Sobrevivência de espermatozoides de catetos (Pecari tajacu) após congelação-descongelação no uso de diferentes diluentes

Transcrição

1 Acta Scientiae Veterinariae, : RESEARCH ARTICLE Pub ISSN Sobrevivência de espermatozoides de catetos (Pecari tajacu) após congelação-descongelação no uso de diferentes diluentes Survival of Collared Peccaries (Pecari tajacu) Sperm after Freezing-thawing Using Different Extenders Lívia Batista Campos, Mariana de Araújo da Silva, José Artur Brilhante Bezerra, Thibério de Souza Castelo, Gislayne Christianne Xavier Peixoto & Alexandre Rodrigues Silva ABSTRACT Background: The development of semen cryopreservation protocols for collared peccaries (Pecari tajacu) would contribute to its preservation and multiplication. Nowadays, studies on this subject report the use of Tris and powdered coconut water (ACP -116c) as extenders. However, such studies are limited to the post-thawing immediate evaluation of samples. The knowledge on the sperm survival after thawing would be important in order to schedule the moment and the vial for artificial insemination. Therefore, the aim of the present research was to verify the effect of Tris and ACP extenders on the sperm survival of frozen-thawed semen, centrifuged or not, derived from collared peccaries. Materials, Methods & Results: Semen from 12 adult males collared peccaries were obtained by electroejaculation. Ejaculates were immediately evaluated for sperm motility, vigor, viability, functional membrane integrity and morphology. Samples were diluted in Tris or ACP, both plus 10% egg yolk and 3% glycerol. Then, they were packaged into 0.25 ml straws, and stored in liquid nitrogen. After one week, samples were thawed at 38ºC/1 min and divided into two aliquots: one immediately diluted in the same extender, and the other submitted to centrifugation and then re-diluted. A thermorresistance test was conducted including assessments at 0, 15, 30, 45, and 60 min as described for fresh semen. After analyzing the data immediately after thawing, we verify that coconut water provided a better preservation of sperm motility (41.3 ± 6.9%) and vigor (2.9 ± 0.2) than Tris, 33.1 ± 5.9% motile sperm with vigor 2.5 ± 0.2 (P < 0.05). During thermorresistance test, however, semen parameters in re-diluted samples rapidly decline after 15 min incubation, in the use of both extenders, independently of the centrifugation (P < 0.05). After 60 min, values for sperm motility were lower than 10% for all the samples, corresponding to the values found for sperm viability. In this moment, no statistical differences were verified between extenders in the samples centrifuged or not (P > 0.05). Discussion: As the first study at evaluating the effect of different extenders on collared peccary sperm survival, it was observed that its frozen-thawed semen samples centrifuged or not, present a very low post-thawing longevity in the use of Tris or ACP extenders. These are, nowadays, the unique extenders reported for collared peccary semen cryopreservation and both seems to be efficient for this proposal. However, an immediate use of the thawed samples is recommended, especially for intrauterine artificial insemination. A reduced longevity after thawing is also observed for swine sperm, the domestic animal more closely related to the peccaries. It is known that swine sperm present great amounts of unsaturated lipids on its plasma membrane, and due to this characteristic, it is highly sensible to freezing-thawing procedures. Due to similarities among swine and peccaries, such characteristic could possibly be extrapolated to the peccaries, but further studies regarding its sperm membrane composition should be conducted. In conclusion, collared peccaries sperm presents a short post-thawing survival, both in the use of Tris or ACP extenders, and its immediate use is recommended. Furthermore, no benefits are derived from the centrifugation process that seems to be unnecessary for frozen-thawed semen samples. Keywords: Tayassu tajacu, thermorresistance test, semen freezing, extenders. Received: 8 June 2014 Accepted: 17 October 2014 Published: 31 October 2014 Laboratório de Conservação e Germoplasma Animal, Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró, RN, Brazil. CORRESPOND- ENCE: A.R. Silva (legio2000@yahoo.com Fax: +55 (84) ) Departamento de Ciências Animais, Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), BR 110, Km 47, Bairro Pres. Costa e Silva. CEP: Mossoró, RN, Brazil. 1

2 INTRODUÇÃO Embora a população de catetos (Pecari tajacu) seja considerada mundialmente estável [14], eles encontram-se sob ameaça na Mata Atlântica e Caatinga [13]. O desenvolvimento de protocolos de criopreservação de sêmen contribuiria para sua preservação e multiplicação em cativeiro. Tais protocolos devem garantir a sobrevivência espermática após descongelação [11], e sua viabilidade no trato reprodutivo da fêmea [21]. Em suínos, filogeneticamente próximos aos catetos [6], o sêmen descongelado tem apresentado baixos valores de motilidade nos testes de termorresistência [3,18,28]. Em catetos, estudos de criopreservação espermática em diluentes à base de Tris [5] ou água de coco - ACP-116c [23] limitam-se à avaliação imediata pós-descongelação, sendo desconhecido o tempo de sobrevivência espermática. Esta informação permitiria uma melhor programação do tempo de uso da dose inseminante, fornecendo direcionamento sobre o sítio de deposição do sêmen. O glicerol tem sido o crioprotetor mais utilizado em diferentes espécies [15,16,24], incluindo catetos [1,5,23]. Apesar dos efeitos benéficos, ele promove alterações físico-químicas que podem levar a ruptura de membranas celulares ou perda de importantes proteínas [8,12,17]. Em humanos, sugere-se que a centrifugação das amostras associada a re-diluição após descongelação reduziria danos espermáticos [22]. Em guepardos, a centrifugação do sêmen descongelado melhora a qualidade seminal [7]. Neste contexto, objetivou-se verificar o efeito dos diluentes Tris e ACP-116c na sobrevivência espermática em amostras descongeladas, centrifugadas ou não, provenientes de catetos. MATERIAIS E MÉTODOS Doze machos catetos, com idade média de 3,3 ± 1,6 anos, pesando 20,5 ± 1,26 kg, foram utilizados neste estudo. Os animais pertencem ao Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS - UFERSA), localizado no nordeste do Brasil (Mossoró, RN, Brasil, 5 10 S, W), tendo sido alimentados com ração balanceada para suínos, fabricada na própria UFERSA, acrescida de vegetais e água ad libitum. Os animais foram contidos fisicamente com auxílio de um puçá e anestesiados por via intravenosa com propofol 1, na dose de 5 mg/kg em bolus [26]. Durante todo o procedimento, os animais foram mantidos em fluidoterapia e as variáveis fisiológicas como temperatura corporal, pulso e frequencia respiratória foram monitoradas. O sêmen foi coletado utilizando-se um eletroejaculador 2 conectado a uma fonte de 12 V. O ciclo de estimulação foi composto por 10 estímulos em cada tensão, iniciando-se com 5 V, seguidos por incrementos de 1 V até atingir 12 V. Cada estímulo durava 3 s, com intervalos intermitentes de 2 s. O ciclo de estímulos foi mantido por 10 min, considerando-se desde o início do procedimento [5]. O sêmen foi coletado em tubos de plástico e imediatamente avaliado. Imediatamente após coleta, o volume do sêmen foi mensurado por micropipetas, sendo anotados o aspecto e a cor dos ejaculados. A concentração espermática foi avaliada em câmara hematimétrica de Newbauer, utilizando-se uma alíquota de 10 μl de sêmen diluída em solução salina formalizada a 10% (2 ml). A motilidade (%) e o vigor espermático (0-5) foram avaliados sob microscopia de luz (100 e 400 ). Para avaliação da morfologia e da viabilidade espermáticas, foi confeccionado um esfregaço de sêmen corado com Azul de Bromofenol avaliado por microscopia de luz (400 ), sendo contadas 200 células [25]. Para avaliação da integridade funcional da membrana plasmática, foi realizado um teste hiposmótico, utilizando uma alíquota de 10 µl de sêmen acrescentada em 90 µl de água destilada (0 mosm/l). Após 45 min de incubação a 38ºC, uma alíquota de sêmen foi avaliada por microscopia de contraste de fase (400 ). Os espermatozoides apresentando edema e dobramento de cauda foram considerados como portadores de uma membrana plasmática funcional [20]. Na diluição do sêmen foram utilizados dois diluentes. O primeiro à base de tampão Tris, composto por 3,028 g de Tris-hidroximetilaminometano, 1,78 g de ácido cítrico monohidratado e 1,25 g de D-frutose dissolvidos em 100 ml de água ultrapura, com osmolaridade de 295 mosm/l e o ph 6,6 [5]. O segundo diluente consistiu em uma solução à base 12 g de água de coco em pó 3 (ACP-116c ) reconstituída em 50 ml de água destilada, apresentando ph 7,4 e osmolaridade 307 mosm/l [23]. Para a criopreservação, foi utilizada a metodologia previamente estabelecida para catetos [5]. Imediatamente após a avaliação inicial, as amostras de sêmen foram divididas em duas alíquotas que foram diluídas em Tris ou ACP-116c contendo 10% de gema de ovo a 38ºC. Em seguida, as amostras foram acondi- 2

3 cionadas em banho-maria e equilibradas por 4 h a 5ºC em uma estufa de demanda biológica de oxigênio. Após a refrigeração, as amostras receberam 6% de glicerol (também a 5ºC), resultando em uma concentração final de 3% de glicerol no diluente. A diluição final resultou em uma concentração de espermatozoides/ ml. As amostras foram envasadas em palhetas de 0,25 ml, as quais foram expostas ao vapor de nitrogênio (N2) a uma altura de 3 cm da superfície do N2 por 20 min. Finalmente, as amostras foram acondicionadas em botijão de N2. Após uma semana, o sêmen foi descongelado em banho-maria a 38ºC/1 min e reavaliado de modo similar ao descrito para o sêmen fresco. Em seguida, as amostras previamente congeladas com cada um dos diluentes, Tris ou ACP-116c, foram divididas em duas alíquotas, sendo que a primeira destas foi imediatamente re-diluída no próprio diluente, na proporção de 1:1; a segunda alíquota foi submetida a centrifugação a 300 g por 10 min, para então ser re-diluída do mesmo modo. Após estes procedimentos, as amostras foram incubadas em banho-maria a 38ºC, e submetidas a um teste de termorresistência [20], em que foram realizadas avaliações sequenciais da motilidade, vigor, viabilidade e integridade funcional da membrana, a cada 15 min, ao longo de 60 min. Os resultados foram expressos na forma de média e erro padrão e analisados pelo programa Statview Os dados foram checados quanto à normalidade através do teste de Shapiro-Wilk, e quanto à homocedasticidade por meio do teste de Levene. Os valores expressos em porcentagens foram transformados em Arco-Seno. Para comparações entre os diferentes tratamentos (diluentes x centrifugação) ao longo do tempo utilizou-se a análise de variância para medidas repetidas. Para comparações entre os grupos, a cada tempo de avaliação, foi utilizada análise de variância seguida do teste de Tukey. À exceção, as comparações relativas ao vigor espermático foram conduzidas por meio do teste Mann-Whitney. Os resultados foram considerados significativos quando P < 0,05. RESULTADOS Foi coletada uma amostra de cada animal, totalizando 12 ejaculados, os quais apresentaram cor branca, aspecto leitoso-aquoso e um volume médio de 2,5 ± 0,6 ml. Com relação às características microscópicas, verificou-se que a concentração espermática foi de 970 ± 374,4 x 106 espermatozoides/ml; motilidade espermática de 87,7 ± 2,6%; vigor de 4,5 ± 0,2; viabilidade de 91,9 ± 1,8%; integridade funcional de membrana de 77,4 ± 0,2% e morfologia espermática normal de 81,3 ± 3,5%. Quando da avaliação imediata do sêmen após a descongelação, verificou-se que o diluente ACP promoveu uma melhor preservação tanto da motilidade quanto do vigor espermático (Tabela 1), quando comparado à ação do Tris (P < 0,05). Entretanto, após a re-diluição das amostras, tanto centrifugadas ou não, os diluentes equipararam-se até o final do teste de termorresistência aos 60 min (P > 0,05). No tocante à avaliação da viabilidade e integridade funcional da membrana espermática (Tabela 2), a similaridade entre os diluentes (P > 0,05) foi verificada desde a descongelação e durante todo o teste de termorresistência. Na avaliação individual dos tratamentos ao longo do teste de termorresistência (Tabela 1), observou-se que a re-diluição realizada após a descongelação promoveu um incremento significativo (P < 0,05) na motilidade espermática nas amostras preservadas em ACP centrifugadas ou não, bem como naquelas diluídas em Tris quando não submetidas à centrifugação (Tabela 1). Porém, a partir dos 15 minutos após a re-diluição, de modo geral, verificou-se uma redução significativa (P < 0,05) da motilidade espermática no uso de ambos diluentes, nas amostras centrifugadas ou não (Tabelas 1). Por outro lado, o vigor espermático permaneceu praticamente inalterado nas amostras tanto diluídas em ACP como em Tris durante o teste de termorresistência (P > 0,05); mas quando tais amostras foram submetidas a centrifugação, verificou-se uma queda significativa do vigor já aos 15 min após a re-diluição (P < 0,05). No tocante à viabilidade espermática e integridade estrutural da membrana (Tabela 2), observou-se uma queda significativa da qualidade espermática ao longo do tempo, no uso de ambos os diluentes, associados ou não à centrifugação (P < 0,05). No que se refere à preservação da morfologia espermática após a descongelação, não foram verificadas diferenças significativas (P > 0,05) ao longo do teste de termorresistência entre os diluentes, associados ou não à centrifugação. De modo geral, todas as amostras apresentaram sempre valores superiores a 50% de células com a morfologia normal. 3

4 Tabela 1. Valores (média ± E.P) de motilidade e vigor espermático verificados no sêmen descongelado (D) de catetos (Pecari tajacu; n=12) diluído em Tris ou água de coco em pó (ACP), íntegro ou centrifugado, submetido a um teste de termorresistência por 60 minutos. Motilidade (%) Vigor (0-5) Tris ACP Tris ACP Avaliação (min.) Íntegro Centrifugado Íntegro Centrifugado Íntegro Centrifugado Íntegro Centrifugado D 33.1 ± 5.9 ab 33.1 ± 5.9 ab 41.3 ± 6.9 aa 41.3 ± 6.9 aa 2.5 ± 0.2 ab 2.5 ± 0.2 ab 2.9 ± 0.2 aa 2.9 ± 0.2 aa T ± 8 ba 39.4 ± 7.4 aa 43.8 ± 7.7 ba 46.3 ± 9.4 ba 2.9 ± 0.3 aa 2.8 ± 0.3 aa 3 ± 0.5 aa 3.3 ± 0.3 aa T15 25 ± 6.5 ca 15.6 ± 6.4 ba 29.4 ± 8.5 ca 25.6 ± 7.5 ca 2 ± 0.4 aa 1.5 ± 0.5 ba 2.4 ± 0.4 aa 2.4 ± 0.5 aa T ± 6.3 da 15 ± 6.5 ca 18.1 ± 4.9 da 15.6 ± 7.2 da 1.6 ± 0.4 aa 1.3 ± 0.5 ba 2 ± 0.4 aa 1.9 ± 0.5 ba T ± 4.9 ea 10.6 ± 4.4 da 10.6 ± 2.7 ea 11.3 ± 5.3 ea 1 ± 0.4 aa 1 ± 0.3 ba 1.8 ± 0.4 aa 1.6 ± 0.5 ba T ± 3.2 ea 5.6 ± 2 da 9.4 ± 4.6 ea 5.6 ± 2.4 fa 0.8 ± 0.4 ba 1 ± 0.3 ba 1.3 ± 0.4 aa 1.1 ± 0.4 ba a,b,c Letras minúsculas indicam comparações entre linhas (P < 0,05); A,B Letras maiúsculas indicam diferenças entre colunas (P<0,05). Tabela 2. Valores (média ± E.P) de viabilidade e integridade funcional de membrana espermática verificados no sêmen descongelado (D) de catetos (Pecari tajacu; n=12) diluído em Tris ou água de coco em pó (ACP), íntegro ou centrifugado, submetido a um teste de termorresistência por 60 minutos. Integridade Funcional da Membrana (%)* Viabilidade espermática (%)* Avaliação (min.) Tris ACP Tris ACP Íntegro Centrifugado Íntegro Centrifugado Integro Centrifugado Íntegro Centrifugado D 42.3 ± 6.9 aa 42.3 ± 6.9 aa 39.4 ± 5.4 aa 39.4 ± 5.4 aa 27.8 ± 4.8 aa 27.8 ± 4.8 aa 35.6 ± 8.2 aa 35.6 ± 8.2 aa T ± 6.9 aa 32.8 ± 4.6 aa 36 ± 4.8 aa 20.4 ± 5.3 ba 39.5 ± 2.9 aa 29 ± 5.1 aa 30.6 ± 7.6 ba 24.6 ± 5.6 ba T ± 6.2 aba 27.5 ± 6.8 aba 24.6 ± 4.3 ba 15.8 ± 7.7 bca 29 ± 5.6 aa 21.8 ±7.1 aba 23.5 ± 6.2 ba 25 ± 5.3 ba T ± 5.1 ba 21.9 ± 8.9 ba 25 ± 4.1 ba 15.6 ± 3.3 ca 31.6 ± 7.7 aa 20.8 ± 8.5 ba 26.6 ± 4.9 ca 16.5 ± 4 ca T ± 5.3 bca 18.3 ± 7.4 bca 23.5 ± 5.2 ba 17.4 ± 4.9 ca 18.8 ± 5.4 aa 18.6 ± 6.7 ba 17.8 ± 4.6 ca 13.8 ± 5 ca T ± 7.7 ca 17.4 ± 7.8 c 20.3 ± 4.1 ba 16.5 ± 4.3 ca 14.6 ± 7 ba 16.3 ± 8 ba 11.3 ± 4.2 ca 10 ± 3.7 ca a,b,c Letras minúsculas indicam comparações entre linhas (P < 0,05); *Não foram verificadas diferenças entre os tratamentos em nenhum dos tempos de avaliação (P > 0,05). 4

5 DISCUSSÃO Ao se avaliar, pela primeira vez, o efeito de diferentes diluentes sobre a sobrevivência espermática de catetos, este estudo demonstrou que o sêmen descongelado, seja utilizando o diluente Tris ou ACP, submetido ou não à centrifugação, apresenta uma baixa longevidade pós-descongelação. De modo geral, todos os parâmetros avaliados sofreram uma redução significativa já aos 15 min pós-descongelação, o que sugere que seu emprego deva ser imediato, realizando-se a inseminação artificial, preferencialmente, por via intrauterina. Uma baixa longevidade espermática pós-descongelação tem sido também descrita para o sêmen de suínos [3,18,28], a espécie doméstica filogeneticamente mais próxima do cateto [6]. Diferentemente de outras espécies mamíferas, sabe-se que grande quantidade de lipídios insaturados, como o ácido docosahexanoico (DHA, 30%) e docosapentanóico (DPA, 25%), são constituintes da membrana plasmática do espermatozoide suíno [27,9] e que esta característica é responsável por uma maior sensibilidade desta célula aos procedimentos de congelação e descongelação [2]. Devido à similaridade entre suínos e catetos, é possível que esta característica esteja também presente no espermatozoide destes últimos, porém, seriam necessários estudos específicos acerca da composição de sua membrana plasmática no sentido de comprovar esta afirmação. Apesar do declínio observado ao longo do teste de termorresistência, ressalta-se o efeito positivo imediato promovido pelo processo de re-diluição sobre os parâmetros seminais. Este efeito pode ser atribuído à imediata redução na concentração de glicerol no meio, haja vista que este é conhecido por possuir efeitos tóxicos que podem alterar as propriedades físico-químicas do espermatozoide e levar ao rompimento de sua membrana plasmática, bem como causar alterações no acrossoma [8,12]. Além disso, tanto o diluente Tris [5] quanto aquele à base de água de coco [23] apresentam substâncias com ação tamponante, bem como substratos energéticos em sua composição. Assim, o tamponamento favoreceria uma estabilização no ph do meio, bem como a fonte nutritiva para as células espermáticas seria renovada, proporcionando o incremento visualizado nos parâmetros seminais, de sobremaneira sobre a motilidade espermática [30]. Entretanto, estes efeitos seriam apenas transitórios, devido a sensibilidade supra citada destas células ao processamento, bem como à inevitável produção de espécies reativas de oxigênio oriunda da incubação [29]. 5 O procedimento de centrifugação pós-descongelação, no presente trabalho, mostrou-se desnecessário no uso de ambos os diluentes. Esta observação difere daquela reportada previamente para o sêmen de guepardos, no qual a centrifugação melhorou a qualidade seminal após a descongelação [7]. Vale ressaltar, no entanto, que Castelo et al. [5] demonstraram que a realização da centrifugação previamente à congelação seria também desnecessária, e inclusive poderia promover um aumento nas patologias espermáticas de catetos. Sabe-se que o uso do sêmen criopreservado é uma ferramenta valiosa em programas de melhoramento genético e conservação de espécies, assim uma das metas da biotecnologia da reprodução é encontrar um bom diluente que além de permitir o aumento do volume total do ejaculado, proporcione um meio favorável para a sobrevivência dos espermatozoides [10]. No presente trabalho foram testados os dois únicos diluentes citados na literatura para a criopreservação do sêmen de catetos, o Tris [5] e o ACP [23]. Em uma análise geral, tais diluentes têm se mostrado eficientes para a criopreservação espermática em catetos, sendo que Silva et al. [23] mostraram haver uma superioridade do ACP sobre o Tris, quando da análise imediata do sêmen após a descongelação, fato também observado no presente estudo. Entretanto, ao longo do teste de termorresistência, evidencia-se que os diluentes se equipararam, não apresentando diferenças em relação a manutenção da sobrevivência espermática. Em conclusão, o espermatozoide de catetos, de modo geral, apresenta uma curta sobrevivência após a descongelação, independente do uso dos diluentes Tris ou ACP, sendo recomendado seu uso imediato. Além disso, salienta-se não ser necessária a realização de centrifugação das amostras após a descongelação. SOURCES AND MANUFACTURERS 1 PROPOVAN, Cristalia, Fortaleza, CE, Brazil. 2 AUTOJAC, Neovet, Campinas, SP, Brazil. 3 ACP, ACP-Biotecnologia, Fortaleza, CE, Brazil. 4 SAS Institute Inc. Cary, NY, USA. Funding. Lívia B. Campos and Alexandre R. Silva are receipt of grants from CNPq. Ethical aproval. Os protocolos experimentais e os cuidados no manejo dos animais foram aprovados pelo comitê de ética da UFERSA, Mossoró, Brasil (Processo nº /114). Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper.

6 REFERENCES 1 Alves H.M., Oliveira I.R.S., Castelo T.S., Lima G.L., Souza A.L.P., Moreira M.A.P., Paula V.V. & Silva A.R Comparison of Different Glycerol and Egg Yolk Concentrations Added to Tris-based Extender for the Collared Peccaries (Tayassu tajacu) Semen Freezing. Reproduction in Domestic Animals. 48(3): Antunes R.C Avanço tecnológico e aplicabilidade da técnica de congelamento de sêmen suíno. Revista Brasileira Reprodução Animal. 31(1): Barros M.H.C., Shiomi H.H., Amorim L.S., Siqueira J.B., Pinho R.O., Lima D.M.A., Lopes P.S., Guimarães S.E.F. & Guimarães J.D Viabilidade espermática do sêmen congelado de suínos da raça Piau avaliada pelo teste de termorresistência. Acta Veterinaria Brasilica. 7(2): Bittencourt R.F., Ribeiro A.L., Santos A.D.F., Furst R., Teixeira R.B.S., Chalhoub M., Portela A.P., Alves S.G.G., Almeida A.K. & Guimarães J.D Utilização de glicerol e etilenoglicol como crioprotetores na congelação do sêmen caprino. Ciência Animal Brasileira. 5(1): Castelo T.S., Bezerra F.S.B., Souza A.L.P., Moreira M.A, Paula V.V., Oliveira M.F. & Silva A.R Influence of the thawing rate on the cryopreservation of semen from collared peccaries (Tayassu tajacu) using Tris-based extenders. Theriogenology. 74(6): Cavalcante-Filho M.F., Miglino M.A., Machado G.V., Bevilacqua E.M.A.F. & Neves W.C Comparative study of the morphology of the stomach of White lipped peccary (Tayassu pecari) and of the collared peccary (Tayassu tajacu). Brazilian Journal of Morphology Science. 15: Crosier A.E., Henghali J.N., Howard J., Pukazhenti B.S., Terrel K.A., Marker L. & Wildt D.E Improved quality of cryopreserved cheetah (Acinomyx jubatus) spermatozoa after centrifugation through Accudenz. Journal of Andrology. 30(3): Curry M. R Cryopreservation of semen from domestic livestock. Reviews Reproduction. 5(1): De Leeuw F.E., Chen H.C., Colenbrander B. & Verkleij A.J Cold-induced ultrastructural changes in bull and boar sperm plasma membranes. Cryobiology. 27(2): Derivaux J Reprodução dos Animais Domésticos. Zaragoza, Editora Acribia, 446p. 11 Hori T., Ichikawa M., Kawakami E. & Tsutsui T Artificial insemination of frozen epididymal sperm in beagle dogs. Journal of Veterinary Medical Science. 66(1): Holt W.V Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science. 62(1-3): ICMBIO Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade Seis espécies de mamíferos dotados de casco correm risco de extinção no Brasil. Disponível em: < Acessado em 05/ IUCN International Union for the Conservation of Nature IUCN Red List of Threatened Species. Disponível em: < Acessado em 05/ Keith S.L Evaluation of new cryoprotectants for the preservation of equine spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 62: Matos D.G., Moses D.F., De Las Heras M.A. & Baldassarre, H Minimal time required in contract with glycerol for cryopreservation of ram semen. In: Proceedings of the 3rd International Congress on Animal Reproduction (The Hague, The Netherlands). pp McLaughin E.A., Ford W.C.L. & Hull M.G.R The contribution of the toxicity of a glycerol-egg-yolk-citrate cryopreservative to the decline in human sperm motility during cryopreservation. Journal of Reproduction & Fertility. 95(3): Ohata P.M., Wentz I., Bernadi M.L., Castagna C. & Bortolozzo F.P Viabilidade do sêmen suíno congelado submetido a um período de equilíbrio pré-congelamento com ou sem presença de plasma seminal. Arquivos da Faculdade de Veterinária UFRGS. 29(2): Santos E.A.A., Sousa P.C., Peixoto G.C.X., Simão B.R., Oliveira M.F. & Silva AR Establishing the hypoosmotic swelling test for sperm analysis in collared peccaries (Pecari tajacu). Arquivo. Brasileiro Medicina Veterinária Zootecnia. 65(4): Santos E.A.A., Sousa P.C., Dias C.E.V., Castelo T.S., Peixoto G.C.X., Lima G.L., Ricarte A.R.F., Simão B.R., Freitas C.I.A. & Silva A.R Assessment of sperm survival and functional membrane integrity of the six-banded armadillo (Euphractus sexcinctus). Theriogenology. 76(4):

7 21 Sellés E., Gadea J., Romar R., Matás C. & Ruiz S Analysis of in vitro fertilizing capacity to evaluate the freezing procedures of boar semen and to predict the subsequent fertility. Reproduction in Domestic Animals. 38(1): Sharma R.K., Vemulapalli S., Kohn S & Agarwal A Effect of centrifuge speed, refrigeration medium, and sperm washing medium on cryopreserved sperm quality after thawing. Archives of Andrology. 39(1): Silva M.A., Peixoto G.C.X., Lima G.L., Bezerra J.A.B., Campos L.B., Paiva A.L.C., Paula V.V. & Silva A.R Cryopreservation of collared peccaries (Tayassu tajacu) semen using a powdered coconut water (ACP-116c ) based extender plus different egg yolk and glycerol concentrations. Theriogenogoly. 78(3): Silva A.R., Cardoso R.C.S., Uchoa D.C. & Silva L.D.M Quality of canine semen submitted to single or fractionated glycerol addition during the freezing process. Theriogenology. 59(3-4): Sousa P.C., Santos E.A.A., Souza A.L.P., Lima G. L., Barros F.F.P.C, Oliveira M.F & Silva A.R Sperm morphological and morphometric evaluation in captive collared peccaries (Pecari tajacu). Pesquisa. Veterinária Brasileira. 33: Souza A.L.P., Castelo T.S., Queiroz J.P.A.F., Barros I.O., Paula V.V., Oliveira M.F. & Silva A.R Evaluation of anesthetic protocol for the collection of semen from captive collared peccaries (Tayassu tajacu) by electroejaculation. Animal Reproduction Science. 116(3-4): Penny P.C., Noble R.C. & Maldjian A Potential role of lipids for the enhancement of boar fertility and fecundity. Pig News Information. 25(4): Tretipskul C., Buranaamnuay K., Koonjaenak S. Tummaruk P. & Techakumphu M The use of computer assisted sperm analysis for discriminating series of motility pattern frozen-thawed boar sperm. Thai Journal Veterinary Medicine. 40(1): Vishwanath R. & Shannon P Do sperm cells age? A review of the physiological changes in sperm during storage at ambient temperature. Reproduction Fertility Development. 9(3): Watson P.F The preservation of semen in mammals. Oxford Review Reproduction Biology. 1: