado em papéis de filtro de 28 m e lavado até ph neutro, seco novamente, e calcinado em mufla a 500 C durante 18h. Ao final da etapa de calcinação, as amostras foram resfriadas e em seguida lavadas com água deionizada até ph neutro com uso de papel de filtro de 28 m, por fim, secas em estufa a 80ºC por 24h. Metodologia adaptada de Šupová et al. (2011). 2.3 Caracterizações Os ossos in natura foram caracterizados por: análise de composição química (proteínas, lipídeos e umidade e cinzas), enquanto a bioapatita obtida foi caracterizada por MEV, EDS, FTIR, TGA e DRX. O teor de carbonato foi determinado segundo a equação (A) (MURUGAN et al., 2003): (A) Onde: CO 3 2- % teor de carbonato em percentagem de massa

5 Transmitância no pico máximo da banda de carbonato localizada em aproximadamente 1450cm -1 Transmitância no pico máximo da banda de fosfato localizada em aproximadamente 569cm -1 A cristalinidade das amostras foi determinada a partir da equação (B), dada abaixo para o cálculo do índice de cristalinidade. (B) IC Índice de cristalinidade (%) Intensidade do vale entre os picos correspondentes aos planos (112) e (300) A intensidade do pico correspondente ao plano (300) 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Caracterização Físico-Química O resíduo ósseo de frangos foi caracterizado segundo sua composição percentual, os dados relativos a caracterização se encontram na Tabela 1. Tabela 1 Composição percentual dos ossos in natura AMOSTRA PROTEÍNAS (%) LIPÍDEOS (%) CINZAS (%) OSSOS IN NATURA 36,66 24,95 33,27 Os ossos de frango são constituídos basicamente por lipídeos, proteínas, matéria inorgânica e umidade, sendo o colágeno a proteína mais abundante na composição dos ossos e a hidroxiapatita o componente principal da fase ingorgânica,

6 representada pelo teor de cinzas. O valor de 33,27 % de cinzas está em concordância com o reportado na literatura de 30 a 70% para a composição de tecidos calcificados (ANGELO, 2008). 3.2 MEV/EDS Através da microscopia eletrônica foi possível verificar a existência de possíveis diferenças estruturais e superficiais promovidas pelo tratamento com NaOH. Nas Figuras 1 e 2 são mostradas as microscopias das Bioapatias 1 e 2. Em todas as amostras dos pós de bioapatita foi possível observar a existência de partículas submicrométricas, bem como, de partículas na escala nanométrica (menores que 100nm), muito embora, apresentem-se, em sua maioria, entre 100 e 1000 nm. As partículas obtidas apresentaram-se na forma de grânulos esféricos. Šupová et al. (2011), obteve, através de processo semelhante, partículas de bioapatita proveniente de ossos de frango menores que 100 nm em forma de agulha. O tamanho dos cristais está relacionado ao tempo e a temperatura na etapa de calcinação, onde um maior tempo ou temperatura acarreta em aglomeração de cristais levando a obtenção de cristais de maior tamanho. No entanto, a dependência do formato dos cristais com a metodologia empregada no processo de purificação ainda não está claramente estabelecida na literatura, Šupová et al. (2014).

7 Figura 1 Micrografia (esquerda) e Gráfico de EDS (direita) Bioapatita 1 Figura 2 Micrografia (esquerda) e Gráfico de EDS (direita) Bioapatita 2 A análise de EDS foi realizada com o intuito de avaliar qualitativamente a razão molar Ca/P das bioapatitas obtidas a partir das 4 condições estudadas, os valores obtidos estão apresentados na Tabela 2. Tabela 2 Relação molar Ca/P das bioapatitas 1 e 2. Amostra Bioapatia 1 Bioapatia 2 Relação Ca/P 1,54 ± 0,06 1,70 ± 0,06 A bioapatita 1 apresentou razão molar Ca/P inferior ao esperado para hidroxiapatita estequiométrica, de 1,67, este valor inferior se relaciona com a existência

8 de substituições do cálcio por cátions metálicos na estrutura cristalina da apatita, característica comum às apatitas biológicas, por isso comumente denominadas cálcio deficientes. Šupová et al., (2011), obtiveram bioapatita de ossos de frango a partir do método hidrotérmico alcalino com razão Ca/P de 1,64. A existência de algumas substituições na estrutura cristalina da bioapatita é tida como vantajosa em relação a HA pura, ou estequiométrica, uma vez que o osso humano também apresenta várias substituições em sua estrutura, muitas destas, mesmo a nível de traços executam papel fundamental nas reações bioquímicas associadas com o metabolismo do osso (ŠUPOVÁ et al., 2011). Já a bioapatita 2 apresentou valor maior que 1,67, indicando composição estrutural rica em cálcio. Os espectros de EDS mostrados nas Figuras 1 e 2 apresentaram uma composição típica de apatitas biológicas, sendo majoritariamente constituídas de Ca e P, e apresentando em sua composição outros cátions metálicos comumente presentes em menor proporção. 3.3 FTIR Através da análise de FTIR foram obtidos os espectros apresentados na Figura 3, de onde foi possível observar as diferenças estruturais entre as amostras de bioapatita em função do procedimento de desproteinização utilizado.

9 Absorbância (u.a.) Bioapatita Bioapatita Comprimento de onda (cm -1 ) Figura 3 Espectro de FTIR das bioapatitas 1 e 2. Todas as amostras apresentaram-se livres de matéria orgânica, não sendo possível a observação de bandas referentes aos demais constituintes do osso, o que corrobora com os resultados apresentados por Armstrong e Singer (1965), em que se constata a remoção completa dos constituintes orgânicos presentes no osso após calcinação de 18h a uma temperatura de 700 ºC. A banda em 870 cm-1 referente a presença de carbonato como substituição do tipo B (quando parte dos grupos PO 4 3- são substituídos por CO 3 2- ). A presença de substituições de carbonato na apatita está diretamente relacionada ao aumento na solubilidade, sendo, portanto, mais facilmente absorvível pelas células vivas em comparação com HA estequiométrica, o que pode potencializar sua bioatividade (MERY et al., 1998). Os teores de carbonato apresentados na Tabela 3 foram calculados a partir do espectro de FTIR segundo a equação (A). Tabela 3 - Teores de carbonato das bioapatitas 1 e 2 Amostra Bioapatita 1 Bioapatita 2 Teor de carbonato (%) 5,02 5,02

10 As apatitas biológicas apresentam uma série de substituintes que lhe conferem melhores propriedades frente as aplicações biomédicas, um dos mais importantes é o carbonato, estando presente na fase mineral do osso humano em uma concentração de cerca de 5-8% (MERY et al.,1998). As bioapatitas extraídas do resíduo ósseo de frango apresentaram teor de carbonato entre 3,58 e 5,02%, sendo valores superiores ao valor de 3,11%, reportado na literatura para bioapatita extraída a partir de ossos de fêmur de frango (ŠUPOVÁ et al., 2011), e ao de 4,4% obtido para bioapatita extraída a partir de tíbia bovina, ambos com o uso do método hidrotérmico alcalino (MURUGAN et al., 2003). 3.4 TGA Utilizou-se a análise termogravimétrica para avaliar a estabilidade térmica dos pós de bioapatita, bem como, para verificar a presença de impurezas orgânicas remanescentes associadas a estrutura das bioapatitas. Através do curva de TGA apresentada na Figura 4, foi possível acompanhar a porcentagem de perda de massa das amostras (Bioapatita 1 e 2) com o aumento da temperatura, onde foi possível observar uma perda de massa entre 0,9 e 1,1% até a temperatura de 400 C. Entre 500 e 900 C foi possível observar uma pequena diminuição na massa da amostra que pode estar relacionada a decomposição do carbonato presente na amostra, que segundo reportada na literatura, ocorre entre 500 e 890 C em atmosfera de nitrogênio, Joschek et al. (2000). As percentagens de perdas mássicas apresentadas ao final da corrida se relacionaram hierarquicamente com os teores de carbonato calculados. Tal resultado corrobora em relação a magnitude em que o carbonato se encontra presente nas amostras analisadas.

11 Massa da amostra (%) Bioapatita 1 Bioapatita Temperatura da amostra ( C) Figura 4 Gráfico da análise termogravimétrica das Bioapatitas 1 e DRX A Figura 5 apresenta os difratogramas obtidos para as bioapatitas 1 e 2. Os espectros apresentaram picos estreito e bem definidos, característica normalmente atribuída a um alto índice de cristalinidade. Os picos apresentaram alto grau de correlação com com os picos característicos de hidroxiapatita encontrados na base de dados PDF-2 do Internacional Center for Diffraction Data (ICDD), tendo como padrão a ficha

12 Figura 5 Difratograma das bioapatitas 1 e 2. Os índices de cristalinidade das amostras estão dispostos na Tabela 3. Os mesmos se mostraram altos, e podem estar relacionados com a temperatura e o tempo utilizado na etapa de calcinação das amostras. Tabela 4 Índice de cristalinidade. Amostra Bioapatia 1 Bioapatia 2 Índice de cristalinidade (%) 95, , CONCLUSÕES Foi possível obter Bioapatita a partir de resíduos ósseos da avicultura com características desejáveis para utilização na formulação de biocompósitos a partir de uma metodologia simples. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Embrapa Agroindústria Tropical pelo apoio financeiro e ao CNPq pela concessão da bolsa de pesquisa. 6. REFERÊNCIAS APARICIO, C.; GINEBRA, M.P. Biomineralization and Biomaterials: Fundamentals and Applications. s.l: Woodhead Publishing, 2015 ARMSTRONG, W. D.; SINGER, L. Composition and constitution of the mineral phase of bone. Clinical orthopaedics and related research, v. 38, p , 1965.

13 ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE PROTEÍNA ANIMAL, Relatório anual da avicultura, COSTA, A. C. F. M.; LIMA, M. G.; LIMA, L. H. M. A.; CORDEIRO, V. V.; VIANA, K. M. S.; SOUZA, C. V.; LIRA, H. L. Hidroxiapatita: Obtenção, caracterização e aplicações. Revista Eletrônica de Materiais e Processos, v.4, n.3, p , MERRY, J. C., GIBSON, I. R., BEST, S. M., & BONFIELD, W.. Synthesis and characterization of carbonate hydroxyapatite. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, v. 9, n. 12, p , MURUGAN, R.; RAO, K.P.; PANDURANGA; KUMAR, T.S.S. Heat-deproteinated xenogeneic bone from slaughterhouse waste: physico-chemical properties. Bulletin of Materials Science, v. 26, n. 5, p , RIVERA-MUÑOZ, E.M. Hydroxyapatite-based materials: synthesis and characterization. INTECH Open Access Publisher, ŠUPOVÁ, M.; MARTYNKOVÁ, G.S.; SUCHARDA, Z. Bioapatite made from chicken femur bone. Ceramics Silikáty, v. 55, n. 3, p , ŠUPOVÁ, M. Isolation and preparation of nanoscale bioapatites from natural sources: a review. Journal of nanoscience and nanotechnology, v. 14, n. 1, p , IBUKI, F.K. Síntese e caracterização de nanopartículas de hidroxiapatita funcionalizadas e análise da interação destas com o tecido dentinário. São Paulo : s.n., 2014.