Tatiana Carvalho de Souza Bonetti. Perfil de citocinas, hormônios e fatores de crescimento em fluido folicular e

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1 Tatiana Carvalho de Souza Bonetti Perfil de citocinas, hormônios e fatores de crescimento em fluido folicular e soro de pacientes submetidas à estimulação ovariana controlada em ciclos de fertilização in vitro Tese apresentada a Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo programa de Pós Graduação em Ginecologia São Paulo 2010

2 Tatiana Carvalho de Souza Bonetti Perfil de citocinas, hormônios e fatores de crescimento em fluido folicular e soro de pacientes submetidas à estimulação ovariana controlada para ciclos de fertilização in vitro Tese apresentada a Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências pelo programa de Pós Graduação em Ginecologia Orientador: Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim G. da Silva Co orientador: Dr. Edson Borges Jr. São Paulo 2010 ii

3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA LABORATÓRIO DE GINECOLOGIA MOLECULAR Chefe do Departamento: Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário Coordenador do Curso de Pós Graduação: Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão iii

4 Tatiana Carvalho de Souza Bonetti Perfil de citocinas, hormônios e fatores de crescimento em fluido folicular e soro de pacientes submetidas à estimulação ovariana controlada para ciclos de fertilização in vitro BANCA EXAMINADORA Presidente da Banca: Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva Co orientador: Prof. Dr. Edson Borges Jr. Titulares Prof. Dr. Edson Guimarães Lo Turco Prof. Dr. Mario Cavagna Prof. Dr. Péricles Assad Hassun Filho Prof. Dr. Tsutomu Aoki Suplentes Prof. Dr. Eduardo Leme Alves da Motta Profa. Dra. Regina Affonso iv

5 Dedicatória Ao meu marido, Josemar, que esteve ao meu lado em todos os momentos, tornado minha vida muito mais simples e feliz, viabilizando a concretização deste trabalho. Aos meus pais que me deram a educação e formação necessárias para que eu chegasse até aqui. A minha irmã, Fernanda, que faz parte da minha vida constantemente. A todos os meus familiares e amigos, que torcem por mim sempre... v

6 Agradecimentos Ao Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva, coordenador do Laboratório de Ginecologia Molecular Departamento de Ginecologia da UNIFESP, e orientador deste trabalho, por ter acreditado nesta proposta, e pela orientação dada sempre com muita paciência, seriedade e discernimento. Ao Dr. Edson Borges Jr., diretor clínico do Fertility Centro de Reprodução Assistida, e co orientador deste trabalho, pela permissão dada para que fossem coletadas amostras de pacientes atendidas na clínica, e pela colaboração e orientação imprescindíveis para a concretização deste estudo. Ao Dr. Assumpto Iaconelli Jr., diretor clínico do Fertility Centro de Reprodução Assistida, pela permissão dada para que fossem coletadas amostras de pacientes atendidas na clínica, possibilitando a realização deste estudo. À Daniela Paes de Almeida F. Braga, coordenadora científica do Fertility Centro de Reprodução Humana Assistida, pela indispensável colaboração na aquisição das amostras biológicas e dados clínicos utilizados neste estudo, assim como na discussão e interpretação dos resultados. À equipe de embriologistas e médicos do Fertility Centro de Reprodução Assistida, pela colaboração na coleta das amostras das participantes deste estudo. À Margarete Meira, secretária do Fertility Centro de Reprodução Assistida, pela responsabilidade na obtenção dos termos de consentimentos assinados pelas participantes deste estudo. À Vanessa Bruno Marques, secretária da Associação Instituto Sapientiae Centro de Estudos e Pesquisa em Reprodução Humana Assistida, pela colaboração na organização das fichas clínicas das participantes deste estudo. vi

7 Ao Prof. Dr. Reinaldo Salomão, coordenador do Laboratório de Imunologia do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da UNIFESP, por permitir a utilização do laboratório para as análises de citometria de fluxo, e auxílio na interpretação dos dados. A Dra. Milena Brunialti, supervisora do Laboratório de Imunologia do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da UNIFESP, por toda a dedicação e paciência em me auxiliar nas análises de citometria de fluxo. Ao João Paulo Kleine, colega do Laboratório de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia da UNIFESP, pela colaboração nas dosagens de proteínas das amostras incluídas no estudo. Às Dra. Giovana Gonçalves Vidotti e Dra. Cristina Valetta Carvalho, colegas do Laboratório de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia da UNIFESP, pela colaboração na revisão final deste trabalho. Ao Dr. Gianfranco Zampieri, coordenador do Laboratório de Bioquímica do Salomão e Zoppi Medicina Diagnóstica, pela colaboração nas análises bioquímicas das amostras incluídas neste estudo. À Patricia Udiloff Malcervelli, biomédica do Laboratório de Bioquímica do Salomão e Zoppi Medicina Diagnóstica, pelas análises bioquímicas das amostras incluídas neste estudo. Aos colegas do Laboratório de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia da UNIFESP, pela colaboração, amizade e incentivo constante. À Profa. Gianni M. S. dos Santos, professora do Setor de estatística aplicada da UNIFESP, pela assessoria estatística dada a este trabalho. Ao Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário, Chefe do Departamento de Ginecologia da UNIFESP. vii

8 Ao Prof. Dr. Manoel João Batista Castello Girão, Coordenador do Curso de Pós Graduação do Departamento de Ginecologia da UNIFESP. Às mulheres participantes deste estudo, pela colaboração e boa vontade, pois sem elas seria impossível a realização deste trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de estudos a mim concedida durante o desenvolvimento deste trabalho (Proc. nº /2008 2). À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro concedido ao Projeto (Proc. Nº 2007/ ), possibilitando o desenvolvimento deste estudo. viii

9 Sumário Dedicatória... v Agradecimentos... vi Sumário... ix Lista de Figuras... x Lista Tabelas... xi Lista de abreviaturas e símbolos... xii Resumo... xiii 1. APRESENTAÇÃO REVISÃO DA LITERATURA Desenvolvimento folicular inicial Ciclo reprodutivo feminino Ação hormonal no ciclo reprodutivo Citocinas e fatores de crescimento no ciclo reprodutivo feminino OBJETIVOS Objetivos específicos MÉTODOS Local do estudo Ética em pesquisa Pacientes Coleta e armazenamento de material e dados clínicos Casuística Ciclo de ICSI e resultados avaliados Protocolos de bloqueio hipofisário e estímulo ovariano controlado Coleta e classificação oocitária Fertilização e desenvolvimento embrionário Resultados clínicos Métodos Laboratoriais Dosagem de citocinas e VEGF por citometria de fluxo Dosagens hormonais Quantificação de proteínas totais Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO Características gerais das pacientes e dos ciclos de ICSI Caracterização das amostras incluídas no estudo Correlação entre citocinas, VEGF, e hormônios em amostras de FF e soro Bonetti TCS, Salomao R, Brunialti M, Braga DPAF, Borges Jr. E, Silva IDCG. Cytokine and hormonal profile in serum samples of patients undergoing controlled ovarian stimulation: interleukin 1β predicts ongoing pregnancy. Human Reproduction, Vol.25, No.8 pp , Bonetti TCS, Klaine JP, Salomao R, Brunialti M, Braga DPAF, Borges Jr. E, Silva IDCG. The intrafollicular interleukin 12 is associated with pituitary blockage protocols and predicts fertilization failure of corresponding oocyte. Human Reproduction. Under review CONCLUSÕES REFERÊNCIAS Abstract Anexo Anexo ix

10 Lista de Figuras Figura 1: Esquemas representativos dos protocolos de bloqueio hipofisário com antagonista do GnRH (1A) e com agonista do GnRH (1B), e estimulação ovariana controlada utilizando FSH r Figura 2: Comparação das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que tiveram o FF proveniente do maior folículo coletado isoladamente (FF isolado) e FF proveniente do pool de dois a quatro folículos de maiores diâmetros (FF pool). Os grupos foram comparados por teste t de Student e estão representados os valores de média, erro padrão da média e número de amostras avaliadas em cada subgrupo Figura 3: Comparação das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que estavam realizando o primeiro ciclos de ICSI ou tinham ciclo anterior em intervalo maior que 60 dias (ciclo 1º/>60 dias), e de pacientes que haviam realizado um ciclo de ICSI anterior em período inferior 60 dias (ciclo <60 dias) Figura 4: Comparação das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que receberam protocolos de bloqueio hipofisário com agonista do GnRH, ou antagonista do GnRH Figura 5: Organograma da análise dos resultados de acordo com as fases do tratamento e perfis das pacientes Figura 6: Análise de correlação entre as concentrações séricas e intrafoliculares para o FSH e AMH Figura 7: Gráficos representativos nos níveis séricos de citocinas, hormônios e VEGF. Os valores numéricos apresentados correspondem a média ± erro padrão da média x

11 Lista Tabelas Tabela 1. Características gerais das pacientes, e resultados laboratoriais e clínicos dos ciclos de ICSI Tabela 2. Correlação entre as concentrações dos fatores mensurados no soro e Fluido Folicular Tabela 3. Inter relação entre os fatores presentes no Fluido Folicular Tabela 4. Inter relação entre os fatores presentes no soro xi

12 Lista de abreviaturas e símbolos AMH Hormônio anti mülleriano, do inglês anti müllerian hormone BMP Proteína morfogenética óssea, do inglês bone morphogenetic protein CBA Análise por citometria por partículas, do inglês cytometric bead array E2 Estradiol EOC Estimulação ovariana controlada EPC Erro padrão do coeficiente EPM Erro padrão da média FIV Fertilização in vitro FF Fluido folicular FSH Hormônio folículo estimulante, do inglês follicular stimulating hormone FSH r Hormônio folículo estimulante recombinante GDF 9 Fator de crescimento e diferenciação 9, do inglês growth differentiation factor 9 GnRH Hormônio liberador de gonadotrofinas, do inglês gonadotrophin release hormone hcg Gonadotrofina coriônica humana, do inglês human chorionic gonadotrophin IC Intervalo de confiança ICSI Injeção intracitoplasmática de espermatozóides, do inglês intracytoplasmic sperm injection IFN γ Interferon γ IL Interleucina LH, do inglês luteinizing hormone LIF Fator inibidor de leucemia, do inglês Leukaemia inhibitory factor MI Metafase I MII Metafase II Nº Número OR Razação de chances, do inglês Odds ratio PI Prófase I PN Prónucleo P4 Progesterona RNA Ácido ribonucléico, do inglês ribonucleic ácid TE Transferência embrionária TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido TGF β Fator de crescimento transformador β, do inglês transforming growth factor β TNF Fator de necrose tumoral, do inglês Tumor necrosis factor VEGF Fator de crescimento vasculo endotelial, do inglês vascular endhotelial growth factor χ2 Qui quadrado xii

13 Resumo Introdução: Os fatores envolvidos no desenvolvimento e maturação folicular, assim como no desenvolvimento embrionário podem ser determinantes das causas da infertilidade. A qualidade do oócito e grau de maturação são diretamente dependentes do microambiente folicular, e afetam as etapas subsequentes desde a fertilização até o desenvolvimento embrionário. A avaliação dos componentes do fluido folicular (FF), e sua relação com os resultados dos ciclos de fertilização in vitro (FIV) podem elucidar fatores envolvidos nas falhas e sucessos deste processo. Materiais e Métodos: Este estudo avaliou 132 amostras de FF e soro de pacientes submetidas a ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI), as quais foram analisadas para as concentrações de IL 8, IL 1β, IL 6, IL 10, TNF, IL 12p70, LIF, VEGF, FSH, estradiol, progesterona, inibina B e hormônio anti mülleriano (AMH). Estes fatores foram correlacionados com a resposta ao estímulo ovariano controlado (EOC), resultados laboratoriais e clínicos dos ciclos de ICSI. As análises foram realizadas por método de regressão linear ou logística múltipla, e ajustados para as variáveis intervenientes. Resultados: Observamos que a presença de IL 1β sérica teve um efeito positivo nas taxas de implantação e aumentou 15 vezes as chances de gestação. Já as concentrações intrafoliculares de citocinas foram correlacionadas com a qualidade dos oócitos e embriões correspondentes as amostras de FF. A presença de IL 12 intrafolicular foi preditiva da falha de fertilização, enquanto as concentrações de IL 8 e LIF afetaram negativamente a qualidade embrionária. Conclusões: Desta forma, os resultados obtidos neste estudo permitem concluir que a composição do FF em pacientes submetidas ao EOC afeta a qualidade de oócitos e embriões e subseqüentes resultados clínicos dos ciclos de ICSI. Outros estudos são necessários para complementar os achados aqui apresentados e, elucidar os complexos mecanismos associados ao ambiente folicular e o potencial de desenvolvimento de oócitos e embriões. xiii

14 1. APRESENTAÇÃO

15 Este estudo iniciou se a partir de uma parceria entre o Laboratório de Ginecologia Molecular e Proteômica, do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), e o Fertility Centro de Fertilização Assistida, tendo como orientador e co orientador os respectivos coordenadores, Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva e Dr. Edson Borges Jr. As pacientes que fizeram parte deste estudo foram aquelas que realizaram tratamento de fertilização in vitro (FIV) no Fertility, e as análises das amostras foram realizadas com a colaboração do Laboratório de Imunologia e Doenças Infecciosas do Departamento de Medicina da UNIFESP e Salomão & Zoppi Medicina Diagnóstica. O sistema reprodutivo feminino envolve processos autócrinos e parácrinos entre hormônios, citocinas, fatores de crescimento, entre outros, que resulta no desenvolvimento de um folículo dominante e ovulação a cada ciclo reprodutivo. Por outro lado, ao estimulo ovariano controlado (EOC), utilizada em tratamentos de FIV para casais inférteis, estimula o desenvolvimento de múltiplos folículos e oócitos a fim de aumentar as chances de fertilização e gestação. Ao mesmo tempo, este procedimento resulta em níveis hormonais suprafiosiológicos, que por sua vez influenciam os microambientes folicular, ovariano e endometrial. Este estudo teve como objetivo avaliar alguns fatores intrafoliculares, e sua associação com o desenvolvimento folicular, oocitário e os resultados de ciclos de FIV. Para tanto, amostras de fluido folicular (FF) e soro coletadas no momento da punção folicular de pacientes submetidas a ciclos de FIV foram avaliadas para as concentrações de Hormônio Folículo Estimulante (FSH, do inglês follicle Stimulation Hormone), Estradiol (E2), Progesterona (P4), Inibina B, Hormônio anti Mülleriano (AMH, do inglês anti Müllerian hormone), Apresentação

16 Fator de Crescimento do endotélio vascular (VEGF, do inglês vascular endhotelial growth factor), Fator Inibidor de Leucemia (LIF, do inglês leukaemia inhibitory factor), Interleucina 1β (IL 1β), Interleucina 6 (IL 6), Interleucina 8 (IL 8), Interleucina 10 (IL 10), Interleucina 12 (IL 12), e Fator de Necrose Tumoral (TNF, do inglês tumor necrosis factor). Os valores mensurados nas amostras de soro e FF foram correlacionadas entre si e com os resultados referentes a resposta a EOC, resultados laboratoriais e clínicos dos ciclos de FIV. O desenvolvimento deste estudo foi realizado com apoio da Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP Auxilio a Pesquisa Regular, Proc. Nº 2007/ ) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ bolsa de doutorado, Proc. Nº /2008 2). De acordo com as recomendações do Conselho de Pós Graduação da Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina (UNIFESP EPM) e da Comissão Especial do Programa de Pós Graduação em Saúde da Mulher do Departamento de Ginecologia da UNIFESP EPM apresentamos dois trabalhos científicos como resultados e discussão" desta tese, um publicado na revista Human Reproduction e outro submetido e sob revisão na revista Fertility and Sterility, conforme descrito a seguir: 1. Bonetti TCS, Salomao R, Brunialti M, Braga DPAF, Borges Jr. E, Silva IDCG. Cytokine and hormonal profile in serum samples of patients undergoing controlled ovarian stimulation: interleukin 1b predicts ongoing pregnancy. Human Reproduction, Vol.25, No.8 pp , Bonetti TCS, Klaine JP, Salomao R, Brunialti M, Braga DPAF, Iaconelli Jr. A, Borges Jr. E, Silva IDCG. The intrafollicular interleukin 12 is associated with pituitary blockage protocols and predicts fertilization failure of corresponding oocyte. Human Reproduction. Under review. Apresentação

17 2. REVISÃO DA LITERATURA

18 5 O sucesso reprodutivo requer que o gameta feminino, o oócito, adquira a capacidade de ser fertilizado. Este processo acontece no folículo ovariano, e a cada ciclo reprodutivo feminino apenas um folículo adquire a capacidade de ovular. O desenvolvimento folicular é coordenado por uma complexa rede de fatores autócrinos, parácrinos e endócrinos. O oócito rege a organização e desenvolvimento folicular durante o ciclo reprodutivo feminino, controlando a proliferação e diferenciação das células da granulosa, que se toram responsivas a gonadotrofinas e em conseqüência produzem fatores protéicos e esteróides. Por outro lado, as gonadotrofinas agem nas células foliculares, células da granulosa e da teca, e nas células somáticas ovarianas, que por sua vez respondem produzindo outros fatores que colaboram no desenvolvimento e maturação oocitária (Duggavathi and Murphy 2009). Os fatores de sinalização entre o oócito e as células da granulosa que o rodeiam são essenciais para induzir e regular o desenvolvimento e diferenciação folicular desde o estágio de folículo primordial até a fase madura, em que o oócito se torna competente para sofrer fertilização e subsequentemente a embriogênese. Tais fatores, estimulam a diferenciação das células da teca e também sua resposta à gonadotrofinas, e a expansão das células do cumulus, que culmina na ruptura da parede folicular, a ovulação propriamente dita. Em contrapartida, as células da granulosa são indispensáveis ao crescimento, diferenciação, maturação nuclear e citoplasmática e, atividades transcricionais do oócito (van den Hurk and Zhao 2005). Assim, o sistema reprodutivo feminino representa uma complexa rede de interrelações autócrinas e parácrinas, envolvendo mecanismos de regulação positivos e negativos, Revisão da literatura

19 6 cascatas de sinalização sinérgicas e antagonistas que são altamente sensíveis. O desequilíbrio de um único componente deste processo pode resultar em falha reprodutiva (Weghofer and Gleicher 2009) 2.1 Desenvolvimento folicular inicial O desenvolvimento folicular se inicia durante a vida fetal, com a transformação de células germinativas primordiais em oócitos envoltos por uma estrutura denominada folículo. Ao nascimento, o córtex ovariano contém aproximadamente 500 mil folículos primordiais, na puberdade este número já está reduzido para 300 a 400 mil, e menos de 1% destes chegam à fase madura e ovulação. Os folículos primordiais irão se desenvolver em folículos primários, pré antrais, antrais e finalmente darão origem aos folículos pré ovulatórios, através de uma série de processos coordenados por hormônios e fatores intra ovarianos locais (revisado por Vegetti and Alagna 2006). A transição de folículos primordiais em folículos primários é um processo contínuo regulado por um equilíbrio entre fatores estimulatórios e inibitórios, independentes da ação de gonadotrofinas. Apesar de evidências da expressão de receptores para FSH (revisado por Vegetti and Alagna 2006), os folículos primordiais se desenvolvem pela ação autócrina e parácrina de citocinas e fatores de crescimento, e vem acompanhada pela proliferação das células da granulosa e da teca (Meduri et al. 2002). Fatores candidatos a regular este processo são os membros da família do fator de crescimento transformador (TGFβ, do inglês transforming growth factor β), como o AMH que bloqueia o desenvolvimento folicular (Durlinger et al. 2002b), enquanto fatores como as proteínas fatores morfogenéticas ósseas (BMPs, do inglês bone morphogenetic protein), fator de crescimento e Revisão da literatura

20 7 diferenciação 9 (GDF 9, do inglês growth differentiation factor 9), LIF e activinas parecem estimular o desenvolvimento dos folículos (Matzuk et al. 2002). O oócito entra em crescimento, as células da granulosa se tornam proliferativas formando uma camada multilaminar e, a partir de células do estroma ovariano originam se as células da teca ao seu redor. Paralelo a isso, é nesta fase que o folículo pré antral acumula proteínas essenciais para que o oócito se torne competente nas fases subseqüentes do desenvolvimento, ou seja, reassumir a maturação nuclear e citoplasmática capacitando o a fertilização e desenvolvimento embrionário inicial (Schultz and Wassarman 1977). Para tanto, ocorre uma complexa reorganização citoplasmática, com um importante aumento na síntese de ácido ribonucléico (RNA, do inglês ribonucleic acid) e proteínas, no número de ribossomos, mitocôndrias e outras organelas, e a formação da zona pelúcida (Picton et al. 1998). 2.2 Ciclo reprodutivo feminino Os folículos pré antrais são os candidatos a serem selecionados ao desenvolvimento até o estágio pré ovulatório, que é dependente da ação das gonadotrofinas. A partir da menarca, a cada ciclo reprodutivo, uma coorte de folículos pré antrais respondem ao estímulo do FSH, a chamada fase de recrutamento folicular, desenvolvendo se até a fase de folículos antrais. Entretanto, na ausência de estímulo gonadotrófico apropriado, os folículos pré antrais entram em atresia (McGee and Hsueh 2000; Zeleznik 2004). Este processo continua durante a vida fértil da mulher até que o pool de folículos primordiais, ou seja, a reserva ovariana esteja esgotada e como consequência não haja mais folículos em desenvolvimento, caracterizando a menopausa (Faddy et al. 1992). Revisão da literatura

21 8 Uma vez que o folículo atinja um determinado diâmetro, as células da granulosa passam a secretar glicoproteínas formando uma cavidade, e caracterizando o folículo antral. Ainda, as células da granulosa se separam em dois subtipos, aquelas que rodeiam e tem contato direto com o oócito passam a ser chamadas de células do cumulus, e as células que limitam a parede interna do folículo são as células da granulosa murais. Nesta fase, as células da granulosa se tornam acopladas uma a outra e a comunicação com o oócito passa a ser feita através das junções comunicantes (gap junctions), que facilitam a comunicação bidirecional e permitem a transferência de nutrientes, precursores metabólicos e moléculas estimulatórias e inibitórias, promovendo o desenvolvimento tanto do oócito quanto das células da granulosa (Telfer and McLaughlin 2007). O recrutamento e seleção folicular, chamado também de fase folicular do ciclo reprodutivo, acontecem a partir da puberdade, e tem como principal parâmetro o clássico eixo hipotálamo hipofise gonadal. O aumento dos níveis de FSH é direcionado pela ação do hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH, do inglês gonadotrophin release hormone) sintetizado pelo hipotálamo e liberado de forma pulsátil. O GnRH age na hipófise estimulando a síntese de ambas as gonadotrofinas, FSH e LH (hormônio luteinizante, LH, do inglês luteinizing hormone), sendo que o determinante para a síntese de FSH ou LH pela hipófise é o padrão de secreção do GnRH (Williams and Erickson 2008). A estimulação cíclica das gonadotrofinas permite que uma coorte de folículos seja recrutada e continue o desenvolvimento até que um atinja a dominância. O FSH é o fator determinante para o recrutamento folicular, e sua ligação aos receptores de FSH presentes nas células da granulosa estimula a síntese de E2 por intermédio da expressão da P450 aromatase. Já o LH se liga nos receptores de LH presentes nas células da teca levando a síntese e secreção de androstenediona, que por sua vez é o substrato para a ação da P450 aromatase nas células da granulosa. Este é o mecanismo envolvido no tradicional conceito duas células duas gonadotrofinas (Hillier 1994; Williams and Erickson 2008). Revisão da literatura

22 9 Com o desenvolvimento do folículo dominante, o FSH estimula a expressão de receptores de LH nas células da granulosa, tornando as competente para também responderem ao estimulo do LH. Embora não se saiba ao certo o mecanismo pelo qual apenas um folículo atinja a dominância, é provável que este seja mais sensível ao FSH do que os demais devido à maior expressão de receptores de FSH e LH nas células da granulosa, ou maior produção de fatores de crescimento locais aumentando a resposta ao FSH (McGee and Hsueh 2000). Os estrógenos produzidos em grandes quantidades pelas células da granulosa do folículo dominante, juntamente com as inibinas, regulam a produção de FSH pela hipófise. Como resultado, os folículos menores e menos responsivos ao FSH são privados do estimulo e sofrem atresia (McGee and Hsueh 2000). Outros fatores produzidos pelas células do folículo dominante são capazes de sensibilizar as células da granulosa de forma que o próprio folículo dominante continue a se desenvolver, mesmo sob menores concentrações de FSH. Nesta fase, a inibina age nas células da teca estimulando a produção de andrógenos, enquanto a activina aumenta a ação do FSH na aromatização dos andrógenos nas células da granulosa (Hillier 2001). A fase final do desenvolvimento folicular depende do estímulo de um pico na concentração do LH e modificações importantes acontecem na expressão gênica das células da granulosa, que estimulam a maturação meiótica final do oócito e culmina com a ovulação, ou seja, liberação de oócito maduro com capacidade de ser fertilizado (Solc et al. 2010). Para que o pico de LH aconteça, o E2 produzido pelas células da granulosa eleva a amplitude dos pulsos do GnRH que, ao mesmo tempo, inibe a secreção do FSH e estimula o pico de LH (Matzuk et al. 2002). O pico de LH e subsequente ovulação na fase intermediária do ciclo reprodutivo caracteriza o fim da fase folicular e início a fase lútea. O corpo lúteo é formado a partir de células remanescentes do folículo ovulado, que sofrem remodelação e neovascularização, e tem como principal função manter o endométrio receptivo, caso ocorra a concepção. A fase lútea é caracterizada pelas altas concentrações de P4 e outros fatores não esteróides como fatores de Revisão da literatura

23 10 crescimento, prostaglandinas e inibinas, que irão manter o corpo lúteo. Na ausência de concepção acontece a luteólise (Messinis et al. 2009). Por outro lado, na ocorrência da concepção, a gonadotrofina coriônica humana (hcg, do inglês human chorionic gonadotropin) resgata o corpo lúteo e, o embrião formado representa uma unidade funcional ativa na qual uma programação molecular própria, e produção de fatores de crescimento regulam seu desenvolvimento e diferenciação (Paria and Dey 1990). Esta etapa requer a ativação do genoma embrionário, e culmina na formação do blastocisto (Artley et al. 1992). Uma vez ativado o genoma embrionário, o embrião se desenvolve rapidamente até formar o blastocisto, que por sua vez, sai da zona pelúcida e ganha a competência de implantar se, o chamado blastocisto expandido. A coordenação e interação dos fatores endócrinos, celulares e moleculares do embrião e do endométrio produzem o ambiente favorável e o estado receptivo para a implantação. No entanto, as sequências precisas dos acontecimentos e detalhes das interações moleculares ainda não estão bem esclarecidos (Paria et al. 2001; Dey et al. 2004; Banerjee and Fazleabas 2010; Dimitriadis et al. 2010). 2.3 Ação hormonal no ciclo reprodutivo Como já citado anteriormente, o estradiol é derivado de precursores andrógenos, que pela ação da P450 aromatase são sintetizados nas células da granulosa pelo estimulo do FSH. Um estudo recente avaliando a relação entre esteróides intrafoliculares e resultados de ciclos de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI, do inglês intracytoplasmic sperm injection) observou que oócitos que degeneraram ou apresentaram falha de fertilização se correlacionam com menores concentrações intrafoliculares de E2 (Lamb et al. 2010). Outros autores mostraram que os níveis Revisão da literatura

24 11 intrafoliculares de FSH estão associados positivamente, enquanto os níveis de E2 e P4 foram inversamente relacionados a captação de oócitos em ciclos de FIV (Rosen et al. 2009) Em pacientes submetidas a ciclos de FIV com bloqueio hipofisário e estimulação ovariana controlada, as concentrações de FSH devem ser interpretadas com cautela, pois se assume que a produção endógena hipofisária de FSH está suprimida, e dessa forma, os níveis séricos de FSH refletem a concentração da gonadotrofina exógena administrada (Mendoza et al. 1999). Já a concentração intrafolicular de FSH representa a quantidade da gonadotrofina exógena que é capaz de atingir o folículo transpondo os mecanismos de regulação folicular de entrada e saída de substancias (Mason et al. 1994). O pico de LH, mimetizado pelo hcg em ciclos EOC (LH/hCG), faz com que as células da teca parem de sintetizar andrógenos, e ocorra a perda da atividade da aromatase nas células da granulosa, fazendo com que produzam P4 ao invés de E2, iniciando a luteinização (Fortune 2001). Assim, os autores sugerem que altas concentrações de E2 possam ser indícios de uma resposta inadequada das células da granulosa ao hcg. Por outro lado, também acreditam que a produção aumentada de P4 pode ser um indicador de excesso de hcg prejudicando a captação de oócitos (Rosen et al. 2009). Os níveis séricos de P4 também tem sido relacionados a resultados dos ciclos de FIV. Uma metanálise mostrou que níveis séricos aumentados de progesterona não se correlacionam com resultados clínicos de ciclos de FIV (Venetis et al. 2007). Entretanto, um estudo recente avaliando mais de 4000 ciclos de FIV sugere que os níveis séricos de progesterona no final do EOC está relacionado a menores taxas de gestação clínica (Bosch et al. 2010). A concentração aumentada de progesterona em pacientes submetidas a EOC pode ser atribuída ao elevado número de folículos que produzem P4 em resposta aos altos níveis de FSH (Bosch et al. 2003). Revisão da literatura

25 12 Outros hormônios ovarianos, como a inibina e AMH, também tem sido relacionados aos resultados dos ciclos de FIV. A inibina é um membro da família do fator de crescimento transformador β (TGF β, do inglês transforming growth factor β), que na forma dimérica, composta pelas subunidades α e β, é biologicamente ativa. A subunidade β ainda tem duas isoformas, A e B; portanto o complexo αβ A é chamado de inibina A e o complexo αβ B chamado de inibina B. Juntamente com a activina, a inibina regula a função das células de Leydig e Sertoli, e síntese de DNA nas células germinativas nos testículos, e a função das células da teca e granulosa nos ovários (Kumanov et al. 2005). A inibina A é produzida pelas células da granulosa de folículos dominantes e corpo lúteo, enquanto a inibina B é predominantemente produzida pela granulosa de folículos pré antrais e antrais pequenos em resposta ao FSH, e declinam na fase folicular tardia, agindo como um modulador da síntese de FSH (Roberts et al. 1993; Muttukrishna et al. 1994; de Kretser et al. 2002). Por ser produzida pelas células da granulosa, a inibina pode servir como um marcador protéico da função destas células (Magoffin and Jakimiuk 1997). Com o declínio da reserva ovariana, os níveis séricos de inibina B diminuem, enquanto os níveis de FSH aumentam. Assim, paralelamente a concentração sérica de FSH, a inibina B também é considerada um marcador de reserva ovariana e de baixa resposta em ciclos de reprodução assistida (Burger 1993; Laven and Fauser 2004; Munz et al. 2004). Também foi observada uma correlação dos níveis séricos de inibina B com resposta ao EOC, considerando número de folículos 10 mm (Luisi et al. 2003). A relação da concentração intrafolicular de inibina B e qualidade oocitária ainda é controversa. Franchimont e cols. sugeriram que os níveis de inibina intrafoliculares podem ser utilizados como parâmetro para maturação oocitária, já que estão positivamente relacionados ao sucesso da fertilização (Franchimont et al. 1990), enquanto Lau e cols. e Wen e cols. não observaram a associação dos níveis de inibina A e B com fertilização (Lau et al. 1999; Wen et al. 2006). Por outro Revisão da literatura

26 13 lado, as concentrações intrafoliculares de inibina A e B em mulheres submetidas a ciclos de FIV foram positivamente associadas à presença (Wen et al. 2006) e número de oócitos recuperados, taxa de fertilização, e sucesso de gestação (Ocal et al. 2004). Em estudo avaliando FF coletado individualmente não evidenciaram relação dos níveis de inibina B com qualidade oocitária (Lau et al. 1999). Já a expressão de mrna da porção α da inibina pelas células da granulosa era maior em folículos que continham oócitos maduros, de melhor qualidade e que fertilizaram, e eram menores em folículos cujos oócitos resultaram em embriões de melhor qualidade, mostrado que a inibina é necessária para a maturação do oócito, mas o excesso pode ser prejudicial ao desenvolvimento do embrião; entretanto as mesmas observações não foram possíveis quando avaliaram as concentrações de inibina A ou B no fluido folicular (Fujiwara et al. 2000). O AMH também é um membro da família do TGF β, e conhecido principalmente por sua ação na diferenciação sexual masculina. Entretanto, em mulheres o AMH é expresso pelas células da granulosa a partir do estágio de folículo primário e está envolvido na foliculogênese (Visser and Themmen 2005). Estudos em animais mostraram que camundongos knockout para o gene do AMH apresentam depleção precoce do pool de folículos primordiais comparado a animais selvagens, indicando uma ação inibitória do AMH produzido pelos folículos em desenvolvimento no recrutamento folicular inicial (Durlinger et al. 1999). Além disso, estudos em animais e in vitro sugerem que o AMH afeta a sensibilidade dos folículos em desenvolvimento ao FSH, sendo que os folículos são mais sensíveis ao FSH na ausência de AMH (Durlinger et al. 2001; Durlinger et al. 2002a; Durlinger et al. 2002b) Em humanos, a expressão do AMH pelas células da granulosa são maiores em folículos pré antrais e antrais com menos de 5 mm de diâmetro, com uma redução gradativa da expressão conforme progride o desenvolvimento do folículo, ou seja, o AMH é produzidos pela coorte de folículos recrutados e que estão em desenvolvimento, mas que não foram selecionados Revisão da literatura

27 14 para dominância. Estes dados sugerem que, também em humanos, o AMH pode ter a função de inibir o recrutamento dos folículos primordiais e agir na seleção folicular. Ainda, os menores níveis de AMH em mulheres após os 35 anos, quando apresentam uma depleção folicular acelerada, reforçam esta hipótese (Weenen et al. 2004; Visser and Themmen 2005). O AMH tem sido considerado um excelente marcador da reserva ovariana (Visser et al. 2006), pelo fato do tamanho da coorte de folículos recrutados ciclicamente ser diretamente proporcional ao pool de folículos primordiais remanescentes, ou seja, à reserva ovariana (Scheffer et al. 1999). Os níveis séricos de AMH decrescerem com o passar dos anos conforme a coorte de folículos primordiais diminui (van Rooij et al. 2002). Este fato foi confirmado pela dosagem sérica de AMH na fase folicular precoce do ciclo reprodutivo, onde as concentrações de AMH declinam significantemente a cada 3 anos, sendo mais sensível que o FSH e inibina B que não se modificam neste intervalo mais curto (de Vet et al. 2002). A forte correlação da contagem de folículos pré antrais com a concentração sérica de AMH, enquanto as correlações com FSH, inibina B e estradiol não foram tão evidentes (Fanchin et al. 2003), e a estabilidade das dosagens de AMH entre ciclos (Fanchin et al. 2005), reforçam a utilização da concentração do AMH na fase folicular inicial do ciclo reprodutivo como marcador de reserva ovariana. Em ciclos de FIV com EOC, a concentração sérica de AMH no início do tratamento também tem se mostrado um marcador preditivo de resposta ao tratamento (van Rooij et al. 2002; Fleming et al. 2006; Nelson et al. 2007). Wunder e cols. observaram a associação positiva do número de oócitos recuperados e concentrações de AMH no FF e soro mensurados no dia da punção folicular, sendo que a associação com os níveis séricos de AMH eram mais fortes do que com os níveis intrafoliculares (Wunder et al. 2008). Além disso, sabe se que os níveis de AMH diminuem gradualmente com o desenvolvimento de múltiplos folículos, provavelmente refletindo a diminuição da expressão do AMH por folículos grandes (Fanchin et al. 2003). Alguns autores também Revisão da literatura

28 15 observaram a relação do AMH com taxa de fertilização (Lekamge et al. 2007; Majumder et al. 2010) e qualidade oocitária (Ebner et al. 2006). 2.4 Citocinas e fatores de crescimento no ciclo reprodutivo feminino Apesar dos clássicos sistemas hipotálamo hipófise gonadal e duas células duas gonadotrofinas serem o eixo para o entendimento da foliculogênese, o crescimento e diferenciação folicular são processos complexos, envolvendo além das gonadotrofinas, hormônios e esteróides, diversos outros fatores tais como fatores de crescimento, citocinas, enzimas, proteoglicanos, e lipoproteínas (van den Hurk and Zhao 2005). As citocinas constituem potentes moduladores da resposta imunológica e, portanto parecem estar envolvidas no sucesso e na falha reprodutiva. Tradicionalmente são divididas em dois subtipos, Th1 e Th2, dependendo do tipo celular que as produzem e do efeito que exercem. As primeiras (Th1) incluem principalmente o interferon γ (IFN γ), interleucina 2 (IL 2) e fator de necrose tumoral (TNF β, do inglês tumor necrosis factor), tendo sua principal ação na imunidade celular. Já as do tipo Th2 são IL 4, IL 5, IL 6 e IL 10 envolvidas na imunidade mediada por anticorpos (Laird et al. 2006). Diversos fatores envolvidos na ovulação são clássicos mediadores da reação inflamatória, entre eles as citocinas produzidas pelas próprias células foliculares ou pelos leucócitos infiltrados no folículo pré ovulatório, que por sua vez estão envolvidas em diferentes processos na fisiologia reprodutiva. Entre estas citocinas estão IL 1, IL 2, IL 6, IL 8, IL 10, TNF (Bukulmez and Arici 2000). Revisão da literatura

29 16 Sabe se que o sucesso da gestação está relacionado à predominância de citocinas do tipo Th2 sobre o tipo Th1 (Wegmann et al. 1993; Vince and Johnson 1996). A expressão de citocinas e seus receptores no útero e embrião na gestação inicial confirmam tais hipóteses e sua função na implantação (Carson et al. 2000; Laird et al. 2006). No entanto, a perda da expressão destas moléculas pode ser compensada por outras, o que dificulta a análise e entendimento do processo (Stewart et al. 1992). Evidências crescentes mostram que citocinas podem modular a função ovariana também em nível local. Durante o ciclo reprodutivo e início da gestação importantes mudanças são observadas no número e perfil de leucócitos presentes no útero e ovários em resposta a estímulos quimioatrativos. Tais leucócitos, por sua vez, migram para locais específicos e secretam fatores parácrinos que agem direta ou indiretamente no controle dos eventos reprodutivos, como esteroidogênese, ovulação, função do corpo lúteo, proliferação endometrial, decidualização e parto (Garcia Velasco and Arici 1999). Por outro lado, as citocinas agem também de forma sistêmica, influenciando a função das glândulas adrenais, e modulando a esteroidogênese (Bornstein et al. 2004). As quimiocinas, apesar de serem membros da família das citocinas, tem sua característica específica como potentes quimioatrativos. A IL 8, principal representante das quimiocinas α, é um potente quimioatrativo de neutrófilos e fator angiogênico, e pode estar envolvida no desenvolvimento folicular, atresia, ovulação, esteroidogênese e função do corpo lúteo, além de ações no endométrio (Garcia Velasco and Arici 1999). Sabe se que a IL 8 é produzida pelas células da granulosa e leucócitos intrafoliculares (Polec et al. 2009), e apresenta um padrão de expressão cíclico durante o ciclo reprodutivo como resultado de uma regulação, direta ou indireta, dos hormônios esteróides (Arici et al. 1998). Revisão da literatura O pico do LH/hCG inicia a maturação final do folículo e concomitantemente dispara uma cascata de eventos que levam à ruptura do folículo e luteinização das células da

30 17 granulosa. Imediatamente antes da ovulação, acontece uma infiltração de granulócitos na área ao redor do folículo (Brannstrom et al. 1994; Chang et al. 1998), e a IL 8, por suas características quimioatrativas de neutrófilos, é provavelmente um dos responsáveis por este evento (Arici et al. 1996) A rápida vascularização do corpo lúteo é guiada por fatores presentes no FF (Frederick et al. 1984) e as propriedades angiogênicas da IL 8 associado ao aumento dos níveis na fase lútea do ciclo reprodutivo, faz da IL 8 um dos candidatos a regulação deste processo. Assim, acredita se na hipótese que a migração dos leucócitos seja regulada por hormônios através da modulação da IL 8, ou seja, a produção de IL 8 é estimulada pelo LH/hCG, que exerce a função de atrair os neutrófilos para a região ao redor do folículo, que por sua vez atuam na ruptura folicular. A IL 8 age ainda como fator angiogênico, contribuindo para a neovascularização do folículo, necessária para a formação do corpo lúteo. Por fim, com o aumento dos níveis de P4, a produção de IL 8 é suprimida (Arici et al. 1996). A IL 12 é uma citocina composta por duas subunidades, p35 e p40, que quando co expressas na mesma célula formam o heterodímero p70 biologicamente ativo (Watford et al. 2003). Produzida principalmente por fagócitos (macrófagos, monócitos e neutrófilos), a IL 12 tem função regulatória na resposta imune adaptativa, e é o principal indutor de resposta tipo Th 1, que juntamente com TNF α e células natural killer estimulam a atividade citotóxica (Trinchieri and Scott 1995; Lamont and Adorini 1996). Visujic e cols relataram a presença de maiores concentrações de IL 12p40 em FF de folículos que continham oócitos e sugeriram seu envolvimento com a maturação folicular (Vujisic et al. 2006). Por outro lado, Coskun e cols. encontraram menores concentrações de IL 12 em folículos pré ovulatórios comparado a folículos imaturos (Coskun et al. 1998). Outro estudo avaliando a presença de IL 12 no FF mostrou que pacientes apresentando Síndrome dos ovários policísticos (SOP) apresentaram menores níveis de IL 12, e uma correlação negativa entre a concentração de IL 12 e Revisão da literatura

31 18 andrógenos, mas não observaram qualquer relação com os resultados dos ciclos de FIV (Gallinelli et al. 2003). A família da IL 1 é um grupo de citocinas polipeptídicas (IL 1 α, IL 1 β e receptor antagonista de IL 1) conhecidas principalmente por seu efeito inflamatório. A IL 1 e seus receptores estão presentes tanto no endométrio (Simon et al. 1996), quanto no oócito e embrião (Tabibzadeh and Sun 1992). Estudos mostram que a interação IL 1 β embrionária com receptor endometrial inicia uma cascata de eventos, induzindo a produção de integrinas e promovendo a implantação (Simon et al. 1997; Sunder and Lenton 2000). A IL 10 é um importante indutor da resposta imune Th 2, compatível com o sucesso da gestação (Mosmann and Sad 1996). Wu e cols. demonstraram que altas concentrações de IL 10 após a implantação são importantes na manutenção da gestação (Wu et al. 2001). Já o TNF é uma citocina que atua com mediadora de uma série de eventos durante a gestação dependendo da idade gestacional (Hunt et al. 1996). Alguns autores afirmam que o TNF faz parte do grupo de citocinas indutoras de uma resposta do tipo Th1 e está associada à falha de FIV e aborto espontâneo (Hill 1995), e que a supressão do TNF no início da gestação parece contribuir para o desenvolvimento normal da mesma (Daher et al. 1999). Por outro lado, Gharesi Fard e cols. demonstraram que a redução nos níveis de TNF α após tratamento com linfócitos em pacientes com aborto de repetição, favoreceu o sucesso da gestação (Gharesi Fard et al. 2008). Além disso, Boomsma e cols, recentemente demonstraram que a presença de TNF α na secreção endometrial tem uma associação positiva com a gestação clínica (Boomsma et al. 2009). Outro grupo de citocinas inclui LIF, IL 6 e IL 11, com estruturas semelhantes, que utilizam o mesmo receptor, promovendo assim ações similares (Laird et al. 2006). Estudos em animais sugerem a importância do LIF na implantação, já que a transferência de blastocistos em camundongos knockout para o gene LIF não resulta em implantação (Stewart et al. 1992). Em humanos, o LIF e a IL 11 são expressos no endométrio de forma ciclo dependente, no entanto, por Revisão da literatura

32 19 diferentes grupos celulares e em diferentes momentos, sugerindo que suas funções na implantação possam ser distintas apesar de pertencerem à mesma família (Robb et al. 2002). Estudos a respeito da expressão de LIF no endométrio em casos de infertilidade ainda são controversos (Laird et al. 1997; Sherwin et al. 2002), inclusive em ciclos de FIV (Hambartsoumian 1998; Ledee Bataille et al. 2004). Estudos mostraram que a co cultura de embriões com células endometriais produtoras de LIF, melhora a qualidade e desenvolvimento embrionário (Spandorfer et al. 2001). Entretanto, a utilização clínica de LIF recombinante em reprodução assistida está sendo desenvolvida, mas o impacto desta intervenção ainda não foi estabelecido (Hoozemans et al. 2004). Oócitos e embriões expressam receptor para LIF (Chen et al. 1999; Sharkey et al. 1999). A concentração de LIF em fluido folicular é regulada de acordo com o estágio de desenvolvimento do folículo e é responsiva ao LH/hCG (Arici et al. 1997). Estudo em animais mostram a ação de LIF juntamente com ligante kit como um importante fator de sobrevivência de células primordiais embrionárias (Morita et al. 1999). Outros estudos in vitro demonstram que LIF é produzido por células da granulosa em cultura (Coskun et al. 1998) e células ovarianas em cultura suplementadas com LIF aumentou a taxa de transição de folículos primordiais para folículos primários (Nilsson et al. 2002). Já a IL 6 não tem uma função direta na regulação da ovulação, mas estudos in vitro e em animais mostram seu envolvimento na modulação da ação das gonadotrofinas, agindo possivelmente na diminuição da capacidade de ligação do FSH ao seu receptor (Machelon et al. 1994a; Machelon et al. 1994b; Breard et al. 1998), e na regulação da produção de esteróides ovarianos (Van der Hoek et al. 1998). Paralelamente, o crescimento folicular também induz a produção de altos níveis de fatores de crescimento autócrinos e parácrinos, que são acompanhados pelo aumento da vascularidade folicular e resposta ao FSH, colaborando para o mecanismo de seleção positiva Revisão da literatura

33 20 daquele folículo (McGee and Hsueh 2000). A partir da fase antral, os folículos adquirem uma rede capilar na camada da teca que permite o suprimento de gonadotrofinas, fatores de crescimento, oxigênio, precursores esteróides e outros fatores necessários ao desenvolvimento do folículo. O processo de neovascularização folicular é disparado pelo pico de LH que estimula a produção do VEGF, um potente mitógeno para células endoteliais e um fator chave na regulação da angiogênese (Garrido et al. 1993; Ferrara and Davis Smyth 1997; Smith 2000), assim como da angiopoetina 1 e 2 que são particularmente importantes na estabilização dos vasos sanguíneos (Fraser and Duncan 2005). A concentração do VEGF é diretamente proporcional ao desenvolvimento folicular, relacionando se, portanto com o tamanho dos folículos (Christenson and Stouffer 1997; Barboni et al. 2000; Berisha et al. 2000; Gutman et al. 2008). A maior vascularização de um folículo individualmente resulta na obtenção de maiores quantidades de gonadotrofinas, e assim parece desempenhar também uma função na seleção e maturação do folículo dominante pré ovulatório (Fraser and Duncan 2005; Kaczmarek et al. 2005). O sistema VEGF receptor de VEGF em reprodução humana assistida não é claro, no entanto Dorn e cols. mostraram que concentrações séricas de VEGF mais elevadas no dia da punção folicular foram preditivas de gestação, mas o tratamento com FSH recombinante (FSH r) reduz tais concentrações (Dorn et al. 2003). Outros estudos em pacientes submetidas a técnicas de FIV mostraram que a maior vascularização peri folicular proporciona maior aporte de oxigênio ao oócito, o que resulta em maior potencial de desenvolvimento e implantação (Van Blerkom 1998; Kim et al. 2004). Por outro lado, Barrosos e cols observaram uma correlação negativa da concentração intrafolicular de VEGF com a morfologia embrionária (Barroso et al. 1999). Outros autores demonstraram que maiores concentrações de VEGF intrafoliculares estavam relacionadas a menores taxas de gestação, concordantes com idade avançada e menor reserva ovariana das pacientes (Friedman et al. 1998; Asimakopoulos et al. 2005). Revisão da literatura

34 21 Assim sendo, o conhecimento dos fatores que regulam o desenvolvimento do oócito e das células foliculares que o rodeiam é essencial para entender as circunstancias fisiológicas necessárias para o sucesso do ciclo reprodutivo feminino, subseqüente fertilização e da fase inicial da embriogênese. Da mesma forma, as alterações na foliculogênese e falhas dos ciclos de FIV podem ser elucidadas a partir do entendimento da inter relação dos fatores envolvidos neste processo, sob as condições suprafisiológicas impostas no EOC. Com isso, nos focamos em avaliar amostras de FF de mulheres submetidas ao EOC, buscando esclarecer possíveis relações entre a composição do FF e os resultados dos ciclos de FIV. Revisão da literatura

35 3. OBJETIVOS

36 23 O objetivo deste estudo foi avaliar a concentração intrafolicular e sérica de citocinas (IL 8, IL 6, IL 1, IL 10, IL 12, TNF e LIF), hormônios (FSH, E2, P4, AMH, inibina β) e fator de crescimento (VEGF) em pacientes submetidas ao EOC para ciclos de ICSI, e correlacionar os perfis encontrados com os resultados do tratamento. 3.1 Objetivos específicos Avaliar relação entre os fatores mensurados no soro com os resultados clínicos dos ciclos de ICSI Avaliar a relação entre os fatores mensurados no fluido folicular com as características dos oócitos e embriões correspondentes Objetivos

37 4. MÉTODOS

38 Local do estudo O presente estudo foi desenvolvido junto ao Laboratório de Ginecologia Molecular e Proteômica, do Departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina, São Paulo SP; em parceria com o Fertility Centro de Fertilização Assistida, São Paulo SP, no período de 2007 à Ética em pesquisa Este estudo, e o respectivo Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), foram analisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo / Escola Paulista de Medicina, protocolo 1699/06 (Anexo 1). Pacientes que procuraram o Fertility Centro de Fertilização Assistida, para realização de tratamento de infertilidade por técnicas de reprodução humana assistida, para obtenção de gestação foram designadas como sujeitos do estudo. Todas as pacientes inférteis que realizaram tratamento no Fertility Centro de Fertilização Assistida, obrigatoriamente, assinaram o TCLE previamente ao início do tratamento proposto, concordando com os procedimentos a serem Métodos

39 26 realizados, como estabelecido pelas normas éticas para utilização das técnicas de reprodução assistida (CFM 1992; CNS 1996). Durante a consulta médica, previamente ao início do tratamento, foram esclarecidos às pacientes os termos deste estudo, e oferecida a possibilidade de participação voluntária. Um segundo TCLE específico a este estudo (Anexo 2) foi lido e assinado voluntariamente pelas pacientes que concordaram em participar. Vale ressaltar que para participação neste estudo, não foi realizado qualquer procedimento adicional ao tratamento proposto, já que o material utilizado foi aquele remanescente dos procedimentos, que seria descartado. Apenas uma coleta de sangue periférico foi realizada. 4.3 Pacientes inclusão e exclusão: As pacientes incluídas no estudo deveriam satisfazer os seguintes critérios de Critérios de inclusão: Casais inférteis que procuraram o Fertility Centro de Fertilização Assistida para realização de tratamento de infertilidade para obtenção de gestação Realizar técnica de reprodução humana assistida de alta complexidade (ICSI) Presença de ambos os ovários Apresentar ciclos menstruais regulares Não possuir anomalia pélvica e/ou uterina clinicamente significativas Métodos

40 27 Índice de massa corporal menor que 35, calculado de acordo com a seguinte fórmula: peso (kg) / altura (m) 2 Dosagens séricas hormonais basais dentro dos limites de normalidade, a saber: E2 70 pg/ml e FSH 14 mu/ml Ter voluntariamente fornecido o termo de consentimento livre e esclarecido Critérios de exclusão: Doença sistêmica clinicamente significativa; Infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), hepatite C ou B; Endometriose graus III ou IV; Hidrossalpinge uni ou bilateral; Sangramento ginecológico anormal, não diagnosticado; Alergia ou hipersensibilidade a gonadotrofinas humanas ou quaisquer outros medicamentos utilizados no tratamento; Conhecido abuso de qualquer substância no período do tratamento. 4.4 Coleta e armazenamento de material e dados clínicos Amostras de soro e FF foram coletados no dia da punção folicular. Durante o procedimento de punção folicular, o maior folículo da coorte, ou um pool de dois a quatro folículos com maiores diâmetros foram inicialmente aspirados, e após a recuperação dos oócitos, o FF remanescente foi centrifugado e o sobrenadante armazenado a 80ºC para análise posterior. Ainda Métodos

41 28 durante o procedimento de punção folicular, uma amostra de 5 ml de sangue periférico foi coletada em tubo seco. A seguir, a amostra foi centrifugada e o soro armazenado a 80ºC, para análises posteriores. Os dados clínicos e laboratoriais referentes ao ciclo de ICSI de cada paciente foram transcritos a partir da respectiva ficha clínica, os quais foram avaliados juntamente aos resultados deste estudo. 4.5 Casuística Foram obtidas amostras de FF e soro provenientes de 133 pacientes. Uma paciente foi excluída do estudo devido à amostra de FF ter sofrido hemólise inviabilizando as análises laboratoriais, com isso foram consideradas para o estudo 132 pacientes. 4.6 Ciclo de ICSI e resultados avaliados As pacientes foram submetidas a EOC seguindo protocolos padrão descritos no Consenso de Indução de Ovulação em Reprodução Assistida (SBRH SPMR 2008), e a ICSI conforme descrita por Palermo e cols. (1992). Métodos

42 Protocolos de bloqueio hipofisário e estímulo ovariano controlado O bloqueio hipofisário foi realizado com agonista ou antagonista do GnRH e EOC utilizando FSH recombinante (FSH r, Gonal F Serono; Suiça). O EOC foi monitorado por dosagens séricas de E2 e ultrassonografias transvaginais seriadas. Quando a paciente apresentou dois ou mais folículos com diâmetro igual ou superior a 16 mm, foi administrado 250 µg de hcg recombinante (hcg r, Ovidrel Serono, Suiça) para maturação folicular final. A punção folicular foi realizada horas após a administração do hcg r (Figuras 1A e 1B). r FSH (dose inicial UI/dia) Menstruação GnRH antagonista (dose 0,25mg/dia) h 2 5 dias A hcg (250 μg) Punção Folicular Transferência embrionária r FSH (dose inicial UI/dia) 1 21 dias Fase lútea média Menstruação GnRH agonista (dose 0,1mg/dia) h 2 5 dias B hcg (250 μg) Punção Folicular Transferência embrionária Figura 1: Esquemas representativos dos protocolos de bloqueio hipofisário com antagonista do GnRH (1A) e com agonista do GnRH (1B), e estimulação ovariana controlada utilizando FSH r. Métodos

43 30 Os parâmetros representativos do grau de resposta ao EOC correlacionados com os resultados deste estudo forma: número e diâmetro médio dos folículos iguais ou maiores que 10 mm no dia da administração do hcg r Coleta e classificação oocitária O FF foi transferido para uma placa de Petri onde os oócitos foram identificados e coletados. Após a recuperação dos oócitos, o FF remanescente foi centrifugado e o sobrenadante armazenado à 80ºC para posterior análise. Após a denudação, os oócitos foram classificados quanto ao grau de maturação, baseado na presença do primeiro corpúsculo polar e vesícula germinativa. Neste estudo, foram avaliados o número total de oócitos recuperados e a taxa de oócitos maduros (MII) por paciente. Metáfase II (MII): Oócitos que apresentavam o primeiro corpúsculo polar foram considerados maduros. Metáfase I (MI): Oócitos que não apresentavam o primeiro corpúsculo polar nem a vesícula germinativa foram classificados como imaturos em estágio de MI. Prófase I (PI): Oócitos nos quais a vesícula germinativa foi visualizada foram classificados como imaturos em estágio de prófase I. Imediatamente antes da ICSI, os oócitos MII foram analisados para presença de alterações morfológicas. As alterações morfológicas oocitárias consideradas como características de oócitos de má qualidade foram: presença de grânulos citoplasmáticos, presença de vacúolos, e debris ou alterações no espaço perivitelino (Rienzi et al. 2008; Ubaldi and Rienzi 2008; Figueira et al. 2009). A taxa de oócitos de boa qualidade (razão entre o número de oócitos de boa qualidade e o total de oócitos MII coletados por paciente) foi correlacionada com os resultados do estudo. Métodos

44 Fertilização e desenvolvimento embrionário Os oócitos em MII foram fertilizados utilizando se a ICSI, de acordo com a técnica padrão descrita por Palermo e cols. (Palermo et al. 1992). No primeiro dia de desenvolvimento, aproximadamente 20 horas após a ICSI, realizou se a checagem da fertilização e os oócitos foram classificados como: Fertilização normal: caracterizado pela presença de dois pró nucleos (2PN) Falha de fertilização: caracterizado pela ausência de PNs Fertilização anormal: caracterizado pela presença de um, três ou mais PNs A taxa de fertilização normal foi calculada pela razão entre o número de oócitos com fertilização normal (2PN) e o número total de oócitos injetados e intactos por paciente. Os embriões foram classificados de acordo com características morfológicas no dia da transferência embrionárias (TE). A TE foi realizada no segundo ou terceiro dia do desenvolvimento e a classificação dos embriões foi realizada utilizando se o mesmo padrão para todos os ciclos, levando se em consideração o número e simetria dos blastômeros, presença de fragmentação e multinucleação. Foram considerados embriões de alta qualidade aqueles que se desenvolveram a partir de oócitos MII, apresentando dois a quatro blastômeros no segundo dia do desenvolvimento ou mais do que seis blastômeros no terceiro dia do desenvolvimento, menos que 20% de fragmentação, ausência de multinucleação e/ou blastômeros dominantes A transferência de um a quatro embriões foi realizada no segundo ou terceiro dia do desenvolvimento embrionário, guiada por ultrassonografia. Os parâmetros representativos da qualidade e desenvolvimento embrionário levados em consideração neste estudo foram: Métodos

45 32 Taxa de embriões de alta qualidade no dia da TE: definida pela razão entre o número de embriões de alta qualidade e o número total de embriões no dia da TE. Taxa de desenvolvimento embrionário: definida pela razão entre o número de embriões que se desenvolveram até o dia da TE e o número de oócitos com fertilização normal Resultados clínicos A gestação foi diagnosticada bioquimicamente pela dosagem sérica de β hcg, 12 dias após a TE. A gestação clínica foi confirmada por ultrassonografia, pela presença de saco gestacional com batimento cardíaco, cinco semanas após a TE. O aborto foi definido como a perda gestacional até 20 semanas de gestação. Em relação aos resultados clínicos, foram avaliadas neste estudo: Taxa de implantação: razão entre o número de sacos gestacionais e o número de embriões transferidos. Taxa de gestação clínica em andamento: definida pela razão entre o número de pacientes com gestação clínica confirmada por ultrassonografia, descontado o número de abortos, e o número total de pacientes com TE. 4.7 Métodos Laboratoriais hormônios, VEGF e proteínas totais. Cada uma das amostras de FF e soro foram submetidas às dosagens de citocinas, Métodos

46 Dosagem de citocinas e VEGF por citometria de fluxo A técnica de citometria de fluxo pelo método CBA (Cytometric bead array) foi realizada no Laboratório de Imunologia do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias (Kumanov et al.), da Universidade Federal de São Paulo, coordenado pelo Prof. Dr. Reinaldo Salomão, com a colaboração da Dra. Milena Brunialti. Para cada amostra foram realizados dois experimentos utilizando a técnica CBA. Um ensaio para a quantificação das citocinas IL 8, IL 1β, IL 6, IL 10, TNF e IL 12p70, utilizando se o Human inflammation cytokine CBA kit (BD TM Cytometric bead array (CBA), BD Biosciences, USA), onde o limite de detecção inferior foi 2,0 pg/ml para as seis citocinas avaliadas; e outro ensaio para a quantificação de VEGF e LIF, utilizando se CBA Flex set (BD TM Cytometric bead array (CBA), BD Biosciences, USA), no qual o limite de detecção inferior foi de 4,5 pg/ml para VEGF, e 5,5 pg/ml para LIF. Foi utilizado o citômetro de fluxo FACS Calibur 4 color flow cytometer (BD Biosciences, USA) e a aquisição e análise dos dados foram realizadas utilizando CellQuest TM e FCAP Array TM Softwares (BD Biosciences, USA), respectivamente. As amostras de soro e FF de cada paciente foram testadas em um mesmo experimento Dosagens hormonais As dosagens dos hormônios FSH, E2, P4, AMH e inibina B foram realizadas no Laboratório de Bioquímica do Salomão e Zoppi Medicina Diagnóstica. As dosagens de FSH, E2, P4 foram realizadas por quimioluminescência utilizando sistema multi análises (ADVIA Centaur CP Immunoassay System, Siemens). O limite de detecção inferior do teste foi 0,3 mui/ml para FSH, 7,0 pg/ml para estradiol, e 0,15 pg/ml para progesterona. Métodos

47 34 O ensaio imunoenzimático foi utilizado para quantificação do AMH (ACTIVE Mullerian Inhibiting Substance/Anti Mullerian Hormone (MIS/AMH) enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kit, Diagnosis System Laboratories, Inc. USA) e inibina B (ACTIVE Inhibin β Enzyme Linked Immunosorbent (ELISA) Kit, Diagnosis System Laboratories, Inc. USA). O limite de detecção inferior do teste foi de 0,006 ng/ml para AMH e 7 pg/ml para Inibina B Quantificação de proteínas totais Devido à grande diferença entre os diâmetros dos folículos e consequentemente do volume do FF, existe uma grande variabilidade entre o conteúdo dos mesmos. A fim de minimizar tal variabilidade e padronizar os resultados, foi realizada a quantificação de proteínas totais presentes no FF, e os resultados dos fatores intra foliculares mensurados foram ajustados para grama de proteína da amostra (Franchimont et al. 1989; Fanchin et al. 2007). As quantificações de proteínas totais foram realizadas utilizando técnica de fotometria por absorbância (Cobas C 111 Analyser, Roche Diagnostics). 4.8 Análise estatística Foram realizadas análises descritiva e estatística, utilizando software Minitab 14 for Windows (Minitab, USA) e GraphPad Prisma 5.01 (GraphPad software, USA). A análise descritiva incluiu o perfil demográfico das pacientes, assim como as características gerais dos ciclos de ICSI. Os dados numéricos foram apresentados como média e erro padrão da média (EPM) e comparados utilizando teste t de Student. Os dados categóricos foram apresentados como porcentagem, e Métodos

48 35 analisados por teste de qui quadrado (χ 2 ) ou exato de Fisher. O teste de correlação de Pearson foi utilizado para avaliar a correlação entre as variáveis. A análise estatística dos resultados foi realizada através de regressão linear ou logística múltipla de acordo com a variável resposta avaliada. A concentração dos fatores avaliados no FF foi analisada após o ajuste por grama de proteína da amostra. Já os níveis séricos foram ajustados para grama de proteína apenas para fins de comparação e correlação com os níveis mensurados no FF. Quando os fatores séricos foram utilizados para avaliar sua relação com os resultados dos ciclos de ICSI, os mesmo foram utilizados na forma original. Todas as análises de regressão linear ou logística foram realizadas utilizando modelo múltiplo, ajustado para a idade das pacientes e outras variáveis possivelmente intervenientes de acordo com a variável resposta analisada. Todos os modelos de regressão linear foram realizados utilizando método stepwise e avaliados quanto aos resíduos. Os resultados das análises de regressão linear foram apresentados como coeficiente e erro padrão do coeficiente (EPC); e para regressão logística, razão de chances (OR, do inglês Odds ratio) e intervalo de confiança 95% (IC 95%). Valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significantes, entretanto todas as variáveis intervenientes utilizadas nos modelos de regressão que apresentavam valores de p 0,10 foram relatadas nos resultados do estudo. Para avaliar a resposta ao EOC foi considerado o número e diâmetro de folículos 10 mm de diâmetro observados a ultrassonografia no dia da administração do hcg r. Ainda em referência a resposta ao EOC, foram avaliados o número de oócitos recuperados, taxa de oócitos maduros (MII) recuperados e taxa de oócitos de boa qualidade. Para a avaliação dos resultados laboratoriais dos ciclos de ICSI, foram incluídos apenas os 96 ciclos em que se utilizaram espermatozóides ejaculados cujo sêmen não apresentasse oligozoospermia grave. Foram levadas em consideração a taxa de fertilização normal, taxa de Métodos

49 36 embriões de boa qualidade no dia da transferência embrionária, e taxa de desenvolvimento embrionário. Em relação aos resultados clínicos, consideraram se 90 ciclos em que se utilizaram espermatozóides ejaculados cujo sêmen não apresentasse oligozoospermia grave e que realizaram a TE. Foram levadas em consideração a taxa de implantação e taxa de gestação clínica em andamento. Métodos

50 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

51 Características gerais das pacientes e dos ciclos de ICSI Em relação à etiologia da infertilidade, a maioria dos casais apresentava fator masculino (45,4%), seguido por infertilidade sem causa aparente (ISCA) (22,0%), fatores femininos (18,2%), fatores masculino e feminino associados (12,9%), e outros (1,5%). Entre os fatores femininos havia endometriose (41,5%), fator ovariano (34,1%) e fator tubário (24,4%). Entre os fatores masculinos, havia azoospermia (27,4%), oligozoospermia grave (28,8%), e oligozoospermia associada ou não à astenozoospermia e teratozoospermia (43,8%). Oitenta e sete casais (65,9%) estavam realizando o primeiro ciclo de ICSI, 23 estavam realizando o segundo ciclo (17,4%) e o restante (n=22, 16,7%) estava realizando o terceiro ou mais ciclos de ICSI, resultando em uma média de 1,6 ciclos por casal. A Tabela 1 mostra as características gerais das pacientes, assim como os resultados referentes à resposta ao EOC, resultados laboratoriais e clínicos dos ciclos de ICSI. Resultados e Discussão

52 39 Tabela 1. Características gerais das pacientes, e resultados laboratoriais e clínicos dos ciclos de ICSI. Características gerais (n=132) Idade da mulher (anos) média ± EPM (intervalo) 33,31 ± 0,41 (22 43) IMC (Kg/m 2 ) média ± EPM (intervalo) 23,64 ± 0,31 (17,2 32,9) Dose total de FSH r administrada (UI) média ± EPM (intervalo) 2328,3 ± 59,2 ( ) Resposta ao EOC (n=132) Nº total de folículos no dia do hcg média ± EPM (intervalo) 18,98 ± 0,89 (3,0 58,0) Nº de folículos 10 mm no dia do hcg média ± EPM (intervalo) 15,78 ± 0,83 (3,0 49,0) Diâmetro dos folículos 10 mm no dia do hcg média ± EPM (intervalo) 15,69 ± 0,11 (12,0 19,0) Nº oócitos recuperados média ± EPM (intervalo) 13,79 ± 0,77 (2,0 58,0) Taxa de oócitos maduros (MII) (%) 72,71% Taxa de oócitos de boa qualidade (%) 21,16% Resultados laboratoriais (n=96) Taxa de fertilização normal 2PN (%) 69,41% Nº de embriões obtidos no dia da TE média ± EPM (intervalo) 6,58 ± 0,38 (1,0 23,0) Taxa de embriões de boa qualidade no dia da TE (%) 59,79% Taxa de desenvolvimento embrionário (%) 95,96% Nº de embriões transferidos por paciente média ± EPM (intervalo) 2,69 ± 0,08 (1,0 4,0) Taxa de bons embriões transferidos (%) 76,49% Resultados clínicos (n=90) Taxa de implantação (%) 18,97% Taxa de gestação bioquímica (%) 35,71% Taxa de gestação clínica em andamento (%) 27,78% Taxa de aborto (%) 22,22% EPM: Erro padrão da média, TE: transferência embrionária 5.2 Caracterização das amostras incluídas no estudo Quanto à citocinas, a IL 8 e IL 6 foram mensuráveis em todas as amostras de FF e na maioria das amostras de soro (99,2% e 59,1%, respectivamente). Entretanto, uma grande proporção das amostras tanto de soro e quanto de FF apresentavam se indetectáveis para as citocinas IL 1β, IL 10, TNF e IL 12p70. A proporção de amostras detectáveis no soro foi de 10,1% para IL 1β, 10,6% para IL 10, 7,6% para TNF e 6,8% para IL 12p70; e no FF foi de 6,8% de para IL 1β, 28,8% Resultados e Discussão

53 40 para IL 10, 8,3% para TNF e 3,8% para IL 12p70. Dessa forma, para fins de análise, os resultados referentes a IL 1β, IL 10, TNF e IL 12p70 foram categorizadas e as amostras de FF ou soro foram consideradas positivas ou negativas (pos/neg). Para IL 8 e IL 6 foram utilizados as concentrações mensuradas. Vale ressaltar ainda que todas as amostras de soro foram indetectáveis para LIF, e portanto, este resultado não foi considerado na análise dos dados. Nas amostras de FF, a mensuração dos esteróides estradiol e progesterona foram superiores aos limites de detecção do ensaio, mesmo após diluição das amostras 100 vezes. Dessa forma, tais dosagens também não foram consideradas na análise dos resultados deste estudo. Para validar os resultados e se evitar vieses, algumas comparações entre subgrupos de pacientes incluídas no estudo foram realizadas. Os resultados das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que tiveram o FF proveniente do maior folículo coletado isoladamente (FF isolado) foram comparados com as dosagens das amostras das pacientes em que o FF era proveniente do pool de dois a quatro folículos de maiores diâmetros (FF pool) (Figura 2). Observamos maiores níveis de LIF e VEGF nas amostras de FF coletadas isoladamente, e maiores níveis de inibina B nas amostras coletadas a partir de um pool de dois a quatro folículos. Resultados e Discussão

54 41 IL p=0,239 IL p=0,934 LIF 50 p=0,050 (pg/g de proteína) FF-isolado 4078 ± n=106 FF-pool 3441 ± n=26 pg/g de proteína FF-isolado ± n=106 FF-pool ± n=26 ng/g de proteína FF-isolado ± n= ± n=26 FF-pool FSH INIBINA-b AMH 300 p=0, p=0, p=0,075 mui/g de proteína ± n= ± n=25 ng/g de proteína ± n= ± n=25 ng/g de proteína ± n= ± n=25 0 FF-isolado FF-pool 0 FF-isolado FF-pool 0 FF-isolado FF-pool VEGF ng/g de proteína p=0, ± n= ± n=26 0 FF-isolado FF-pool Figura 2: Comparação das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que tiveram o FF proveniente do maior folículo coletado isoladamente (FF isolado) e FF proveniente do pool de dois a quatro folículos de maiores diâmetros (FF pool). Os grupos foram comparados por teste t de Student e estão representados os valores de média, erro padrão da média e número de amostras avaliadas em cada subgrupo. Entre as 132 pacientes incluídas no estudo, algumas características foram observadas: 11 pacientes haviam realizado um ciclo de tratamento anterior em período inferior a 60 dias; 14 pacientes utilizaram espermatozóides não ejaculados para ICSI; uma paciente utilizou espermatozóides não ejaculados para ICSI e também havia realizado um ciclo de tratamento anterior em período inferior a 60 dias; 16 pacientes utilizaram espermatozóides provenientes de amostras de sêmen apresentando oligozoospermia grave (<5 x 10 6 espermatozóides/ml); 5 pacientes utilizaram espermatozóides provenientes de amostras de sêmen apresentando oligozoospermia grave (<5 x 10 6 Resultados e Discussão

55 42 espermatozóides/ml) e também haviam realizado um ciclo de tratamento anterior em período inferior a 60 dias. Dessa forma, os resultados das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que haviam realizado um ciclo de ICSI anterior em período menor que 60 dias foram comparando as aquelas que estavam realizando o 1º ciclo ou com ciclo anterior com mais de 60 dias de intervalo. Não houve diferença estatisticamente significante nas comparações dos níveis de citocinas, VEGF e FSH; já os níveis de inibina β e AMH eram mais elevados nas amostras de FF das pacientes que estavam realizando o 1º ciclo de ICSI ou com ciclo anterior em período maior que 60 dias (Figura 3). Entretanto, baseados nos níveis médios destes fatores e do pequeno número de pacientes que haviam realizado um ciclo anterior em intervalo menor que 60 dias, foi considerado que estas diferenças não eram clinicamente significantes. IL p=0,579 IL p=0,654 LIF 50 p=0,705 (pg/g de proteína) ± n= ± n=17 pg/g de proteína ± n= ± n=17 ng/g de proteína ± n= ± n=1 7 0 ciclo 1º/>60 dias ciclo < 60 dias 0 ciclo 1 º/>6 0 dias ciclo <60 dias 0 ciclo 1º/> 60 dias cic lo <60 dias FSH INIBINA-b AMH 300 p=0, p=0, p=0,054 mui/g de proteína ± n= ± n=17 ng/g de proteína ± n= ± n=17 ng/g de proteína ± n= ± n=17 0 ciclo 1º/>60 dias ciclo <60 dias 0 ciclo 1º/>60 dias c iclo <6 0 dias 0 ciclo 1º/> 60 dias ciclo <60 dias VEGF 100 p=0,320 ng/g de proteína ± n= ± n=17 0 ciclo 1 º/>60 dias cic lo < 60 dia s Figura 3: Comparação das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que estavam realizando o primeiro ciclos de ICSI ou tinham ciclo anterior em intervalo maior que 60 dias (ciclo 1º/>60 dias), e de pacientes que haviam realizado um ciclo de ICSI anterior em período inferior 60 dias (ciclo <60 dias) Resultados e Discussão

56 43 As amostras das 15 pacientes para as quais espermatozóides não ejaculados foram utilizados para a ICSI e das 21 pacientes que utilizaram espermatozóides ejaculados cujo sêmen apresentava oligozoospermia grave, foram consideradas apenas nas análises referentes à resposta ao EOC, mas não nas análises quanto aos resultados laboratoriais e clínicos, as quais sofrem a influência da origem e qualidade do espermatozóide utilizado para a ICSI (Tesarik 2005). Em relação ao protocolo de bloqueio hipofisário, os fatores mensurados no FF das pacientes que utilizaram agonista do GnRH foram comparados com aquelas que utilizaram antagonista do GnRH. Apenas os níveis de IL 8 foram superiores nas pacientes que receberam antagonista do GnRH, e as amostras foram avaliadas como um todo (Figura 4). IL p=0,007 IL p=0,200 LIF 50 p=0,998 (pg/g de proteína) ± n= ± n=53 pg/g de proteína ± n= ± n=53 ng/g de proteína ± n= ± n=53 0 Agonista do GnR H Antagonista do GnRH 0 Agonista do GnRH Antagonista do GnRH 0 Agonista do GnRH Antagonista do GnRH FSH INIBINA-b AMH 300 p=0, p=0, p=0,250 mui/g de proteína ± n= ± n=53 ng/g de proteína ± n= ± n=53 ng/g de proteína ± n= ± n=53 0 Agonista do GnRH Antagonista do GnRH 0 Agonista do GnRH Antagonista do GnRH 0 Agonista do GnRH Antagonista do GnRH VEGF 100 p=0, ng/g de pr ote ína ± n= ± n=53 0 Agonis ta do GnRH Antagonista do GnR H Figura 4: Comparação das dosagens dos fatores presentes do FF das pacientes que receberam protocolos de bloqueio hipofisário com agonista do GnRH, ou antagonista do GnRH. Resultados e Discussão

57 44 Para a avaliação dos resultados clínicos deste estudo, foram consideradas apenas as pacientes que tiveram transferência embrionária (TE). Seis pacientes não realizaram TE: três por não terem embriões de boa qualidade disponíveis para transferência, e três por terem apresentado síndrome do hiperestímulo ovariano e todos os embriões foram criopreservados. A Figura 5 mostra um organograma de análise dos resultados de acordo com as fases do tratamento e perfis das pacientes. 1ª fase da análise dos resultados Resposta ao estímulo ovariano controlado, maturidade e qualidade oocitária 2ª fase da análise dos resultados Resultados laboratoriais: fertilização, desenvolvimento embrionário e qualidade embrionária 3ª fase da análise dos resultados Resultados clínicos: implantação e gestação em andamento 132 ciclos 96 ciclos 36 pacientes excluídas (ICSI com espermatozóide não ejaculado ou oligozoospermia grave) 90 ciclos 6 pacientes excluídas (sem transferência embrionária) Figura 5: Organograma da análise dos resultados de acordo com as fases do tratamento e perfis das pacientes Resultados e Discussão

58 Correlação entre citocinas, VEGF, e hormônios em amostras de FF e soro A Tabela 2 mostra os resultados das mensurações realizadas no soro e FF, assim como a análise de correlação entre elas. Todos os valores foram ajustados para concentração de proteína (grama de proteína) na respectiva amostra. A análise de correlação de Pearson mostrou uma relação positiva entre as dosagens no soro e FF para FSH e AMH (Figura 6). A presença de IL 1β no soro e no FF também apresentou correlação positiva (r=0,213; p=0,014). Tabela 2. Correlação entre as concentrações dos fatores mensurados no soro e Fluido Folicular. SORO média ± EPM FLUIDO FOLICULAR média ± EPM IL 8 (pg/g de proteina) 507 ± ± 215 0,754 IL 6 (pg/ g de proteina) 30,01 ± 3, ,8 ± 28,7 0,636 VEGF (pg/ g de proteina) 1,10 ± 0,07 25,69 ± 1,30 0,891 LIF (pg/ g de proteina) 13,98 ± 0,78 FSH (mui/ g de proteina) 95,02 ± 3,80 102,2 ± 4,52 <0,0001 E2 (pg/ g de proteina) 26,12 ± 1,82 P4 (ng/ g de proteina) 1411 ± 943 INIBINA B (pg/ g de proteina) 5,08 ± 0,64 168,59 ± 4,98 0,614 AMH (ng/ g de proteina) 16,62 ± 1,40 43,16 ± 2,84 0,002 EPM: Erro padrão da média p FSH-FF (mui/g de proteína) Pearson r: 0,8519, p<0, FSH-Soro (mui/g de proteína) AMH-FF (ng/g de proteína) Pearson r: 0,2765, p=0, AMH-Soro (ng/g de proteína) Figura 6: Análise de correlação entre as concentrações séricas e intrafoliculares para o FSH e AMH. Resultados e Discussão

59 46 Em seguida os fatores presentes no FF ajustados para concentração de proteína na amostra foram correlacionados entre si (Tabela 3). Pudemos observar que no FF a IL 8 está correlacionada com a maioria dos outros fatores avaliados. Resultados e Discussão

60 Tabela 3. Inter relação entre os fatores presentes no Fluido Folicular IL 8 (pg/g proteína) IL 6 (pg/ g proteína) IL 1β (pos/neg) IL 10 (pos/neg) TNF (pos/neg) IL 6 (pg/ g proteína) r p 0,177 0,043 IL 1β (pos/neg) r p 0,259 0,003 0,254 0,003 IL 10 (pos/neg) r p 0,153 0,080 0,365 <0,001 0,094 0,286 TNF (pos/neg) r p 0, 133 0,130 0, 191 0,028 0,136 0,120 0,293 0,001 IL 12p70 (pos/neg) r p 0,009 0,917 0,052 0,550 0,054 0,541 0,137 0,118 0,371 <0,001 LIF (pg/ g proteína) r p 0,252 0,004 0,058 0,510 0,045 0,607 0,155 0,076 0, 136 0,121 VEGF (pg/ g r 0,302 0,105 0,034 0,041 0,045 proteína) p <0,001 0,230 0,695 0,641 0,612 FSH (mui/ g r 0,367 0,047 0,000 0,120 0,019 proteína) p <0,001 0,597 0,999 0,173 0,831 Inibina B (pg/g r 0,243 0,019 0,091 0,220 0,062 proteína) p 0,005 0,829 0,303 0,011 0,480 AMH (ng/ g r 0,318 0,239 0,189 0,062 0,164 proteína) p <0,001 0,006 0,032 0,484 0,063 Legenda: pos/neg: positivo/negativo; r=r de Pearson; p=valor de p (teste de correlação de Pearson) IL 12p70 (pos/neg) 0,057 0,517 0,061 0,489 0,024 0,784 0,077 0,382 0,116 0,189 LIF (pg/ g proteína) 0,638 <0,001 0,042 0,630 0,077 0,382 0,020 0,825 VEGF (pg/ g proteína) 0,069 0,435 0,135 0,126 0,071 0,422 FSH (mui/ g proteína) 0,345 <0,001 0,287 0,001 Inibina B (pg/ g proteína) 0,448 <0,001

61 Os fatores mensurados no soro, nos seus valores brutos, ou seja, não ajustados para concentração de proteínas na amostra, estão representados na Figura pg/ml IL ± pg/ml IL-6 2,004 ± 0,2139 mui/ml FSH 6,566 ± pg/ml Inibina-b 336,8 ± 34,31 pg/ml Estradiol ng/ml 1574,0 ± 91, Progesterona 23,70 ± 0, ng /ml AMH 1,134 ± 0,095 pg /ml VEGF 75,90 ± 4,980 Figura 7: Gráficos representativos nos níveis séricos de citocinas, hormônios e VEGF. Os valores numéricos apresentados correspondem a média ± erro padrão da média. A análise de correlação entre os fatores séricos mostrou que o FHS, Inibina B, AMH, E2 e P4 estão todos correlacionados positivamente entre si (Tabela 4).

62 Tabela 4. Inter relação entre os fatores presentes no soro IL 8 (pg/ml) IL 6 (pg/ml) IL 1β (pos/ neg) IL 10 (pos/ neg) TNF (pos/ neg) IL 12p70 (pos/ neg) IL 6 (pg/ml) r p 0,335 <0,001 IL 1β (pos/neg) r p 0,118 0,177 0,090 0,307 IL 10 (pos/neg) r p 0,036 0,680 0,460 <0,001 0,298 0,001 TNF (pos/neg) r p 0,088 0,315 0,014 0,875 0,730 <0,001 0,126 0,150 IL 12p70 r 0,026 0,203 0,371 0,619 (pos/neg) p 0,765 0,020 <0,001 <0,001 0,219 0,011 VEGF (pg/ml) r p 0,034 0,703 0,090 0,306 0,098 0,264 0,108 0,219 0,025 0,774 0,015 0,868 FSH r 0,009 0,15 0,115 0,107 (mui/ml) p 0,925 0,094 0,201 0,234 0,04 0,659 0,076 0,397 E2 (pg/ml) r 0,132 0,281 0,061 0,167 0,039 p 0,136 0,001 0,494 0,059 0,657 0,016 0,857 P4 (ng/ml) r 0,114 0,442 0,076 0,193 0,033 p 0,196 <0,001 0,392 0,028 0,709 0,098 0,266 Inibina B r 0,158 0,530 0,037 0,346 (pg/ml) p 0,075 <0,001 0,679 <0,001 0,036 0,685 0,087 0,330 AMH r 0,004 0,072 0,079 0,018 0,088 0,325 (ng/ml) p 0,966 0,418 0,378 0,843 0,108 0,223 Legenda: pos/neg: positivo/negativo; r=r de Pearson; p=valor de p (teste de correlação de Pearson) VEGF (pg/ml) 0,033 0,714 0,009 0,922 0,007 0,937 0,074 0,404 0,024 0,785 FSH (mui/ ml) 0,427 <0,001 0,261 0,003 0,262 0,003 0,249 0,005 E2 (pg/ml) 0,498 <0,001 0,617 <0,001 0,339 <0,001 P4 (ng/ml) 0,610 <0,001 0,262 0,003 Inibina B (pg/ml) 0,419 <0,001

63 5.4 Bonetti TCS, Salomao R, Brunialti M, Braga DPAF, Borges Jr. E, Silva IDCG. Cytokine and hormonal profile in serum samples of patients undergoing controlled ovarian stimulation: interleukin 1β predicts ongoing pregnancy. Human Reproduction, Vol.25, No.8 pp , 2010

64 Conclusões 51

65 Conclusões 52

66 Conclusões 53

67 Conclusões 54

68 Conclusões 55

69 Bonetti TCS, Klaine JP, Salomao R, Brunialti M, Braga DPAF, Borges Jr. E, Silva IDCG. The intrafollicular interleukin 12 is associated with pituitary blockage protocols and predicts fertilization failure of corresponding oocyte. Human Reproduction. Under review. Conclusões

70 Conclusões 57