A ANÁLISE MINERAL DE VINHOS. METODOLOGIAS IMPLEMENTADAS NO LABORATÓRIO DO INIA-DOIS PORTOS

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1 A ANÁLISE MINERAL DE VINHOS. METODOLOGIAS IMPLEMENTADAS NO LABORATÓRIO DO INIA-DOIS PORTOS Sofia CATARINO 1 ; António Sérgio CURVELO-GARCIA 1 RESUMO A análise mineral de mostos de vinhos é requerida com frequência no âmbito do controlo da qualidade, nas suas vertentes tecnológica, sensorial, de segurança alimentar e legal. Identificam-se as principais razões que justificam o controlo de elementos minerais no vinho, na perspectiva do produtor/enólogo. A aplicação de técnicas de análise multi-elementar e isotópica, com progressivo abaixamento dos limites de detecção e de quantificação dos métodos, permitindo quantificar cada vez mais elementos no vinho, abriu novos campos de investigação. Apresenta-se informação sistematizada sobre os métodos analíticos indicados pela OIV e sobre os métodos implementados no Laboratório de Análise Mineral do INIA-Dois Portos. São discutidas as potencialidades, vantagens e desvantagens das diferentes técnicas analíticas (FAAS, ETAAS e ICP-MS) e apresentados resultados da participação do INIA-Dois Portos num ensaio colaborativo da OIV para determinação de metais em vinhos por ICP-MS. Palavras-chave: Vinho, análise mineral, métodos de análise, AAS, ICP-MS. 1 - ANÁLISE MINERAL: RAZÕES PARA A SUA REALIZAÇÃO O vinho apresenta na sua composição várias dezenas de elementos químicos em concentrações muito diversas, os quais apresentam diferentes níveis de importância sob o ponto de vista enológico. O conhecimento dos teores de vários desses elementos, ao longo das diferentes etapas de produção, é fundamental no âmbito tecnológico, da qualidade organoléptica, da segurança alimentar, e face às restrições legais vigentes (CATARINO et al., 2008). De seguida identificam-se as principais razões, na perspectiva do produtor/enólogo que justificam o controlo de elementos minerais no vinho: Pela sua importância ponderal, elementos tais como sódio (Na), potássio (K), magnésio (Mg) e cálcio (Ca), são os principais responsáveis pela estrutura metálica dos vinhos e pela sua capacidade tampão ácido-base. Dependendo da concentração em que se apresentam, determinados metais podem originar fenómenos depreciativos da qualidade do vinho, tais como oxidações, turvações e precipitações. Potássio, Ca, ferro (Fe) e cobre (Cu) são exemplos clássicos, no âmbito da química enológica, de elementos envolvidos nos referidos fenómenos de instabilidade físico-química, mas outros elementos podem estar envolvidos, como por exemplo o alumínio (Al) e o zinco (Zn). Estes últimos elementos, quando em concentrações elevadas, podem igualmente estar na origem de aromas e gostos desagradáveis. Outros, como por exemplo Na, em ligação 1 Instituto Nacional de Recursos Biológicos IP, INIA Dois Portos. Quinta de Almoínha, Dois Portos, Portugal. evn.sofia.catarino@mail.net4b.pt; sofia.catarino@inrb.pt

2 com o teor de cloro (Cl), fornecem informação para o controlo e detecção de práticas enológicas não autorizadas. O conhecimento da concentração de alguns elementos essenciais nos mostos é igualmente importante, tendo em conta os efeitos da sua carência na actividade de leveduras e bactérias lácticas. Em determinadas situações, justifica-se o controlo do teor de metais pesados nos mostos, uma vez que quando em concentrações elevadas influenciam a fermentação alcoólica e a fermentação maloláctica (CATARINO et al., 2007). Finalmente, justifica-se ainda esse controlo por razões que se relacionam com o cumprimento das restrições legais existentes. Actualmente, a Organização Internacional da Vinha e do Vinho estabelece limites máximos admissíveis para os teores de alguns elementos nos vinhos (OIV, 2009). O potencial contributo do vinho para a dieta humana enquanto fornecedor de elementos essenciais, constitui outra perspectiva sobre a importância da composição mineral do vinho e sua caracterização. A aplicação de técnicas de análise multi-elementar e isotópica, com progressivo abaixamento dos limites analíticos dos métodos, permitindo quantificar cada vez mais elementos no vinho, abriu novas perspectivas de investigação sobre a composição mineral do vinho. A informação sobre a composição elementar e isotópica do vinho tem sido explorada com o objectivo de garantir a origem geográfica e, nesse sentido, a autenticidade do vinho (CATARINO e CURVELO-GARCIA, 2009). Por outro lado, os avanços nas técnicas analíticas instrumentais, concretamente a possibilidade de acoplamento de técnicas, potenciaram o estudo de fenómenos de complexação de iões metálicos, com outras espécies químicas do vinho (polissacáridos, polifenóis, proteínas). 2 - DETERMINAÇÃO ANALÍTICA Diversas técnicas têm sido utilizadas no doseamento de metais no vinho, com especial destaque para as técnicas espectrométricas. Os métodos de análise para a determinação de metais em vinhos indicados pela OIV, e adoptados pela União Europeia, baseiam-se essencialmente na espectrofotometria de absorção atómica (AAS), com chama (FAAS) e com atomização electrotérmica (ETAAS). A técnica de FAAS é indicada nos métodos de referência para doseamento de K, Na e Fe (após remoção do álcool), e método único para determinação de Ca, Cu, Mg, Zn (após remoção do álcool), e prata (Ag) (após mineralização da amostra) (OIV, 2009). Relativamente a Cu, esta técnica permite

3 avaliar a legalidade do vinho (limite máximo admissível é 1 mg/l), mas no entanto evidencia manifestas dificuldades na quantificação de Cu na generalidade dos vinhos. O método de referência para doseamento de arsénio (As) baseia-se na ETAAS com gerador de hidretos. Actualmente, no que se refere ao doseamento de chumbo (Pb) em vinhos, a OIV define os critérios de desempenho que o método a aplicar na quantificação deste metal pesado deverá cumprir. Como exemplos, são apresentados métodos que se baseiam em ETAAS, técnica que é também suporte do método único apresentado pela OIV para a determinação de cádmio (Cd). Finalmente, o doseamento de boro (B) é realizado por aplicação de um método colorimétrico, e o de mercúrio (Hg) por espectrometria de fluorescência atómica. A FAAS é relativamente vulgar nos laboratórios de Enologia, apresentando baixos custos de investimento e de funcionamento face às alternativas, e facilidade de operação. É uma técnica altamente específica e assegura boa precisão dos resultados. Apresenta contudo uma capacidade de detecção limitada (limites de detecção ao nível de sub mg/l), considerando o intervalo de concentrações encontrado no vinho. O método das adições, por vezes utilizado, apresenta reduzida precisão entre outras desvantagens (MILLER e MILLER, 1993). Por outro lado, a opção pela préconcentração da amostra diminui a praticabilidade dos métodos. A técnica de ETAAS apresenta elevada sensibilidade, baixos limites de detecção (apropriados para análise vestigial), livre de interferências espectrais, exigindo uma preparação mínima da amostra. É sujeita a interferências químicas, sendo a sua gama de trabalho limitada. Permite elevada produtividade, não tão elevada como a FAAS, e com menor precisão do que a última, com custos inferiores aos da técnica de ICP-MS. Quando é necessária informação apenas sobre um elemento, constitui uma excelente alternativa às técnicas multi-elementares de espectrometria de emissão com plasma acoplado por indução (ICP-OES) e de espectrometria de massa com plasma acoplado por indução (ICP-MS). A aplicação da técnica de ICP-OES, pouco vulgarizada em laboratórios de enologia, sendo apropriada para o doseamento de um conjunto alargado de elementos, apresenta limitações para elementos vestigiais (limites analíticos entre 1 e 10 µg/l, para a generalidade dos elementos) (ACETO et al., 2002). A técnica de ICP-MS apresenta como grandes vantagens a análise multi-elementar e isotópica, selectividade e sensibilidade elevadas, excelentes limites analíticos (tipicamente inferiores a 0,01 µg/l), gama de trabalho bastante alargada, elevada

4 produtividade, sendo aplicada cada vez com mais frequência na caracterização de vinhos. É uma técnica afectada por interferências espectrais e interferências não espectrais relacionadas com efeitos de matriz. Possibilita diferentes procedimentos de quantificação (modo quantitativo e semi-quantitativo) de acordo com a exactidão e precisão requeridas. É ainda pouco usual nos laboratórios de enologia, devido aos custos envolvidos e à considerável especialização que exige principalmente na fase de desenvolvimento de métodos. Não sendo ainda referida no compêndio de métodos de análise de vinhos e mostos da OIV, foram recentemente promovidos por esta organização dois ensaios colaborativos, envolvendo mais de uma dezena de laboratórios europeus, para avaliação das características de um método ICP-MS para a doseamento de metais em vinhos. De utilização ainda menos vulgarizada, diversas técnicas electroquímicas têm sido aplicadas na análise mineral de vinhos: voltametria de redissolução e potenciometria de redissolução, potenciometria com eléctrodo selectivo e polarografia (FOURNIER et al., 1998). 3 - METODOLOGIAS IMPLEMENTADAS NO LABORATÓRIO DO INIA DOIS PORTOS No Quadro 1 apresenta-se informação sistematizada sobre os parâmetros analisados no Laboratório de Análise Mineral do INIA-Dois Portos, técnicas analíticas aplicadas, referências dos métodos de análise e algumas das suas figuras de mérito. Por FAAS é possível realizar o doseamento de Ca, Fe, Mg, K e Na. Alumínio, Cd, Pb, cobalto (Co) e Cu podem ser determinados por ETAAS. Com recurso à técnica de ICP-MS, encontrase implementado um método quantitativo para determinação de 26 elementos contaminantes dos vinhos, em particular dos elementos objecto de controlo legal. Com recurso a um método semi-quantitativo é possível obter informação sobre cerca de 60 elementos, com um erro associado inferior a 20% para a maioria dos analitos. A abordagem semi-quantitativa, menos exacta mas mais rápida que a abordagem quantitativa, pode ser extremamente útil quando se pretende comparar amostras ou obter informação sobre o perfil mineral de uma determinada amostra. Actualmente no Laboratório de Análise Mineral do INIA-Dois Portos é o único laboratório de enologia nacional que dispõe de um equipamento de ICP-MS.

5 Quadro 1 Parâmetros analíticos e métodos de análise implementados no Laboratório de Análise Mineral do INIA-Dois Portos Parâmetro Analítico (referência) Técnica analítica Limite de detecção (µg/l, excepto Ca, Na, Fe, K, Mg - mg/l) Características do método de análise Recuperação (%) Repetibilidade (% coeficiente de variação) Alumínio 1 ETAAS ,5 2,6 Alumínio 2 ICP-MS 0, ,2 4 Arsénio 2 ICP-MS 0, ,2 4 Bário 2 ICP-MS 0, ,2 4 Berílio 2 ICP-MS 0, ,2 4 Bismuto 2 ICP-MS 0, Cádmio 3 ETAAS 0, ,9 1,7 Cádmio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Cálcio 4 FAAS 0, ,3 1,1 Césio 2 ICP-MS 0, ,2 4 Chumbo 4 ETAAS ,5 3,0 Chumbo 2 ICP-MS 0, ,2 4 Cobalto 5 ETAAS 0, ,4 4,6 Cobalto 2 ICP-MS 0, ,2 4 Cobre 6 ETAAS Cobre 2 ICP-MS 0, ,2-4 Estrôncio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Ferro 7 FAAS 0, ,5 3,5 Ferro 2 ICP-MS 0, ,2-4 Gálio 2 ICP-MS 0, Índio 2 ICP-MS 0, Lítio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Magnésio 4 FAAS 0, ,5 1,4 Manganês 2 ICP-MS 0, ,2-4 Mercúrio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Níquel 2 ICP-MS 0, ,2-4 Potássio 8 FAAS ,4-0,9 Rubídio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Selénio 2 ICP-MS 0, Sódio 9 FAAS 1, ,3 3,4 Tálio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Urânio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Vanádio 2 ICP-MS 0, ,2-4 Zinco 2 ICP-MS 0, ,2-4 1 CATARINO et al. (2002); 2 CATARINO et al. (2006); 3 CATARINO e CURVELO GARCIA (1999); 4 OIV (2009); 5 CATARINO et al. (2009); 6 CATARINO et al. (2005); 7 NP 2280; 8 NP 3685; 9 NP 3594.

6 3.1 - Participações em ensaios colaborativos internacionais Ao longo dos últimos anos foram diversas as participações em ensaios colaborativos internacionais. A título de exemplo, e pelo seu contributo para a definição de métodos de análise para vinhos e mostos no âmbito da OIV, referem-se os seguintes: - Validação do método para determinação de Pb em vinhos por ETAAS. Informação utilizada na definição de critérios para os métodos para determinação de Pb em vinho (OIV, 2009); - Determinação de metais em vinhos por ICP-MS, ensaios MV-1/08 e MV-1/09. Seguidamente apresentam-se alguns resultados da participação no ensaio MV-1/09, para avaliação dos parâmetros fundamentais de funcionamento de um método de análise de metais por ICP-MS, baseado no método descrito na FV 1265 (OIV, 2007), e estabelecimento das suas características, fundamentalmente no que se refere à precisão (repetibilidade e reprodutibilidade). Participaram no ensaio 10 laboratórios europeus (Alemanha, Espanha, França, Portugal e República Checa). Foram ensaiadas 16 amostras codificadas de A a P: 4 amostras de vinho tinto (D-M, H-J), 4 amostras de vinho Porto (B-K, E-L), 6 amostras de vinho branco (F-N, C-I, A-O) e 2 amostras de vinho Champanhe (G-P) (Quadro 2). Diferentes níveis analíticos foram obtidos mediante selecção de amostras com concentrações naturais dos analitos objecto do ensaio, e mediante a adição de padrões de concentração conhecida, sobre as amostras naturais. Para cada amostra existia uma outra idêntica (duplicado), codificada de diferente forma (informação não conhecida dos participantes). O delineamento do ensaio, tratamento de dados, resultados e discussão encontram-se descritos sob forma de relatório. 4 - CONCLUSÕES Os métodos de análise anteriormente apresentados fornecem informação sobre o teor total do elemento, independentemente da(s) forma(s) química(s) em que este encontra. A evolução da análise mineral de vinhos deverá contemplar o desenvolvimento de metodologias que permitam, com maior facilidade, a especiação dos elementos de interesse enológico e investigação dos fenómenos de complexação dos iões metálicos com outras espécies químicas do vinho.

7 Quadro 2 Alguns resultados da participação do INIA-Dois Portos no ensaio colaborativo da OIV para determinação de metais em vinhos por ICP-MS - (MV-1/09) Amostras Concentrações iniciais Adições (mg/l) Resultados INIA Dois Portos* (Valor de referência)** (As, Co - µg/l; Cu, Fe mg/l) Recuperação (MV-1/09) (%) As Co Cu Fe As Co Cu Fe As Co Cu Fe F-N 0,011 <0,02 0,19 0,82 11,2 ± 0,5 (15,49) 12,1 ± 0,8 (11,58) 0,14 ± 0,01 (0,16) 0,92 ± 0,04 (1,1) Vinho Branco C-I 0,010 0,005 0,5 1 24,3 ± 0,2 (27,15) 19,25 ± 0,08 (18,72) 0,705 ± 0,007 (0,74) 2,02 ± 0,02 (2,13) A-O 0,025 0, ± 2 (46,25) 24 ± 2 (22,37) 1,065 ± 0,007 (1,14) 3,2 ± 0,3 (3,18) Porto B-K 0,006 0,011 0,24 1,44 E-L 0,050 0,020 1,5 3 9,2 ± 0,4 (11,01) 78 ± 10 (80,4) 9,0 ± 0,6 (7,79) 28 ± 4 (26,92) 0,185 ± 0,007 (0,21) 1,6 ± 0,2 (1,68) 1,5 ± 0,1 (1,56) 4,34 ± 0,4 (4,3) Vinho Tinto D-M <0,01 <0,02 0,14 2,9 H-J 0,100 0, ,26 ± 0,08 (4,3) 102,4 ± 0,7 (113,23) 2,81 ± 0,07 (2,9) 43,9 ± 0,2 (48,63) 0,12 (0,14) 1,745 ± 0,007 (2,05) 2,63 ± 0,01 (3,09) 6,73 ± 0,09 (7,75) Champanhe G-P ,89 ± 0,05 (4,42) 1,665 ± 0,007 (1,83) 0,035 ± 0,007 (0,042) 0,635 ± 0,007 (0,83) * Média das concentrações dos duplicados ± desvio padrão correspondente; ** Média dos valores médios (fornecidos pelos laboratórios participantes) após eliminação de anómalos.

8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACETO M., ABOLLINO O., BRUZZONOTI M.C., MENTASTI E., SARZANINI C., MALANDRINO M., Determination of metals in wine with atomic spectroscopy (flame-aas, GF-AAS and ICP- AES); a review. Food Additives and Contaminants, 2, CATARINO S., CURVELO-GARCIA A.S., Les teneurs en plomb et en cadmium de quelques vins portugais. Feuillet Vert de l OIV, CATARINO S., CURVELO-GARCIA A.S., BRUNO DE SOUSA R., Determination of aluminum in wine by graphite furnace AAS: Validation of Analytical Method. Atomic Spectroscopy, 23 (6), CATARINO S., PIMENTEL I., CURVELO-GARCIA A.S., Determination of copper in wine by ETAAS using conventional and fast thermal programs: validation of analytical method. Atomic Spectroscopy, 26 (2), CATARINO S., CURVELO-GARCIA A.S., BRUNO DE SOUSA R., Measurements of contaminant elements of wines by inductively coupled plasma mass spectrometry: a comparison of two calibration approaches. Talanta, 70, CATARINO S., BALEIRAS-COUTO M.M., BRAZ R., CURVELO-GARCIA A.S., Influência e eliminação do cobre e do chumbo na fermentação alcoólica. In proceedings of: 7º Simpósio de Vitivinicultura do Alentejo (vol. 2), 73-81, Évora. CATARINO S., CURVELO-GARCIA A.S., BRUNO DE SOUSA R., Elementos contaminantes nos vinhos (revisão). Ciência e Técnica Vitivinícola, 23 (1), CATARINO S., CURVELO-GARCIA A.S., A composição multi-elementar e razões isotópicas como marcadores da origem geográfica de vinhos. In: 1º Congresso Internacional dos Vinhos do Dão, Viseu. CATARINO S., NEVES A., BRUNO DE SOUSA R., Determination of cobalt in wine and must by electrothermal atomization atomic absorption spectrometry: analytical method development and validation. Ciência e Técnica Vitivinícola, 24 (2), FOURNIER J.-B., HIRSCH O., MARTIN G.J., Analyse du zinc, du cuivre et du plomb dans le vin. Rapport entre les concentrations totales analysées para spectrométrie d absorption atomique et les concentrations des ions libres déterminées par polarographie. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 32 (1), MILLER J.C., MILLER J.N., Statistics for analytical chemistry, 3 rd edition, 233 p, Ellis Horwood, PTR Prentice Hall Analytical Chemistry Series. OIV, Analyse multiélémentaire para ICP/MS. Feuillet Vert de l OIV, 1265 (CII-SCMA ). OIV, Compendium of International Methods of Wine and Must Analysis. International Organisation of Vine and Wine, Paris.