11 a 14 de dezembro de 2012 Campus de Palmas

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1 CONTROLE SANITÁRIO EM PEIXES AMAZÔNICOS: DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA A PREVENÇÃO E O CONTROLE DE PATÓGENOS POTENCIALMENTE CAUSADORES DE ZOONOSES - PCR-RFLP. Aline Rodrigues Dantas 1 ; Marcello Otake Sato 2 1 Aluna do Curso de Medicina; Campus de Palmas; ard.aline@gmail.com; PIBIC/CNPq 2 Orientador do Curso de Medicina; Campus de Palmas; otake@mail.uft.edu.br RESUMO Os heterophiídeos, grupo de trematóides gastrintestinais, acometem mamíferos, aves e peixes e são considerados um dos maiores responsáveis por doença em humanos e perdas na produção animal. Por possuírem apenas uma célula, a extração de DNA das metacercárias torna-se difícil. A proposta do presente trabalho foi avaliar a metodologia mais adequada para extração de DNA genômico de metacercárias de Heterophiideos, o que permitiria qualificar sua ocorrência em peixes amazônicos e um melhor controle sanitário. A extração dos DNAs das metacercárias foi dividida entre grupos com fim análise do significado da maceração e/ou efeito de lise adicional por proinase K seguida por PCR. Após corrida eletroforética, observou-se formação de apenas uma banda para cada amostra, e que essas bandas encontravam-se em mesma altura no gel, indicando que o fragmento amplificado pela PCR foi de tamanho semelhante em todas as amostras. Portanto, a extração de DNA através do método clássico (fenol-clorofórmio) mostrou-se eficaz e equivalente em todos os grupos de amostras, o que implica dizer que apenas os reagentes utilizados no método são capazes de quebrar a dupla parede que envolve o parasito, sem necessidade de maceração ou efeito lise adicional. A PCR também é uma valiosa ferramenta na detecção desses parasitos, uma vez que resultou em amplificação exponencial das cópias de DNA a partir de uma única metacercária, em quantidade considerável. Mesmo não sendo possível realizar identificação morfológica das metacercárias, devido à especificidade dos primers, seria factível delinear uma técnica de PCR-RFLP, após o sequenciamento dos amplicons obtidos. Palavras-chave: metacercárias; heterophiídeos; peixes; zoonoses, PCR. INTRODUÇÃO Nas últimas décadas tem aumentado consideravelmente a relevância dos estudos relacionados com parasitos e outros patógenos de organismos aquáticos, principalmente daqueles hospedeiros com potencial para o cultivo e para a comercialização, face ao aumento significativo destas atividades no Brasil e no mundo. (LUQUE, 2004, p. 161) Os peixes, assim como outros animais, podem ser vítimas

2 de uma variedade enorme de agentes causadores de doenças, de origem viral, bacteriana, micótica e/ou parasitária, colocando em risco, algumas vezes, a saúde do consumidor. (RUPPERT et al., 2005 apud MACUÁCUA, 2010) Visto a escassez de informações a respeito da fauna parasitária de peixes amazônicos [...], é fundamental o desenvolvimento de pesquisas que objetivem o conhecimento da riqueza biológica da Amazônia, e a partir daí determinar a importância sanitária e de saúde pública de peixes comercializados e/ou beneficiados na região, buscando padronizar técnicas eficientes na inspeção do pescado, protegendo o consumidor e beneficiando exportadores. (OLIVEIRA, L. 2005) O conhecimento dos parasitos de peixes é fundamental sob o aspecto de produção e para a inspeção sanitária, pois através da ação espoliativa, tóxica ou mecânica, estes bioagentes podem desencadear quadros patológicos que restringem o crescimento e até podem levar à morte de seus hospedeiros (SÃO CLEMENTE et al., 1998 apud NEVES, 2009; EIRAS, 1994 apud NEVES, 2009) Avanços científicos recentes, principalmente no campo da biotecnológica, têm auxiliado no esclarecimento e controle dos processos patogênicos em peixes. Ferramentas e técnicas de biologia molecular têm sido desenvolvidas e utilizadas para o diagnóstico das principais doenças [e] caracterização molecular de isolados [...]. (FIGUEIREDO et al., 2008) Os heterophiídeos, grupo de trematóides gastrintestinais, acometem mamíferos, aves e peixes e são considerados um dos maiores responsáveis por doença em humanos, patogenia e perdas na produção animal. (OLIVEIRA, A. et al., 2007) A infecção do hospedeiro definitivo é passiva e ocorre pela da ingestão de peixes transportando metacercárias, encontradas geralmente fixadas na pele ou brânquias. Por possuírem apenas uma célula, a extração de DNA das metacercárias torna-se difícil, pela quantidade de DNA e pela composição da dupla parede que envolve o parasito. Surge assim a proposta deste trabalho de avaliar a metodologia mais adequada para extração de DNA genômico de metacercárias de Heterophiideos de boa qualidade e em maior quantidade, utilizando técnicas rápidas e altamente sensíveis e específicas de biologia molecular, de modo a qualificar a ocorrência de heterophiídeos em peixes amazônicos o que possibilitaria um melhor controle sanitário dos mesmos. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos do estudo foram realizados no Laboratório Multidisciplinar/Biotério da Universidade Federal do Tocantins, campus de Palmas. Foram coletados peixes, com auxílio de rede e

3 anzol, entre maio de 2012 e agosto de 2012, do Lago de Palmas (10º17 34 S 48º26 08 W) e do Ribeirão Araras (10º08 29 S e 48º29 23 W), no município de Palmas, estado do Tocantins. Os peixes coletados eram mantidos vivos (em galão de água, oxigenada com bomba de ar) até serem sacrificados para análise, esta realizada em placa de petri, com auxílio de microscópio (lupa) estereoscópico, para infecção por metacercárias. A pesquisa fez-se nas nadadeiras removidas com tesoura - e superfície corporal após remoção das escamas com bisturi; se encontrado sinal de infecção seguia-se à pesquisa da musculatura através de cortes, também com bisturi. A extração das metacercárias encontradas durante análise foi realizada manualmente com auxílio de agulha descartável para seringa. O acondicionamento das amostras foi feito parte em eppendorf com solução salina a 0,85%; parte em eppendorf com álcool 70%. Os eppendorfs foram mantidos à temperatura ambiente. A extração do DNA foi feita das metacercárias, individualmente, encontradas no pescado. Consistiu, primeiramente, na separação de quatro grupos de amostras (M, S, P, PS). As amostras do grupo M, após acréscimo de água destilada (reagente constituinte do método), sofreram leve maceração antes de serem acrescentados os reagentes restantes e realizadas as técnicas próprias do método. As amostras do grupo S, não sofreram maceração. As amostras do grupo P, após acréscimo de água destilada (reagente constituinte do método), sofreram leve maceração, seguida do acréscimo de proteinase K (reagente constituinte do método); a solução foi colocada em banho Maria por 30 minutos à 50º C, para efeito de lise adicional de membranas, antes de serem acrescentados os reagentes restantes e realizadas as técnicas próprias do método. As amostras do grupo SP, não sofreram maceração, mas também foram acrescidas de proteinase K à semelhança do grupo P. A reação de PCR foi realizada em mistura de dntps, MgCl 2, TAq polimerase, primers e DNA molde (foi realizada a PCR do resultante da extração de DNA de cada uma das metacercárias individualmente). A PCR foi feita em 1 hora e 20 minutos, com ciclos de amplificação consistindo de 30 segundos de desnaturação a 94 C, 30 segundos de anelamento a 55ºC (devido aos primers utilizados) e extensão de 40 segundos a 72 C, mais 5 minutos de extensão a 72 C. Os primers padrões utilizados para a amplificação foram o pr-a (5 - TGG TTT TTT GGG GTC CAT CCT GAG GTT TA - 3 ) e o pr-b (5 - AGA AAG AAC GTA ATG AAA ATG AGC AAC - 3 ). Os produtos das reações de PCR - acrescidos de um tampão de corrida (Bromophenol Blue, loading solution) - e de 3 a 4 µl de marcador (DNA ladder, 100bp) foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2%, sendo o mesmo submerso em uma solução eletrolítica (TBE), aplicando-se uma

4 corrente elétrica com 150v, por um período aproximado de 30 a 40 minutos. A visualização dos resultados foi feita sob luz UV emitida por um transluminador. Foram feitas quatro eletroforeses, segundo técnica explicada, entre os grupos M e P, os grupos S e M, somente com o grupo PS e com todos os grupos juntos. RESULTADOS E DISCUSSÃO O número de peixes coletados totalizou 41 exemplares distribuídos em dez espécies (Hoplias malabaricus, nove espécimes; Hoplerythrinus unitaeniatus, dois espécimes; Crenicichla sp., um espécime; Geophagus sp., sete espécimes; Aquidens sp., dois espécimes; Serrasalmus brandti, um espécime; Pimelodus sp., um espécime; Tetragonopterus argenteus, dois espécimes; Astianax sp., 12 espécimes e Bryconops alburnoides, quatro espécimes). Destes 11 encontravam-se infectados (inteirando 64 metacercárias), sendo esses um Aquidens sp. (perfazendo oito metacercárias encontradas), três Hoplias malabaricus (perfazendo dez metacercárias encontradas), três Astianax sp. (perfazendo cinco metacercárias encontradas) e quatro Bryconops alburnoides (perfazendo 41 metacercárias encontradas). O resultado após a extração dos DNAs das metacercárias (divididas em grupos, como já exposto) e PCR obteve-se pela eletroforese. Passou-se então à análise das fotos dos géis onde se realizaram as corridas de eletroforese entre os grupos M e P, entre os grupos M e S, somente com o grupo PS e entre todos os grupos juntos. Em cada uma das eletroforeses observou-se a formação de apenas uma banda para cada amostra, e que essas bandas encontravam-se em mesma altura no gel, indicando que o fragmento amplificado pela PCR foi de tamanho semelhante em todas as amostras. Dos resultados obtidos é possível afirmar que a extração de DNA através do método clássico (fenol-clorofórmio) mostrou-se eficaz e equivalente em todos os grupos de amostras, o que implica dizer que apenas os reagentes utilizados no método são capazes de quebrar a dupla parede que envolve o parasito, sem necessidade de maceração. A PCR também é uma valiosa ferramenta na detecção desses parasitos, uma vez que seu uso possibilitou a amplificação exponencial das cópias de DNA a partir de uma única metacercária, em quantidade considerável, permitindo armazenamento para posterior uso e/ou comparação. Mesmo não sendo possível a identificação morfológica das metacercárias, devido à especificidade dos primers, seria possível delinear uma técnica de PCR-RFLP, após o sequenciamento dos amplicons obtidos.

5 LITERATURA CITADA OLIVEIRA, Sandra Aparecida de; BLAZQUEZ, Francisco Javier Hernandez; ANTUNES, Sergio Araújo; MAIA, Antonio Augusto Mendes. Metacercárias de Ascocotyle (Phagicola) longa Ransom, 1920 (Digenea: Heterophyidae), em Mugil platanus, no estuário de Cananéia, SP, Brasil Ciência Rural. v.37, n.4, p , FIGUEIREDO, Henrique César Pereira; LEAL, Carlos Augusto Gomes. Tecnologias aplicadas em sanidade de peixes. Revista Brasileira de Zootecnia, Viçosa, v. 37, n. spe, July Disponível em: < Acesso em: 2 de Março de LUQUE, José Luis. Biologia, Epidemiologia E Controle De Parasitos De Peixes. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v.13, suplemento 1, Disponível em: < Acesso em: 21 de Agosto de NEVES, Daniela Nogueira. Helmintos Parasitos De Peixes De Importância Higiênico-Sanitária. Belém, Disponível em: < %20Daniela%20Nogueira%20Neves.pdf> Acesso em: 2 de Março de MACUÁCUA, Aventina Artur. Estudo de Metazoários Parasitas do Peixe Serra Scomberomorus commersoni(lacépède, 1800) da Baía de Maputo. Maputo, Disponível em: < %20ESTUDO.pdf> Acesso em: 2 de Março de BARROS, Luciano Antunes ; FILHO, Jonas Moraes; OLIVEIRA, Renê Luiz de. Nematóides Com Potencial Zoonótico Em Peixes Com Importância Econômica Provenientes Do Rio Cuiabá. Revista Brasileira de Ciência Veterinária, v. 13, n. 1, p , jan./abr OLIVEIRA, Silvio Abner Lameira de. Pesquisa De Helmintos Em Musculatura E Serosa Abdominal De Peixes De Importância Comercial Capturados No Litoral Norte Do Brasil. Belém, Disponível em: < VEIRA.pdf> Acesso em: 2 de Março de BARROS, Ana Amélia Borba Gonçalves; MAGALHÃES, Gabriela Rocha; CAVALCANTE, Vânia de Fátima do Nascimento. Ocorrência De Endoparasitos Em Peixes Consumidos No Município De Curralinho, Ilha Do Marajó, Estado Do Pará, E Sua Importância Na Inspeção Do Pescado. Belém, AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq Brasil.