O ciclo de Krebs ou do ácido cítrico

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1 O ciclo de Krebs ou do ácido cítrico Ciclo de Krebs ou do ácido cítrico; Rui Fontes 1- Por acção das enzimas da glicólise a glicose é, no citoplasma das células, parcialmente oxidada a piruvato. O piruvato entra para a mitocôndria e, através da acção catalítica da desidrogénase do piruvato, dá origem a acetil-coa (ver equação 1). No catabolismo dos aminoácidos, dos ácidos gordos e do etanol também se forma acetil-coa. O ciclo de Krebs (também designado do citrato ou dos ácidos tricarboxílicos) é uma via metabólica central no metabolismo dos nutrientes pois permite a oxidação do grupo acetilo da acetil- CoA (a CO 2 ) com a concomitante redução do NAD + e do FAD a NADH e FADH 2 que são intermediários no processo de redução do O 2 (a H 2 O). A importância do ciclo de Krebs no metabolismo e na sobrevivência dos seres vivos fica evidenciada pela extrema raridade das doenças congénitas em que há defeitos na actividade de enzimas deste ciclo [1]. piruvato + NAD + + CoA acetil-coa + NADH + CO 2 (1) 2- As enzimas envolvidas nas reacções do ciclo de Krebs estão todas dentro da mitocôndria e são as seguintes: síntase do citrato (equação 2), aconitase (equação 3), desidrogénase do isocitrato (equação 4), desidrogénase do -cetoglutarato (equação 5), sintétase de succinil-coa (equação 6), desidrogénase do succinato 1 (equação 7), fumárase (equação 8) e desidrogénase do malato (equação 9). A sintétase de succinil-coa é o nome atribuído a duas isoenzimas distintas mas com actividades semelhantes: uma tem maior afinidade para o GDP e leva à formação de GTP enquanto a outra tem maior afinidade para o ADP e leva à formação directa de ATP. acetil-coa + oxalacetato + H 2 O citrato + CoA (2) citrato isocitrato (3) isocitrato + NAD + -cetoglutarato + CO 2 + NADH (4) -cetoglutarato + NAD + + CoA succinil-coa + NADH + CO 2 (5) succinil-coa + GDP (ou ADP) + Pi succinato + CoA + GTP (ou ATP) (6) succinato + FAD fumarato + FADH 2 (ver nota de rodapé nº 1) (7) fumarato + H 2 O malato (8) malato + NAD + oxalacetato + NADH (9) Se ignorarmos momentaneamente a formação de NADH, FADH2, ATP (ou GTP), CO 2 e CoA poderemos escrever a seguinte sequência de transformações: oxalacetato [4C] (+ acetil-coa [2C no resíduo acetilo]) citrato [6C] isocitrato [6C] -cetoglutarato [5C] succinil-coa [4C no resíduo de succinilo] succinato [4C] fumarato [4C] malato [4C] oxalacetato [4C]. O facto de iniciarmos e terminarmos a listagem com o mesmo composto (o oxalacetato) evidencia o carácter cíclico do processo. A diminuição do número de carbonos nos passos isocitrato [6C] -cetoglutarato [5C] e -cetoglutarato [5C] succinil-coa [4C no resíduo de succinilo] explica-se pela libertação simultânea de CO 2 (ver equações 4 e 5). 3- A sintétase de succinil-coa (equação 6) existe na forma de duas isoenzimas. Uma das isoenzimas tem maior especificidade para o ADP e a outra maior especificidade para o GDP mas, em ambos os casos, a reacção pode ser entendida como correspondendo à rotura de uma ligação rica em energia e formação de outra ligação rica em energia. No sentido succinil-coa succinato rompe-se uma ligação tioéster e forma-se uma ligação anidrido entre os fosfato e ; num dos casos do ATP e no outro do GTP. No entanto, em última análise, se também considerarmos a actividade da cínase dos nucleosídeos-difosfatos 1 A desidrogénase do succinato é, entre as enzimas do ciclo de Krebs, a única que está na membrana interna da mitocôndria. Sendo constituída por várias subunidades é também conhecida como complexo II. O FAD não é o aceitador último dos electrões no processo catalisado pela desidrogénase do succinato mas sim o grupo prostético que aceita directamente os electrões (ou os hidrogénios ) quando o succinato se oxida. Nas células, o aceitador último dos electrões na acção catalítica da desidrogénase do succinato é a ubiquinona (ou coenzima Q) mas, tradicionalmente, quando se discute o ciclo de Krebs, aponta-se o FAD como o oxidante do succinato. Curiosamente, quando se discute o papel catalítico da desidrogénase do succinato no contexto do estudo da fosforilação oxidativa já é a ubiquinona que é, tradicionalmente, apontado como o oxidante. Uma visão global da actividade catalítica da enzima permite compreender que a redução da ubiquinona (a ubiquinol) pelo FADH2 também faz parte da sua actividade global e que a esta é melhor expressa pela equação seguinte: succinato + ubiquinona (ou coenzima Q) fumarato + ubiquinol (ou coenzima QH2). Estas idissincrasias têm origem na história da investigação da desidrogénase do succinato e das vias metabólicas onde pode ser integrada. Página 1 de 5

2 (ver equação 10) pode admitir-se que, na célula, o que se forma é ATP. Esta cínase não é, tradicionalmente, considerada uma enzima do ciclo de Krebs, mas tem um papel importante neste contexto já que permite a transferência do fosfato terminal do GTP (formado pela acção de uma das isoenzimas da sintétase do succinil-coa) para o ADP e, consequentemente, a formação de ATP. Assim, mesmo que se admita que, num dado órgão, a isoenzima com maior actividade seja, a que tem maior afinidade para o GDP, o somatório da sua actividade (ver equação 6; com GDP como substrato) com a da cínase dos nucleosídeos difosfatos (ver equação 10) é a equação 11. Por contraponto com a formação de ATP na fosforilação oxidativa, a fosforilação do ADP (catalisada pela isoenzima que tem como substrato o ADP ou pelo somatório das duas actividades atrás referidas) diz-se que ocorre ao nível do substrato. GTP + ADP GDP + ATP (10) succinil-coa + ADP + Pi succinato + CoA + ATP (11) 4- A fase preparatória da oxidação do grupo acetilo da acetil-coa a CO 2 começa com a sua ligação ao oxalacetato por acção da síntase do citrato. Os passos oxidativos em que ocorre a redução do NAD + e do FAD são os catalisados pelas desidrogénases do isocitrato, do -cetoglutarato, do malato (NAD + a NADH) e do succinato (FAD a FADH 2 ). O NAD + existe nas células em concentrações de ordem M e a oxidação da glicose, dos ácidos gordos e dos aminoácidos (que são ingeridos em quantidades de alguns moles por dia) só pode ocorrer se o NADH formado aquando das reacções 4, 5 e 9 for imediatamente reoxidado a NAD +. Algo de muito semelhante pode ser dito do FAD com a particularidade de o FAD ser um dos grupos prostéticos da desidrogénase do succinato (ver nota de rodapé nº 1). A regeneração do NAD + e do FAD é indispensável para que o processo oxidativo possa prosseguir e, na mitocôndria, o único mecanismo que permite reoxidar o NADH e o FADH 2 é desempenhado pelos complexos da cadeia respiratória sendo que o oxidante final é o O 2 : ao contrário do que acontece no caso da glicólise não existe ciclo de Krebs anaeróbio. As descarboxilações (libertação de CO 2 ) ocorrem durante as acções catalíticas da desidrogénase do isocitrato (ver equação 4) e da desidrogénase do -cetoglutarato (ver equação 5) e, tal como no caso da desidrogénase do piruvato (ver equação 1), as reacções que estas duas desidrogénases catalisam são frequentemente referidas como oxidações-descarboxilativas. Juntamente com a desidrogénase do piruvato, as desidrogénases do isocitrato e do -cetoglutarato são responsáveis pela esmagadora maioria das moléculas de CO 2 que os animais produzem. 5- A equação 12 descreve o somatório das reacções que constituem o ciclo de Krebs (equações 2-9) e a catalisada pela cínase dos nucleosídeos-difosfatos (equação 10): CH 3 CO-CoA + 2 H 2 O + 3 NAD + + FAD + ADP + Pi 2 CO 2 + CoA + 3 NADH + FADH 2 + ATP (12) Esta equação mostra que, conceptualmente, a acção do conjunto das enzimas referidas pode ser entendida como um somatório de três processos: (12a) a hidrólise da acetil-coa, (12b) a oxidação do resíduo de acetato a CO 2 com a concomitante redução do FAD e do NAD + e (12c) a síntese de ATP (a partir de ADP + Pi). CH 3 CO-CoA + H 2 O CoA + CH 3 COOH CH 3 COOH + 2 H 2 O + 3 NAD + + FAD 2 CO NADH + FADH 2 ADP + Pi ATP + H 2 O (12a) (12b) (12c) Os processos 12a e 12b são exergónicos enquanto o 12c é endergónico e só ocorre porque está acoplado com os dois primeiros. Vistos como um todo, o somatório das reacções é, obviamente, um processo exergónico; de contrário, a reacção 12 não poderia ocorrer no sentido indicado. 6- Em todos os tecidos e, particularmente, nos músculos, o principal papel das enzimas do ciclo de Krebs é, tal como indica a equação 12, catalisar a oxidação completa do resíduo acetilo do acetil-coa formado durante o catabolismo da glicose, ácidos gordos e aminoácidos. Nas reacções em que intervêm catalisadores, porque estes não se consomem nem se formam durante o processo reactivo, o catalisador não aparece na equação final. O mesmo acontece no caso dos intermediários do ciclo de Krebs: quando se somam as equações que expressam a actividade de cada uma das enzimas os intermediários desaparecem da equação. Em cada uma das reacções um intermediário converte-se no seguinte e o último (o oxalacetato) converte-se no primeiro (o citrato). Por isso, não é de estranhar que seja costume dizer-se que, no processo de oxidação do grupo acetilo da acetil-coa, os intermediários do ciclo de Krebs têm um papel catalítico. Página 2 de 5

3 7- Nos músculos, a velocidade com que ocorrem as reacções catalisadas pelas enzimas do ciclo de Krebs é proporcional à despesa energética: a velocidade com que ocorrem as reacções do ciclo de Krebs (a oxidação do acetil-coa a CO 2 ) aumenta quando, como acontece durante o exercício físico, aumenta a velocidade de hidrólise do ATP. As enzimas que catalisam reacções fisiologicamente irreversíveis são as catalisadas pela síntase do citrato e pelas desidrogénases do isocitrato e do -cetoglutarato. Estas enzimas são, in vitro, inibidas pelo ATP e estimuladas pelo ADP; dado que o esforço muscular implica aumento da velocidade da hidrólise do ATP (actividade das ATPases da actina-miosina, do Ca 2+ e do Na + /K + ) pensou-se durante muito tempo que ocorria diminuição da concentração de ATP e aumento da de ADP durante o trabalho muscular e que essas variações de concentração fossem a causa directa da activação destas enzimas e do ciclo de Krebs no seu conjunto. Contudo, in vivo, as variações de concentração do ATP (mesmo quando o trabalho muscular é violento) são praticamente nulas e as do ADP são muito modestas; por isso crê-se, actualmente, que o marcado aumento da actividade das enzimas do ciclo de Krebs e o consequente aumento de produção de CO 2 durante o esforço muscular só, em parte, pode ser causado pelo aumento do ADP. Pensa-se actualmente que um dos factores responsáveis pelo aumento da produção de CO 2 durante o esforço poderá ser o ião Ca 2+ que estimula as desidrogénases do isocitrato e do -cetoglutarato (activação alostérica) e cuja concentração aumenta na célula (citoplasma e mitocôndria) durante a actividade contráctil do músculo [2]. 8- É de notar que a acetil-coa não estimula a actividade das enzimas do ciclo de Krebs; ou seja, não é de esperar que a ingestão aumentada de glicose ou ácidos gordos leve, por si só, a um aumento da oxidação da acetil-coa formada a partir dos nutrientes. Os sistemas oxidativos e, em particular, o ciclo de Krebs têm velocidades que permitem manter a concentração de ATP estacionária: só é possível aumentar a velocidade de oxidação da acetil-coa (e, em última análise, a da oxidação dos nutrientes) se aumentar a velocidade de hidrólise do ATP. Ou seja, a velocidade de oxidação dos nutrientes aumenta quando um animal faz exercício físico mas aumentar a ingestão de nutrientes não aumenta a velocidade da sua oxidação Para além do papel central no processo oxidativo dos nutrientes (catabolismo) as enzimas do ciclo de Krebs também participam noutros processos metabólicos que podem ser vistos como anabólicos. Por isso se costuma dizer que o ciclo de Krebs tem carácter anfibólico: os intermediários deste ciclo são intermediários no catabolismo dos nutrientes mas também podem ser intermediários em processos anabólicos, como a síntese de ácidos gordos a partir de glicose (lipogénese), a síntese de glicose (gliconeogénese) ou de glicerol-3-p (gliceroneogénese) a partir de aminoácidos ou de lactato, a síntese de alguns aminoácidos a partir de glicose assim como a síntese do heme da hemoglobina e de outras proteínas hemínicas. O papel anabólico das enzimas do ciclo de Krebs tem particular relevância nos casos do fígado, rim e tecido adiposo. 10- Quando um intermediário do ciclo de Krebs é convertido num outro composto que não o é, diz-se que o processo é cataplerótico [3, 4]. As reacções catapleróticas tenderiam a esvaziar o ciclo de Krebs mas um processo cataplerótico não pode ocorrer sem que, a uma velocidade semelhante, um outro composto que não é intermediário do ciclo de Krebs origine um intermediário do ciclo. Os processos deste último tipo chamam-se anapleróticos. É uma boa aproximação à realidade afirmar-se que os intermediários do ciclo de Krebs mantêm concentrações estacionárias; em diferentes estados metabólicos ou mesmo quando um músculo passa do estado de repouso para o de trabalho mecânico as concentrações dos intermediários do ciclo de Krebs variam muito pouco [3-6]. 11- Quando a glicemia desce depois de terminado o processo absortivo de uma refeição que continha glicose, o fígado (e o rim) forma glicose usando oxalacetato do citoplasma como percursor e ao processo chama-se gliconeogénese. A quantidade total de oxalacetato num homem é de alguns milimoles 3 mas, na gliconeogénese, pode formar-se cerca de 100 g de glicose por dia [7]. O fenómeno só é possível porque o oxalacetato citoplasmático é formado a partir de malato (catálise pela desidrogénase do malato citoplasmática: ver equação 9) que saiu da mitocôndria. A transformação de malato mitocondrial (intermediário do ciclo de Krebs) em oxalacetato citoplasmático é um processo cataplerótico. O processo é sustentável porque durante a gliconeogénese ocorrem simultaneamente processos anapleróticos que permitem formar intermediários do ciclo de Krebs. Quando, num processo anaplerótico, um qualquer 2 De facto, esta afirmação não é completamente verdadeira porque, quando se ingerem alimentos em excesso, ocorrem fenómenos adaptativos que tendem a aumentar ligeiramente a velocidade de oxidação dos nutrientes. No entanto, é de sublinhar que a esmagadora maioria dos nutrientes que excedem os gastos energéticos de um dado indivíduo acabam armazenados na forma de triacilgliceróis do tecido adiposo. 3 A massa molecular do ácido oxalacético é 132 g/mol. Página 3 de 5

4 intermediário se forma, esse intermediário pode, por acção das enzimas do ciclo de Krebs, substituir o malato consumido. São exemplos de processos anapleróticos importantes durante a gliconeogénese (i) a conversão de lactato citoplasmático em oxalacetato mitocondrial [via acção sequenciada da desidrogénase láctica (ver equação 13), do transporte de piruvato para a mitocôndria e da acção da carboxílase do piruvato (ver equação 14)], (ii) a conversão de glutamina, glutamato e outros aminoácidos em - cetoglutarato mitocondrial e (iii) a conversão de propionato em succinil-coa mitocondrial. Todas as substâncias que podem, directa ou indirectamente, ser substratos em processos anapleróticos dizemse também glicogénicas porque, no fígado e no rim, são substratos da gliconeogénese. Um exemplo de uma reacção anaplerótica é a catalisada pela desidrogénase do glutamato (ver equação 15): nesta reacção um aminoácido (o glutamato) converte-se num intermediário do ciclo de Krebs (o -cetoglutarato); o glutamato é, por isso, um substrato da gliconeogénese. lactato + NAD + piruvato + NADH (13) piruvato + CO 2 + ATP oxalacetato + ADP + Pi (14) glutamato + NAD + + -cetoglutarato + NADH + NH 4 (15) 12- A acetil-coa, reage com um intermediário do ciclo de Krebs (o oxalacetato) formando citrato (síntase do citrato: ver equação 2). Nesta reacção, ao contrário do que acontece no caso dos processos anapleróticos, não há formação líquida de um intermediário do ciclo de Krebs a partir de um outro que o não é. A reacção catalisada pela síntase do citrato pode ser interpretada como a conversão de um intermediário do ciclo de Krebs (o oxalacetato) noutro intermediário do ciclo de Krebs (o citrato): em termos líquidos não há nem formação nem consumo dos intermediários do ciclo de Krebs entendidos como um todo. Por isto, a reacção catalisada pela síntase do citrato não é uma reacção anaplerótica (nem cataplerótica). Por outro lado, a conversão de acetil-coa em oxalacetato via reversão da reacção catalisada pela desidrogénase do piruvato (e a subsequente carboxilação do piruvato a oxalacetato; ver equação 14) também não é possível porque a reacção catalisada pela desidrogénase do piruvato é fisiologicamente irreversível (ver equação 1). A acetil-coa não pode, por estes motivos, ser considerada um substrato da gliconeogénese A esmagadora maioria dos ácidos gordos, quer os da dieta quer os que fazem parte da estrutura dos lipídeos dos seres vivos, contém um número par de carbonos. Estes ácidos gordos geram, no seu catabolismo, apenas acetil-coa e não podem, portanto, contribuir para a formação de glicose: os ácidos gordos de cadeia par não são glicogénicos. Pelo contrário, a glicose pode dar origem a ácidos gordos cuja síntese ocorre no citoplasma partindo de acetil-coa (lipogénese). A acetil-coa excedentária relativamente às necessidades energéticas da célula não pode ser oxidada a CO 2 no ciclo de Krebs mas pode, pelo menos no fígado e no tecido adiposo, ser convertida em ácidos gordos no citoplasma das células. No entanto, a acetil-coa não pode atravessar a membrana mitocondrial porque não existe transportador para esta substância. O mecanismo que permite, de forma indirecta, transportar acetil-coa para o citoplasma é complexo e envolve as actividades catalíticas da síntase do citrato dentro da mitocôndria (ver equação 2), do transportador para o citrato existente na membrana interna da mitocôndria (ver equação 16) e, já no citoplasma, da líase do ATP-citrato (ver equação 17). citrato mitocondrial citrato citoplasmático (16) ATP + citrato + CoA oxalacetato + ADP + Pi + acetil-coa (17) O somatório das equações 2, 16 e 17 (ver equação 18) mostra que o transporte de acetil-coa ocorre à custa do gasto de uma ligação rica em energia do ATP: acetil-coa (mit.) + oxalacetato (mit.) + ATP + H 2 O acetil-coa (cit.) + oxalacetato (cit.) + ADP + Pi (18) 14- Sendo o acetil-coa citoplasmático um substrato para a formação endógena de ácidos gordos pode afirmar-se que a fracção da glicose ingerida que não é oxidada contribui para a formação dos triacilgliceróis que formam as gotículas de gordura dos adipócitos e de outras células do organismo. No entanto, o contrário não é verdadeiro: a maioria dos ácidos gordos que ingerimos são de cadeia par e, no seu catabolismo, geram acetil-coa que não pode converter-se em glicose. 4 Do mesmo modo, também as substâncias que geram apenas acetil-coa no seu catabolismo também não são substratos da gliconeogénese e, portanto, não geram glicose no organismo. Página 4 de 5

5 1. Rustin, P., Bourgeron, T., Parfait, B., Chretien, D., Munnich, A. & Rotig, A. (1997) Inborn errors of the Krebs cycle: a group of unusual mitochondrial diseases in human, Biochim Biophys Acta. 1361, Balaban, R. S. (2002) Cardiac energy metabolism homeostasis: role of cytosolic calcium, J Mol Cell Cardiol. 34, Brunengraber, H. & Roe, C. R. (2006) Anaplerotic molecules: Current and future, J Inherit Metab Dis. 29, Owen, O. E., Kalhan, S. C. & Hanson, R. W. (2002) The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function, J Biol Chem. 277, Brunengraber, H., Boutry, M. & Lowenstein, J. M. (1973) Fatty acid and 3- -hydroxysterol synthesis in the perfused rat liver. Including measurements on the production of lactate, pyruvate, -hydroxy-butyrate, and acetoacetate by the fed liver, J Biol Chem. 248, Sharma, N., Okere, I. C., Brunengraber, D. Z., McElfresh, T. A., King, K. L., Sterk, J. P., Huang, H., Chandler, M. P. & Stanley, W. C. (2005) Regulation of pyruvate dehydrogenase activity and citric acid cycle intermediates during high cardiac power generation, J Physiol. 562, Bisschop, P. H., Pereira Arias, A. M., Ackermans, M. T., Endert, E., Pijl, H., Kuipers, F., Meijer, A. J., Sauerwein, H. P. & Romijn, J. A. (2000) The effects of carbohydrate variation in isocaloric diets on glycogenolysis and gluconeogenesis in healthy men, J Clin Endocrinol Metab. 85, Página 5 de 5