EDENILCE DE FÁTIMA FERREIRA MARTINS

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1 1 EDENILCE DE FÁTIMA FERREIRA MARTINS Análise Reprodutiva de Machos e Fêmeas da Espécie Tambaqui (Colossoma macropomum - CUVIER, 1818) Submetidos a Diferentes Indutores Hormonais Cuiabá 2011

2 2 EDENILCE DE FÁTIMA FERREIRA MARTINS Análise Reprodutiva de Machos e Fêmeas da Espécie Tambaqui (Colossoma macropomum - CUVIER, 1818) Submetidos a Diferentes Indutores Hormonais Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal Área de Concentração: Produção Animal Linha de Pesquisa: Nutrição e Produção Animal/Piscicultura Orientadora: Prof. Dr. Jayme Aparecido Povh Co-Orientadora: Profª. Drª. Janessa Sampaio de Abreu Ribeiro. Co- orientador: Prof. Dr. Danilo Pedro Streit Jr. Cuiabá 2011

3 3 M379a Martins, Edenilce de Fátima Ferreira Análise Reprodutiva de Machos e Fêmeas da Espécie Tambaqui (Colossoma macropomum CUVIER, 1818) Submetidos a Diferentes Indutores Hormonais / Edenilce de Fátima Ferreira Martins. Cuiabá : UFMT, p. ilust. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Universidade Federal de Mato Grosso para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Orientador: Prof.Dr. Jayme Aparecido Povh 1. DESOVA DE PESCADO, 2. EXTRATO DE HIPÓFISE DE CARPA, OVOPEL, REOFILICO, SÊMEN. I.Título.

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5 5 Dedico Á Deus por seu infinito amor e cuidado e por permitir que eu consiga entender e aceitar os planos que Ele tem para minha vida. Aos meus pais, Adilson Fonseca Martins e Eva de Fátima Ferreira pelo apoio e amor incondicional, sempre me ajudaram, por sempre acreditarem na minha vitória. Ao orientador Jayme Aparecido Povh, por sua paciência, pelos ensinamentos, pela confiança depositada, pelo apoio e principalmente por acreditar que eu seria capaz, obrigada pela sua orientação e amizade, que permanecerá sempre em meu coração. Toda vitória é alcançada com luta e sofrimento, porém a luta passa, o sofrimento é apenas temporário, mas a vitória que se consegue é para sempre.

6 6 AGRADECIMENTOS Talvez a parte mais difícil seja agradecer a todos aqueles que tiveram papel decisivo para que este trabalho chegasse ao fim. Devo agradecer a muitas pessoas, cada qual representando uma peça importante na minha vida. A Deus, que permitiu que as realizações e alegrias sobrepujassem as frustrações e tristezas, fazendo com que esta jornada tenha sido compensadora. Aos meus pais, Adilson Fonseca Martins e Eva de Fátima Ferreira, pelos inúmeros ensinamentos, me encorajaram a vender os desafios, pelo carinho, amor e confiança. Mãe e Pai amo vocês incondicionalmente. Ao meu orientador Prof. Dr. Jayme Aparecido Povh que além de desempenhar sua função de professor e pesquisador, ainda achou tempo para transmitir experiências de vida, formação profissional e exemplos de dedicação ao trabalho e de conduta ética e moral. Foi um privilégio ter contado com sua orientação. A minha co-orientadora, Prof. Drª. Janessa Sampaio de Abreu Ribeiro, pelas conversas e conselhos nos meus momentos de dúvidas. Ao professor Dr. Edivaldo de Sampaio de Almeida Filho, pela amizade e por ter aceitado participar da minha defesa. Ao co-orientador Prof. Dr. Danilo Pedro Streit Jr., por ter aceitado o convite e participação da minha defesa. Ao professor Dr. Carlos Antonio Lopes de Oliveira, por ter disponibilizado seu tempo para me ajudar com a estatística do meu experimento, sua ajuda foi de grande valia. A Universidade Federal de Mato Grosso e ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, pela oportunidade de realização do mestrado. A FAPEMAT pela concessão da bolsa de estudos. Aos funcionários da secretaria da Pós-graduação Elaine e Douglas, pela amizade e disposição sempre auxiliando no que fosse preciso, Obrigada! A minhas queridas amigas Leni, Maryane, Fabiana, Valéria pela desinteressada amizade, constante apoio a todas as minhas iniciativas e pelos momentos de alegria e tristeza que passamos juntas durante esse tempo de convivência. Aos amigos adquiridos ao longo do mestrado, André Buzutti, Fabio Calhao, Marcelo, Rodrigo, Jorge, Marleide, Inácio, Celina, Evelyn, Elayna, Daniel, Rafael, Kênia, que fizeram diferença em minha vida.

7 7 Aos colegas adquiridos, Deivison, Pablo, Antônio, Ana Paula que participaram de momentos importantes da minha vida. Aos amigos de república, Fabiana, Mary, Leni, Inácio, Rodrigo, Evelyn, Emerson, Valéria e agregados que foram tantos, que estiveram junto comigo nos momentos alegres e tristes. Aos meninos da república rabo de vaca, Josimar, Marcus, Rodrigo e Inácio pelos almoços, jantas e seções de filme. Ao Senhor José Mario e Érika Piscicultura Buriti, pelo auxilio e ajuda na execução do experimento, pelo fornecimento da estrutura e dos animais e conhecimento na área. Aos funcionários da Piscicultura Buriti pela ajuda na execução do experimento. As estagiárias, Francielle, Laila, Evanielle e João Ênio pela ajuda na execução do experimento. A todos, muito Obrigada!

8 8 Tudo isso é... Saber Viver Quando me amei de verdade, compreendi que em qualquer circunstância, eu estava no lugar certo, na hora certa, no momento exato. E então, pode relaxar. Hoje sei que isso tem nome... Auto-estima. Quando me amei de verdade, pude perceber que minha angústia, meu sofrimento emocional, não passa de um sinal de que estou indo contra minhas verdades. Hoje sei que isso é... Autencidade. Quando me amei de verdade, parei de desejar que a minha vida fosse diferente e comecei a ver que tudo o que acontece contribui para o meu crescimento. Hoje chamo isso de... Amadurecimento. Quando me amei de verdade, comecei a perceber como é ofensivo tentar forçar alguma situação ou alguém apenas para realizar aquilo que desejo, mesmo sabendo que não é o momento ou a pessoa não está preparada, inclusive eu mesmo. Hoje sei que o nome disso é... Respeito. Quando me amei de verdade comecei a me livrar de tudo que não fosse saudável. Pessoas, tarefas, tudo e qualquer coisa que me pusesse para baixo. De início minha razão chamou essa atitude de egoísmo. Hoje sei que se chama... Amor-próprio. Quando me amei de verdade, deixei de temer o meu tempo livre e desisti de fazer grandes planos, abandonei os projetos megalômanos de futuro. Hoje faço o que acho certo, o que gosto, quando quero e no meu próprio ritmo. Hoje sei que isso é... Simplicidade. Quando me amei de verdade, desisti de querer sempre ter razão e, com isso, errei menos vezes. Hoje descobri a... Humildade.

9 9 Quando me amei de verdade, desisti de ficar revivendo o passado e de preocupar com o futuro. Agora, me mantenho no presente, que é onde a vida acontece. Hoje vivo um dia de cada vez. Isso é... Plenitude. Quando me amei de verdade, percebi que minha mente pode me atormentar e me decepcionar. Mas quando a coloco a serviço do coração, ela se torna uma grande e valiosa aliada. Tudo isso é... Saber Viver! Charles Chaplin

10 10 RESUMO MARTINS, E. F. F. Análise Reprodutiva de Machos e Fêmeas da Espécie Tambaqui (Colossoma macropomum - CUVIER, 1818) Submetidos a Diferentes Indutores Reprodutivos p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, As características de sabor, rusticidade, rápido crescimento e boa conversão alimentar tornaram o tambaqui, Colossoma macropomum, um dos peixes mais importante para a piscicultura brasileira. Este trabalho teve o objetivo de avaliar a eficiência da indução reprodutiva de machos e fêmeas e as características espermáticas do sêmen submetidos a diferentes indutores hormonais e diferentes posologias. Os reprodutores foram submetidos à reprodução induzida com extrato de hipófise de carpa (EHC) e Ovopel (produto sintético). No experimento com as fêmeas foram avaliados quatro tratamentos (3 posologias de Ovopel e uma posologia de extrato de hipófise de carpa) com quatro repetições, sendo os seguintes: 0,2; 0,4; 0,6 pellets de Ovopel/kg de peso vivo e 5,5 mg de EHC/kg de peso vivo. No experimento com os machos foram avaliados nove tratamentos (sete posologias com Ovopel, uma posologia de extrato de hipófise de carpa e 1 controle) com três repetições sendo os tratamentos: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 pellets de Ovopel/kg de peso vivo, 2,5 mg de extrato de hipófise de carpa/kg de peso vivo e o controle (sem indução). No experimento com as fêmeas, todos os tratamentos induziram a reprodução sendo que a posologia de 0,6 pellets de ovopel obteve taxa de desova de 50% as demais posologias de ovopel e EHC apresentaram taxa de desova de 100%, não houve mortalidade em nenhum dos tratamentos. Não houve diferenças estatísticas entre as posologias testadas de Ovopel e extrato de hipófise de carpa para peso dos ovócitos, nº de ovócitos/g e horas-grau. Maior taxa de fecundação foi verificada para a posologia de 5,5 mg de extrato de hipófise de carpa e maior taxa de eclosão, na posologia 0,2 pellets de Ovopel/kg de peso vivo. Os dados apresentados mostram que o indutor Ovopel pode ser utilizado eficientemente na substituição do EHC na posologia de 0,2 pellets/kg de peso vivo. No experimento com os machos os parâmetros volume espermático, motilidade progressiva e vigor espermático tiveram menores valores com a posologia de 0,1 pellets de Ovopel/kg de peso vivo e o controle. Considerando as patologias, as incidências de cauda quebrada, cauda dobrada e cabeça solta foram maiores com as posologias de 0,6, 0,1 e

11 11 0,4 pellets de Ovopel, respectivamente. A análise de regressão mostra que para reprodutores de 8 kg de peso vivo a posologia ideal é de 0,4 pellets, sendo que para peixes menores a quantidade de Ovopel deve ser reduzida para 0,2 pellets. Palavras chave: desova, extrato de hipófise de carpa, Ovopel, reofilico, sêmen

12 12 ABSTRACT MARTINS, E.F.F. Analysis of Male and Female Reproductive Species tambaqui (Colossoma macropomum - Cuvier, 1818) Submitted to Different Inducers Reproductive p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá, The flavor characteristics, hardiness, fast growth and good feed conversion made the tambaqui, Colossoma macropomum, one of the most important fish for fish farming in Brazil. This study aimed to evaluate the efficiency of induction of reproductive males and females and the sperm characteristics of semen subjected to different hormonal inducers and different dosages. The animals were subjected to induced reproduction with carp pituitary extract (EHC) and Ovopel (synthetic product). In the experiment females were evaluated four treatments (3 doses of Ovopel and a dosage of carp pituitary extract) with four replications, being the following: 0.2; 0.4; 0.6 Ovopel pellets/kg alive and 5.5 mg EHC/kg body weight. In the experiment with males nine treatments (seven Ovopel dosage, a dosage of carp pituitary extract and 1 control) with three replications and the treatments were: 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7 Ovopel pellets/kg body weight, 2.5 mg of carp pituitary extract/kg body weight and control (without induction). In the experiment with females, all treatments induced reproduction and the dose of 0.6 pellets obtained Ovopel spawning rate of 50% of the other dosages and Ovopel EHC showed spawning rate 100% there was no mortality in any treatments. There were no statistical differences between the dosages tested Ovopel and carp pituitary extract for weight of oocytes, number of oocytes/g-hour degree. Higher rate of fertilization was observed for a dose of 5.5 mg of carp pituitary extract and higher hatching rate, at a dose of 0.2 Ovopel pellets/kg body weight. The data show that the inductor Ovopel can be efficiently used in the replacement of EHC in dosage of 0.2 pellet/kg body weight. In the experiment with males parameters sperm volume, sperm motility and vigor had lower values with a dose of 0.1 Ovopel pellets/kg body weight and control. Considering the conditions, the incidence of broken tails, tail tucked and head were loose with larger dosages of 0.6; 0.1 and 0.4 Ovopel pellets, respectively. The regression analysis shows that for players 8 kg body weight ideal dosage is 0.4 pellets, and for the amount of smaller fish Ovopel should be reduced to 0.2 pellets. Key words: semen, Ovopel, carp pituitary extract, rheophilic, hatching

13 13 LISTA DE TABELAS Página REVISÃO Tabela 1. Patologias espermáticas (primárias e secundárias) que são mais relacionadas em peixes Capítulo I Tabela 1. Posologias do protocolo de indução à reprodução da espécie C. macropomum Tabela 2. Parâmetros analisados no sêmen da espécie Colossoma macropomum induzidos com Ovopel, extrato de hipófise de carpa e sem indução Tabela 3. Espermatozóides analisados no sêmen da espécie Colossoma macropomum induzidos com Ovopel, extrato de hipófise de carpa e sem indução hormonal Tabela 4. Morfologia espermática de machos da espécie Colossoma macropomum induzidos com Ovopel, extrato de hipófise de carpa e controle Capítulo II Tabela 1. Posologias de indução à reprodução de fêmeas da espécie C. macropomum, com extrato de hipófise e diferentes concentrações de Ovopel... Tabela 2. Indução reprodutiva de fêmeas da espécie Colossoma macropomum induzidas com Ovopel e extrato de hipófise de carpa (EHC)... Tabela 3. Parâmetros analisados em fêmeas da espécie Colossoma macropomum induzidas com Ovopel e extrato de hipófise de carpa (EHC)

14 14 LISTA DE FIGURAS Página Revisão de Literatura Figura 1. Evolução na produção de tambaqui em cativeiro no Brasil no período de 1994 a Figura 2. Reprodutores de tambaqui (Colossoma macropomum) contidos em tanques dentro de laboratório, para indução hormonal Figura 3. Padrões hormonais no eixo hipotálamo-pituitária-gonadal de peixes Figura 4. A - patologia quebrada, B- patologia cauda quebrada, C- patologia cabeça solta, D- patologia cauda curta, corado com rosa bengala Figura 5. A- ovos não viáveis (gorados), B- ovos viáveis, C- larvas eclodidas Capítulo I Figura 1. Dosagem de hormônios em relação ao peso da espécie C. macropomum e volume de sêmem... Figura 2. Morfologia espermática de machos da espécie C. macropomum submetidos a diferentes posologias de ovopel... Figura 3. Probabilidade de espermatozóides da espécie C. macropomum submetidos a diferentes posologias de Ovopel Anexo Figura 6.1 A - Apresentação comercial dos Indutores hormonais utilizados, B- direita Ovopel, esquerda Extrato de Hipófise de Carpa (EHC) utilizados na indução de Colossoma macropomum... Figura 6.2 Extrusão das fêmeas de tambaqui (C. macropomum)... Figura 6.3 Coleta do sêmen de machos de tambaqui (C. macropomum)

15 15 SUMÁRIO Página INTRODUÇÂO REVISÃO DE LITERATURA PRODUÇÃO DE PESCADO ESPÉCIE TAMBAQUI Colossoma macropomum (CUVIER, 1818) REPRODUÇÃO DE PEIXES Análise Qualitativa do Sêmen Motilidade Progressiva e Vigor Espermático Concentração Espermática Morfologia Espermática Análise dos ovócitos Desenvolvimento Embrionário INDUÇÃO HORMONAL Extra hipófise de Carpa/Salmão Ovopel REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARTIGOS GERADOS CAPÍTULO I 45 Características quantitativas e qualitativas do sêmen da espécie tambaqui submetidos a diferentes indutores reprodutivos Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Resultados e Discussão Conclusões... Agradecimentos Referências... 54

16 16 CAPÍTULO II 63 Reprodução induzida de fêmeas da espécie tambaqui submetidas a diferentes 64 indutores hormonais Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Resultados e Discussão Conclusões Agradecimentos Referências Anexo... 78

17 17 Análise Reprodutiva de Machos e Fêmeas da Espécie Tambaqui (Colossoma macropomum - CUVIER, 1818) Submetidos a Diferentes Indutores Hormonais INTRODUÇÃO No Brasil, os dados estatísticos do MPA (2010) mostram que a produção de pescado aumentou 25% nos últimos oito anos, passando de para toneladas no ano de Esta estatística revela que somente nos últimos dois anos houve um crescimento de 15,7%, sendo que a aquicultura apresentou uma elevação de 43,8%, passando de para toneladas/ano e a piscicultura um aumento de 60,8%, passando de 210 mil para 337 mil toneladas, sendo a área que mais cresceu nos últimos anos no Brasil. Quanto à pesca extrativista os dados do MPA mostram que a produção tanto marítima quanto continental passou de para toneladas/ano no mesmo período, representando um aumento em torno de 5,4% (BRASIL, 2010). A produção de tambaqui no país tem apresentado contínuo crescimento, partindo de oito mil toneladas em 1994 e atingindo 46 mil toneladas em Atualmente a produção de tambaqui representa 14% do total de pescado proveniente da piscicultura continental, sendo o quarto organismo aquático e o terceiro peixe mais produzido no Brasil (BRASIL, 2010). A aquicultura será fundamental para suprir a demanda por pescado considerando a tendência de aumento de consumo pela população. Dessa forma, a piscicultura torna-se uma atividade promissora, já que a mesma está estreitamente relacionada com a capacidade de perpetuação das espécies, produzindo larvas para criação, repovoamento e a formação de plantéis de reprodutores (GODINHO et al. 1984). Os avanços tecnológicos que viabilizaram a produção de peixes nativos no Brasil tiveram inicio na década de 30, por Rodolpho Von Ihering e seus colaboradores que, coletaram hipófise de rã e induziram machos à espermiação com dosagens crescentes e sucessivas, com intervalos de seis horas, impulsionando novos estudos aplicados à reprodução de peixes (CASTAGNOLLI, 1992). Esta técnica utilizada na reprodução de peixes migradores é utilizada em todo o mundo, sendo conhecida como hipofisação (ZANIBONI FILHO e WEINGARTNER, 2007). A técnica de hipofisação consiste na retirada de glândulas pituitárias de peixes, após a maturação sexual, para utilização em reprodutores com objetivo de promover a maturação final dos gametas e desova.

18 18 Este protocolo foi amplamente adotado e aplicado em várias espécies de peixes de diversas regiões e em condições ambientais diversificadas. Entretanto, a eficiência desta técnica é limitada, particularmente, no que se refere à resposta ao protocolo de indução, taxas de fertilização, produção e liberação de gametas e sobrevivência de reprodutores de diferentes espécies (MARQUES, 2001; SHIMODA et al. 2007), uma vez que há uma grande diversidade ictiológica de cada grupo filogenético, sendo necessários ajuste nos protocolos técnicos. A procura por novas alternativas para obtenção de peixes conduz a busca por produtos sintéticos, como as gonadotrofinas, levando ao desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas de indução à reprodução, propiciando uma exploração mais racional de reprodutores geneticamente selecionados e redução no custo de produção de alevinos (FOGLI DA SILVEIRA et al. 1988). Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes indutores reprodutivos em machos e fêmeas de tambaqui (Colossoma macropomum) com o intuito de aprimorar as técnicas atualmente existentes de indução.

19 19 REVISÃO DE LITERATURA 1. PRODUÇÃO DE PESCADO A produção de pescado no Brasil em 2003 foi de toneladas/ano e em 2009 atingiu produção de toneladas, sendo que toneladas provenientes da produção aquícola e toneladas da pesca extrativista (BRASIL, 2010). A aquicultura em 2003 tinha produção de ,5 t/ano atingindo em 2009 produções de ,0 t, sendo que a piscicultura foi um dos setores de maior crescimento, em 2003 com produção de ,5 t/ano e em 2009 atingiu toneladas (BRASIL, 2010). A produção total da pesca extrativa passou de t/ano em 2007 para t/ano em 2009, representando um crescimento relativo acumulado de 5,4%. Entretanto, a produção de pescado proveniente de aquicultura entre os anos de 2007 a 2009 apresentou um crescimento significativo de 43,2% saltando de t em 2007 para t em 2009 (BRASIL, 2010). O crescimento da produção de pescado no período de 2007 a 2009 foi bastante superior (115,7%) ao de aves (12,9%), suínos (9,2%) e bovinos (-8,6%) (IBGE/SIDRA, 2010). Este contexto demonstra a expressiva evolução da aquicultura, sendo que a expectativa para 2011 é de t proveniente da pesca extrativa e t da aquicultura com uma produção total de pescado de 1.430,000 t (BRASIL, 2010). A piscicultura nacional obteve um crescimento de 60,2% do ano de 2007 a A piscicultura nacional teve incremento de 90% na produção quando comparamos o ano de 2009 ao de As espécies mais produzidas no Brasil são tilápia (Oreochromis niloticus), carpa (Cyprinus carpio), tambaqui (Colossoma macropomum) e pintado (Pseudoplatystoma corruscans) (BRASIL, 2010). A produção de tambaqui (C. macropomum) no país tem apresentado contínuo crescimento, partindo de oito mil toneladas em 1994 e atingindo 46 mil toneladas em 2009 (Figura 1.), representando 14% do total de pescado proveniente da piscicultura continental, o que coloca o tambaqui como o quarto organismo aquático e o terceiro peixe mais produzido no Brasil.

20 20 Figura 1. Evolução na produção de tambaqui em cativeiro no Brasil no período de 1994 a Fonte: BRASIL, (2010). No ano de 2009, a região Nordeste apresentou a maior produção de pescado marinho e continental (capturado e pesca) t respondendo por 34% da produção nacional, seguida pelas regiões Sul, Norte, Sudeste e Centro-Oeste, cujas produções foram respectivamente de t (25%), t (21%), t (14%) e t (6%) (BRASIL, 2010). Na produção nacional do pescado por Unidade da Federação no ano de 2009, o estado de Santa Catarina foi o maior produtor de pescado com t, seguido pelo Pará e Bahia com t e t, e, representando a região Centro-Oeste, com 72,030 t e o estado de Mato Grosso com ,8 t (BRASIL, 2010). 2. ESPÉCIE TAMBAQUI - Colossoma macropomum (CUVIER, 1818) O tambaqui, Colossoma macropomum, Cuvier (1818), é um peixe que pertencente à Ordem Characiforme, família Characidae e sub-família Myleinae (NAKATANI et al. 2001). Esta espécie nativa da bacia amazônica é reofílica e esta amplamente distribuída na parte tropical da América do Sul e na Amazônia Central (ARAÚJO-LIMA e GOMES, 2005). Recebe outras denominações comum como cachama, gamitana e black pacu (ARAÚJO- LIMA e GOMES, 2005). É o segundo maior peixe de escamas do rio Solimões/Amazonas

21 21 que, no ambiente natural, pode chegar até 100 cm de comprimento e 30 kg de peso corporal (ARAÚJO-LIMA e GOULDING, 1998). O tambaqui é um peixe de escamas com corpo romboidal, nadadeira adiposa curta com raios nas extremidades, dentes molariformes e rastros branquiais longos e numerosos, boca prognata pequena e forte lábios grossos. A coloração parda é geralmente na metade superior e preta na metade inferior do corpo, mas pode variar para mais clara ou mais escura (Figura 2.) dependendo da cor da água (ARAÚJO-LIMA e GOULDING, 1998). Figura 2. Reprodutores de Tambaqui (Colossoma macropomum) contidos em tanque dentro de laboratório, para indução hormonal. O tambaqui é considerado uma das espécies mais importantes para a economia da Amazônia, sendo muito apreciado pelo sabor (GOMES et al. 2003). Apresenta bom desenvolvimento, alta produtividade, rápido crescimento, resistência a elevadas temperaturas, a enfermidades e a baixos níveis de oxigênio dissolvido (SILVA et al. 1986; ARAÚJO-LIMA e GOMES, 2005; PORTO, 2005). Em situação de hipóxia, desenvolve adaptações comportamentais e fisiológicas para suportar a adversidade, como aumento da respiração e

22 22 batimento cardíaco, aumento da afinidade da hemoglobina pelo oxigênio, redução do metabolismo e crescimento mais lento (VAL e ALMEIDA-VAL, 1995; GOMES et al. 2006). A característica de aproveitar vários tipos de alimentos faz com que o tambaqui seja um peixe de fácil adaptação na piscicultura. Esta espécie apresenta-se como excelente filtrador de plâncton, possui crescimento rápido e boa resistência ao manuseio (ARAÚJO- LIMA e GOULDING, 1998). Apresenta hábito alimentar onívoro e diurno (ANDRADE et al. 2008), alimenta-se de frutas, algas, sementes e pequenos crustáceos, mas adapta-se muito bem à alimentação artificial (RASGUIDO e LOPES, 2004). A alimentação natural da larva do tambaqui consiste de zooplâncton, particularmente cladóceros e copépodes, chegando a consumir uma quantidade de alimento correspondente a cerca de 9% do seu peso (SANTOS et al. 2006). O período reprodutivo do tambaqui ocorre nos meses de temperaturas mais elevadas do ano, sendo à maior concentração de desovas por indução hormonal entre os meses de novembro a fevereiro. Esta espécie apresenta desova total e fertilização externa, respondendo de forma satisfatória à indução hormonal com boa taxa de fertilização e viabilidade de larvas (SILVA et al. 2007). Durante a estação seca (julho a outubro) em habitat natural, realiza longas migrações enquanto ocorre a maturação das gônadas (ROMAGOSA et al. 1988). Segundo Vazzoler (1996), nas espécies de desova total, os ovócitos maduros são eliminados durante o período reprodutivo de uma só vez, ao contrário daquelas de desova múltipla ou parcelada que eliminam seus óvulos mais de uma vez. Na região da Amazônia, o tambaqui possui desova anual e total que ocorre durante um período determinado do ano, época das enchentes dos rios. Esse comportamento da espécie se difere na região Nordeste, onde recebendo ração e manejo adequados podem desovar o ano inteiro, mediante a indução hormonal de fêmeas e machos (VIVIER et al. 1999). Quando atingem cerca de 45 a 60 cm de comprimento padrão, ou aproximadamente três anos de idade, iniciam maturação sexual, sendo que a fêmea desova 10% do seu peso vivo e cada grama liberada representa aproximadamente ovócitos (ARAUJO-LIMA e GOULDING, 1997), medindo cerca de 1,3 mm de diâmetro (SANTOS et al. 2006). O grau de maturação gonodal do tambaqui é determinado pelas seguintes características externas: fêmeas apresentam abdômen abaulado e macio e papila urogenital saliente e avermelhada e os machos fluidez de sêmen obtido por massagem abdominal suave. Embora o tambaqui seja uma espécie que se adapte com grande facilidade aos sistemas de produção, não se reproduz em cativeiro, a menos que seja submetido à indução

23 23 hormonal (ROMAGOSA et al. 1988). São utilizados produtos naturais, como extrato de pituitária e hcg (gonadotrofina coriônica humana) e substâncias sintéticas, como os análogos de hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH ou LH-RH) e antagonistas do hormônio bloqueador de gonadotrofinas (dopamina) (URBINATI e GONÇALVES, 2005). Estudos demonstraram que o sêmen da espécie C. macropomum apresenta coloração leitosa, textura acentuadamente viscosa e concentração espermática média em torno de 35 x 10 9 espermatozóides por mililitros. Em espécies aquáticas, de fecundação externa, os espermatozóides são liberados em um ambiente hostil e quando ativados tem uma sobrevivência por um período muito curto de 1 a 3 minutos (MENEZES et al. 2008). O grande número de espermatozóides no ejaculado e a longevidade do espermatozóide após ativação auxiliam no momento da fecundação (HOLT e VAN LOOK, 2004), pois os espermatozóides no momento da ejaculação são imóveis e a mobilidade é induzida ao entrar em contato com água e ficam ativos por menos de três minutos (KIME et al. 2001). 3. REPRODUÇÃO DE PEIXES A reprodução em ambiente natural depende de um ajuste temporal, grarantindo que a desova ocorra no melhor local e no momento exato, quando as condições ambientais estejam mais favoráveis para a sobrevivência dos descendentes. Dessa forma, a sincronia entre os processos fisiológicos de maturação gonadal com as condições ambientais são fundamentais para o sucesso reprodutivo (CYRINO et al. 2004). Peixes reofílicos em condições naturais realizam a piracema, sendo a reprodução regulada por ritmos endógenos mediados por fatores externos, como variações de temperatura, fotoperíodo (mudanças cíclicas de luz), aumento das chuvas, pressão da massa de água, ph, entre outras variáveis, que determinam o melhor período para a desova e proporcione sobrevivência da prole (ZANUY e CARRILLO, 1987 ; WAYNAROVICH e HORVATH, 1989). Em condições de confinamento, supressões fisiológicas tendem a ocorrer no processo reprodutivo. Pois ocorrem restrições de áreas para deslocamentos, variações de temperatura e fotoperíodo que interferem na ação de hormônios sexuais indutores da ovulação. Este fato proporciona o desenvolvimento dos ovócitos, mas não a maturação final e desova (ZOHAR e MYLONAS, 2001; YARON, 1995). Fotoperíodo e temperatura são os principais moduladores da maturação gonadal dos peixes. Nos ciprinídeos, a temperatura é mais

24 24 importante, enquanto em salmonídeos e outras famílias de peixes o fotoperíodo exerce maior atuação na atividade endócrina (BAYARRI et al. 2004). Os peixes percebem o fotoperíodo através dos olhos e pelos fotorreceptores da glândula pineal, órgão endócrino localizado na parte alta do cérebro. A glândula pineal sintetiza e secreta a melatonina, hormônio que participa da determinação do momento do desenvolvimento. Porém, dados de relação entre a secreção de gonadotrofinas e melatonina nos peixes ainda é escasso (BROMAGE et al. 1995). De maneira geral, observa-se estímulo da secreção de hormônio luteinizante (LH) pela melatonina, mas seu efeito depende da relação dia-noite (INTERVET, 2009). A reprodução dos peixes é um processo complexo controlado pelo eixo hipotálamopituitária-gonadal (ROMAGOSA, 1998 ; STREIT Jr. 2002). Dois hormônios denominados gonadotropinas são responsáveis pelo controle do ciclo reprodutivo em peixes: hormônio gonadotrópico I- hormônio folículo-estimulante (FSH) e hormônio gonadotrópico IIhormônio luteinizante (LH) (FONTAINE, 1976). O hipotálamo é ativado por fatores ambientais e químicos (feromônios). Após esta ativação, diferentes neuropeptídeos (hormônios liberadores de gonadotrofinas GnRH: FSH e LH ) são sintetizados e secretados através das fibras neurosecretórias da pituitária (Figura 3.) (INTERVET, 2009). A liberação do LH é estimulada pelo GnRH e inibida pela dopamina, que age como um fator inibitório da liberação de gonadotrofinas. A dopamina age diretamente na pituitária, modulando as ações de GnRH (PETER et al. 1993). A inibição da dopamina sobre a liberação de GnRH depende da presença de altos níveis de estradiol durante a vitelogênese, prevenindo a liberação de LH, com a queda nos concentrações de estradiol ao final deste processo cessa a inibição pela dopamina (INTERVET, 2009). Uma das razões para não ocorrer a ovulação e desova é a falha da pituitária na secreção de LH (LIN e PETER, 1996). Tanto o FSH como o LH induzem a esteroidogênese em células gonadais específicas e o FSH está envolvido na regulação dos estágios iniciais da gametogênese até a vitelogênese nas fêmeas e a espermatogênese nos machos. Após o término desse processo, os níveis sanguíneos de FSH diminuem e os de LH aumentam rapidamente. O LH está envolvido na regulação da maturação final do oócito e ovulação nas fêmeas e na espermiogênese e espermiação dos machos (CHYB et al. 1999).

25 25 Figura 3. Padrões hormonais no eixo hipotálamo-pituitária-gonadal de peixes. Fonte: Intervet (2009). Para ovulação é necessário induzir a maturação final dos oócitos (migração e quebra da vesícula germinal) das matrizes. Vários hormônios podem ser utilizados para induzir a maturação e ovulação de ovócitos pós-vitelogênicos. São utilizados extrato de pituitária de peixes (extrato de hipófise carpa/salmão), gonadotrofina coriônica humana (hcg), 17α hidroxi 20β dihidroxi e antagonistas da dopamina (Ovopel) (ZOHAR e MYLONAS, 2001). Contudo, quase a totalidade das induções reprodutivas no Brasil é realizada com extrato de hipófise de carpa. 3.1 Análise Qualitativa do Sêmen Estudos de biologia do sêmen de peixes começaram no século XIX. Várias características da biologia do sêmen de peixe foram rapidamente identificadas, tais como a imobilidade do espermatozóide no sêmen, a curta duração do seu movimento após sua

26 26 ativação e a necessidade de diluição em água para a iniciação do movimento do espermatozóide (BILLARD e COSSON, 1992), sendo essas características estudadas em diversas espécies de peixes. A análise da qualidade do sêmen pode ser utilizada como uma poderosa ferramenta para selecionar reprodutores quanto a sua eficiência reprodutiva. 3.2 Motilidade Progressiva e Vigor Espermático Estudos de motilidade espermática em peixes são ainda limitados e a maior parte estão relacionados com a regulação da ativação da motilidade de peixes foi feita com espermatozóides de truta. Os principais problemas limitantes de pesquisas em motilidade espermática consistem em sua curta duração, em sua rápida alteração e na dificuldade de se obter uma mistura homogênea do sêmen (COSSON et al. 1999). A duração da motilidade espermática em peixes de água doce é de curta duração, (COSSON et al. 1999) e muito variada entre as espécies podendo variar de 30 segundos para truta-arco-íris (Oncorhynchus mykiss) (PERCHE et al. 1993), 300 segundos para dourado (Salminus maxillosus), 612 segundos para curimbatá (Prochilodus lineatus) (CÓSER et al. 1984). A energia para a motilidade e o metabolismo do espermatozóide é derivada de uma quebra de nutrientes exógenos e endógenos na presença ou ausência de oxigênio. A diminuição da capacidade de natação dos espermatozóides é originada em parte pela diminuição do estoque de energia ocorrida durante o período de motilidade (COSSON et al. 1999). A fosforilação oxidativa mitocondrial é altamente requerida para produzir energia durante a locomoção dos espermatozóides, logo após a iniciação da motilidade, o ATP intracelular nos espermatozóides diminuiu rapidamente e sua regeneração ocorreu espontaneamente dentro de 15 segundos (COSSON et al. 1999). Lahnsteiner et al. (1998) verificaram que os espermatozóides do sêmen de truta arcoíris (O. mykiss) utilizam triglicérides e glicose como fonte primária de energia, mas o ATP continua sendo a fonte de energia mais importante para o batimento flagelar. Durante a imobilidade do espermatozóide, o catabolismo da glicose e de triglicerídeo pode ocorrer simultaneamente, mas os parâmetros que regulam esta energia ainda são desconhecidos. A duração da motilidade no meio natural varia amplamente entre as espécies e coincide em geral com o período fértil dos óvulos COSSON et al. (1999). Em razão do

27 27 tamanho dos espermatozóides, as análises de motilidade espermática de peixes têm sido conduzidas em microscopia de luz ou em contraste de fase com aumento de 100 a 650x (WAYMAN et al. 1998). Para análise, em uma lâmina de microscopia ótica dilui-se uma gota de sêmen (5 µl) em 20 µl de solução fisiológica (0,9% cloreto de sódio), leva-se ao microscópio com contraste de fase em objetiva de 40X, avaliando, por método subjetivo, os movimentos retilíneos e a propulsão dos espermatozóides, obtendo assim as variáveis motilidade progressiva e vigor espermático. O escore de avaliação da motilidade progressiva varia de 0 a 100% e para vigor espermático de 0 a 5 pontos. 3.3 Concentração Espermática A concentração espermática permite determinar a quantidade de espermatozóides presentes no sêmen. A concentração dos espermatozóides é medida através de câmaras de contagem (Makler, Horwell, Neubauer). Coloca-se um volume de 10 µl de esperma com formol-salina no centro da câmara de Neubauer, adapta-se a lamínula e realiza-se a contagem em microscopia de fase em aumento de 200 vezes, dos 4 quadrantes da câmara. Em seguida, o número total de células obtidos nos 4 quadrantes é dividido por 4 (média) e multiplicado pelo valor da diluição realizada. Ao final, o valor encontrado deve ser multiplicado por 1x10-4 /ml (ordem de grandeza da câmara), obtendo-se a quantidade de espermatozóides por mm Morfologia Espermática O exame de morfologia espermática permite a determinação da freqüência de cada uma das anormalidades espermáticas e do percentual total de alterações na amostra de sêmen. Essas alterações podem interferir na capacidade de movimentação e fecundação do espermatozóide, de acordo com a localização do defeito. Este exame é uma ferramenta fundamental para o descarte do sêmen e até mesmo do reprodutor (BORTOLOZZO et al. 2005). Para a análise de morfologia espermática, utilizando-se microscopia óptica, são observados esfregaços úmido corados com rosa bengala, corante recomendado para peixes por STREIT Jr. et al. (2004), contando-se 200 espermatozóides, classificando-os em; normais e patologias primárias e secundárias de acordo com HERMAN et al. (1994), (Tabela 1.).

28 28 Tabela 1. Patologias espermáticas (primárias e secundárias) que mais são relacionadas em peixes. Primárias Cauda quebrada Cauda enrolada Cauda curta Cauda degenerada Macrofalia Anormalidades Secundárias Cauda dobrada Cabeça solta Cauda solta Gota distal Gota citoplasmática Na Figura 4. temos as patologias mais acometidas nos espermátozoides de peixes sendo classificadas como primárias ou secundárias conformo tabela 1. Figura 4. A - patologia de cauda quebrada, B- patologia cauda enrolada, C- patologia cabeça solta, D- patologia cauda curta, corado com rosa bengala. 3.5 Análise dos ovócitos Estudos que envolvem a determinação do desenvolvimento e da maturação sexual são fundamentais para a ciência da pesca e são pré-requisitos para a compreensão do ciclo de vida

29 29 dos peixes (Figura 5.) (SILVAKUMARANA et al. 2003) qualidade viáveis para formação de larvas saudáveis. e obtenção de ovócitos de A B C Figura 5. A - ovos não viáveis (gorados), B- ovos viáveis, C- larvas eclodidas. 3.6 Desenvolvimento Embrionário Estudos sobre ovos de peixes são de grande interesse por fornecerem subsídios para a compreensão da fisiologia dessa célula germinativa, tendo em vista a preservação de gameta e consequentemente da ictiofauna e o aprimoramento de técnicas de cultivo (GODINHO et al. 2007). No Brasil, pesquisas relacionadas à biologia reprodutiva e ao desenvolvimento embrionário e larval de peixes em cativeiro têm sido baseadas principalmente em espécies reofílicas. O desenvolvimento embrionário é um processo que se inicia com a fertilização do ovócito e vai até a eclosão das larvas. Após a fertilização, o ovo absorve água e ocorre a formação do espaço perivitelino, com a separação entre o córion e a membrana vitelina. Os ovos dos peixes são telolécitos, com um elevado suprimento de vitelo, do qual o embrião irá se nutrir durante a embriogênese, assim como as larvas durante algum tempo após a eclosão (NAKATANI et al. 2001). 4. INDUÇÃO HORMONAL O manejo reprodutivo adequado deve buscar atingir o potencial fisiológico de cada espécie de peixes para gerar um maior número de larvas. A aplicação das técnicas convencionais de indução hormonal é indicada para peixes que atingiram a maturação sexual no momento em que a vitelogênese esta completa nos ovócitos. Dessa forma, a indução hormonal é utilizada para garantir a maturação final e desova (CYRINO et al. 2004). Já para os machos a indução hormonal tem função de aumentar o volume de sêmen produzido.

30 30 Alguns métodos utilizados para a indução hormonal com doses preparatórias ou até mesmo doses múltiplas impõem manipulações desnecessárias, causando estresses adicionais aos peixes manejados podendo levar a morte desses animais. Segundo Zohar e Mylonas (2001) o uso de tratamento múltiplo (várias doses) pode resultar na morte dos peixes após a indução, prejudicando a maturação final dos ovócitos e reduzindo a qualidade dos ovos, bem como requer mais trabalho, tempo e monitoramento. Contudo Zanuy e Carrillo (1987) destacam vantagens em métodos mais simples, com baixo custo e a não necessidade de equipamentos sofisticados, utilizando doses facilmente calculadas como é o caso da hipofisação. O termo hipofisação refere-se à administração de extratos de hipófise bruto de peixe (HOUSSAY, 1930), em 1929 Rodolpho Von Ihering iniciou os trabalhos com a hipofisação no Brasil, no cultivo de peixes na região Nordeste brasileira, sendo esta técnica atualmente a mais utilizada na reprodução induzida de peixes no Brasil (MORAES et al. 2001). 4.1 Extrato de hipófise de carpa/salmão A utilização de extrato de hipófise é conhecida como o método de hipofisação, é uma das técnicas mais simples e muito utilizada na reprodução de peixes. A coleta da hipófise é realizada em peixes maduros sexualmente, ou seja, quando ocorre a concentração máxima de gonadotrofina na hipófise durante a fase final da vitelogênese. A carpa comum é a principal doadora de hipófise para uso comercial, em função de ser uma espécie cosmopolita. Também é produzida a hipófise seca de salmão, que atendem um mercado diferenciado. O extrato de hipófise atua como um complemento da quantidade de gonadotrofina produzida pelo organismo receptor, substituindo a quantia que deixou de ser produzida pela ausência das condições ambientais favoráveis (DANUBIO, 2011), como por exemplo, o confinamento. As hipófises coletada frescas são imediatamente submetidas a desidratação com acetona e posteriormente armazenadas e comercializadas na forma inteiras ou em pó. x. A dosagem de extrato de hipófise é expressa em miligramas ou como um número de glândulas pituitárias dessecadas com acetona. A glândula pituitária de uma carpa comum de 1,5 a 2,0 kg desidratada pesa entre 2,5 a 3 mg (FELTEN, 2005). Pois um frasco contém material suficiente para certa quantidade de matrizes, fazendo com que o criador tenha que ajustar seus planos de reprodução ao tamanho da embalagem. Este produto é preparado em

31 31 laboratório especializado apresentando preço consideravelmente elevado e seus agentes ativos se decompõem rapidamente e tem problema com a falta de padronização do produto. Existem inúmeros protocolos de indução hormonal com o extrato de hipófise sendo o mais comum a posologia com duas injeções intramusculares na fêmea (intervalo de 10 a 24 horas, dependendo da espécie), e uma dose única no macho no momento da segunda dose da fêmea. Em alguns casos, a desova pode ser obtida com apenas uma aplicação, o que reduz o manejo das fêmeas (BALDISSEROTTO, 2002). As posologias variam conforme a espécie que recebe a aplicação e também de acordo com a espécie doadora da hipófise e pode variar de 1 a 6 mg/kg de peso vivo para induzir a desova e a espermiação na maioria das espécies reofílicas (LIMA e GOULDING, 1998). Segundo relatos de Zaniboni Filho e Barbosa (1996) algumas espécies de teleósteos apresentaram maior fecundidade e taxa de fecundação se os reprodutores receberem uma aplicação de extrato de hipófise (0,25 mg/kg de peso vivo) um ou três dias antes do tratamento convencional com extrato hipofisário o resultado será otimizado. Trabalhando com a com a propagação artificial do peixe japonês (Carassius auratus), Rosa et al. (1994 )utilizaram extrato de hipófise de carpa (EHC), com duas aplicações de EHC nas fêmeas, 0,5 e 4,5 mg de hipófise/kg de peso vivo (primeira e segunda aplicação respectivamente) e nos machos 0,5 e 2,5 mg de hipófise/kg de peso vivo (primeira e segunda aplicação respectivamente). Nos animais submetidos à desova seminatural, foi obtido eficácia de 100% na desova, com taxas de fecundação entre 45 e 48% com 0% de mortalidade dos reprodutores. Nos animais submetidos à extrusão, 75% das fêmeas hipofisadas apresentaram resultados positivos, com taxa de fecundação entre 65 e 70% com 0% de mortalidade dos reprodutores. O sêmen do peixe japonês apresentou características de semi-denso com coloração branco gelo. Já Orbolato et al. (2006) realizaram reprodução induzida com extrato bruto de hipófise de caroá (EBHC) em 80 fêmeas e 89 machos, do lambari (Astyanax bimaculatus), sendo que os machos receberam dose única de 3 mg/kg de peso vivo de extrato bruto de hipófise de carpa (EBHC) e as fêmeas duas doses, totalizando 5,0 mg/kg de peso vivo, sendo 20% na primeira aplicação e 80% na segunda aplicação da posologia total. Os autores obtiveram fecundidade absoluta de aproximadamente ovócitos e taxa de fecundidade de 70%,e concluíram que a indução hormonal com EBHC é efetiva para promover a maturação final dos ovócitos e a desova nesta espécie.

32 32 Induzindo exemplares de tambaqui (Colossoma macropomum) com extrato de hipófise de carpa, Cavalcante Filho et al. (2009) utilizou o protocolo com duas aplicações nas fêmeas (primeira dose de 0,6 mg/kg e 5,0 mg/kg na segunda dose) e uma única dose de 2,5 mg/kg de peso vivo nos machos. Houve resposta positiva de 75% das fêmeas e 100% dos machos. A carpa comum é o principal doador de hipófise para uso experimental e comercial, entretanto busca-se hipófise de origens diversas, com o intuito de diminuir o valor agregado ao extrato de hipófise e sua difícil aquisição, Souza et al. (2003) induziram exemplares de carpa (Cyprinus carpio) com extrato de hipófise de frango (EHF), coelho (EHCo) e o controle extrato de carpa (EHC), sendo os machos submetidos a uma única aplicação, 3,0, 5,0 e 7,0 mg de EHC, EHF e EHCo/kg de peso vivo respectivamente; nas fêmeas duas aplicações, divididas em 10 e 90% da dose total de 5,0, 9,0 e 12,6 mg EHC, EHF e EHCo/kg de peso vivo, respectivamente. Os autores encontraram valores superiores para volume médio de sêmen, concentração espermática e número de espermatozóides liberados no sêmen quando submetidos a EHC e EHF, porém para motilidade progressiva e vigor espermático não houve diferenças entre os indutores testados. Nas fêmeas, taxa de desovas, unidade térmica acumulada, número de ovócitos/g de ovócitos liberados e taxa de eclosão apresentaram respostas positivas somente para EHC e EHF. Machos de curimbatás (Prochilodus lineatus) foram induzidos por Streit Jr. et al. (2004) com extrato de hipófise de carpa (EHC), extrato de hipófise de frango (EHF) e extrato de coelho (EHCo). Os animais receberam dosagem única de 3,0, 5,0 e 7,0 mg de EHC, EHF e EHCo/kg de peso vivo respectivamente e obtiveram um volume médio de sêmen e número de espermatozóides totais superior para EHC e EHF, porém a indução com EHCo produziu maior concentração espermática/mm³ de sêmen quando comparado com EHC. Para motilidade progressiva o EHF foi mais eficiente que o EHC e ambos os tratamentos produziram comportamento semelhantes para o vigor espermático, levando a conclusão que o EHF apresentou eficiência semelhante ao tradicional EHC. 4.2 Ovopel O ovopel é um produto sintético desenvolvido pela Universidade de Godollo na Hungria, composto por análogo do GnRH mamíferos, D-Ala6, Pro9Net-mGnRH, e os antagonistas do receptor solúvel em água a dopamina, a metoclopramida. As concentrações D-Ala6, Pro9Net-mGnRH e metoclopramida é de μg e 9-10 mg respectivamente

33 33 (DAS, 2004). O hormônio é disponível na forma de pellets, sendo que cada pellet contém gonadotrofina que estimulam a liberação análoga do hormônio hipotalâmico. O ovopel atua semelhante na hipófise levando à secreção de gonadotrofinas endógenas (DAS, 2004). O ovopel é de fácil armazenamento e utilização, fácil acesso ao produto e menor custo em relação à hipófise (SZABO, 1996). Ensaios revelam que uma dose de 1-1,5 pellets/kg de peso vivo pode produzir até 100% de desova. Para ciprinídeos, bons resultados foram relatados quando administradas doses de 2 a 2,5 pellets/kg de peso vivo em fêmeas produzindo com êxito nas desovas (DAS, 2000). Estudo realizado por Brzuska e Grzywaczewski (1999) sugere possibilidade de uso desse hormônio novamente depois de alguns dias se a primeira estimulação falhar, enquanto tal medida não é recomendada no caso da hipofisação. De acordo com Horvarth et al. (1997) observaram que a indução a ovulação em peixes com GnRH tem sido utilizado há décadas. O ovopel (análogo do GnRH) foi testado em espécies ciprinícolas, carpa comum, prateada e capim (Cyprinus carpio, Hypophthalmichthys molitrix e Ctenopharyngodon idella) comparando a proporção de fêmeas que ovularam ou não ovularam com o ovopel e extrato de hipófise de carpa e concluíram que os animais submetidos ao ovopel responderam positivamente apresentando alta taxa de ovulação. Exemplares de carpas indianas de Assam (Catla catla) e chinesas carpa prateada e capim (Hypophthalmichthys molitrix e Ctenopharyngodon idella) foram induzidas por Das (2004) com ovopel, extrato de hipófise e o ovaprim (produto sintético, que contém Ova-RH, um análogo sintético de GnRH de Salmão a partir de um inibidor da dopamina), com dosagem única para os indutores sintéticos e duas dosagens para o extrato de hipófise. Os animais submetidos ao ensaio com posologia do ovopel com 1 a 1,5 pellets/kg de peso vivo produziram 100% de desova, com um tempo de resposta entre 4 e 9 horas e uma taxa de fecundação entre 65 e 80%. Os autores concluíram que a qualidade dos ovócitos e taxa de eclosão foram melhores com ovopel e ovaprim, possivelmente devido a falta de padronização da hipófise. Os resultados indicaram superioridade do hormônio ovopel sobre o extrato de hipófise e ovaprim. Fora do período reprodutivo do Catfish (Silurus glanis), Ulikowski (2004) testou métodos de reprodução artificial por meio de estimulação térmica e hormonal. Os animais foram induzidos com Ovopel e EHC, sendo que os tratamentos foram denominados A, B, C e N. O tratamento A recebeu duas doses de Ovopel, 0,2 e 0,3 pellets/kg de peso vivo, e uma de EHC com 3 mg/kg de peso vivo, com intervalo entre as aplicações de 24 horas. Os

34 34 tratamentos B, C e N receberam uma dose de ovopel de 0,3 pellets/kg de peso vivo e uma de EHC de 3 mg/kg de peso vivo nas fêmeas e os machos foram estimulados com uma dose de Ovopel de 1 pellets/kg de peso vivo. As fêmeas que receberam estimulação com duas doses de Ovopel e uma de EHC forma mais eficientes na desova, produzindo maior número de ovócitos e maior sobrevivência de embriões. A ação de diferentes indutores hormonais podem ter reposta também diferentes, dependo da origem, do ambiente dos animais a serem estimulados. Por exemplo, Kucharczyk et al. (2007) selecionaram tenca selvagem (Tinca tinca) com peso médio de 0,8 a 1,2 kg, onde machos e fêmeas foram mantidos em tanques de 1000 L com temperatura controlada em torno de 22ºC e 18 horas de luz e 6 horas de escuro (fotoperíodo) e submetidos a diferentes tipos de estimulação hormonal. Os animais foram divididos em 3 grupos experimentais e um controle, recebendo uma única posologia EHC (3 mg/kg de peso vivo) e hcg (Gonadotrofina Coriônica Humana - dosagem de 1000 IU/kg de peso vivo) e Ovopel (2 pellet/kg de peso vivo) e para o controle utilizaram 0,5 ml de solução de 0,9% de NaCL/kg de peso vivo. Os animais que receberam o tratamento controle, não desovaram e todas as fêmeas estimuladas com Ovopel desovaram. O menor tempo de horas-grau (8-11horas) foi observado nos animais submetidos ao hcg seguido pelo EHC (10-12 horas) e com o Ovopel foi (12-16 horas). Comparando a eficiência do EHC com Ovopel e hcg também foi testada por Targonska e Kucharczk (2010) porém com goldfish (Carassius auratus auratus), onde os indutores foram administrados em dose única e induzindo duas desovas o mesmo peixe em um período de 21 dias. Os melhores resultados foram observados nos animais submetidos à hcg (variando entre 88,7 a 100%) e verificaram ainda que na primeira desova as fêmeas produziram maior número de ovócitos/kg de peso vivo, alem de uma maior sobrevivência de embriões e de reprodutores.

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43 43 WAYNAROWICH, E. ; HORVATH, L. A propagação de peixes de águas tropicais: manual de extensão. BRASÍLIA; FAO/CODEVASF/CNPq, p.

44 44 ARTIGOS PRODUZIDOS Capítulo I

45 45 Características quantitativas e qualitativas do sêmen de reprodutores de tambaqui induzidos com diferentes indutores reprodutivos Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar as características qualitativas e quantitativas do sêmen de reprodutores de tambaquis (Colossoma macropomum) submetidos a diferentes indutores hormonais. Foram utilizados nove tratamentos e três repetições, totalizando 27 unidades experimentais, submetidos aos seguintes tratamentos: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 e 0,7 pellets de Ovopel/kg de peso vivo; 2,5 mg de extrato de hipófise de carpa (EHC)/kg de peso vivo; e sem indução hormonal (controle). A posologia com 0,1 pellets de Ovopel e o controle apresentaram menor volume de sêmen, motilidade progressiva e vigor espermático. A análise de regressão indica que quanto maior a posologia de Ovopel maior o volume de sêmen produzido. Reprodutores com peso médio de 8 kg apresentaram melhores características qualitativas e quantitativas com a posologia de 0,4 pellets de Ovopel/kg de peso vivo, e para reprodutores menores de 8 kg os melhores resultados foram obtidos com posologias de 0,2 e 0,4 pellets. A utilização do indutor Ovopel na concentração adequada pode substituir o protocolo tradicional EHC na reprodução de C. macropomum. Termos para indexação: Colossoma macropomum, ovopel, extrato de hipófise, reprodução Quantitative and qualitative characteristics of semen from breeding tambaqui induced with different inducers reproductive Abstract - The objective of this study was to evaluate the qualitative and quantitative characteristics of the semen of animals of tambaqui (Colossoma macropomum) submitted to different hormonal inducers. There were nine treatments and three replications, totaling 27 experimental units, to the following treatments: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6 and 0.7 Ovopel pellets/kg weight, 2.5 mg of carp pituitary extract (EHC)/kg body weight, and without

46 46 hormonal induction (control). Dosing with 0.1 Ovopel and control pellets had lower semen volume, sperm motility and vigor. Regression analysis indicates that the higher the dosage of Ovopel greater the volume of semen produced. Animals with an average weight of 8 kg presented better qualitative and quantitative characteristics with a dose of 0.4 Ovopel pellets/kg body weight, and less than 8 kg breeding the best results were obtained with doses of 0.2 and 0.4 pellets. The use of the appropriate inducer concentration Ovopel can replace the traditional protocol EHC reproduction of C. macropomum. Index terms: Colossoma macropomum, ovopel, pituitary extract, reproduction Introdução A aquicultura tem apresentado maior crescimento em relação ao extrativismo, sendo este incremento mais elevado na piscicultura continental. Em 2009 a produção de tambaqui (Colossoma macropomum) atingiu ,20 toneladas, o que representou 14% de total de peixes proveniente da piscicultura continental, sendo à espécie aquícola nativa mais produzida, atrás apenas das espécies exóticas tilápia (Oreochromis niloticus), camarão marinho (Litopenaeus vannamei) e carpa comum (Cyprinus carpio) (Brasil, 2010). Este panorama deve-se ao grande potencial da espécie C. macropomum para piscicultura nacional, uma vez que é uma espécie onívora, possui carne de excelente qualidade, além da facilidade no manejo, adaptando-se em diferentes ambientes. A espécie C. macropomum é reofílica, necessitando de indução hormonal para reprodução em cativeiro (Castagnolli, 1992). A prática da reprodução induzida em condições laboratoriais com o protocolo tradicional com extrato de hipófise (carpa ou salmão) apresenta resultados positivos para esta espécie em cativeiro.

47 47 O hormônio mais utilizado para a reprodução de peixes reofilícos é o extrato de hipófise de carpa ou salmão (Zaniboni Filho & Weingartner, 2007). Contudo, a utilização de hormônios liberadores de gonadotrofinas (mgnrha e sgnrha) associados a bloqueadores de receptores da dopamina (pimozide, domperidone e metoclopramida), denominados como GnRHa+inibidor dopaminergético, pode ser uma alternativa de menor custo e maior eficiência na indução reprodutiva de peixes. Entre estes, o Ovopel é um produto sintético desenvolvido pela Universidade de Godollo na Hungria, composto pelo análogo do GnRH de mamíferos (D-Ala6, Pro9Net-mGnRH), e os antagonistas da dopamina, do receptor solúvel em água e metoclopramida. As concentrações D-Ala6, Pro9Net-mGnRH e metoclopramida são de μg e 9-10 mg, respectivamente (Das, 2004). A ineficiência na indução hormonal é um fator de risco para a perda de reprodutores durante o período reprodutivo. Dessa forma, o emprego de indutores que reduzam a mortalidade após a indução e que também promovam o retorno à reprodução em um mesmo período reprodutivo, são fundamentais para um laboratório de produção de alevinos. Este contexto tende a adquirir uma importância ainda maior considerando o programa de melhoramento genético nacional da espécie C. macropomum em andamento no Brasil, em que um reprodutor terá maior valor. Dessa forma, o uso de hormônios mais eficientes aliados a técnicas mais adequadas, possibilita reduzir os custos de produção, melhorando a produção de juvenis e reduzindo a mortalidade de reprodutores. A qualidade do sêmen é fundamental para o processo reprodutivo, pois a contribuição do macho para a eficiência reprodutiva e produtiva é de grande importância, uma vez que além do aporte genético, neles pode se aplicar a maior e mais rápida pressão de seleção. Fatores como a concentração espermática, aspecto, volume produzido, são de grande significância para o bom desempenho reprodutivo aliado às qualidades espermáticas como vigor espermático e percentual de células vivas (Salgueiro & Nunes, 1999).

48 48 A concentração espermática, volume, motilidade progressiva, vigor espermático e patologia espermática são parâmetros que têm sido utilizados como critérios qualitativos e quantitativo do sêmen e com indicadores da capacidade fertilizante Streit et al. (2006). O objetivo do trabalho foi avaliar as características quantitativas e qualitativas do sêmen de tambaqui (Colossoma macropomum) induzidos com diferentes indutores hormonais. Material e Métodos Foram utilizados 27 machos de C. macropomum pesando 8,0 ± 1,98 Kg, com idade entre 5 a 6 anos, provenientes de uma piscicultura situada no município de Nova Mutum- MT, região Centro-Oeste do Brasil, Rod. 163, 198 km, no período de dezembro de 2009 a março de Os reprodutores foram capturados e selecionados segundo as características de coloração eritematosa, aspecto edemaciado da papila urogenital e eliminação de sêmen em resposta à massagem manual sobre a parede celomática. Posteriormente, foram pesados, identificados com microchip e acondicionados em tanques de litros, com fluxo de água contínuo e temperatura média de 29 C. Os reprodutores foram induzidos à reprodução com os indutores extrato de hipófise de carpa (EHC) e Ovopel nas posologias apresentadas na tabela 1. A aplicação do hormônio foi intraperitoneal, sentido encéfalo-caudal. A indução dos reprodutores ocorreu às 18:00, sendo que a coleta do sêmen ocorreu com 240 horas-grau. Para a coleta do sêmen, os animais foram submetidos a uma solução com benzocaína (60 ml para 400 litros de água) por 5 minutos. Os sêmens foram coletados em seringas individualizadas acondicionadas em recipientes com temperatura de 8±1 C, para posterior análise laboratorial.

49 49 Para a análise da qualidade seminal, 5 µl de sêmen foi depositada sobre lâmina de microscopia e observada em aumento de 40X. Em seguida, o sêmen foi ativado com solução fisiológica, para avaliação dos parâmetros motilidade progressiva e vigor espermático, sendo utilizado escore de 0 a 100% e de 0 a 5 pontos, respectivamente. A duração da motilidade dos espermatozóides foi mensurada através do tempo em que os espermatozóides apresentavam motilidade e vigor. Quanto a analises quantitativa, o volume de sêmen foi determinado pelas seringas graduadas de 10 ml; e para determinar concentração espermática, dilui-se 0,02 ml de sêmen em 40 ml de formol-salina tamponada, resultando na diluição de 1:2000, e realizou-se a contagem em câmara de Neubauer com 10 µl do diluente (sêmen + solução de formol salina tamponada) em aumento de 20X. As morfologias espermáticas foram avaliadas dos esfregaços dos diluentes (sêmen + solução de formol salina tamponada) corados com rosa bengala, segundo metodologia descrita por Streit Jr. et al. (2004). Duzentos espermatozóides foram classificados em normais, patologias primárias e secundárias de acordo com Herman et al. (1994). O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente ao acaso, com nove tratamentos (sete posologias de Ovopel, uma com extrato de hipófise de carpa e um controle sem indução) com três repetições, totalizando 27 unidades experimentais. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística por meio do Statistical Analysis System (SAS, versão 9.0). Para as variáveis motilidade progressiva e vigor espermático foi utilizada metodologia de Modelos Lineares Generalizados, com distribuição Gamma e função de ligação inversa pelo Proc. Genmod SAS, testando níveis de Ovopel em relação ao extrato de hipófise e o controle (sem indução), e posterior regressão em função dos níveis de Ovopel. Para os parâmetros, concentração espermática, volume e motilidade foram testadas as diferenças entre

50 50 médias dos níveis de Ovopel em relação ao extrato de hipófise e o controle. Para os níveis de Ovopel e peso foi ajustado regressão múltipla, usando o Proc. Genmod SAS. Para análise da morfologia espermática (anormalias primárias e secundárias) foi utilizada metodologia de Modelos Lineares Generalizados (MLG), pela distribuição de Poisson, com função de ligação logarítmica implementada pelo SAS pelo Proc. Genmod. Para probabilidade de ocorrência de espermatozóides normais e anormalidades primárias e as secundarias foi utilizada a metodologia de Modelos Lineares, a partir da distribuição binomial, com função de ligação logística pelo Proc. Genmod e curva de regressão de probabilidade de ocorrência de morfologias em função das doses de Ovopel. Resultados e Discussão O volume médio de sêmen produzido foi de 3,14 ml, sendo que as posologias entre 0,2 e 0,7 pellets de Ovopel/kg de peso vivo e 2,5 mg de EHC/kg de peso vivo apresentaram maior produção de sêmen e não diferiram entre si. A posologia 0,1 pellets de Ovopel e o controle (sem indução) apresentaram menor quantidade de sêmen, demonstrando que esta posologia de Ovopel foi menos eficiente para maior liberação de sêmen que os outros tratamentos hormonais (Tabela 2). A motilidade progressiva média foi de 82,59%, sendo que houve diferenças estatísticas entre os tratamentos, em que as posologias 0,1; 0,5; 0,6 e o controle apresentaram menores motilidades. Para vigor espermático, a média foi de 2,96 pontos, sendo que a posologia 0,1 apresentou valor estatisticamente menor em relação aos demais tratamentos. A média para tempo de motilidade dos espermatozóides foi de 109,55 segundos e não houve diferenças estatísticas entre os tratamentos (Tabela 2).

51 51 Os resultados indicam que houve estímulo a partir de algumas posologias testadas para motilidade progressiva, no qual as posologias 0,2 (88,33%); 0,3(90,00%); 0,4 (81,66%) e 0,7 (90,00%) pellets de Ovopel e 2,5 (88,33%) mg de extrato de hipófise apresentaram eficiência semelhantes para esse parâmetro. Estes resultados mostram que os valores obtidos com estas posologias de Ovopel para motilidade progressiva não diferiram do protocolo tradicional de extrato de hipófise. Valores semelhantes foram obtidos nos trabalhos de indução hormonal com extrato de hipófise de carpa por Kavamoto (1998) em pacu (Piaractus mesopotamicus), que encontrou motilidade média de 89%, e Talmelli et al. (2001), que encontraram motilidade média de 90,9% para piabanha (Brycon insignis). Estes resultados obtidos são importantes, pois segundo Hafez & Hafez (2000), a motilidade é essencial para boa taxa de fertilização por estarem relacionadas com espermatozóides de qualidade. Segundo Salisbury & Vandemark (1964), a determinação da concentração espermática é um dado fundamental na rotina da reprodução artificial, no sentido de se conhecer a quantidade de células possíveis de serem fecundante. No presente estudo, a concentração espermática (ml) média foi de 9, 047 x 10 9 espermatozóides/ml e não diferiram significativamente entre os tratamentos (Tabela 2). Farias et al. (1999) testaram a indução do C. macropomum com GnRH (hormônio liberador de gonadotrofina) e encontraram resultados inferiores aos deste estudo quanto aos valores de concentração, que foi de 6,00 x 10 9 espermatozóides/ml. Valores superiores foram encontrados por Menezes et al. (2008) na indução da espécie C. macropomum com extrato de hipófise de carpa, o qual encontraram 35 x 10 9 espermatozóides\ml. A avaliação da morfologia do sêmen não mostrou diferenças significavas entre espermatozóides normais e com as patologias primárias e secundárias (Tabela 3). Para anormalias primárias cauda curta, as posologias 0,3; 0,4; 0,7 pellets de Ovopel e o controle apresentaram os menores índices. Para anormalias secundárias cauda

52 52 dobrada e cabeça solta, os menores índices foram registrados nas posologias de 0,1 e 0,4 pellets de Ovopel, respectivamente (Tabela 4). Os tratamentos 0,2; 0,3 e 0,4 pellets de Ovopel\kg de peso vivo apresentaram melhores resultados avaliando concomitantemente os parâmetros motilidade progressiva, vigor, patologias primárias e secundárias. Segundo Hafez & Hafez (2000), as patologias secundárias (cauda dobrada, cabeça solta) podem ser devido a problemas na composição de esfregações. Dessa forma, considerando apenas motilidade progressiva, vigor espermático e as patologias primárias, as posologias 0,2; 0,3; 0,4 e 0,7 pellets de Ovopel e 2,5 mg de extrato de hipófise de carpa foram mais eficientes para reprodução de machos da espécie C. macropomum. Estes resultados indicaram que estas posologias de Ovopel e protocolo tradicional de extrato de hipófise de carpa apresentaram resultados semelhantes para patologias primárias, as quais estão relacionadas com a maturação dos espermatozóides na espermatogênese. As posologias que apresentaram maiores motilidades também tiveram menores incidências de patologias primárias e secundárias, indicando uma correlação inversa entre estes dois parâmetros (Tabela 2 e 4). Isso evidência que patologias espermáticas provocam redução na motilidade, pois essas anormalias podem limitar a motilidade e vigor dos espermatozóides e, consequentemente, interferir na taxa de fertilização. Estudando a espécie curimba (P. scrofa = P. lineatus), Kavamoto et al. (1999) observaram incidência de 9,54% de patologias primárias (cauda enrolada, cauda dobrada) e secundárias (cabeça solta). Estes resultados foram semelhantes ao obtido no presente estudo, em que a incidência foi de 9,0 a 14,16% (Tabela 3), valores superiores foram obtidos por Streit et al. (2006) para a espécie pacu (Piaractus mesopotamicus), os quais encontraram índices de 41,8 % de patologias em reprodutores induzidos e 37,4% em reprodutores não induzidos.

53 53 A origem das patologias primárias nas células espermáticas segundo Herman et al. (1994) pode estar relacionada com deficiências nutricionais, idade dos machos, endogamia ou doenças que possam acometer os reprodutores; e as patologias secundárias com a temperatura do ambiente e alimentação dos reprodutores. No presente trabalho os reprodutores tiveram manejo semelhante em todo o período reprodutivo e, portanto, as diferenças estão relacionadas aos indutores hormonais e posologias. Para as posologias de Ovopel, houve diferenças significativas para variável volume, sendo representada pela equação: Y = 26, ,938d + 204,578d 2 8, 324p 0,6511p ,608d.p 69,712 d 2.p 4,221d.p 2 + 5,291d 2.p 2 (R 2 = 0,91). Pode-se observar (Figura 1) que o efeito do indutor Ovopel para C. macropomum com peso de 4 kg apresentaram um grande volume de sêmen na posologia de 0,2 e 0,3 pellets\kg de peso vivo sem afetar as características qualitativas; e em peixes com peso de 8 kg o maior volume foi obtido com a posologia de 0,4 pellets\kg de peso vivo. Também foi possível observar que o aumento da posologia de Ovopel resulta em aumento do volume até uma determinada posologia, porém o excesso deste hormônio pode produzir um efeito inibitório. As patologias espermáticas cabeça solta e cauda dobrada apresentaram diferenças significativas em relação às posologias de Ovopel (Figura 2). Para cabeça solta (CbS) e cauda dobrada (CdD) foram obtidas as fórmulas: CbS= exp.(1,7585 0,7042d + 0,1009d 2 ); e CdD= exp.(2,0008 0,1675d), respectivamente. Foi encontrada a posologia de 0,4 pellets de Ovopel\kg de peso vivo para menor incidência de cabeça solta, porém com uma acentuada presença de cauda dobrada. Todavia, estas patologias podem estar relacionadas com o preparo dos esfregaços. A probabilidade de espermatozóides normais em relação às posologias de Ovopel é expressa pela equação μ= 1, ,2554d 0,0303d 2. Nesta equação a posologia de 0,4

54 54 pellets foi a que apresentou a maior incidência de espermatozóides normais em relação as demais posologias (Figura 3). Conclusões 1. O indutor Ovopel pode ser utilizado eficientemente para reprodução de machos da espécie C. macropomum em substituição ao protocolo tradicional com extrato de hipófise de carpa, considerando que as características quantitativas e qualitativas do sêmen em ambos os protocolos foram semelhantes. 2. A posologia mais eficiente para reprodução da espécie C. macropomum com peso de 8 kg foi de 0,4 pellets de Ovopel\kg de peso vivo; e para animais com peso inferiores a 8 kg a posologias mais eficientes foram 0,2 e 0,3 pellets de Ovopel\kg de peso vivo. Agradecimentos À Fundação de Ampara a Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT), pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de Mestrado; e ao proprietário da Piscicultura Buriti, Sr. José Mário Ribeiro Mendes, pelo fornecimento da estrutura e dos animais para execução do projeto. Referências BRASIL - MINISTÉRIO DA PESCA E AQUICULTURA (2010). Mais pesca e aquicultura. Disponível em: Acesso em: 14 de fevereiro CASTAGNOLLI, N. Piscicultura de água doce. Jaboticabal: FUNEP, 1992, 189p.

55 55 DAS, S. K. Evaluation of a new spawning agent, Ovopel in induced breeding of indian carps. Asian Fisheries Scienc, Philippines, v. 17, p , FARIAS, J.O.; NUNES, J.F.; CARVALHO, M.A.A.; SALGUEIRO, C.C.M. Avaliação in vitro e in vivo do sêmen de tambaqui (Colossoma macropomum) conservado a temperatura ambiente e criopreservado em água de coco. Revista Científica Produção Animal, p , HAFEZ, E. S. E.; HAFEZ, B. Reproduction in farm animals. 7. ed. Philadelphia: Lippicott Williams and Wickins, HERMAN, H.A.; MITCHELL, J.R.; DOAK, G.A. The artificial insemination and embryo tranfer of diary and beef cattle. Illinois: Interstate Publishers, 1994, 392 p. KAVAMOTO, E. T. Efeito da estimulação hormonal sobre as características seminais, desenvolvimento dos testículos e ocorrência de células espermáticas anormais no sêmen do pacu, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887). São Paulo, 115 p. (Tese de Doutorado. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP), MENEZES, J.T.B.; QUEIROZ, L.J.; COSTA, D.C.R.; MENEZES, J.R.J.B. Avaliação espermática pós-descongelamento em tambaqui, Colossoma macropomum (Cuvier, 1818), Acta Amazonica, v. 38, n. 2, p , SALGUEIRO, C.C.M.; NUNES, J.F. Estudo de características testiculares e espermáticas de caprinos e ovinos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 23, n.3, p , SALISBURY, G. M. e VANDEMARK, N. L. Fisiología de la reproducción y de la inseminación artificial de los bóvidos. Zaragoza, Acribia, p. SAS Institute Inc. SAS Technical report: Release Cary:NC, STREIT Jr., D.P.; MORAES, G.V.; RIBEIRO, R.P.; POVH, J.A.; SOUZA, E.D.; OLIVEIRA, A.C.L. Avaliação de diferentes técnicas para coloração de sêmen de peixes.

56 56 Arquivos de Ciência Veterinárias e Zoologia da UNIPAR, Umuarama, v. 7, p , STREIT Jr., D.P.; RIBEIRO, R.P.; MORAES, G.V.; MENDEZ, L.V.; GALLO, J.M.; DIGMAYER, M.; POVH, J.A. Características qualitativas do sêmen de pacu (Piaractus mesopotamicus) após indução hormonal. Biosci. J., Uberlândia, v. 22, n. 3, p , TALMELLI, E.F..; KAVAMOTO, E.T.; FENERICH-VERANI, N. Características seminais da piabanha, Bryncon insignis (STEINDACHNER, 1876), após estimulação hormonal. Boletim do Instituto de Pesca, São Paulo, v. 27, nº. 2, p , ZANIBONI FILHO, E.; WEINGARTNER, M. Técnicas de indução da reprodução de peixes migradores. Florianópolis, SC, 2007.

57 57 Anexos Tabela 1. Posologias do protocolo de indução hormonal a reprodução da espécie C. macropomum. Posologia Hormônio Aplicação 0,1 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única 0,2 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única 0,3 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única 0,4 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única 0,5 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única 0,6 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única 0,7 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única 2,5 mg/kg de peso vivo Extrato de Hipófise de carpa Única Sem indução - -

58 58 Tabela 2. Parâmetros analisados no sêmen da espécie Colossoma macropomum induzidos com Ovopel, extrato de hipófise de carpa e sem indução hormonal. Tratamentos Volume Motilidade Vigor Tempo de Concentração (ml) ** (%) ** (pontos) ** Motilidade (s) (espermatozó * ides/ml) * 0,1pellets/kg 2,43 AB 70,00 B 2,33 B 117,67 9,699 X ,2 pellets/kg 3,13 A 88,33 A 3,66 A 77,33 8,177 X ,3 pellets/kg 3,93 A 90,00 A 4,00 A 143,33 10,655 X ,4 pellets/kg 4,16 A 81,66 AB 3,33 AB 110,33 9,829 X ,5 pellets/kg 3,20 A 78,33 B 3,33 AB 98,33 6,394 X ,6 pellets/kg 3,80 A 78,33 B 3,00 AB 117,67 10,83 X ,7 pellets/kg 3,46 A 90,00 A 4,00 A 102,67 7,524 X ,5 mg (EHC)/kg 3,30 A 88,33 A 4,33 A 109,67 10,42 X 10 9 Sem indução 0,90 B 78,33 B 3,00 AB 109,00 7,897 X 10 9 ** Médias seguidas de mesma letra maiúscula são estatisticamente iguais entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de significância. *Efeito não significativo.

59 59 Tabela 3. Espermatozóides analisados no sêmen da espécie Colossoma macropomum induzidos com Ovopel, extrato de hipófise de carpa e sem indução hormonal. Tratamento Espermatozóides * Espermatozóides * Patologias a Patologias b normais (%) anormalidades primárias secundárias (%) (%) (%) 0,1 pellets/kg 87,66 12,34 7,16 5,18 0,2 pellets/kg 85,84 14,16 10,16 4,00 0,3 pellets/kg 87,16 12,84 7,00 5,84 0,4 pellets/kg 91,00 9,00 6,00 3,00 0,5 pellets/kg 91,00 9,00 7,00 2,00 0,6 pellets/kg 88,00 12,00 8,5 3,5 0,7 pellets/kg 86,66 13,34 8,5 4,84 2,5 mg (EHC)/kg 88,16 11,84 7,84 4,00 Sem indução 89,34 10,66 7,00 3,66 *Efeito não significativo. a Patologias Primárias: cauda quebrada, cauda enrolada, cauda curta. b Patologias secundárias: cauda dobrada, cabeça solta.

60 60 Tabela 4. Morfologia espermática da espécie Colossoma macropomum induzidos com Ovopel, extrato de hipófise de carpa e sem indução hormonal. Tratamento Cauda * Cauda * Cauda ** Cauda ** Cabeça ** quebrada (%) Enrolada (%) curta (%) dobrada (%) solta (%) 0,1 pellets/kg 2,0 10,00 2,33 AB 8,00 A 2,99 ABC 0,2 pellets/kg 3,0 14,00 1,99 AB 4,00 B 1,99 BC 0,3 pellets/kg 1,66 11,33 1 B 3,00 B 2,99 ABC 0,4 pellets/kg 2,66 8,66 0,66 B 5,00 AB 1,50 C 0,5 pellets/kg 2,33 9,66 1,99 AB 2,33 B 1,66 BC 0,6 pellets/kg 3,33 9,00 4,33 A 2,66 B 4,00 AB 0,7 pellets/kg 3,66 12,33 1 B 3,00 B 5,66 A 2,5 mg (EHC)/kg 3,00 10,66 1,66 AB 3,66 B 3,66 AB Sem indução 4,33 8,66 1 B 3,33 B 1,66 BC ** Médias seguidas de mesma letra maiúscula são estatisticamente iguais entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de significância. *Efeito não significativo.

61 Y = 26, ,938d + 204,578d 2 8, 324p 0,6511p ,608d.p 69,712 d 2.p 4,221d.p 2 + 5,291d 2.p 2 R 2 = 0,91 61 Posologia máxima para animais de 8 kg Figura 1. Dosagem de hormônios em relação ao peso da espécie C. macropomum e o volume de sêmen. CbS= exp.(1,7585 0,7042d + 0,1009d 2 ) CdD= exp.(2,0008 0,1675d) Posologia para menor incidência de CbS Figura 2. Morfologia espermática de machos C. macropomum submetidos a diferentes posologias de Ovopel.

62 62 μ= 1, ,2554d 0,0303d 2 Posologia de maior probabilidade de espermatozóides normais Figura 3. Probabilidade de espermatozóides normais da espécie C. macropomum submetidos a diferentes posologias de Ovopel.

63 Capítulo II 63

64 64 Reprodução induzida de fêmeas de tambaqui submetidas a diferentes indutores hormonais Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes indutores hormonais na indução reprodutiva de matrizes de tambaqui (Colossoma macropomum). Foram utilizadas 16 fêmeas distribuídas em quatro tratamentos com quatro repetições. Os tratamentos foram: 0,2; 0,4 e 0,6 pellets de Ovopel/kg de peso vivo (aplicados em dose única) e 5,5 mg de extrato de hipófise de carpa (EHC)/kg de peso vivo (duas doses, 10% e 90%, com intervalo de 12 horas entre as aplicações). Todas as posologias obtiveram respostas positivas, sendo que a posologia de 0,6 pellets de ovopel obteve taxa de desova de 50% e as demais posologias de ovopel e EHC apresentaram taxa de desova de 100%. Não houve mortalidade de matrizes após a aplicação dos tratamentos. Não houve diferenças estatísticas entre as posologias testadas de Ovopel e extrato de hipófise de carpa para peso dos ovócitos, nº de ovócitos/g e horas-grau. O tratamento com EHC apresentou maior taxa de fecundação e o tratamento com 0,2 pellets de Ovopel proporcionou maior taxa de eclosão. Os dados apresentados mostram que o indutor Ovopel pode ser utilizado eficientemente na substituição do EHC na posologia de 0,2 pellets/kg de peso vivo para reprodução induzida do tambaqui. Termos para indexação: Colossoma macropomum, Ovopel, extrato de hipófise de carpa, fertilização, desova Induced breeding of females of tambaqui submitted to different hormonal inducers Abstract - The objective of this study was to evaluate different inducers reproductive hormonal induction of arrays of tambaqui (Colossoma macropomum). We used 16 females divided into four treatments with four replications. The treatments were: 0.2, 0.4 and 0.6 Ovopel pellets/kg body weight (applied as a single dose) and 5.5 mg of carp pituitary extract

65 65 (EHC)/kg body weight (two doses, 10% and 90%, with an interval of 12 hours between applications). All doses had positive responses, with a dose of 0.6 pellets obtained ovopel spawn rate of 50% and the other dosages of ovopel and EHC showed spawning rate of 100%. There was no mortality matrix after application of treatments. There were no statistical differences between the doses tested Ovopel and carp pituitary extract for weight of oocytes, number of oocytes/g-hour degree. Treatment with CHE had a higher rate of fertilization and treatment with 0.2 Ovopel pellets showed higher hatching rate. The data show that the inductor Ovopel can be efficiently used in the replacement of EHC in dosage of 0.2 pellet / kg body weight for induced breeding of tambaqui. Index terms: Colossoma macropomum, Ovopel, carp pituitary extract, fertilization, hatching Introdução O tambaqui, Colossoma macropomum (CUVIER, 1818) é um dos peixes mais importantes da piscicultura brasileira, e de acordo com o MPA (BRASIL, 2010) é a espécie nativa mais produzida no Brasil. Esta espécie é endógena da bacia amazônica e considerada o segundo maior peixe de escamas do rio Solimões e do Amazonas (GOULDING & CARVALHO, 1982). No habitat natural realiza piracema, sendo que a reprodução ocorre no período das chuvas e como em todo peixe teleósteo, a desova é regulada por ritmos endógenos mediados por fatores externos, como; variações de temperatura, fotoperíodo, chuvas, pressão da massa de água, ph entre outras variáveis, que determinam o melhor período para a desova, proporcionando sobrevivência da prole (ZANUY & CARRILLO, 1987 ; WAYNAROVICH, 1989).

66 66 A criação do tambaqui em cativeiro proporciona alterações fisiológicas no processo reprodutivo, devido às restrições de fatores ambientais que interferem na forma de ação dos hormônios indutores da desova, sendo os controles endócrinos e metabólicos os principais reguladores endógenos da etapa de ovogênese (NAGAHAMA, 1983). Embora haja o desenvolvimento gonadal, o processo da maturação final (ovulação seguida da desova) não acontece, por motivos dessas restrições (ZOAR & MYLONAS, 2001). Para superar tal problema, hormônios exógenos são comumente aplicados, sendo o mais utilizado em pisciculturas comerciais, o extrato de hipófise de carpa (EHC). Pontualmente em algumas pisciculturas o LHRa (análogo do LHRH, liberador do hormônio luteinizante, nonapeptídeo) ou similares. A técnica de hipofisação é praticada desde 1935, sendo a mais utilizada atualmente no Brasil e consiste na indução hormonal na fase de vitelogênese para garantir a maturação final e a desova. Essa etapa final consiste basicamente na migração e a posterior desintegração da vesícula germinal, com o rompimento do envelope folicular e a consequentemente liberação dos ovócitos na luz do ovário (ZANIBONI FILHO & WEINGARTNER, 2007). Porém, apresenta alguns problemas que tornam restrita sua utilização, como por exemplo; potência estimuladora variada levando ao sucesso incerto da desova, dificuldades envolvidas na coleta e armazenamento das hipófises, dificuldade na aquisição do hormônio e a necessidade de administrar duas posologias para as fêmeas, fazendo com que esses animais sejam mais suscetíveis ao estresse de manuseio. O emprego de indutores que reduzam a mortalidade após a indução, tanto em situações de desova ou não desova, e promovam o retorno à reprodução em um mesmo período reprodutivo são fundamentais para uma estação de piscicultura. Com o programa de melhoramento genético desta espécie em andamento, este contexto tende a adquirir uma importância ainda maior.

67 67 Embora o extrato de hipófise seja um dos indutores que responde positivamente a reprodução de várias espécies de peixes, há necessidade de buscar protocolos que sejam mais eficazes na reprodução. Nesse sentido, o desenvolvimento de protocolos com a utilização de hormônios liberados de gonadotropina combinados com antagonistas da dopamina para maturação final e desova nas fêmeas e espermiação em machos têm demonstrado grande potencial (ANON, 1997). O Ovopel, é um produto sintético, composto por análogo do GnRH mamíferos (D- Ala6, Pro9Net-mGnRH), e os antagonistas da dopamina, do receptor solúvel em água e metoclopramida. As concentrações D-Ala6, Pro9Net-mGnRH e metoclopramida são de μg e 9-10 mg, respectivamente (DAS, 2004). Uma vantagem do uso deste hormônio para a estimulação a reprodução foi observado por Brzuska & Grzywaczewski (1999) onde sugerem a possibilidade de uso desse hormônio novamente depois de alguns dias se a primeira estimulação falhar, enquanto tal medida não é possível no caso da hipofisação. Nos estudos comparativos entre indutores, Kucharczyk et al. (2007) testaram os indutores EHC (extrato de hipófise de carpa), hcg (Gonadotrofina Coriônica Humana) e Ovopel em peixes tenca (Tinca tinca) e observaram que todos os tratamentos foram eficientes, sendo o período de horas-grau foram observados com o hcg (8-11 h), seguido pelo EHC (10-12 h) e Ovopel (12-16 h). Entretanto, Brzuska (2008) comparou o efeito do extrato de hipófise de carpa (EHC) e do Ovopel em fêmeas do bagre europeu (Silurus glanis L.) e verificou que o Ovopel possibilitou maior percentual de ovulação em relação ao EHC. O objetivo deste trabalho foi avaliar os índices reprodutivos de tambaqui (Colossoma macropomum), induzidos com Extrato de hipófise de carpa e Ovopel.

68 68 Material e Métodos Foram utilizadas 16 fêmeas de tambaqui (C. macropomum) com peso médio de 8,544 ±1,84 kg e idade entre cinco e seis anos, provenientes de uma piscicultura, situada no município de Nova Mutum- MT, Rod. 163, km 198. Os animais foram selecionados segundo as características de coloração eritematosa e aspecto edemaciado da papila urogenital e abdômen abaulado. Os animais foram pesados, identificados com microchip e acondicionados em tanques de alvenaria com capacidade de litros, com fluxo de água constante e temperatura média de 29 C. Os tratamentos ministrados foram: indução intramuscular de EHC, com posologia de 5,0 mg/kg de peso vivo, dividido em duas aplicações, 10% na primeira e 90% doze horas após e Ovopel em posologias de 0,2: 0,4 e 0,6 pellets/kg de peso vivo com indução única (Tabela 1), a temperatura da água foi monitorada para determinação das horas-grau. A colheita dos ovócitos foi realizada através da extrusão, as fêmeas foram submetidas a uma solução anestésica com benzocaína (60 ml para 400 litros de água) na qual os animais ficaram expostos por 5 minutos. Em seguida, extrusou-se ovócitos, a partir de movimentos no sentido encéfalo-caudal, recolhendo em recipientes secos. Os ovócitos foram pesados e uma amostra de um grama de ovócitos foi utilizada para contagem dos gametas. Para realizar a fecundação foi utilizado sêmen criopreservado, com motilidade em torno de 30±5%. A palheta com sêmen foi descongelada em água com temperatura em torno de 28±1ºC, e em seguida o sêmen foi misturado suavemente com os ovócitos e hidratados com água e levados para incubadoras de 200l para desenvolvimento embrionário. A taxa de desova das matrizes foi determinada pela razão entre o total de fêmeas que desovaram e o total de fêmeas submetidas à indução reprodutiva. A taxa de fertilização foi mensurada após 8 horas de desenvolvimento dos ovos fecundados. Para taxa de eclosão, o

69 69 desenvolvimento embrionário foi analisado visualmente as larvas vivas e com movimento dentro da membrana, foi realizado contagem de 100 larvas aleatórias e contabilizado número de larvas em movimento e larvas sem movimento ou com defeitos. As horas-grau foram determinadas pela diferença entre à hora da extrusão e à hora da última aplicação do indutor na matriz, multiplicada pela temperatura média da água. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente ao acaso com quatro tratamentos (três posologias de Ovopel e uma posologia com extrato de hipófise de carpa) quatro repetições, totalizando 16 unidades experimentais. Os dados obtidos foram submetidos a analise estatística por meio do Statistical Analysis System (SAS, versão 9.0). Para as variáveis nº de ovócitos/g de ovócito, peso das fêmeas e horas-grau, testou-se os efeitos de tratamento e peso das fêmeas como covariável, usando o Proc. Modelos Lineares Generalizados. Para taxa de fecundação e taxa de eclosão foi utilizado a Metodologia de Modelos Lineares Generalizado, utilizando distribuição de Poisson com função de ligação logarítmica, usando Proc. Genmod. Resultados e Discussão As fêmeas de tambaqui desovaram com todas as posologias avaliadas, sendo que a posologia de 0,6 pellets de ovopel/kg de peso vivo resultou em apenas 50% de taxa de desova. Já para as demais posologias de Ovopel e extrato de hipófise de carpa a taxa de desova foi de 100%, alem de não ter havido mortalidade de reprodutores (Tabela 2). A posologia mais elevada foi a de 0,6 pellets de Ovopel/kg de peso vivo que resultou no menor número de fêmeas desovas o que pode ser devido ao excesso deste hormônio que pode produzir um efeito inibitório, fazendo com que o animal não responda positivamente ao protocolo de indução.

70 70 Trabalhando com a propagação artificial do peixe japonês (Carassius auratus) Rosa et al. (1994) utilizaram o extrato de hipófise de carpa (EHC), com duas aplicações de EHC nas fêmeas, sendo a primeira( 0,5 e 4,5 mg/kg de peso vivo) encontraram resultados de taxa de desova de 75% das fêmeas e taxa de fecundação entre 65 a 70% e 0% de mortalidade dos reprodutores. Já Bruska & Bialowas (2002) compararam o uso de Ovopel e extrato de hipófise na reprodução de carpas (Cyprinus carpio) e verificaram que o grupo de peixes submetido ao Ovopel apresentou maior número de fêmeas desovadas e ovos de melhor qualidade. Não houve diferenças estatísticas entre as posologias testadas de Ovopel e extrato de hipófise de carpa, para peso dos ovócitos, nº de ovócitos/g de ovócito e horas-grau (Tabela 3). Resultados diferentes foram encontrados com Brzuska (2002), que testou extrato de hipófise de carpa com dose de 4 mg/kg de peso vivo e Ovopel na posologia de 1 pellets/kg de peso vivo na reprodução do bagre Africano (Clarias gariepinus) utilizando Segundo o autor, a utilização do Ovopel levou ao maior peso de ovócitos e maior qualidade dos ovos incubados por 24h. O autor concluiu que o maior peso dos ovos obtidos e com maior qualidade foi encontrado nos animais estimulados pelo Ovopel comparado com a ovulação dos animais estimulados com extrato de hipófise de carpa. Muito embora não tenha havido diferenças estatística nas horas-grau, as matrizes submetidas ao tratamento de 0,2 pellets de Ovopel/kg de peso vivo desovaram com 332,7 horas-grau, o que representou 12 horas e 28 minutos após a aplicação do hormônio considerando a temperatura média da água de 28ºC. Para o tratamentos com 4,5 + 0,5 mg de EHC registrou-se média de 310,3 horas-grau, representando 11 horas e oito minutos após a segunda aplicação do hormônio na mesma temperatura considerada para o tratamento com Ovopel. Esses resultados demonstram que a posologia de 0,2 pellets de Ovopel e 4,5 + 0,5 mg de EHC apresentaram resultados semelhantes já que todas as matrizes submetidas a esses tratamentos responderam positivamente e com menor tempo de horas-grau para desova, sendo

71 71 que o período de espera para a desova é de extrema importância num laboratório de reprodução, pois é preciso observar os reprodutores e identificar o momento da desova e coleta do ovócitos, já que no caso de extrusão os ovócitos não podem entrar em contado com água. Os demais tratamentos com Ovopel apresentaram maior tempo de resposta para o estimulo a desova, que pode estar relacionado ao estimulo provocado por este indutor que atua sobre a hipófise para ai sim liberar o hormônio gonadotrópico que estimula a liberação de gametas. E quando o estimulo parte do EHC, este faz a vez da hipófise, logo acelera o tempo de atuação nas gônadas, levando menos tempo para liberar os gametas. A taxa de fertilização do tratamento com EHC foi mais elevada em todos os tratamentos. Contudo a taxa de eclosão na posologia de 0,2 pellets de Ovopel/kg de peso vivo foi a mais elevada (Tabela 3). A taxa de fertilização obtida no presente trabalho foi afetada pelo uso de espermatozóides criopreservado. Pois, mesmo estabelecendo uma motilidade espermática mínima de 30%, o sêmen não possibilitou a sua plenitude e termos de qualidade. Johnson et al. (2000) citaram que a qualidade dos espermatozóides criopreservados, é de fundamental importância para o sucesso na fertilização. A eficiência de fertilização do espermatozóide após criopreservação está diretamente relacionada com a composição da solução diluídora que prolonga a vida de espermatozóide in vitro. Por exemplo, com o pacu (Piaractus mesopotamicus) espécie nativa denominada de redondo como o tambaqui (Colossoma macropomum), Streit Jr. et al. (2006) utilizou sêmen criopreservado com diferentes soluções crioprotetoras e concluíram que a qualidade seminal empobrece, principalmente quanto a motilidade e vigor espermático, o que pode comprometer a taxa de fertilização. Este fato pode justificar a baixa taxa de fertilização no presente trabalho. De todo modo, o mesmo sêmen criopreservado foi utilizado para os gametas oriundos dos animais induzidos com diferentes tratamentos e a posologia de 0,2 pellets de Ovopel/kg de

72 72 peso vivo, foi a mais eficiente. Das (2004) induziu exemplares de carpas indianas de Assam (Catla catla) e carpas chinesas, prateada (Hypophthalmichthys molitrix) e capim (Ctenopharyngodon idella), avaliando o efeito do Ovopel, extrato de hipófise e do Ovaprim (GnRH de Salmão, e um inibidor da dopamina). O autor utilizou dosagem de Ovopel, calculada com base no peso e condições dos reprodutores, em dosagem única e o extrato de hipófise em duas dosagens. Os animais submetidos ao ensaio com posologia de ovopel de 1 a 1,5 pellets/kg de peso vivo resultaram em 100% de desova, com tempo de resposta de 4 h e 50 minutos a 9 horas, com taxa de fecundação de 65 a 80%. O autor concluiu que a qualidade dos ovócitos e taxa de eclosão foram melhores com ovopel e ovaprim, devido a falta de padronização da hipófise. Conclusões 1. As posologias de Ovopel avaliadas induziram as fêmeas à reprodução semelhantes ao extrato de hipófise de carpa. 2. A posologia de 0,2 pellets de Ovopel/kg de peso vivo apresentou melhores resultados para os parâmetros avaliados. 3. A utilização de 0,2 pellets de Ovopel/kg de peso vivo pode ser utilizada em substituição ao indutor extrato de hipófise de carpa considerando que os parâmetros avaliados foram semelhantes. Agradecimentos À Fundação de Ampara a Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT), pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de Mestrado; e ao proprietário da Piscicultura Buriti, Sr. José Mário Ribeiro Mendes, pelo fornecimento da estrutura e dos animais para execução do projeto.

73 73 Referências ANON-Cooperative Team for Hormonal Application in Pisciculture. A new highly effective ovulating agent for fish reproduction. Practical application of LH-RH analogue for the induction of spawning of farm fishes. Sci.Sinica, v. 20, 1997, 469p. BRZUSKA, E. Artificial spawning if african catfish, clarias gariepinus stimulation of Ovulation using carp pituitary or Ovopel. Jornal of Applied Aquaculture, v. 12, n. 04, BRZUSKA, E.; BIALOWAS, H. Artificial spawning of carp Cyprinus carpio. Aquacult Res. v.33, p , BRZUSKA, E. Artificial spawning of European catfish Silurus glanis L.: differences between propagation results after stimulation of ovulation with carp pituitary and Ovopel. Aquaculture Research, v. 32, p , BRZUSKA, E.; GRZYWACZEWSKI, R. Artificial spawning of carp Cyprinus carpio L.:differences between the effects on reproduction in females of Israeli strain Dor-70 and its cross-breed treated with carp pituitary and Ovopel. Aquaculture Research, v. 30, p , DAS, S. K. Evaluation of a new spawning agent, Ovopel in induced breeding of indian carps. Asian Fisheries Scienc, Philippines, v. 17, p , GOULDING, M.; CARVALHO, M.L. Life history and management of the tambaqui (Colossoma macropomum, characidae): An important Amazonian foodfish. Revista Brasileira de Zoologia, Viçosa, v.1, p , JOHNSON, L. A. Lessons from the cryopreservation livestock sperm. In: TIERSCH, T. R.; MAZIK, P. M. (Eds.). Cryopreservation in aquatic species. Baton Rouge: World Aquaculture Society, p

74 74 KUCHARCZYK, D.; KUJAWA, R.; MAMCARZ, A. Articial spawning of common tench (Tinca tinca L) collec ted from wil populations. Polosh Journal of Natural Sciences, Pol. v, 22 p , NAGAHAMA, Y. The funcional morphology of teleosts gonads. In: Hoar WS, Randall DJ, Donaldson E M, (Ed.). Fish physiology. London: Academic Press, v.9a, p ROSA, J.C.S.; SILVA, J.W.B; OLIVEIRA, J.W.B. Propagação artificial do peixe japonês, Carassius auratus (Linnaeus, 1766), GUNTHER, 1870, com extrato de hipófise. Revista Ciência Agronômica, Fortaleza, v.25, p , SAS Institute Inc. SAS Technical report: Release Cary:NC, STREIT Jr, D.P.; BENITES, C.; MORAES, G.V.; RIBEIRO, R.P.; SAKAGUTI, E.S.; CALDIERI, R.F. Sêmen de pacu (Piaractus mesopotamicus) criopreservado com diluentes utilizados para sêmen de suínos. Ciência Animal Brasileira, v. 7, n. 3, p , ZANIBONI-FILHO, E.; WEINGARTNER, M. Técnicas de indução da reprodução de peixes migradores. Rev Bras Reprod Animal, v.31, p , ZANUY, S.; CARRILLO, M. La reproducción de los teleosteos y su aplicación en acuicultura. Ed. Reproducción en Acuicultura. Madri, p , ZOHAR, Y.; MYLONAS, C.C. Endocrine manipulations of spawning in cultured fish: from hormones to genes. Elsevier Aquaculture, v. 197, p , WAYNAROWICH, E. ; HORVATH, L. A propagação de peixes de águas tropicais: manual de extensão. BRASÍLIA; FAO/CODEVASF/CNPq, p.

75 75 Anexos Tabela 1. Posologias de indução à reprodução de fêmeas da espécie C. macropomum, com extrato de hipófise e diferentes concentrações de Ovopel. Tratamentos Hormônio 1ª Aplicação 2ª Aplicação 0,2 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única - 0,4 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única - 0,6 pellets/kg de peso vivo Ovopel Única - 5,0 mg/kg de peso vivo EHC * 10% aplicação 90% aplicação * Extrato de hipófise de carpa (EHC)

76 76 Tabela 2. Resposta e liberação de gametas após a indução reprodutiva de fêmeas de Colossoma macropomum induzidas com Ovopel e extrato de hipófise de carpa (EHC). Tratamentos Tipo de Peso das Resposta Taxa de hormônios fêmeas (kg) desova 0,2 pellets de Ovopel/kg Ovopel 10,5 Respondeu 100% de peso vivo Ovopel 5,0 Respondeu Ovopel 9,0 Respondeu Ovopel 8,2 Respondeu 0,4 pellets de Ovopel/kg Ovopel 9,5 Respondeu 100% de peso vivo Ovopel 6,5 Respondeu Ovopel 11,5 Respondeu Ovopel 8,9 Respondeu 0,6 pellets de Ovopel/kg Ovopel 9,0 Respondeu 50% de peso vivo Ovopel 6,0 Não respondeu Ovopel 9,5 Respondeu Ovopel 8,9 Não respondeu 0,5 + 4,5 mg de EHC * EHC * 6,0 Respondeu 100% EHC * 8,5 Respondeu EHC * 11,0 Respondeu EHC 8,7 Respondeu * Extrato de hipófise de carpa

77 77 Tabela 3. Parâmetros analisados em fêmeas de Colossoma macropomum induzidas com Ovopel e extrato de hipófise de carpa (EHC). Tratamentos Peso Peso dos Nº Horas- Taxa de Taxa de das ovócitos ovócitos/g grau * fertilização ** eclosão ** fêmeas * (g) * de ovócito * 0,2 pellets 8, ,7 30,45 b 25,53 a 0,4 pellets 9, ,82 27,80 b 17,79 b 0,6 pellets 9, ,6 32,63 b 24,00 b 0,5+4,5 mg EHC 8, ,3 35,63 a 19,56 b ** Médias seguidas de mesma letra minúscula são estatisticamente iguais entre si pelo Teste de Tukey ao nível de 5% de significância. *Efeito não significativo.

78 78 6. Anexos A B Figura 6.1 Apresentação comercial dos Indutores hormonais utilizados, B esquerda- Ovopel e a direita Extrato de Hipófise de Carpa (EHC), utilizados na indução de Colossoma macropomum. Figura 6.2 Extrusão das fêmeas de tambaqui (C. macropomum) Figura 6.3 Coleta do sêmen de tambaqui (C. macropomum).