MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL

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1 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL CAMPUS BENTO GONÇALVES DETERMINAÇÃO DE OCRATOXINA A EM UVAS E VINHOS DA VARIEDADE PINOT NOIR EM DIFERENTES ÉPOCAS DE COLHEITA SANDI MARINA CORSO Professora Orientadora: Simone Bertazzo Rossato Bento Gonçalves, março de 2012.

2 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE EDUCAÇÃO PROFISSIONAL E TECNOLÓGICA INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO RIO GRANDE DO SUL CAMPUS BENTO GONÇALVES DETERMINAÇÃO DE OCRATOXINA A EM UVAS E VINHOS DA VARIEDADE PINOT NOIR EM DIFERENTES ÉPOCAS DE COLHEITA SANDI MARINA CORSO Trabalho de Conclusão do Curso Superior de Tecnologia em Viticultura e Enologia, apresentado como pré-requisito para a obtenção do título de Tecnólogo em Viticultura e Enologia. Professora Orientadora: Dra. Simone Bertazzo Rossato Supervisor Técnico: Juliano Perin Bento Gonçalves, março de

3 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais, Jairo e Janete por todo amor, carinho, apoio, confiança e amizade. Pelos princípios de vida, pelos exemplos éticos e morais, pelo tempo que me dedicaram e pelas oportunidades de estudo que me proporcionaram. Ao meu namorado, André, pela amizade, carinho e amor. AMO VOCÊS! 3

4 EPÍGRAFE "É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar; é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver..." Martin Luther King 4

5 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus, o centro da minha vida, por ter me sustentado em Suas mãos para que eu não tropeçasse em meio às adversidades e provações. Aos meus pais Jairo e Janete que me ensinaram desde criança: Para ser grande é preciso ser perseverante e forte. É com grande alegria e gratidão que dedico esta minha vitória a vocês, pessoas que me possibilitaram todo suporte seja ele emocional ou financeiro, no decorrer de minha vida. Por muitas vezes terem deixado de lado seus sonhos para acreditar nos meus. Se venço hoje, é graças também a vocês. Tentarei sempre ser motivo de orgulho para vocês assim como vocês são para mim. Os amo e essa conquista é nossa! Obrigada pela confiança e pelo amor em mim depositados. As minhas queridas irmãs, Cyndel e Emanuele, que mesmo distantes se fizeram presentes em todos os momentos, a lembrança afetuosa de vocês e o abraço amoroso a cada reencontro ajudaram-me a chegar até aqui. Amo-as. Aos casais Pompeu e Jussara, Larri e Vera por terem sido meus segundos pais, por terem me aceitado de braços abertos; pelo carinho e confiança em mim depositados e pelo apoio e incentivo ao longo desta jornada. Muito obrigada! Ao meu melhor amigo, colega e namorado André por toda caminhada que fizemos juntos até o dia de hoje, e pelas próximas que virão, pelas caronas até em casa depois das aulas, pelas longas tardes e noites de estudo e não de namoro, por me fazer acreditar dia após dia que é possível, por me incentivar a seguir meus sonhos, por ter me aturado nos momentos de estresse, e por tornar minha vida cada dia mais feliz. TE AMO! Ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia, por tornar possível minha formação. Aos excelentes professores do curso, por toda dedicação, apoio, conhecimentos repartidos e por tornarem ainda mais apaixonante o mundo dos vinhos. 5

6 A professora Simone Bertazzo Rossato, exemplo de profissional, pela colaboração, oportunidade, incentivo e por todos os ensinamentos a mim passados. Á empresa Moët Hennessy do Brasil Chandon de Garibaldi, em especial ao Enólogo Juliano, Enólogo Leonardo, Agrônomo Márcio e Engenheiro Leandro por possibilitarem a vivência com o meio técnico da vitivinicultura e qualidade e por ceder o espaço e matéria-prima para a realização da parte experimental do trabalho. Obrigada pela amizade, paciência, ensinamentos, carinho e incentivo em todos os momentos. Aos colegas da turma Viti/Eno 2008 I e amigos que conquistei durante o curso, em especial ás colegas de apartamento, por terem-me aturado durante todo este tempo, pelos momentos de dificuldade e principalmente pelos de alegria, festas e parceria que passamos juntos, meu sincero agradecimento. A todos que tenham contribuído de alguma forma para a realização deste trabalho e para minha formação. MUITO OBRIGADA! 6

7 ÍNDICE DE TABELAS TABELA 01 - Produção de uvas no Brasil (em toneladas) IBGE TABELA 02 - Produção de vinhos, sucos e derivados no Rio Grande do sul, em litros /2010 (UVIBRA E IBRAVIN) TABELA 03 - Comercialização de vinhos e suco de uva provenientes do Rio Grande do Sul e litros 2007/2010 (UVIBRA E IBRAVIN) TABELA 04 - Ocorrência de Ocratoxina A em vinhos (SHUNDO et al., 2008) TABELA 05 - Países que possuem regulamentação para OTA em produtos de Uva ou em outros alimentos (FAO) TABELA 06 - Análises realizadas nos mostos para vinificação em branco e tinto, da variedade Pinot Noir nas três etapas de colheita TABELA 07 - Composição físico-química dos vinhos da variedade Pinot Noir em relação á diferentes etapas de colheita, da localidade de São Roque, Garibaldi, na safra de

8 ÍNDICE DE FIGURAS FIGURA 01 - Regiões produtoras de vinho do Brasil (Site do vinho brasileiro) FIGURA 02 - Evolução da produção de vinhos e derivados no Rio Grande do Sul (IBRAVIN) FIGURA 03 - Dados mensais de horas de frio (T<7,2 C) de abril/2010 a setembro/2010 e decendiais de temperatura de setembro/2010 a março/2010 (EMBRAPA UVA E VINHO) FIGURA 04 - Dados mensais de chuva, insolação e dias com chuva e resultados decendiais do balanço hídrico de cultivo, calculado para Bento Gonçalves (EMBRAPA UVA E VINHO) FIGURA 05 - Quociente Heliopluviométrico de Maturação (QM) da safra 2010/2011 e QM calculado com os dados normais ( ) de chuva e insolação em Bento Gonçalves na Serra Gaúcha (EMBRAPA UVA E VINHO) FIGURA 06 - Estrutura química da Ocratoxina A FIGURA 07 - Metabólitos formados pela OTA e detectados in vivo em diferentes espécies (RINGOT et al ) FIGURA 08 - Metodologia empregada para realização do estudo FIGURA 09 - Esquema fluxograma das operações utilizadas para a elaboração dos vinhos brancos da variedade Pinot Noir do Distrito de São Roque na safra de FIGURA 10 - Esquema fluxograma das operações utilizadas na elaboração dos vinhos tintos da variedade Pinot Noir do Distrito de São Roque na safra de FIGURA 11 - Percentual de uvas danificadas e sãs da variedade Pinot Noir na localidade de São Roque Garibaldi na safra de FIGURA 12 - Relação entre a precipitação pluviométrica e níveis de danificações/podridões na variedade de uva Pinot Noir na safra de 2011 no Distrito de São Roque Garibaldi

9 FIGURA 13 - Relação entre álcool provável e acidez total do mosto utilizado para vinificação em branco e tinto respectivamente, em diferentes etapas de colheita das uvas da variedade Pinot Noir da localidade de São Roque na safra de FIGURA 14 - Relação entre a sanidade das uvas e álcool potencial em uvas utilizadas para vinificação em branco e vinificação em tinto respectivamente

10 LISTA DE ANEXOS ANEXO 01 Resolução RDC Nº 7, de 18 de fevereiro de 2011, ANVISA - limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos ANEXO 02 Metodologia análise Ocratoxina A HPLC (OIV)

11 ÍNDICE DE SIGLAS AW: Atividade de Água FAO: Food and Agriculture Organization (Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura). HF: Horas de Frio IARC: International Agency for research on câncer (Agência Internacional de pesquisa do câncer). IBRAVIN: Instituto Brasileiro do Vinho LMT: Limites Máximos Toleráveis MAPA: Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento OIV: Organização Internacional da Vinha e do Vinho OTA: Ocratoxina A PEP: Prêmio de Escoamento de Produção QM: Quociente Heliopluviométrico de Maturação SO 2 : Dióxido de enxofre UVIBRA: União Brasileira de Vitivinicultura 11

12 SUMÁRIO DEDICATÓRIA... 3 EPÍGRAFE... 4 AGRADECIMENTOS... 5 ÍNDICE DE TABELAS... 7 ÍNDICE DE FIGURAS... 8 LISTA DE ANEXOS ÍNDICE DE SIGLAS RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Uvas e Vinhos Produção de vinho no Brasil Serra Gaúcha Condições Meteorológicas e sua influência na vindima de 2011 no Rio Grande do Sul Pinot Noir Ocratoxina A (OTA) Origem Fungos produtores de Ocratoxina A Estrutura química e propriedades físico-químicas da Ocratoxina A Aspectos toxicológicos da Ocratoxina A Ocratoxina A em uvas e vinhos Ocorrência de Ocratoxina A em vinhos brasileiros Maturação e sanidade das uvas e qualidade do vinho Variação dos níveis de OTA durante vinificação Legislação relativa à Ocratoxina A MATERIAIS E MÉTODOS Amostragem Métodos Vinificação em branco para a variedade Pinot Noir Vinificação em tinto para a variedade Pinot Noir

13 3.3. Análises Análise de Ocratoxina A Análises físico-químicas Análise estatística descritiva RESULTADOS E DISCUSSÕES Sanidade das uvas nas diferentes etapas de colheita Composição dos mostos Parâmetros físico-químicos dos vinhos Nível de Ocratoxina A nos mostos e vinhos CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS

14 RESUMO A Ocratoxina A é uma micotoxina nefrotóxica e possivelmente carcinogênica para humanos. A ocorrência de Ocratoxina A em uvas e posteriormente em mostos e vinhos, deve-se principalmente ás condições fitossanitárias das uvas, mas fatores como: A variedade de uva, grau de maturação, danos físicos do grão, práticas de viticultura e condições climáticas também exercem influência sobre sua ocorrência. Este estudo teve como objetivo determinar a relação entre as condições fitossanitárias da uva com o teor de Ocratoxina A de uvas e vinhos da variedade Pinot Noir na safra de As uvas foram coletadas em um intervalo de oito dias a partir da data de colheita estabelecida (dia 0) até o 16º dia. A escolha das plantas foi realizada de forma aleatória e o volume coletado em cada amostragem foi de aproximadamente 60 kg de uva, destinando 30 kg destas uvas para uma microvinificação em branco e 30 kg para microvinificação em tinto. Tanto as amostras das uvas como dos vinhos não apresentaram limites detectáveis de Ocratoxina A, mesmo sendo utilizadas uvas de diferentes estados de sanidade. Em relação ás análises físico-químicas, todos os resultados encontram-se dentro dos limites estabelecidos pela Legislação para a produção de vinhos ideais para consumo. Palavras chave: Ocratoxina A, uvas, vinhos, condições fitossanitárias. 14

15 ABSTRACT The ochratoxin A is a mycotoxin nephrotoxic and possibly carcinogenic to humans. The occurrence of ochratoxin A in grapes and subsequently in musts and wines is mainly due to the conditions of the grape plant health, but factors such as: grape variety, degree of maturation, physical damage of the grain, viticulture practices and climatic conditions also play influence its occurrence. This study aimed to determine the relationship between the phytosanitary conditions of the grape with the OTA content of grapes and wines of the Pinot Noir harvest in The grapes were collected at an interval of eight days from the date of collection established (day 0) to day 16. The choice of plants were randomly collected and the volume in each sample was approximately 60 kg of grapes, allocating 30 kg for a microvinification these grapes white and 30 kg for microvinification in red. Both samples of grapes and the wines did not show detectable limits for Ochratoxin A, even being used grapes from different states of health. Where such physical-chemical analyzes, all results are within the limits established by law for the production of wines ideal for drinking Keywords: Ochratoxin A, grapes, wine, phytosanitary conditions. 15

16 1. INTRODUÇÃO Cada vez mais o vinho tem sido reconhecido por possuir propriedades que proporcionam benefícios para a saúde humana. Devido a estes benefícios, recomenda-se um consumo regular e moderado como um hábito saudável. Entretanto, toda esta atenção voltada ao vinho e o atual incentivo para seu consumo é motivo de preocupação, pois, nos vinhos também tem sido encontradas algumas substâncias que promovem efeitos tóxicos à saúde humana, como por exemplo, o etilcarbamato, as histaminas (aminas biogênicas) e mais recentemente micotoxinas como a ocratoxina A (OTA). A Ocratoxina A além de ser encontrada no vinho e no suco de uva também está presente em outros grupos de alimentos como cereais e oleaginosas que são sua maior fonte de contaminação. A ocorrência desta micotoxina nas uvas e posteriormente nos mostos e nos vinhos, deve-se principalmente às condições fitossanitárias das uvas, uma vez que a Ocratoxina A é produzida por espécies de fungos do gênero Penicillium e Aspergillus, e estes se desenvolvem na uva quando se constata algum rompimento da sua película e durante a maturação. As uvas das variedades Vitis Vinífera, por serem mais sensíveis à podridão e ao ataque fúngico, são as que possuem maior probabilidade de contaminações por fungos produtores de Ocratoxina A. Dessa forma as instituições de controle da segurança alimentar têm demonstrado grande interesse em pesquisas relacionadas à micotoxinas e suas concentrações em alimentos e bebidas. No caso específico do vinho, a OIV (Organização Internacional da Vinha e do Vinho) estabeleceu em 2 µg.l -1 os níveis máximos aceitáveis de Ocratoxina A em vinhos e derivados da uva e do vinho, sendo estes utilizados em muitos países como critério de controle para exportação. No Brasil, foi aprovado recentemente um Regulamento Técnico (Anexo 01) sobre os Limites Máximos Tolerados (LMT) para -1 de micotoxinas em alimentos e bebidas, onde fica estabelecido o máximo de 2 µg.l OTA para uvas, vinhos e derivados da uva e do vinho, mesmo valor adotado pela OIV. 16

17 Devido aos fatores citados anteriormente, os estudos relacionados com as condições da matéria-prima e as possíveis consequências no produto final, torna-se uma ferramenta de grande valia para o setor da uva e do vinho brasileiro. Diante disto, considera-se de extrema importância, a nível industrial, ter um parâmetro de sanidade da uva através do estudo dos níveis de OTA no produto final. Este estudo ainda ganha importância uma vez que o vinho tem sido alvo de estudos devido aos seus benefícios, o que tem elevado seu consumo. Isto pode estar contribuindo para uma maior ingestão de substâncias tóxicas ao organismo humano. Este trabalho teve como objetivo geral, avaliar a presença de Ocratoxina A em uvas e vinhos da variedade Pinot Noir da safra de 2011, e como objetivos específicos, determinar a relação entre a sanidade da uva e os teores de Ocratoxina A encontrados tanto nas uvas quanto nos vinhos; analisar os valores de OTA em uvas e vinhos da variedade Pinot Noir, com uvas de diferentes estados de sanidade, vinificadas em branco, oriundas do Distrito de São Roque, município de Garibaldi, RS, na safra de 2011 e analisar os valores de OTA em uvas e vinhos da variedade Pinot Noir, com uvas de diferentes estados de sanidade, vinificadas em tinto, oriundas do Distrito de São Roque, município de Garibaldi, RS, na safra de

18 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Uvas e Vinhos Produção de vinho no Brasil A produção de vinhos brasileiros está dividida em nove áreas que se encontram divididas em zonas de clima temperado, subtropical e tropical (Figura 01). As áreas que mais se destacam são a região da Fronteira, Serra do Sudeste, Serra Gaúcha, Campos de Cima da Serra e regiões Central e Norte do Estado do Rio Grande do Sul, todas de clima temperado (IBRAVIN, 2009; E-VINHO, 2009). As regiões de cultivo de Santa Catarina, ainda áreas de clima temperado, são as do Vale do Rio do Peixe, Planalto Serrano, Planalto Norte e Carbonífera. A região Norte do Paraná é tipicamente subtropical e o Noroeste do Estado de São Paulo, Norte do Estado de Minas Gerais e Vale do Sub-Médio São Francisco (Pernambuco e Bahia), caracterizam-se como zonas tropicais. O estado de São Paulo na região Sudeste e a região Sul do Estado de Minas Gerais também são conhecidamente produtores. Além das áreas mencionadas, outros pólos vitivinícolas continuam a surgir pelo Brasil (IBRAVIN, 2010). 18

19 FIGURA 1 - Regiões produtoras de vinho do Brasil. FONTE: Sitedovinhobrasileiro A região Sul do Brasil é responsável pela maior parte da produção de uvas, vinhos e sucos do país (Tabela 01). Na safra de 2010, fatores climáticos desfavoráveis, especialmente nas áreas de produção de uvas para vinhos, resultaram em menor produção (EMBRAPA, 2011). A tabela 02 apresenta a produção de vinhos, sucos e derivados do Rio Grande do Sul, verificando-se redução de 4,49%, em 2010 (EMBRAPA, 2011). 19

20 TABELA 01 Produção de uvas no Brasil (em toneladas) Estado/Ano Pernambuco Bahia Minas Gerais São Paulo Paraná Santa Catarina Rio Grande do Sul Brasil Fonte: IBGE TABELA 02 Produção de vinhos, sucos e derivados no Rio Grande do sul, em litros /2010. *Transformados em litros de suco simples Fonte: União Brasileira de Vitivinicultura UVIBRA, Instituto Brasileiro do Vinho IBRAVIN O Rio Grande do Sul apresentou redução na comercialização de suco e vinhos no ano de 2010, em relação ao ano anterior (Tabela 03). Os vinhos de mesa tiveram queda de 5,66%, enquanto os vinhos finos sofreram redução de 35,34%. Este elevado decréscimo na comercialização de vinhos finos pode ser atribuído ao fato de em 2009 terem sido criados mecanismos de redução de estoques, via PEP (Prêmio de Escoamento da Produção do Governo Federal) resultando num elevado crescimento naquele ano. Por ter sido um ano atípico para esta categoria de vinhos, o ano de 2009 não pode ser usado como referência para avaliação de mercado (EMBRAPA, 2011). Os vinhos espumantes, cujo mercado tem absorvido toda produção gaúcha, pelas características e elevada qualidade, em 2010 continuaram sua trajetória crescente. Os espumantes moscatéis obtiveram aumento de 17,84%, e os espumantes apresentaram crescimento de 10,97% nas vendas (EMBRAPA, 2011). 20

21 FIGURA 02 Evolução da produção de vinhos e derivados no Rio Grande do Sul Fonte: IBRAVIN TABELA 03 - Comercialização de vinhos e suco de uva provenientes do Rio Grande do Sul e litros 2007/2010*. *Tabela ajustada em 17/03/ Elaborado com uvas americanas e híbridas; 2 corte de vinho de mesa e vinho fino de mesa; 3 elaborado a partir de cultivares Vitis Vinifera; 4 valores convertidos em suco simples; 5 inclui litros do PEP. Fonte: UVIBRA e IBRAVIN 21

22 Serra Gaúcha A Serra Gaúcha está localizada no Nordeste do Estado do Rio Grande do Sul, cujas coordenadas geográficas e indicadores climáticos médios são: latitude 29ºS, longitude 51ºW, altitude m, precipitação pluviométrica de 1.700mm, temperatura 17,2ºC e umidade relativa do ar 76% (IBRAVIN, 2010). É a maior região vitícola do país com cerca de 40 mil hectares de vinhedos (IBRAVIN, 2010). Trata-se de uma viticultura de pequenas propriedades, pouco mecanizada devido à topografia acidentada (IBRAVIN, 2010). A poda é realizada em julho-agosto e a colheita concentra-se nos meses de janeiro a março (IBRAVIN, 2010). A densidade de plantio situa-se entre a plantas por hectare e predomina o sistema de condução em latada ou pérgola (horizontal), proporcionando produção de 10 a 30 toneladas /ha, de acordo com a cultivar e as condições climáticas da safra(ibravin, 2010). A maior parte da uva colhida é destinada à elaboração de vinhos, sucos e outros derivados (IBRAVIN, 2010) Condições Meteorológicas e sua influência na vindima de 2011 no Rio Grande do Sul. As condições meteorológicas exercem grande efeito no desenvolvimento e na produtividade do vinhedo, assim como na qualidade da produção. Essa influência ocorre em todos os estádios fenológicos da planta, desde o repouso vegetativo durante o inverno, passando pela brotação, floração, frutificação e crescimento das bagas ao longo da primavera/verão, maturação no verão, e até a queda das folhas no outono. As condições do tempo também são determinantes para a ocorrência de pragas e doenças e para a realização de práticas de manejo nos vinhedos como, por exemplo, raleio de frutos, adubação, irrigação, controle fitossanitário e colheita (MANDELLI et al., 2011). A obtenção de vinhos finos de boa qualidade depende de uvas adequadas, sendo que as cultivares de uva Vitis Vinifera são bastante sensíveis ao tempo e ao clima onde são cultivadas. Dessa forma, as condições do tempo ao longo do ciclo de produção tem grande influência sobre a qualidade da uva. 22

23 Para o estudo do tempo e do clima da safra de 2011, foram utilizados os dados meteorológicos da estação da Embrapa Uva e Vinho, em Bento Gonçalves (lat.: -29,1o; lon.: -51,5o; alt.: 640 m). Embora uma única estação não represente a totalidade da região, seus dados são um indicativo das condições no seu entorno que, devido a interações locais de altitude, declividade e relevo, podem resultar em microclimas distintos e induzir a resultados diferenciados em cada cultivar. Assim, os dados são utilizados para caracterizar o comportamento médio da videira e seus efeitos sobre a produtividade e qualidade da produção. Neste contexto, segue o resultado das condições meteorológicas ocorridas na safra de 2010/2011, sobre a produção de vinhos finos na Região da Serra Gaúcha. A soma de horas de frio foi menor que a normal de abril a junho, mas acumulou maior somatório em julho e agosto, totalizando 341 horas valor pouco abaixo do normal para a região (Figura 03). No aspecto geral, destaca-se que o inverno de 2010 apresentou um frio mais tardio, em relação à normal climática, o que não compromete a evolução da dormência, mas pode atrasar a data da brotação. Temperaturas mais frias que o normal ocorreram em outubro, com mínimas próximas a 5 C, o que chegou a provocar baixa uniformidade de brotação, prejudicando o desenvolvimento vegetativo inicial. É importante destacar que, ao contrário de anos anteriores, nesta safra não ocorreu danos por geadas tardias na Serra Gaúcha (MANDELLI et al., 2011). As condições do tempo na Serra Gaúcha se mantiveram muito favoráveis à qualidade da uva durante os primeiros meses do ciclo 2010/2011, pois outubro, novembro e dezembro apresentaram totais de chuva bem menores que o normal. Essas condições favoreceram o florescimento, fecundação e pegamento dos frutos. O tempo mais seco atenuou a ocorrência de doenças e facilitou a realização de práticas de manejo fitossanitário pelos agricultores. Alguns vinhedos em áreas de solos rasos chegaram a exibir sintomas de deficiência hídrica no início de janeiro (MANDELLI et al., 2011). A situação começou a mudar no último decêndio de janeiro (Figura 04). O primeiro mês de 2011 foi relativamente chuvoso na Serra Gaúcha, com 12 dias de chuva e um total 25% maior que a média normal para esse mês. Fevereiro foi o mês mais crítico, com 15 dias de chuva e um total 59% acima da média. Isso repercutiu no total de insolação desse mês, que totalizou apenas 160 horas, a menor do período analisado (Figura 04). Apesar do total de chuva em março ter sido ainda maior que em fevereiro 23

24 (109% acima da média), a chuva se concentrou no final do mês e não impactou no total de insolação. O balanço hídrico foi pequeno nos primeiros 20 dias de março, o que proporcionou condições mais favoráveis á maturação durante esse intervalo (MANDELLI et al., 2011). Como consequência das condições de chuva e insolação, o Quociente Heliopluviométrico de Maturação (QM), que indica a favorabilidade das condições de tempo para a qualidade da produção, se manteve em níveis elevados e acima da média, até 25 de janeiro (Figura 05). A partir dessa data, no entanto, começou a diminuir e se manteve abaixo da média para o período até o final da safra (MANDELLI et al., EMBRAPA UVA E VINHO). FIGURA 03: Dados mensais de horas de frio (T<7,2 C) de abril/2010 a setembro/2010 e decendiais de temperatura de setembro/2010 a março/2010. Fonte: Embrapa Uva e Vinho. Abreviações e legenda: Mínima abs: mínima absoluta; Máxima abs.: máxima absoluta; Média mín.: média das mínimas; Média máx.: média das máximas. As linhas pontilhadas representam as normais das temperaturas mínimas, máximas e médias. 24

25 FIGURA 04: Dados mensais de chuva, insolação e dias com chuva e resultados decendiais do balanço hídrico de cultivo, calculado para Bento Gonçalves. Fonte: Embrapa Uva e Vinho. Abreviações e legenda: D. chuva: dias do mês com chuva; ARM: armazenamento hídrico; DEF: deficiência hídrica; EXC: excedente hídrico. FIGURA 05: Quociente Heliopluviométrico de Maturação (QM) da safra 2010/2011 e QM calculado com os dados normais ( ) de chuva e insolação em Bento Gonçalves na Serra Gaúcha, Fonte: Embrapa Uva e Vinho e INMET. 25

26 2.2. Pinot Noir O Pinot Noir é originário da Borgonha, França. Possui película tinta e sabor neutro. Brota por volta de 22/08 a 01/09 e amadurece por volta de 10/01 a 20/01. Sua produtividade varia de 12 a 17 t/ha, com teor de açúcares de 15 a 17º Brix e acidez total 100 a 120 meq/l. É resistente á antracnose, sensível ao oídio, moderadamente sensível ao míldio e altamente sensível á podridões (o que influenciou na escolha desta variedade para o estudo em questão). Produz vinho tinto, varietal fino, deficiente em cor. Vinificado em branco utiliza-se na espumantização. Apesar do alto potencial de açúcares, dificilmente atinge a completa maturação nas condições climáticas do sul do Brasil, pois a uva frequentemente apodrece antes de estar com seu potencial desenvolvido. Seu melhor uso é na vinificação em branco visando à elaboração de espumante (GIOVANNINI, 2008) Ocratoxina A (OTA) A Ocratoxina A é uma micotoxina produzida por espécies de fungos filamentosos do gênero Aspergillus e Penicillium, que se desenvolvem nos alimentos, podendo assim originar sua presença nos mesmos Origem A ocratoxina A (OTA) foi descoberta como um metabólito de cultura de Aspergillus ochraceus, em 1965, na África por Van Der Merwe et al. (BENNETT & KLICH 2003), ao observar sua presença em amostras de milho. Mais tarde foi identificada como um metabólito secundário de várias outras cepas de Aspergillus e Penicillium (ROSA et al., 2002). Em 1969, foi relatada sua presença como contaminante em gêneros alimentícios, primeiramente em milho e cereais e depois em um grande número de produtos de origem animal e vegetal (TATEO et al., 2000). A detecção de OTA como contaminante em vinhos apareceu nos anos 80, com maior incidência nas regiões do Sul da Europa. 26

27 Zimmerli e Dick (1995) confirmaram sua presença em uvas e vinhos, e desde então, esta micotoxina tem sido considerada a mais relevante para a saúde em relação a uvas e vinhos Fungos produtores de Ocratoxina A A OTA é um metabólito secundário produzido por fungos filamentosos do gênero Penicillium e Aspergillus. O gênero Aspergillus adaptou-se bem a zonas tropicais e sub-tropicais de clima quente, enquanto fungos do gênero Penicillium se desenvolvem mais em áreas de clima frio, e podem ser encontrados ambientalmente nas zonas temperadas e frias, afastadas do equador (BRAGULAT et al, 2001; RINGOT, 2006). Segundo Battilani et al (2002), os principais fungos considerados causadores de contaminação dos vinhedos são o Penicillium verrucosum e o Aspergillus ochraceus (anteriormente conhecido como Aspergillus alutaceus). Posteriormente, foi evidenciada a capacidade de produção de OTA pelo A. carbonarius e A. niger, que estão amplamente difundidos nas zonas mais quentes da Europa, como Espanha, Itália e Portugal (MIDIO, 2000; BRAGULAT, 2001; RINGOT, 2006; ATOUI et al, 2007; OGA, 2008; VALERO, 2008; KAPETANAKOU et al, 2009). Em uma pesquisa executada por Clouvel et al (2008), no Sul da França, a contaminação por A. carbonarius nos vinhedos foi intensificada pela incidência de outro fungo, Botrytis (Botrytis cinérea) e por vetores como a mariposa da uva (Lobesia botrana). Neste caso o dano causado na superfície das bagas propiciou um aumento significativo de OTA em relação às amostras pouco afetadas pelos insetos e pelo Botrytis. Leong et al (2006) estudaram a relação entre a atividade de água (AW) e temperatura ( C) no desenvolvimento de fungos e na produção de OTA. As melhores condições encontradas para o A. carbonarius produzir OTA eram de AW de 0,965 e 15ºC, e para o A. niger, a AW ideal estava em torno de 0,95. O aumento de temperaturas de 16-25ºC favoreceu o aumento da produção de OTA para fungos isolados de A. carbonarius enquanto que o A. niger produziu OTA independentemente da temperatura. Dados similares são relatados por Anli e Bayram (2009), onde fungos isolados de A. carbonarius produziram OTA entre 15ºC e 20ºC, e A. niger apresentaram produção maior entre 20ºC e 25ºC. 27

28 El Khoury et al (2008), isolaram fungos de uvas libanesas durante a safra de 2005, desde a mudança de cor e amadurecimento até a colheita. Dos isolados, 95,5% pertenciam ao gênero Aspergillus spp., onde 56,9% eram constituídos de aspergillus negros (52,2% agregados de A. niger, 2,9% A. japonicus e 1,8% A. carbonarius) e 43,1% eram A. flavus. Todos os isolados de A. carbonariuns foram capazes de produzir OTA e nenhum outro produtor foi identificado. Na Argentina, a incidência de fungos produtores de OTA foi averiguada por Ponsone et al (2007), durante o desenvolvimento das uvas. Nos resultados a maior contaminação foi de Aspergillus niger, da qual 24% de 246 fungos isolados eram produtores de OTA, entretanto, nenhuma concentração da micotoxina foi encontrada nas uvas. Segundo Chiotta et al (2009), em estudo semelhante conduzido na Argentina, a área de maior incidência apresentava 32,5% da microbiota isolada de Aspergillus nigri, onde 81% pertenciam ao A. niger, 11% ao A. carbonarius e 8% a Aspergillus uniseriados. De 284 fungos isolados, 91 (32%) foram identificados como produtores de OTA, divididos em 69% de A. niger e 31% de A. carbonarius Estrutura química e propriedades físico-químicas da Ocratoxina A A ocratoxina A é um policetídio derivado de uma dihidro-isocumarina unida pelo carbono 7 carboxílico a uma l- -fenilalanina através de uma ligação amídica. A fórmula química é C 2 0H 18 O 6 NCl e seu peso molecular é 403,82. Na figura 06 encontra-se a estrutura química da OTA ou 7-(L- -fenilalanilcarbonil) - carboxil-5- cloro-8-hidroxi-3,4-dihidro-3r-metilisocumarina (RINGOT et al, 2006). FIGURA 06 - Estrutura química da Ocratoxina A. 28

29 A OTA apresenta-se como um composto cristalino altamente solúvel em solventes orgânicos polares, pouco solúvel em água e solúvel em carbonato de sódio de meio aquoso. Seus pontos de fusão são 90 C e 171ºC quando recristalizada com benzeno ou xileno, respectivamente. Possui absorção no comprimento de onda 333 nm (λ) e emissão no comprimento de onda entre nm, com coeficiente de absorção molar (ε) de 5440 m 2 /mol, quando solubilizada em solução de tolueno-ácido acético 99:1(v/v) (VALENTA, 1998; ROSA et al., 2004; SHUNDO et al., 2006; RINGOT et al., 2006; VALERO, 2008). Ocratoxina A é uma substância resistente à temperatura, e a maioria dos métodos de análise utilizam-se de soluções ácidas para extração e armazenamento, condições nas quais a toxina é extremamente estável (VALENTA, 1998). Diferentes solventes podem ser usados no armazenamento e manuseio, e a micotoxina pode permanecer em soluções de etanol por mais de um ano. Soluções de tolueno:ácido-acético 99:1 a temperaturas de congelamento (-18ºC) apresentam perdas mínimas em períodos acima de 6 meses. Em metanol, problemas de decomposição podem ser observados após alguns anos de armazenamento a temperaturas de -18ºC (VALENTA, 1998) Aspectos toxicológicos da Ocratoxina A A ocratoxina A é considerada nefrotóxica e imunossupressora. Estudos apontam efeitos carcinogênicos e hepatotóxicos em animais não ruminantes, principalmente aves e suínos. Em teste com animais, os sintomas mais aparentes são o de nefropatia com atrofia tubular e fibrose intersticial. Um dos relatos mais conhecidos da toxicidade da ocratoxina A para humanos foi a Nefropatia Endêmica dos Bálcãs (NEB), onde diversos casos de câncer do trato urinário foram associados à presença da OTA quando comparados a outras regiões onde a micotoxina não está presente com tanta frequência (VALENTA, 1998; MIDIO, 2000; BELLI et al, 2002; RINGOT et al, 2006). Segundo a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC, 2003) a OTA é classificada como um possível carcinógeno para humanos no grupo 2B. Em 2001, o JECFA (The Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) estabeleceu a ingestão tolerável semanal provisória de 100 ng/kg de peso corpóreo (p.c) (IARC, 1993; JECFA, 2001). 29

30 A OTA é facilmente absorvida pelo sistema gastrointestinal e sua toxicidade pode variar conforme a concentração e o organismo. Uma vez ingerida e absorvida pelo trato intestinal a OTA se distribui rapidamente pelo organismo por formar adutos com proteínas sanguíneas e posteriormente ligar-se com os tecidos (VALENTA, 1998; MIDIO, 2000; RINGOT et al., 2006; TURNER et al., 2009). Esta ligação é reversível e ocorre em sítios que podem competir com alguns fármacos comumente utilizados. Os grupamentos carboxílicos e fenólicos em sua estrutura química fazem o maior papel na absorção, uma vez que a OTA age como um ácido fraco e passa através das membranas celulares por difusão simples (VALENTA, 1998; MIDIO, 2000; RINGOT et al, 2006; TURNER et al, 2009). A porcentagem de OTA absorvida é diferente entre as espécies, por exemplo, nos porcos é de 66%, em ratos e coelhos de 56% e em galinhas de 40% (RUHLAND et al., 1997; MÍDIO, 2000; MONACI E PALMISANO, 2004; RINGOT et al, 2006; TURNER et al, 2009). Animais ruminantes apresentam menor sensitividade devido ao seu estômago complexo e a protozoários presentes no rúmen, que degradam a toxina. Na distribuição da OTA, 99% ligam-se as proteínas séricas, principalmente a albumina, o que facilita a sua absorção passiva. A meia-vida junto ao sangue varia de uma espécie para outra e depende do grau de afinidade e da força da ligação, e é considerada mais longa em humanos (RUHLAND et al, 1997; MÍDIO, 2000; MONACI E PALMISANO, 2004; RINGOT et al, 2006; TURNER et al, 2009). Em um estudo populacional, Coronel et al (2009) analisou plasma sanguíneo de 279 pessoas da província de Lleida, na Espanha, durante uma campanha de doação de sangue. Em paralelo foi realizado um levantamento de produtos alimentícios consumidos, dos quais se gerou uma estimativa dos grupos de alimentos que englobavam as maiores fontes de OTA (CORONEL et al., 2009). Entre os produtos mais consumidos e contaminados estavam cereais e derivados, seguidos de cerveja e vinho. Os resultados apontaram um consumo diário de 1,69 e 1,96 ng/kg de peso corporal/dia, e pessoas acima de 45 anos apresentaram o maior acúmulo (1,05±1,29 ng/ml). Uma vez que a ocratoxina A atinge o fígado ela é biotransformada em diversos metabólitos. Estes caminhos de biotransformação e seus mecanismos ainda não são claros (RINGOT et al, 2006). A contribuição da OTA e seus metabólitos para 30

31 toxicidade ainda não foram elucidados totalmente e muitos destes metabólitos ainda estão por serem caracterizados. No entanto, podem estar associados à morte celular por diversas formas, das quais incluem-se distúrbios na respiração mitocondrial, inibição de enzimas nos processos de formação de proteínas e gliconeogênese, e danos ao DNA e RNA pela formação de adutos (RINGOT et al, 2006). Entre os principais metabólitos encontrados (Figura 07) estão a OTB, OTα, 4-OH OTA e seus dois epímeros 4(R) e 4(S)-OH OTA (formados em fígados de porcos), e a OP-OTA que se trata da própria OTA com anel aromático de lactona aberto (RINGOT et al, 2006). FIGURA 07 - Metabólitos formados pela OTA e detectados in vivo em diferentes espécies. Fonte: RINGOT et al (2006). 31

32 Ocratoxina A em uvas e vinhos O vinho pode estar contaminado por ocratoxina A quando as uvas destinadas à produção tenham sido alvo do desenvolvimento de fungos. A matéria-prima é a maior fonte de OTA nos vinhos engarrafados, e sua condição sanitária nos processos é de grande importância (ANLI E BAYRAM, 2009). Quantidades máximas de 0,4 μg/l da micotoxina foram encontradas em vinhos (ZIMMERLY E DICK, 1996; VISCONTI, 2008). Battilani et al (2006), quantificaram a presença de OTA em cachos destinados à vinificação na Itália, a concentração do contaminante na uva foi considerada baixa, e a maioria das amostras se apresentou abaixo do limite de detecção (LOD de 0,03 ng/g). Concentrações mais altas foram encontradas nas uvas da região Sul do país (de 0,4 ng/g a 0,65 ng/g). Chiotta et al (2009), analisaram a microbiota nas uvas de vinhedos da Argentina e encontraram concentrações de OTA que variaram de 0,1 ng/g e 1,20 ng/g. Soufleros et al (2003), realizaram a análise de vinhos tintos, rosé e brancos produzidos na Grécia e encontraram OTA em 62,8% das amostras. A maior parte destes vinhos não foram considerados um risco à saúde, cujos valores de OTA estavam abaixo de 0,05 ng/ml. Vinhos com maior quantidade de açúcares apresentaram níveis mais altos do que vinhos secos, com resultados variando de <0,02 a 3,2 ng/ml. Valores similares de contaminação foram encontrados na Europa por Battilani et al (2002), cujas concentrações encontradas variaram de <0,01 μg/l a 3,4 μg/l. Visconti et al (2008), fizeram um levantamento de dados sobre a presença de OTA em vinhos e as contaminações variavam de um mínimo de 0,005 μg/kg até o máximo de 15,6 μg/kg nos vinhos europeus. Em um estudo realizado por Hocking et al. (2003), a presença de OTA foi analisada em diferentes safras, cor e classe de vinhos provenientes de diversas regiões produtoras da Austrália. Das amostras, 344 eram de vinhos tintos e 257 de vinhos brancos. A concentração de OTA nos vinhos tintos variou entre 0,05 e 0,62 μg/l em 14% de amostras positivas. Nos vinhos brancos, 16% das amostras estavam contaminadas em concentrações de 0,05 a 0,5 μg/l. O maior valor encontrado para OTA foi de vinhos de safra indefinida, entretanto, nos resultados entre safras de 1984 a 2000, a concentração mais alta foi de 0,50 μg/l de OTA, em Em pesquisa realizada no mercado de São Paulo, Shundo et al (2008), avaliaram diversos vinhos provenientes de países da Europa, África e América Latina (Tabela 04). 32

33 A maior concentração de OTA encontrada foi de 0,32 ng/ml em vinhos italianos. Vinhos de países como Argentina, Uruguai e África do Sul apresentaram valores abaixo de 0,03 ng/ml e os do Chile não apresentaram contaminação. TABELA 04 - Ocorrência de Ocratoxina A em vinhos. NÚMERO DE NÚMERO DE VALORES DE OTA PAÍS AMOSTRAS AMOSTRAS (ng/ml) POSITIVAS (%) Chile 7 0 ND Argentina 6 (16.7) <0.03 Uruguai 3 (33.3) <0.03 França 5 (60.0) Itália 5 (100) Portugal 5 (100) Espanha 2 (100) África do Sul 1 (100) <0.03 ND = Não Detectada (Limite de Detecção de 0,01 ng/ml) Adaptado de Shundo et al (2008). Um levantamento de dados realizado por Belli et al (2002), que englobou amostras de diferentes regiões da Europa, evidenciou que vinhos do tipo branco e rosé apresentam maiores níveis de contaminação do que vinhos tintos, embora a porcentagem de amostras positivas encontradas em diferentes pesquisas seja maior neste último. Uma das evidências mais marcantes encontradas é o gradiente Norte-Sul de contaminações dos vinhos Europeus, mais frequentemente na região do mar Mediterrâneo, ao Sul. Atribui-se este fato a variação de temperaturas mais frias do norte e mais quentes e úmidas ao Sul. Segundo Valero et al (2008), vinhos feitos de uvas cultivadas nas regiões mais quentes do Mediterrâneo, conhecidas por serem quentes e secas no verão e úmida no outono, apresentaram 60% de contaminação, dos quais 27% estavam acima de 2μg/L de OTA. Rosa et al (2004) analisaram vinhos europeus e de países da América Latina vendidos no mercado da cidade do Rio de Janeiro, diferenciando-os por cor. Em seus 33

34 resultados, os vinhos tintos apresentaram uma incidência de 45% de contaminação por OTA, variando entre as concentrações de 0,0283 e 0,0567 μg/l. A maior incidência foi em vinhos tintos italianos (75%). Na América do Sul, 31,2% das amostras de vinho tinto apresentaram OTA e a maior concentração encontrada foi de 0,0707 μg/l em vinhos chilenos Ocorrência de Ocratoxina A em vinhos brasileiros A presença de Ocratoxina A em vinhos brasileiros foi reportada por Rosa et al (2004), neste caso, os resultados apresentaram 30% de contaminação em tintos, 20% em brancos e 20% em rosé. A concentração de OTA foi a mais alta para os vinhos tintos (máximo de 0,0424 μg/l), seguida de vinhos brancos (0,0354 μg/l) e de vinho rose (0,0282 μg/l). Na pesquisa realizada em São Paulo por Shundo et al (2006), a contaminação por OTA encontrada variou de concentrações entre 0,1 e 1,33 μg/l. A incidência foi de 9 amostras positivas em um total de 29. Neste estudo, as amostras foram divididas em regiões Norte e Sul. A região Sul apresentou apenas 2 amostras positivas (6,9%) e valores de OTA entre 0,1 e 0,24 μg/l. Das 7 amostras analisadas da região Norte todas apresentaram contaminação, onde o valor máximo foi 1,33 μg/l. Em ambas as pesquisas citadas, os valores de OTA estavam abaixo do limite das legislações pertinentes (OIV E ANVISA), no entanto, Welke et al (2010) avaliaram a presença de OTA em 34 amostras de vinho tinto e foi encontrada em uma das amostras a concentração de 4,5 μ/l Maturação e sanidade das uvas e qualidade do vinho Ao contrário do ataque do míldio e do oídio, que é possível controlar, a podridão é a enfermidade mais grave da uva. As podridões dão lugar a diversas transformações bioquímicas e químicas na uva (FLANZY, 2000). Muitos fungos, como espécies de Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, Penicillium, Rhisopus e Stemphylium podem causar podridão nas uvas, e estes podem ocorrer associados à Botrytis cinérea, por exemplo. 34

35 Como no caso da podridão negra, causada por Aspergillus negros, a podridão verde, causada por Penicillium, e a podridão acética, causada por leveduras e bactérias acéticas, os fungos penetram nas bagas das uvas por feridas e bagas com rupturas, aumentando o risco com a maturação à medida que se aproxima à vindima, quando o teor de açúcar nas bagas está elevado, e a película mais vulnerável á rompimentos e danos. Em uvas com cachos muito fechados e vinhas muito vigorosas, o risco é maior, bem como em bagas com feridas causadas por granizo, traças, oídio, pássaros, abelhas ou secura excessiva e também devido à temperatura e umidade elevadas (agravada pela chuva), favorecendo ainda mais o risco de podridão (AGUIAR et al., 2001; SERRA 2005). Quando a uva permanece muito tempo na parreira, ocorre a sobrematuração. Assim, o fruto perde água, começa a murchar e seu suco concentra. Este suco concentrado possui maior quantidade de açúcar, podendo ocasionar um maior ataque fúngico, causando mais podridão na uva (PEYNALD, 1999). A diversidade de espécies de fungos encontradas como esporos na superfície saudável das uvas depende não somente da variedade da uva, maturidade, práticas culturais, mas também das condições climáticas e geográficas (SAGE et al., 2004). Já, Lo Curto et al. (2003) relataram que o uso de alguns pesticidas sintéticos podem reduzir os níveis de OTA e que o bom estado sanitário é essencial para prevenir alto nível de contaminação. Considera-se que os fatores abióticos que mais influenciam o cultivo da vinha são o solo e o clima. Estes fatores abióticos, além de poderem ser limitantes ao estabelecimento da cultura, são responsáveis por uma grande diversidade de situações, que influenciam as características das uvas e vinhos de um determinado local (SERRA, 2005). É fundamental que a videira esteja perfeitamente adaptada às condições edafoclimáticas da região. Por isso, a escolha da variedade a se cultivar e do portaenxerto utilizado são muito importantes para o bom estabelecimento da vinha e qualidade das uvas produzidas. A escolha do sistema de condução da vinha condiciona fortemente a qualidade das uvas. Outros fatores como fertilizações e tratamentos fitossanitários, determinam o sucesso da vinha, interferindo desta forma no estado sanitário da vindima, podendo provocar uma degradação do potencial qualitativo da uva (RIBÉREAU GAYON et al., 2003). 35

36 Estes fatores, naturais e humanos, contribuem na obtenção de um vinho de qualidade, resultando em um aumento significativo do valor agregado ao mesmo e a viabilização da atividade vitivinícola em determinada região. O acompanhamento da maturação e da colheita é fundamental para a obtenção de um máximo de qualidade do vinho. Além disso, cuidados na colheita auxiliam para a obtenção de um grau de qualidade do vinho significativamente maior (GUERRA & ZANUS, 2006). Diante dessas tendências mundiais, o consumidor nacional tem valorizado cada vez mais os alimentos produzidos em sistemas que estabeleçam um compromisso com a preservação do meio ambiente, da saúde e da estrutura de produção, sempre valorizando um produto final que atenda aos requisitos de segurança alimentar (ROMBALDI et al., 2004) Variação dos níveis de OTA durante vinificação Mudanças nas características da fermentação dos vinhos podem afetar a concentração de OTA de forma positiva ou negativa. Segundo Meca et al (2010), os níveis de contaminação reduziram significativamente em testes realizados com 16 cepas de Saccharomyces cerevisiae empregadas pelas indústrias. Esta redução ocorre quando o levedo se desenvolve e absorve a OTA, prendendo-a em suas paredes celulares. (CARIDI et al, 2006) Em vinhos licorosos (Vinho do Porto), a interrupção dos processos fermentativos pela fortificação do mosto permite que parte da micotoxina mantenha-se no produto, uma vez que o levedo é morto pela adição de álcool etílico potável. Logo, vinhos de fermentação prolongada apresentam menores concentrações de OTA do que vinhos cujos processos fermentativos são tradicionalmente alterados (VALERO et al, 2008). O uso de culturas de bactérias láticas pode reduzir a contaminação da mesma forma que o levedo, através da absorção da OTA pela biomassa em crescimento (CARIDI et al, 2006; FUCHS et al, 2008; AMASQUETA et al, 2009). Outra maneira de diminuir a presença de OTA está no controle dos processos de filtração e separação de sólidos durante a maceração da uva, que permite a retirada de grande parte da micotoxina junto ao material vegetal (VISCONTI et al, 2008). Valero et al (2008) avaliaram processos produtivos e analisaram diferentes vinhos da Europa e região do Mediterrâneo. Constataram que diferentes tipos de tratamentos das uvas, conforme as características do produto final desejado tinham 36

37 papel importante na concentração de OTA. Houve um aumento nos valores de OTA em pós-colheita, quando usado secagem artificial da uva para vinhos a base de uvas secas ou passas. As correntes de ar morno e seco proporcionaram o desenvolvimento de fungos micotoxigênicos significativamente maior do que em temperatura mais alta. O uso da secagem artificial ou natural é comum na produção de vinhos doces e licorosos, no entanto a secagem natural proporciona maiores danos pós-colheita nas uvas do que a anterior. Lombaert et al (2004), investigaram a presença de ocratoxina A em variedades de uvas passas vendidas no mercado canadense e importadas de outros países. A análise apontou 79% de amostras positivas para OTA. A média de concentração foi maior em amostras importadas da Austrália (12,9 ng/g). Testes realizados em microvinificação por Ratola et al (2005), relataram um decréscimo de até 92% do conteúdo de OTA durante o processo de separação de sólidos do mosto e fermentação. Meca et al (2010), reafirmaram os dados relatados ao descreverem que a OTA é em parte absorvida pela biomassa do levedo durante seu desenvolvimento. Produtos que não levam processos fermentativos tais como preparados de sucos e polpas, podem apresentar níveis maiores de OTA quando comparados com os produtos fermentados Legislação relativa à Ocratoxina A A avaliação de risco da Ocratoxina A em alimentos ocorre oficialmente através de uma junta de especialistas da Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO) e Organização Mundial da Saúde (OMS) que se reúnem regularmente para as reavaliações pertinentes. Desde 1970 os contaminantes de alimentos têm sido avaliados pelos comitês dos órgãos mundiais, entre eles, o Codex Alimentarius. São as resoluções tomadas a partir destes encontros que estabelecem os níveis a serem seguidos pela comunidade internacional para o comércio dos seus produtos (HERRMAN, 1991; WHO, 2001). Em relação à Ocratoxina A, tem se dado atenção especial desde 1993, quando a Agência Internacional para Pesquisa do Câncer (IARC), classificou esta micotoxina como um carcinógeno humano do grupo 2B, baseado em suficientes evidências para carcinogenicidade em estudos em animais de laboratório (WHO, 1993; PITTET, 1998; DRAGACCI ET AL., 1999). 37

38 Atualmente os países da Comunidade Européia possuem limites para micotoxinas em diversos produtos de diferentes origens. Para Ocratoxina A em vinhos, o limite regulamentado é de 2 μg/l ou 2 ppb de OTA, estabelecido pela OIV (Organização Internacional da Vinha e do Vinho). Alguns países fora da União Européia regulamentam Ocratoxina A para uvas passas, sucos de uva e para todos produtos alimentícios (Tabela 05) (FAO, 2004). TABELA 05 Países que possuem regulamentação para OTA em produtos de uva ou em outros alimentos. País Limite de OTA μg/kg Alimento Bulgária 3 Suco de Uva 5 Uvas passas Eslováquia 10 Produtos alimentícios Hungria 10 Uvas passas, café torrado e produtos de café; outros produtos de origem vegetal; Iran 10 Uvas passas e frutas secas Romênia 20 Produtos alimentícios Sérvia e Montenegro 10 Produtos alimentícios Suíça 5 Produtos alimentícios Turquia 10 Uvas passas Vietnan 35 (total de micotoxinas) Produtos alimentícios União Européia 2 Vinhos Fonte: FAO, No Brasil, devido a vários fatores como: crescimento da área e práticas vitivinícolas, exigência de alguns países para exportação e aos vários efeitos tóxicos da Ocratoxina A á saúde humana, foi aprovada recentemente a Legislação Nacional (Resolução RDC Nº 7 de 18 de fevereiro de 2011) que estabelece os Limites Máximos Tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos (Anexo 01), onde fica estabelecido o Limite Máximo de 2 μg/l para suco de uva, polpa de uva, vinho e seus derivados, mesmo limite estabelecido pela OIV. 38

39 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Amostragem As amostras de uvas da variedade Pinot Noir foram coletadas no Distrito de São Roque, município de Garibaldi, em vinhedos com sistema de condução espaldeira pertencentes à Möet Hennessy do Brasil Vinhos e Destilados Ltda. (Vinícola Chandon) na safra de As uvas foram coletas três (3) vezes (três amostras) em um intervalo de tempo de oito em oito (8) dias. A primeira coleta foi feita na data de colheita estabelecida pela vinícola (que foi o dia 0), a segunda oito dias depois (08) e a última dezesseis (16) dias depois. A primeira coleta foi realizada nos dia 31 de janeiro de 2011, a segunda dia 07 de fevereiro de 2011 e a terceira dia 15 de fevereiro de 2011 (Figura 08). O critério do intervalo de cada coleta foi estabelecido neste período devido às condições climáticas e ao estado fitossanitário das uvas. Este estado fitossanitário foi caracterizado devido às danificações das uvas, sendo estas, bagas que foram atacadas por fungos, aves, vespas e abelhas, além daquelas com podridões e secura excessiva. Cerca de 60kg de Pinot Noir foram coletados em cada data de colheita, os quais foram vinificados em branco e tinto, com duas repetições. Portanto, cada unidade experimental foi constituída de 15kg de uva A escolha das plantas foi realizada de forma aleatória, coletando um pequeno número de cachos das plantas distribuídas em uma mesma quadra com área de 0,86 hectares. Posteriormente à colheita, as uvas foram conduzidas à Vinícola Chandon, no município de Garibaldi, onde foram realizadas as microvinificações. 39

40 1ª etapa de colheita 2ª etapa de colheita 3ª etapa de colheita 1AB 2AB 1AT 2AT 1BB 2BB 1BT 2BT 1CB 2CB 1CT 2CT FIGURA 08 Metodologia empregada para realização do estudo. 1: 1ª repetição; 2: 2ª repetição; A: 1ª etapa de colheita; B: 2ª etapa de colheita; B: Branco; T: Tinto Métodos As microvinificações foram realizadas seguindo os critérios de vinificação em branco e tinto clássicos, segundo Ribéreau-Gayon et al. (2003), procurando seguir as mesmas condições encontradas na indústria e aplicando as mesmas técnicas/critérios de vinificação em cada uma das três amostragens, diferenciando somente o fator vinificação em branco e vinificação em tinto. Primeiramente foram coletados os cachos de uva e acondicionados em caixas plásticas com capacidade para 20 kg cada, no qual foi separado o grão do engaço. Foram separados e pesados 40 kg de uva (somente os grãos), destes 40 kg, as bagas danificadas foram separadas e pesadas, assim como as bagas sãs, estabelecendo a percentagem de bagas danificadas em relação às sãs em cada coleta. Depois de estabelecida esta percentagem, as uvas foram cuidadosamente misturadas. Neste momento foi retirada e separada uma amostra de 1kg de uva com as devidas proporções de uvas podres e sãs e as mesmas foram encaminhadas para análise de Ocratoxina A no laboratório Eurofins de São Paulo. As uvas destinadas à elaboração dos vinhos foram em seguida separadas em quatro medidas/porções de 10 kg cada. A estratégia de pesquisa utilizada neste trabalho foi o estudo de caso, que segundo Ponte (2006) é uma investigação que se assume como particularística, isto é, que se debruça deliberadamente sobre uma situação específica que se supõe ser única ou especial, pelo menos em certos aspectos, procurando descobrir a que há nela de mais essencial e característico e, desse modo, contribuir para a compreensão global de um certo fenômeno de interesse. Yin (1994) diz ainda que o estudo de caso trata-se de uma abordagem metodológica de investigação especialmente adequada quando procuramos 40

41 compreender, explorar ou descrever acontecimentos e contextos complexos, nos quais estão simultaneamente envolvidos diversos fatores. Segundo Guba & Lincoln (1994) o objetivo é relatar os fatos como sucederam, descrever situações ou fatos, proporcionar conhecimento acerca do fenômeno estudado e comprovar ou contrastar efeitos e relações presentes Vinificação em branco para a variedade Pinot Noir Para a vinificação em branco, foram utilizados 20 kg de uva em cada uma das três etapas de colheita/amostragens, destinando 10 kg de uva para cada repetição (duas repetições para cada uma das três etapas de colheita). O mosto foi separado da parte sólida através de prensagem manual, foi homogeneizado e simultaneamente adicionouse uma dose de aproximadamente 0,05 ml.l -1 de bissulfito de amônia, 30 minutos após a adição de bissulfito de amônia, adicionou-se uma dose de 0,02 mg.l -1 de enzima pectolítica. Duas horas após a adição de enzima, acrescentou-se 0,07 g.l -1 de gelatina e logo em seguida, adicionou-se uma dose de 0,38 ml.l -1 de sílica 40%. O mosto foi colocado em recipiente de plástico, com tampa, com capacidade para 20 litros. Em seguida foi realizada a limpeza do mosto a 8 C, a fim de clarificar o mosto antes da fermentação, por um período de aproximadamente 24 horas para a obtenção de um mosto límpido (Figura 09). Após a limpeza do mosto, o líquido foi retirado através de trasfega do recipiente de 20 litros. As fermentações foram conduzidas em recipientes de vidro com capacidade de 4,6 litros com uma pequena válvula para saída de gás carbônico e foram mantidos à temperatura de C durante toda a fermentação. Para a realização da fermentação, foram inoculadas 0,2 g.l -1 de levedura seca ativa do gênero Saccharomyces bayanus previamente hidratadas. Quatro horas após a adição de leveduras, foram adicionados 0,2 g.l -1 de fosfato de amônia. Vinte e quatro horas após a inoculação de leveduras foi efetuada a correção do açúcar, a partir de análise de álcool potencial, foram adicionadas 5,3 g.l -1 de açúcar previamente diluídas em mosto. Após a correção do açúcar, adicionou-se 30 g.hl -1 de bentonite previamente diluído, para a decantação de depósitos. 41

42 A fermentação alcoólica aconteceu em sete dias, e seu término foi constatado por meio de análise de densidade e açúcar residual. Assim, o vinho foi trasfegado, desprezando-se as borras grossas, adicionaram-se 0,05 ml.l de solução de SO 2 para que evitar a oxidação do produto e para que o vinho não realizasse fermentação malolática, e 1 hora depois foi adicionado uma dose de 30 g.hl -1 de bentonite, previamente diluída, para clarificação. Logo após, o vinho foi submetido à estabilização tartárica à temperatura de 4-8 C por aproximadamente 20 dias, depois disso, foi submetido novamente à uma trasfega. Após estabilização tartárica, corrigiu-se o teor de SO 2 (dióxido de enxofre) livre para aproximadamente 20 mg.l -1. Em seguida o vinho foi acondicionado em garrafas de vidro com capacidade para 750 ml, as garrafas foram vedadas com bidule e tampa corona, para posteriormente serem encaminhadas para análise em laboratório externo. O mesmo método foi utilizado para cada uma das três (3) etapas de colheita/amostragens, alterando somente a quantidade de açúcar utilizado para a correção do álcool nos vinhos. 42

43 Colheita Desengace Pesagem Coleta e envio de amostras para análise de Ocratoxina A Esmagamento Prensagem e separação da casca Adição de bissulfito de amônia Adição de enzima pectolítica Adição de sílica e gelatina Limpeza do mosto Sifonagem Adição do pé-de-cuba Adição de nutriente Fermentação alcoólica (13 a 17ºC) Correção do açúcar Adição de bentonite 1ª trasfega Adição de bentonite Estabilização tartárica (4-8ºC durante 20 dias) Adição de dióxido de enxofre (terminada a fermentação) 2ª trasfega Análise do anidrido sulfuroso Correção dos níveis de anidrido sulfuroso Engarrafamento Coleta e envio de amostras para análise de Ocratoxina A FIGURA 09 Esquema fluxograma das operações utilizadas para a elaboração dos vinhos brancos da variedade Pinot Noir do Distrito de São Roque na safra de

44 Vinificação em tinto para a variedade Pinot Noir Para a vinificação em tinto (Figura 10), foram utilizados 20 kg de uva em cada uma das três etapas de colheita/amostragens, destinando 10 kg de uva para cada repetição (duas repetições para cada uma das três etapas de colheita). Os grãos de uva foram esmagados manualmente e simultaneamente adicionou-se de uma dose de aproximadamente 0,05 ml.l -1 de bissulfito de amônia, 30 minutos após a adição de bissulfito de amônia, adicionou-se uma dose de 0,02 mg.l -1 de enzima pectolítica. Duas horas após a adição de enzima pectolítica, foram inoculadas 0,2 g.l -1 de levedura seca ativa do gênero Saccharomyces bayanus previamente hidratadas. O mosto foi colocado em recipiente de plástico, com tampa e saída para gás carbônico, com capacidade para 20 litros e mantido à temperatura de C em contato com cascas e sementes. Durante a fermentação, o mosto foi submetido a cinco (5) remontagens manuais diárias com duração de 5 minutos cada remontagem. Dois dias após a inoculação de leveduras foi realizada correção de açúcar, com base em análise de álcool potencial. Foram adicionadas 5,3 g.l -1 de açúcar. Depois de sete (7) dias, constatou-se o término da fermentação através de análise de densidade e açúcar residual. No mesmo dia o vinho foi sifonado e recebeu 210 ml de pé-de-cuba com bactérias selecionadas, do gênero Oenonococcus oeni, para a realização de fermentação malolática. Após cinco (5) dias, constatou-se o término da fermentação malolática através de análise de cromatografia em papel. Separou-se manualmente a parte líquida das cascas e sementes e corrigiu-se o teor de SO 2 (dióxido de enxofre) livre para aproximadamente 25 g.l -1. Em seguida o vinho foi acondicionado em garrafas de vidro com capacidade para 750 ml, as garrafas foram vedadas para posteriormente serem encaminhadas para análise em laboratório externo.. O mesmo método foi utilizado para cada uma das três (3) etapas de colheita/amostragens, alterando somente a quantidade de açúcar utilizado para a correção do álcool nos vinhos. 44

45 Colheita Desengace Pesagem Coleta e envio de amostra para análise de Ocratoxina A Prensagem Adição de bissulfito de amônia Adição de enzima pectolítica Adição do pé-de-cuba Fermentação com a parte sólida (maceração): 20-24ºC - 7 dias Remontagens Correção do açúcar 1ª trasfega Adição de pé-de-cuba (bactérias selecionadas) Fermentação malolática (5 dias) 2ª trasfega Análise de anidrido sulfuroso Adição de dióxido de enxofre Coleta e envio de amostra para análise de Ocratoxina A FIGURA 10 Esquema fluxograma das operações utilizadas na elaboração dos vinhos tintos da variedade Pinot Noir do Distrito de São Roque na safra de

46 3.3. Análises Análise de Ocratoxina A Foram analisadas uvas da variedade Pinot Noir e seus respectivos vinhos, elaborados com uvas de diferentes períodos de colheita e estados fitossanitários, conforme citados anteriormente. A análise de OTA foi realizada segundo método adotado pela OIV Resolução 16/2011 (Anexo 02). As determinações de Ocratoxina foram realizadas pelo laboratório Eurofins de São Paulo Análises físico-químicas As determinações realizadas nos mostos e vinhos foram feitas segundo metodologia oficial descrita pela OIV (1990). Nas uvas foram realizadas análises de grau Babo/álcool potencial, medidos por espectrofotômetro e acidez total por titulometria. Nos mostos, foram realizadas novamente análises de álcool provável e acidez, e foram realizadas ainda análises de ph pelo método eletrométrico, densidade por densimetria, SO 2 livre e SO 2 total, ambos pelo método Ripper (titulométrico). Já nos vinhos prontos, os parâmetros analisados foram: SO 2 livre, SO 2 total, Acidez total, acidez volátil - utilizando equipamento Gibertini (Itália) e posterior titulação, álcool - utilizando equipamento Gibertini, com posterior leitura em alcoômetro, ph e açúcar residual, realizado por titulometria Análise estatística descritiva A análise estatística correspondeu à classificação das características resposta (relação entre percentagem de uvas sãs e uvas danificadas, relação entre precipitação pluviométrica e sanidade das uvas, relação entre álcool provável e acidez total tanto 46

47 para mostos para vinificação em brancos como para tintos, relação entre álcool potencial e sanidade das uvas tanto para brancos como para tintos), tendo como base as diferentes etapas de colheita (características explicativas). 4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 4.1. Sanidade das uvas nas diferentes etapas de colheita Conforme pode ser verificado na Figura 11, observaram-se níveis de danificações de 0,9%, 14,8% e 47% na primeira, segunda e na terceira etapa de colheita respectivamente, para uvas da variedade Pinot Noir, comprovando ser uma variedade altamente suscetível à podridões da uva madura e do cacho (CAMARGO, 1994; GIOVANNINI, 2005). FIGURA 11 Percentual de uvas danificadas e sãs da variedade Pinot Noir na localidade de São Roque Garibaldi na safra de

48 Percentagem de uvas danificadas Precipitação pluviométrica (mm) Entre as etapas de colheita, a precipitação pluviométrica foi de aproximadamente 39 mm, sendo 14mm da 1ª para a segunda etapa e 25mm da segunda para a terceira etapa de colheita. A relação entre sanidade e precipitação pluviométrica pode ser observada na Figura 12, onde se pôde verificar que com o aumento das chuvas tende a haver também o aumento significativo de uvas com danificações/podridões. A umidade associada à temperatura elevada que ocorreu na Serra Gaúcha contribuiu para o desenvolvimento dos microrganismos causadores de podridões. Fato este que pode ser explicado devido a precipitações pluviométricas ou caso haja muita irrigação nas fases iniciais do período de maturação podem ocasionar danos nas bagas por rupturas (HIDALGO, 1999). Além disso, a variedade de uva Pinot Noir possui uma menor resistência à ataques fúngicos em relação á outras variedades. Conforme GIOVANNINI (2005), a chuva também facilita as condições para o aumento da incidência de podridões do cacho, sendo que a possibilidade de manter a uva com estado de sanidade ideal diminui colheita 2 colheita 3 colheita Níveis de danificações/ podridões (%) P recipitações pluviométricas (mm) FIGURA 12 Precipitação pluviométrica e níveis de danificações/podridões na variedade de uva Pinot Noir na safra de 2011 no Distrito de São Roque Garibaldi. 48

49 4.2. Composição dos mostos As análises efetuadas nos mostos da variedade Pinot Noir, tanto para vinificação em branco como para vinificação em tinto estão indicadas na Tabela 06. As amostras para análise foram coletadas logo após a prensagem/esmagamento das uvas, sendo que, durante este processo de prensagem/esmagamento foram adicionados 0,05 ml.l -1 de bissulfito de amônia a fim de evitar a oxidação dos mostos. Os mostos tenderam a apresentar um decréscimo na acidez e um aumento do ph em ambos os casos (branco e tinto), o que concorda com a literatura (VOGT, et al., 1984, PEYNAUD, 1999). Observou-se que ocorreram outras alterações nos parâmetros, como SO 2 e álcool provável analisados nos mostos de uma colheita para outra desta mesma variedade de uva. Estes parâmetros encontram-se dentro dos níveis normais e desejáveis para uma obtenção de um vinho de boa qualidade físico-química (OUGH, 1992; RIBERÉAU GAYON et al., 2003). TABELA 06 Análises realizadas nos mostos para vinificação em branco e tinto, da variedade Pinot Noir nas três etapas de colheita. 1ª ETAPA 2ª ETAPA 3ª ETAPA Branco Tinto Branco Tinto Branco Tinto SO 2 livre 2,8 6,6 4,0 7,8 3,8 6,7 SO 2 total 15,1 26,5 17,0 32,3 36,5 57,8 Álcool provável 10,2 8,6 10,4 11,0 9,8 9,6 Acidez total (ácido 4,55 5,25 3,86 4,6 3,75 4,55 tartárico) ph 3,28 3,32 3,37 3,39 3,37 3,48 Com relação ao álcool potencial, a acidez total e os diferentes tempos de colheita das uvas, a figura 13, mostra as análises realizadas nos mostos obtidos a partir de uvas de diferentes tempos de colheita, o qual se observa a interferência de fatores externos, pois mesmo com o decréscimo de acidez, o que concorda com Hidalgo (1999) e Ribéreau Gayon et al. (2003) o álcool provável é instável e na última etapa de colheita ele diminui em relação à segunda etapa. 49

50 Álcool provavel (%) Ácido tartárico (acidez) Álcool provável (%) Ácido tartárico (acidez) De acordo com Hidalgo (1999) e Ribéreau Gayon et al. (2003) a maturação prática da uva é alcançada quando a concentração de açúcares da uva estiver aumentando e a acidez total diminuindo e quando estes componentes estiverem praticamente estáveis durante alguns dias, este é o momento de maturação da uva. Esta relação facilita a hora da colheita, podendo saber se a uva já está madura e pronta para ser colhida. 10,5 10,4 10,3 10,2 10,1 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 1 etapa de colheita 2 etapa de colheita 3 etapa de colheita 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Álcool provável (%) Acidez total (ácido tartárico) ,4 5,2 5 4,8 4,6 4,4 Álcool provável (%) Acidez total (ácido tartárico) 0 1 etapa de colheita 2 etapa de colheita 3 etapa de colheita 4,2 FIGURA 13 Álcool provável e acidez total do mosto utilizado para vinificação em branco e tinto respectivamente, em diferentes etapas de colheita das uvas da variedade Pinot Noir da localidade de São Roque na safra de

51 Quanto à relação entre os açúcares, à percentagem de uvas sãs e as diferentes etapas de colheita das uvas, a figura 14 mostra as análises efetuadas na variedade Pinot Noir, o qual se observa que com o passar do tempo das colheitas a sanidade das uvas decaiu (99,1; 85,2 e 53% de uvas sadias), o que também ocorreu com o álcool provável da segunda para a terceira etapa de colheita. Nesta variedade observou-se que com o aumento do álcool provável ocorreu uma diminuição da sanidade das uvas no decorrer das colheitas, ou seja, aumentou a quantidade de uvas danificadas, podendo ter sido por ataques de abelhas e vespas que atacam a uva madura devido à doçura das bagas, além do ataque fúngicos, uma vez que esta variedade é altamente sensível à podridão da uva madura, conforme Giovannini (2005). O teor médio de açúcar na uva Pinot Noir aumentou da primeira colheita para a segunda, ou seja, ocorreu uma maturação na uva entre estas etapas de colheita, mas após, começou a diminuir. O que não se pode relacionar com a sanidade das uvas, pois esta aumentou em todas as três etapas de colheita. O desenvolvimento inicial de Botrytis cinérea nas uvas, por exemplo, tem importante papel no acúmulo de açúcares, mostrando que o aumento de açúcares pode ser também devido a este tipo de ataque fúngicos (RIBÉREAU GAYON et al., 2003). 51

52 Percentagem de uvas sãs Álcool provável (%) Percentagem de uvas sãs Álcool provável (%) etapa de colheita 2 etapa de colheita 3 etapa de colheita 10,5 10,4 10,3 10,2 10,1 10 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 Sanidade das uvas (%) Álcool provável (%) Sanidade das uvas (%) Álcool provável (%) etapa de colheita 2 etapa de colheita 3 etapa de colheita 0 FIGURA 14 Sanidade das uvas e álcool potencial em uvas utilizadas para vinificação em branco e vinificação em tinto respectivamente. 52

53 4.3. Parâmetros físico-químicos dos vinhos Os teores médios das análises físico-químicas dos vinhos estão apresentados na Tabela 07. O ph dos vinhos brancos apresentou uma pequena diferença nas três etapas de colheita, sendo que na primeira colheita o ph foi maior (3,19) e com o decorrer das colheitas, este sofreu uma leve diminuição, o que não coincide com Ribéreau-Gayon et al. (2003), que diz que com a maturação da uva, ou colheitas em dias sucessivos, o ph dos vinhos aumentam. Desta forma, observa-se que a quantidade de uvas danificadas pode ser um fator interferente neste resultado. Já o ph dos vinhos tintos, teve um aumento considerável da primeira etapa de colheita (A) para a segunda (B), porém uma diminuição da segunda para a terceira colheita (C). A acidez volátil do vinho branco teve uma diminuição considerável da primeira (A) para segunda colheita (B), contudo, da segunda para a terceira colheita (3) houve um aumento também significativo. Em relação aos vinhos tintos, a acidez volátil aumentou gradativamente, o que mostra que a sanidade das uvas interferiu neste acréscimo, levando em consideração que na elaboração do vinho tinto foi realizado o processo de maceração, onde o produto permanece por certo tempo em contato com as bagas da uva extraindo os componentes presentes na mesma. Os teores de acidez total para ambos os casos foram irregulares, diminuindo da primeira (1) para a segunda etapa de colheita (2), porém aumentando da segunda para a terceira colheita (3), o que não está de acordo com a literatura (PEYNAUD, 1999; FLANZY, 2000; RIBÉREAU GAYON et al., 2003), pois teria que diminuir com o passar do tempo das colheitas, o que pode ser explicado em virtude das condições climáticas da Serra Gaúcha, uma vez que durante o período de colheita das uvas, um dos fatores determinantes da época foi a precipitação pluviométrica. Em relação ao teor alcóolico nos vinhos em ambos os casos (vinificação em branco e vinificação em tinto) ao álcool aumentou nas três etapas de colheita. Isto se deve pelo fato de as uvas, com o passar do tempo, estarem mais maduras e com uma maior concentração de açúcar. O teor alcoólico formado nos vinhos 53

54 da variedade Pinot Noir apresentou-se menor para os vinhos tintos, constatando que os valores acompanharam as tendências observadas já nos mostos. Os valores de álcool observados nos vinhos encontram-se dentro dos limites exigidos pela legislação (BRASIL, 2004), comprovando que as uvas de todas as variedades e em todas as colheitas encontravam-se no seu ponto ideal de maturação e colheita. TABELA 07 Composição físico-química dos vinhos da variedade Pinot Noir em relação à diferentes etapas de colheita, da localidade de São Roque, Garibaldi, na safra de A Branco A Tinto B Branco B Tinto C Branco C Tinto SO 2 Livre 24,75 21,65 22,7 19,5 20,9 18,65 SO 2 Total 64,85 64,1 59,95 56,5 60,05 68,7 Acidez Total 4,5 3,25 3,6 2,96 4,03 3,05 Acidez Volátil 0,415 0,235 0,075 0,445 0,275 0,665 ph 3,195 3,64 3,18 3,9 3,165 3,87 Álcool 10,485 9,265 10,995 10,6 11,2 11 Açúcar 1 1,095 1,98 1, A = 1ª etapa de colheita, B = 2ª etapa de colheita e C = 3ª etapa de colheita. SO 2 livre e total medidos em mg/l, Acidez total expressa em ácido tartárico, Acidez volátil expressa em ácido acético, Álcool em % vol. e Açúcar em g/l. A partir destes resultados, pode-se notar que em qualquer uma das colheitas, nos vinhos da variedade Pinot Noir, os parâmetros físico-químicos encontram-se dentro dos requisitos exigidos pela legislação (BRASIL, 2004), para a produção de vinhos para consumo. Dessa forma podemos estabelecer que qualquer uma das colheitas está dentro do ponto ideal de maturação da uva, independente do aumento da percentagem de uvas danificadas pela supermaturação, contudo, em relação à qualidade organoléptica, o quesito sanidade poderá influenciar fortemente no produto final. 54

55 4.4. Nível de Ocratoxina A nos mostos e vinhos Tanto em amostras de uvas, como de vinhos, em qualquer das três etapas de colheita ou vinificação, os valores de Ocratoxina A encontrados ficaram abaixo do limite de detecção (1,7 μg/l -1 ), tanto para vinhos brancos como para vinhos tintos, mesmo este último ficando em contato com as cascas, pois segundo Moruno (2002), a toxina encontra-se principalmente nas cascas da uva, estando esta presente mais nos vinhos tintos em relação aos brancos. Em relação à não detecção de OTA nas uvas e vinhos Otteneder e Majerus (2000) citam que o suco de uva é mais contaminado que os vinhos, o qual há ausência do processo de fermentação; mas concentrações similares de ocratoxina A foram observadas em suco de uva e vinho tinto, mostrando que a OTA não era degradada durante o processo de vinificação (ZIMMERLI & DICK, 1996). Portanto se não foi detectado OTA nas uvas analisadas, dificilmente seria encontrado nos seus respectivos vinhos. Em algumas regiões geográficas é raro encontrar Aspergillius carbonarius, enquanto que em outras, sua presença é habitual. Por esta razão, recentemente estudos estão analisando a microbiota fúngica habitual no vinhedo a fim de poder estabelecer o risco real de que se produza o desenvolvimento de um fungo produtor de OTA (ROUSSEAU, 2004; SAGE et al., 2004). Segundo Rosa et al. (2002), a diversidade fúngica depende de vários fatores como a variedade de uva, grau de maturação e danos físicos dos grãos, das práticas de viticultura e condições climáticas. Ainda, Vanderlinde et al. (2005) afirmam que nas últimas safras, os vinhos brasileiros, principalmente os brancos não tiveram níveis muito altos de OTA e muitos não atingiram os limites detectáveis de OTA, indicando que a presença de OTA está relacionada diretamente às condições climáticas. Além do mais, fatores como atividade de água (aw), temperatura e umidade são importantes para o desenvolvimento fúngico e produção da micotoxina (LILLEHOJ & ELLING, 1983; MAGAN & LACEY, 1988; RAMOS et al., 1998). 55

56 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS - Não foi possível estabelecer uma relação direta entre a sanidade da uva com o teor de Ocratoxina A nas uvas e vinhos provenientes da variedade de uva Pinot Noir na safra de O teor de Ocratoxina A nas uvas e nos vinhos analisados não foi detectado, mesmo estes sendo microvinificados com uvas de diferentes condições de sanidade, com ataques fúngicos. - Todos os parâmetros físico-químicos analisados nos mostos e vinhos encontram-se dentro da legislação para a produção de vinhos ideais para consumo. - Embora o trabalho tenha demonstrado níveis inferiores aos limites de detecção de Ocratoxina A, para uma melhor avaliação, o mesmo deveria ser repetido em outras safras com diferentes condições meteorológicas, em diferentes variedades de uvas e com outros produtos (suco de uva). 56

57 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANLI, E.; BAYRAM, M. Ochratoxin A in Wines. Food Reviews International, 25 (2009) ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) Resolução RDC n 7 de 18 de fevereiro de 2011, que estabelece os Limites Máximos Tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos. ATOUI, A.; MITCHELL, D.; MATHIEU, F.; MAGAN AND,N.; LEBRIHI, A.; Partitioning of ochratoxin A in mycelium and conidia of Aspergillus carbonarius and the impact on toxin contamination of grapes and wine. Journal of Applied Microbiology, 103 (2007) BATITILANI, P.; PIETRI, A. Ochratoxin A in grapes and wine. European Journal of Plants Pathology. v. 108, p , BATTILANI, P.; PIETRI, A.; BERTUZZI, T.; LANGUASCO, L.; GIORNI, P.; KOZAKIEWICZ, Z. Occurrence of ochratoxin A producing fungi in grapes grown in Italy. Journal of Food Protection. v. 66, p , BELLÍ, N.; MARÍN, S.; DUAIGUES, A.; RAMOS, A.J.; SANCHIS, V. Ochratoxin A in wines, musts and grape juices from Spain. Journal of the Science of Food and Agriculture. v. 84, p BENNETT, J.W.; KLICH, M. Mycotoxins. Clinical Microbiology Reviews. v. 16, n. 3, p July BRAGULAT, M.R.; ABARCA, M.L.; CABAÑES, F.J. An easy screening method for fungi production Ochratoxin A in pure culture. International Journal of Food Microbiology, 71(2), (2001) BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Lei nº , de 12 de novembro de Altera dispositivos da Lei nº 7.678, de 8 de novembro de 1988, que 57

58 dispõe sobre a produção, circulação e a comercialização do vinho e derivados da uva e do vinho, e dá outras providências. CARIDI, A.; GALVANO, F.; ALESSIO, T.; ALBERTO, R.; Ochratoxin A removal during winemaking. Enzyme and Microbial Technology 40 (2006) CHIOTTA, M.L.; PONSONE, M.L.; COMBINA; M.; TORRES, A.M.; CHULZE; S.N. Aspergillus section Nigri species isolated from different wine-grape growing regions in Argentina. International Journal of Food Microbiology, 136 (2009) CLOUVEL, P.; BONVARLET, L.; MARTINEZ, A.; LAGOUARDE P.; DIENG, I.; MARTIN, P.; Wine contamination by ochratoxin A in relation to vine environment. International Journal of Food Microbiology. 123 (2008) CORONEL, M.B.; SANCHIS, V.; RAMOS, A.J.; MARIN, S. Assessment of the exposure to ochratoxin A in the province of Lleida, Spain. Food and Chemical Toxicology. 47 (2009) EL KHOURY, A.; RIZK, T.; LTEIF, R.; AZOURI, H.; DELIA, M. L., LEBRIHI, A. Fungal contamination and Aflatoxin B1 and Ochratoxin A in Lebanese wine grapes and musts. Food and Chemical Toxicology, 46 (2008) EMBRAPA UVA E VINHO, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 2012: Disponível em < Acessado em 22 de novembro de FAO, Food And Agriculture Organization of the United Nations. Worldwide Regulations for Mycotoxins in food and feed In 2003, Fao Food And Nutrition, paper 81, (2004). FLANZY, C. Enología: fundamentos científicos y tecnológicos. 2 ed. Madrid; Mundi- Prensa, GIOVANNINI, E. Produção de Uvas: para vinho, suco e mesa. Editora Renascença. 2ª Edição, 2005, 368 p. 58

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64 7. ANEXOS ANEXO I MINISTÉRIO DA SAÚDE AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA DIRETORIA COLEGIADA RESOLUÇÃO - RDC Nº 7, DE 18 DE FEVEREIRO DE 2011(*) Dispõe sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos. A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso da atribuição que lhe confere o inciso IV do art. 11 do Regulamento aprovado pelo Decreto nº 3.029, de 16 de abril de 1999, e tendo em vista o disposto no inciso II e nos 1º e 3º do art. 54 do Regimento Interno aprovado nos termos do Anexo I da Portaria nº 354 da Anvisa, de 11 de agosto de 2006, republicada no DOU de 21 de agosto de 2006, em reunião realizada em 15 de fevereiro de 2011, adota a seguinte Resolução da Diretoria Colegiada e eu, Diretor-Presidente Substituto, determino a sua publicação: Art. 1º Fica aprovado o Regulamento Técnico sobre limites máximos tolerados (LMT) para micotoxinas em alimentos, nos termos desta Resolução. Art. 2º Este Regulamento possui o objetivo de estabelecer os limites máximos para aflatoxinas (AFB1+AFB2+AFG1+AFG2 e AFM1), ocratoxina A (OTA), desoxinivalenol (DON), fumonisinas (FB1 + FB2), patulina (PAT) e zearalenona (ZON) admissíveis em alimentos prontos para oferta ao consumidor e em matériasprimas, conforme os Anexos I, II, III e IV desta Resolução. Parágrafo único. Os limites máximos tolerados referem-se aos resultados obtidos por metodologias que atendam aos critérios de desempenho estabelecidos pelo Codex Alimentarius. 64

65 Art. 3º Este Regulamento aplica-se às empresas que importem, produzam, distribuam e comercializem as seguintes categorias de bebidas, alimentos e matérias primas: I - amendoim e seus derivados; II - alimentos à base de cereais para alimentação infantil (lactentes e crianças de primeira infância); III - café torrado (moído ou em grão) e solúvel; IV - cereais e produtos de cereais; V - especiarias; VI - frutas secas e desidratadas; VII - nozes e castanhas; VIII - amêndoas de cacau e seus derivados; IX - suco de maçã e polpa de maçã; X - suco de uva e polpa de uva; XI - vinho e seus derivados; XII - fórmulas infantis para lactentes e fórmulas infantis de seguimento para lactentes e crianças de primeira infância; XIII - leite e produtos lácteos, e XIV - leguminosas e seus derivados. Art. 4º Os níveis de micotoxinas deverão ser tão baixos quanto razoavelmente possível, devendo ser aplicadas as melhores práticas e tecnologias na produção, manipulação, armazenamento, processamento e embalagem, de forma a evitar que um alimento contaminado seja comercializado ou consumido. 65

66 Art. 5º No caso de produtos não previstos no art. 3º desta Resolução e que sejam produzidos a partir de ingredientes com limites estabelecidos na forma dos Anexos deste Regulamento, que forem desidratados ou secos, diluídos, transformados e compostos, os limites máximos tolerados devem considerar as proporções relativas dos ingredientes no produto, concentração e diluição em relação aos limites estabelecidos para os ingredientes. 1º Na hipótese do "caput" deste artigo, o interessado será notificado para fornecer informações relativas à proporção dos ingredientes no produto, bem como aos fatores específicos de concentração e diluição, caso seja necessário. 2º A não apresentação das informações mencionadas no 1º no prazo de 10 (dez) dias, ou sua inadequação, ensejará conclusão com base nos dados disponíveis. Art. 6º Os limites máximos tolerados se aplicam à parte comestível dos produtos alimentícios em questão, salvo especificação em contrário. Art. 7º O descumprimento das disposições contidas nesta Resolução constitui infração sanitária, nos termos da Lei nº 6.437, de 20 de agosto de 1977, sem prejuízo das responsabilidades civil, administrativa e penal cabíveis. Art. 8º Ficam revogadas a Resolução CNNPA nº 34, de 1976, publicada no D.O.U. de 19/01/1977, e a Resolução RDC nº 274, de 15 de outubro de Art. 9º São concedidos prazos para aplicação dos limites máximos tolerados estabelecidos nos anexos desta Resolução, tendo em vista a necessidade de adequação do setor produtivo, com exceção dos limites estabelecidos no Anexo I. Art. 10. Os Limites Máximos Tolerados (LMT) estabelecidos para as Micotoxinas e as respectivas categorias de alimentos especificadas no Anexo II entrarão em vigor em 1º de janeiro de Art. 11. Os Limites Máximos Tolerados (LMT) estabelecidos para as Micotoxinas e as respectivas categorias de alimentos especificadas no Anexo III entrarão em vigor em 1º de janeiro de

67 Art. 12. Os Limites Máximos Tolerados (LMT) estabelecidos para as Micotoxinas e as respectivas categorias de alimentos especificadas no Anexo IV entrarão em vigor em 1º de janeiro de Art. 13. Esta Resolução e seu Anexo I entram em vigor na data de sua publicação. DIRCEU BRÁS APARECIDO BARBANO ANEXO I - Aplicação Imediata LIMITES MÁXIMOS TOLERADOS (LMT) PARA MICOTOXINAS LIMITES MÁXIMOS TOLERADOS (LMT) PARA MICOTOXINAS Micotoxinas Alimento LMT ( g/kg) Leite fluído 0,5 Aflatoxina M1 Leite em pó 5 Queijos 2,5 Cereais e produtos de cereais, exceto milho e derivados, 5 incluindo cevada malteada Feijão 5 Castanhas exceto Castanha-do-Brasil, incluindo nozes, pistachios, avelãs e amêndoas 10 Frutas desidratadas e secas 10 Castanha-do-Brasil com casca para consumo direto 20 Aflatoxinas Castanha-do-Brasil sem casca para consumo direto 10 B1, B2, G1, G2 Castanha-do-Brasil sem casca para processamento posterior 15 Alimentos à base de cereais para alimentação infantil (lactentes e crianças de primeira infância) 1 Fórmulas infantis para lactentes e fórmulas infantis de seguimento para lactentes e crianças de primeira 1 infância Amêndoas de cacau 10 67

68 Produtos de cacau e chocolate 5 Especiarias: Capsicum spp. (o fruto seco, inteiro ou triturado, incluindo pimentas, pimenta em pó, pimenta de caiena e pimentão-doce); Piper spp. (o fruto, incluindo a pimenta branca e a pimenta preta) Myristica 20 fragrans (noz-moscada) Zingiber officinale (gengibre) Curcuma longa (curcuma). Misturas de especiarias que contenham uma ou mais das especiarias acima indicadas Amendoim (com casca), (descascado, cru ou tostado), 20 pasta de amendoim ou manteiga de amendoim Milho, milho em grão (inteiro, partido, amassado, 20 moído), farinhas ou sêmolas de milho Cereais e produtos de cereais, incluindo cevada 10 malteada Feijão 10 Café torrado (moído ou em grão) e café solúvel 10 Vinho e seus derivados 2 Suco de uva e polpa de uva 2 Especiarias: Capsicum spp. (o fruto seco, inteiro ou triturado, incluindo pimentas, pimenta em pó, pimenta de caiena e pimentão-doce) Piper spp. (o fruto, incluindo Ocratoxina A a pimenta branca e a pimenta preta) Myristica 30 fragrans (noz-moscada) Zingiber officinale (gengibre) Curcuma longa (curcuma) Misturas de especiarias que contenham uma ou mais das especiarias acima indicadas Alimentos a base de cereais para alimentação infantil 2 (lactentes e crianças de primeira infância) Produtos de cacau e chocolate 5,0 Amêndoa de cacau 10 Frutas secas e desidratadas 10 Desoxinivalenol Arroz beneficiado e derivados

69 (DON) Alimentos a base de cereais para alimentação infantil (lactentes e crianças de primeira infância) 200 Milho de pipoca 2000 Fumonisinas Alimentos a base de milho para alimentação infantil (B1 + B2) 200 (lactentes e crianças de primeira infância) Zearalenona Alimentos a base de cereais para alimentação infantil (lactentes e crianças de primeira infância) 20 Patulina Suco de maçã e polpa de maçã 50 ANEXO II - Aplicação em janeiro de 2012 LIMITES MÁXIMOS TOLERADOS (LMT) PARA MICOTOXINAS Micotoxinas Alimento LMT ( g/kg) Trigo integral, trigo para quibe, farinha de trigo integral, 2000 farelo de trigo, farelo de arroz, grão de cevada Desoxinivalenol Farinha de trigo, massas, crackers, biscoitos de água e (DON) sal, e produtos de panificação, cereais e produtos 1750 de cereais exceto trigo e incluindo cevada malteada Farinha de milho, creme de milho, fubá, flocos, canjica, Fumonisinas 2500 canjiquinha (B1 + B2) Amido de milho e outros produtos à base de milho 2000 Farinha de trigo, massas, crackers e produtos de panificação, cereais e produtos de cereais exceto trigo e 200 incluindo cevada malteada Arroz beneficiado e derivados 200 Zearalenona Arroz integral 800 Farelo de arroz 1000 Milho de pipoca, canjiquinha, canjica, produtos e subprodutos à base de milho 300 Trigo integral, farinha de trigo integral, farelo de trigo 400 ANEXO III- Aplicação em janeiro de

70 LIMITES MÁXIMOS TOLERADOS (LMT) PARA MICOTOXINAS Micotoxinas Alimento LMT ( g/kg) Ocratoxina A Cereais para posterior processamento, incluindo grão de 20 cevada Trigo e milho em grãos para posterior processamento 3000 Trigo integral, trigo para quibe, farinha de trigo integral, 1500 Desoxinivalenol farelo de trigo, farelo de arroz, grão de cevada (DON) Farinha de trigo, massas, crackers, biscoitos de água e sal, e produtos de panificação, cereais e produtos 1250 de cereais exceto trigo e incluindo cevada malteada. Fumonisinas (B1 + B2) Milho em grão para posterior processamento 5000 Zearalenona Milho em grão e trigo para posterior processamento 400 ANEXO IV - Aplicação em janeiro de 2016 LIMITES MÁXIMOS TOLERADOS (LMT) PARA MICOTOXINAS Micotoxinas Alimento LMT ( g/kg) Trigo integral, trigo para quibe, farinha de trigo integral, 1000 farelo de trigo, farelo de arroz, grão de cevada Desoxinivalenol Farinha de trigo, massas, crackers, biscoitos de água e (DON) sal, e produtos de panificação, cereais e produtos 750 Fumonisinas (B1 + B2) Zearalenona de cereais exceto trigo e incluindo cevada malteada. Farinha de milho, creme de milho, fubá, flocos, canjica, canjiquinha 1500 Amido de milho e outros produtos a base de milho 1000 Farinha de trigo, massas, crackers e produtos de panificação, cereais e produtos de cereais exceto trigo e

71 incluindo cevada malteada. Arroz beneficiado e derivados 100 Arroz integral 400 Farelo de arroz 600 Milho de pipoca, canjiquinha, canjica, produtos e subprodutos à base de milho 150 Trigo integral, farinha de trigo integral, farelo de trigo 200 (*) Republicada por ter saído, no DOU nº 37, de , Seção 1, pág. 72, com incorreção no original. D.O.U., 22/02/ Seção 1 REP., 09/03/ Seção 1 71

72 ANEXO II METODOLOGIA ANÁLISE DE OCRATOXINA A HPLC OIV OENO es RESOLUCION OENO 16/2001 DETERMINACION DE LA OCRATOXINA POR COLUMNA DE INMUNO- AFINIDAD LA ASAMBLEA GENERAL, Visto el Artículo 5, inciso 4 de la Convención internacional de unificación de los métodos de análisis y de apreciación de los vinos del 13 de octubre de 1954, A propuesta de la Sub-Comisión de métodos de análisis y de apreciación de los vinos, DECIDE introducir en el Anexo A del Compendio de los métodos internacionales de análisis de los vinos y mostos, el método siguiente: DETERMINACION DE LA OCRATOXINA EN EL VINO DESPUES DE PASAJE SOBRE COLUMNA DE INMUNO-AFINIDAD Y CLHP CON DETECCION FLUORIMETRICA 1. CAMPO DE APLICACION Este documento describe un método que se aplica a la determinación de la ocratoxina A (OTA) en los vinos tintos, rosados y blancos (comprendidos los vinos especiales) en concentraciones que van hasta 10 μg/l utilizando una columna de inmunoafinidad y la cromatografía líquida alto rendimiento (CLHP) [1]. Este método ha sido validado durante un estudio realizado en colaboración internacional, que consistió en dosificar la OTA en los vinos blancos y tintos en el transcurso del análisis de vinos naturalmente contaminados y de vinos a los que se adicionó la toxina a concentraciones entre 0,01 μg/l y 3,00 μg/l. El método puede aplicarse a los vinos espumosos y a los vinos de aguja, a condición que las muestras sean previamente desgasificadas (por sonicación por ejemplo). 2. PRINCIPIO Las muestras de los vinos son diluidas con una solución conteniendo polietileno glicol e hidrógenocarbonato de sodio, luego son filtradas y purificadas sobre columna de inmunoafinidad. La OTA es eluída con metanol y cuantificada por CLHP en fase inversa con uma detección fluorimétrica. 3. REACTIVOS Durante el análisis, salvo indicación contraria, utilizar únicamente reactivos reconocidos de calidad para el análisis o agua de calidad EN ISO Los solventes deben ser de calidad CLHP. 72

73 3.1 Cloruro de sodio (NaCl) 3.2 Hydrógenocarbonato de sodio (NaHCO3) 3.3 Polietileno Glicol (PEG 8000) 3.4 Metanol (CH3OH) 3.5 Acetonitrilo (CH3CN) 3.6 Agua purificada para laboratorio Por ejemplo, de calidad EN ISO 3696 (agua para utilización en laboratorio de química analítica-especificación y método experimental [ISO 3696 : 1997]) 3.7 Acido acético 85% (CH3COOH) 3.8 Solución de dilución (1% PEG + 5% NaHCO3) Disolver 10 g de PEG (3.3) et 50 g de NaHCO3 (3.2) en 950 ml de agua y completar a 1 litro con agua. 3.9 Solución de lavado (2,5% de NaCl + 0,5 % NaHCO3) Disolver 25 g de NaCl (3.1) y 5 g de NaHCO3 (3.2) en 950 ml de agua y completar a 1litro con agua Fase móvil CLHP (agua:acetonitrilo:ácido acético glacial, 99:99:2, v/v/v) Mezclar 990 ml de agua con 990 ml de acetonitrilo (3.5) y 20 ml de ácido acético glacial (3.7). Filtrar en filtro 0,45 μm y desgasificar (por ejemplo con helio) Tolueno 3.12 Mezcla de solventes (Tolueno:ácido acético glacial, 99:1, v/v). Mezclar 99 partes en volumen de tolueno (3.11) con una parte en volumen de ácido acético glacial (3.7) Solución madre de OTA Disolver 1 mg de OTA o el contenido de una ampolla (si la OTA ha sido obtenida em forma de película después de la evaporación) en la mezcla de solvente (3.12) para obtener una solución conteniendo aproximadamente 20 à 30 μg/ml d'ota. Para determinar la concentración exacta, registrar el espectro de absorción de la solución 300 et 370 nm en una cubeta de cuarzo de 1 cm de camino óptico utilizando la mezcla de solvente (3.12)como blanco. Identificar el máximo de absorción y calcular la concentración de OTA'OTA (c) en μg/ml por medio de la ecuación siguiente: c = Amax M 100 / ε δ En la cual: Amax = Absorción determinada a la longitud de onda máxima (a más o menos 333 nm) M = masa molecular de la OTA = 403,8 g/mole ε = coeficiente de extinción molar de la OTA en la mezcla de solvente (3.12) (ε = 544/mole) 73

74 δ = camino óptico (cm) Esta solución es estable a 18 C por lo menos durante 4 años Solución estándar de OTA (2 μg/ml en el tolueno:ácido acético, 99:1, v/v) Diluir la solución madre (3.13) con la mezcla de solventes (3.12) para obtener una solución estándar con una concentración de OTA de 2 μg/ml. Esta solución puede ser conservada a +4 C en el refrigerador. Su estabilidad debe ser controlada regularmente. 4. UTENSILIOS Equipo habitual de laboratorio y en particular el material siguiente: 4.1 Frascos de vidrio (4 ml) 4.2 Bomba de vacío para preparar las columnas de inmunoafinidad. 4.3 Recipiente y tubo de evacuación adaptados a las columnas de inmunoafinidad 4.4 Filtros en fibra de vidrio (por ejemplo Whatman GF/A). 4.5 Columna de inmunoafinidad específica para la OTA. La columna debe tener una capacidad de ligazón total al menos igual a 100 ng de la OTA y permitir um rendimiento de purificación al menos igual a 85% cuando se hace pasar una solución diluída de vino conteniendo 100 ng de OTA. 4.6 Evaporador giratório 4.7 Cromatógrafo líquido, con una bomba capaz de asegurar un caudal constante 1ml/mn en isocrático. 4.8 Sistema de inyección, equipado de un circuito de 100 μl. 4.9 Columna de CLHP analítica en acero 150 4,6 mm (d.i.) rellena con una fase estacionaria C18 (5 μm) precedida de una pre-columna o pre-filtro (0,5 μm) conteniendo una fase conveniente.columnas de dimensiones diferentes pueden ser utilizadas siempre y cuando aseguren una buena línea de base y un ruido de fondo que permita la detección del pico de OTA sobre los otros picos Detector de fluorescencia conectado a la columna y cuya longitud de onda de excitación esté fijada a 333 nm y la longitud de onda de emisión a 460 nm Sistema de adquisición de datos 4.12 Espectrómetro U.V. 74

75 5. MODO DE OPERACION 5.1 Preparación de las muestras Verter 10 ml de vino en un frasco cónico de 100 ml. Agregar 10 ml de la solución de dilución (3.8). Mezclar vigorosamente. Filtrar sobre filtro en fibra de vidrio (4.4) (el filtrado es necesario para las soluciones turbias o cuando aparece un precipitado, después de la dilución). 5.2 Purificación por columna de inmunoafinidad Ajustar la columna de inmunoafinidad (4.5) a la bomba de vacío (4.2) y fijar el recipiente (4.3). Agregar 10 ml (equivalente de 5 ml de vino) de la solución diluida en el recipiente y hacer pasar en la columna de inmunoafinidad con un caudal de aproximadamente 1 gota por segundo. Debe evitarse que la columna de inmunoafinidad esté en seco. Lavar la columna de inmunoafinidad con 5 ml de la solución de lavado (3.9) luego con 5 ml de agua siempre con caudal de 1 a 2 gotas por segundo. Secar la columna haciendo pasar aire. Eluir la OTA en el frasco de vidrio (4.1) con 2 ml de metanol (3.4) a la velocidad de 1 gota por segundo. Evaporar el eluido a seco a 50 C bajo hidrógeno. Redisolver inmediatamente en 250 μl de la fase móvil CLHP (3.10) y almacenar a 4 C hasta el análisis por CLHP. 5.3 Análisis CLAR (Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento) Inyectar 100 μl de extracto reconstituido (equivalente a 2 ml de vino) en el cromatógrafo por el circuito de inyección. Condiciones operatorias: Caudal: 1 ml /min. Fase móvil: acetonitrilo:agua:ácido acético glacial (99:99:2, v/v/v) Detección fluorimétrica: longitud de onda de excitación= 333 nm Longitud de onda de emisión= 460 nm Volumen de inyección: 100 μl 6. CUANTIFICACION DE LA OCRATOXINA A (OTA) La cuantificación de la OTA deberá ser realizada midiendo las áreas bajo curva (o, si no, las alturas de picos).al tiempo de retención de la OTA, por comparación com la curva de calibración. 6.1 Curva de calibración Preparar una curva de calibración cada día de análisis y cada vez que las condiciones cromatográficas cambien. Medir 0,5 ml de la solución estándar de OTA (3.14) a 2 μg/ml en un frasco de vidrio y evaporar el solvente bajo hidrógeno. Redisolver en 10 ml de fase móvil CLAR (3.10) previamente filtrada en filtro 0,45 μm. Se obtiene así una solución de OTA a 100 ng/ml. Preparar 5 soluciones de calibrado CLAR en 5 frascos aforados de 5 ml siguiendo el Cuadro 1. Completar cada estándar a 5 ml con la fase móvil CLAR (3.10). Inyectar 100 μl de cada solución en el CLAR. 75

76 NOTA: 1. Si la cantidad de OTA en las muestras se sitúa más allá de la gama de calibración, una dilución apropiada será realizada o bien volúmenes inferiores deberán ser inyectados. En este caso, el cálculo final (7) debe ser considerado caso por caso. 2. Debido a la gran variabilidad de las concentraciones, se recomienda hacer pasar la recta de calibración por cero para obtener una cuantificación exacta para las escasas concentraciones de OTA (inferiores a 0,1μg/l). 7. CALCULOS Calcular a partir de las curvas de calibrado la cantidad de OTA en la parte alícuota de la solución testada inyectada en la columna de CLAR. Calcular la concentración de OTA (COTA) en ng/ml (équivalent à μg/l) utilizando la fórmula: COTA = MA 2/V1 V3/V2 En la cual: MA es la masa de ocratoxina A (en ng) en la parte alícuota de la matriz inyectada em la columna y determinada a partir de la curva de calibración. 2 es el factor de dilución. V1 es el volumen de muestra a analizar (10 ml) V2 es el volumen de la solución testada, inyectada en la columna (100 μl) V3 es el volumen de solución utilizada para redisolver el eluído seco (250 μl) 8. RENDIMIENTO DEL METODO EN LABORATORIO El Cuadro 2 reúne los resultados del método aplicado a los vinos blancos, rosados y tintos, en los laboratorios que han participado a la validación del mismo. 76

77 9. TRABAJO EN COLABORACION El método ha sido validado por un estudio en colaboración, en el cual participaron 16 laboratorios repartidos en 8 países, siguiendo las recomendaciones del protocolo harmonizado para la validación de los métodos de análisis. [2].Cada participante analizó 10 vinos blancos, 10 vinos tintos, los cuales representaban 5 vinos duplicados a ciegas naturalmente contaminados o sobrecargados. El rendimiento del método que deriva de este trabajo es consignado en los anexos I y II. 77