ATIVIDADE DE PROTEASES EM JUNDIÁS ALIMENTADOS COM DIFERENTES NÍVEIS DE PROTEÍNA E SEPARADOS POR SEXO

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1 ATIVIDADE DE PROTEASES EM JUNDIÁS ALIMENTADOS COM DIFERENTES NÍVEIS DE PROTEÍNA E SEPARADOS POR SEXO Rafael Lazzari*, João Radünz Neto, Viviani Corrêia, Fernando Jonas Sutili, Vânia Lucia Loro, Alexandra Pretto e Jorge Eugênio da Silva Filipetto * Laboratório de Piscicultura, Departamento de Zootecnia, Universidade Federal de Santa Maria, RS. rafaellazzari@yahoo.com.br Resumo A atividade de proteases foi avaliada em um experimento com 100 dias de duração, onde se testou 3 níveis de proteína bruta (24, 27 e 30%) na alimentação de jundiás (135 machos e 135 fêmeas, peso inicial médio 216,38 ± 26,73g). Os peixes foram alimentados uma vez ao dia, com dietas contendo farinha de carne e ossos e farelo de soja como fontes protéicas. O experimento foi delineado em um arranjo fatorial 3X2 (3 níveis PB e 2 sexos), onde ao final do período de alimentação, 9 peixes por tratamento foram sacrificados para a determinação das atividades enzimáticas de protease ácida, tripsina e quimiotripsina. Para quimiotripsina, ocorreu efeito do nível de proteína, onde os peixes alimentados coma dieta contendo 27%PB apresentaram maior atividade. Os machos de jundiá apresentaram maior atividade de tripsina; entretanto, a quantidade de protease ácida encontrada foi menor em relação às fêmeas. Conclui-se que o nível de proteína dietária afeta a atividade de proteases do jundiá e o sexo influencia na atividade de tripsina e protease ácida. Introdução O processo digestivo é a transformação do alimento no trato digestório em compostos mais simples (aminoácidos, ácidos graxos, glicerol, açúcares) para que sejam transportados aos tecidos, via corrente sangüínea. A presença de enzimas digestivas ao longo do trato digestório é importante neste processo (De Silva & Anderson, 1995). A atividade das enzimas digestivas dos peixes está muito relacionada com a composição da dieta e com o hábito alimentar de cada espécie (Ray, 1988). As enzimas mais importantes na digestão das proteínas são a pepsina, a tripsina e a quimotripsina (Steffens, 1989). Estas endopeptidases são capazes de hidrolisar a maioria dos peptídeos encontrados nas dietas, pois atuam em pontos muito específicos das moléculas protéicas (Fang & Chiou, 1989). Estudos realizados com a piracanjuba (Brycon orbignyanus) mostraram que esta espécie adapta suas enzimas proteolíticas de acordo com a composição da dieta, ocorrendo grande atividade de pepsina no estômago (Garcia-Carreño et al., 2002). O jundiá (Rhamdia quelen) altera a atividade de protease ácida de acordo com o aumento da quantidade de proteína na dieta (Melo et al., 2002). Experimentos realizados com o jundiá e com o pintado (Pseudoplatystoma corruscans) demonstram que a atividade das proteases alcalinas (tripsina e quimotripsina) pode sofrer maior influência do tipo de dieta (composição) do que simplesmente pela variação da quantidade de proteína (Melo et al., 2002; Lundstedt et al., 2004). O jundiá (Rhamdia quelen) é uma espécie de hábito alimentar onívoro, com boas características zootécnicas, porém exigente quanto à qualidade da proteína (Meyer &

2 Fracalossi, 2004). O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade de algumas proteases em jundiás alimentados com diferentes níveis de proteína e separados por sexo. Material e Métodos Os peixes utilizados neste estudo foram obtidos a partir de um experimento de crescimento realizado no Laboratório de Piscicultura (altitude 95m, latitude sul e longitude oeste ) da Universidade Federal de Santa Maria, RS. O período de alimentação foi de 100 dias, entre os meses de abril e junho de 2006, onde 270 peixes (135 machos e 135 fêmeas, peso inicial médio 216,38 ± 26,73g) foram distribuídos (15 peixes/tanque) em um sistema de recirculação de água, com filtragem biológica e composto por 18 caixas de polipropileno (280L). O delineamento experimental foi constituído de um arranjo fatorial 3 X 2 (3 níveis protéicos e 2 sexos), sendo testados os níveis de 24, 27 e 30% de proteína bruta. A alimentação dos peixes foi realizada uma vez ao dia (9h), sendo que nos primeiros 20 e nos últimos 20 dias foi fornecido 1,5% do peso vivo. Nos outros 60 dias a quantidade oferecida foi de 3%PV. As dietas experimentais foram formuladas de acordo com Lazzari et al. (2006), conforme Tabela 1. Os ingredientes foram pesados e posteriormente misturados, através de amassadeira, até completa homogeneização. Posteriormente a mistura foi umedecida, peletizada e levada a estufa de circulação de ar forçado por 24h a 53ºC. Após a secagem, a ração foi moída, peneirada, sendo conservada em congelador. Periodicamente foram aferidos os parâmetros físico-químicos da água: temperatura, amônia total, nitrito, alcalinidade, ph e oxigênio dissolvido. Para medição da temperatura, foi utilizado termômetro (bulbo de mercúrio), para oxigênio um oxímetro digital e para as demais análises um kit colorimétrico (marca Alfakit). A água para as análises foi coletada sempre na entrada dos filtros biológicos, antes da alimentação diária. Após o período de alimentação, foram retirados ao acaso uma amostra de 3 peixes por tanque (9 por tratamento), submetidos a jejum prévio de 24 horas, sendo posteriormente abatidos por hipotermia para retirada do estômago e do intestino. Após a separação do estômago e do intestino, as partes foram dissecadas em Placa de Petri contendo solução salina (NaCl 0,7%), o conteúdo digestivo foi descartado e as respectivas partes homogeneizadas com solução tampão ph 7,0. Utilizou-se um homogeneizador Potter-Elvehjem a 1000 rpm durante 2 minutos. Os homogeneizados foram então centrifugados a x g/5 minutos a 4ºC. Os sobrenadantes resultantes foram utilizados nos ensaios enzimáticos. Foram aferidas as atividades de protease ácida no estômago e de tripsina e quimiotripsina no intestino. A atividade de protease ácida foi realizada utilizando-se o método de hidrólise da caseína modificado por Hidalgo et al. (1999). O ensaio foi conduzido utilizando-se KCl 0,1M em tampão ph 1,8. A reação enzimática consistia de 1% de caseína em água (0,4 ml), tampão (1,6 ml) e 20 l do homogeneizado. Em seguida os tubos foram incubados no banho 30ºC durante 40 minutos. A reação foi interrompida com 1 ml de TCA 15%. Após, as amostras foram centrifugadas e os sobrenadantes foram lidos em 280 nm. A tirosina foi

3 utilizada como padrão, sendo uma unidade de enzima definida como a quantidade de enzima necessária para catalizar a formação de 1 g de tirosina por 1 min por mg de proteína. Para a atividade de tripsina e quimotripsina foram utilizadas as metodologias descritas por Hummel (1959). A atividade de tripsina foi realizada a 30ºC com o substrato - - toluenesulphonyl- L-arginine methyl ester hydrochloride (TAME). Os extratos (30 l) foram incubados por 2 minutos em 2 ml de Tris/CaCl 2 tampão 8,1 e a absorbância foi lida a 247 nm. A quimotripsina foi realizada com Benzoyl-L-tyrosine ethyl ester (BTEE) 0,001M a 30ºC. Os extratos (30 l) foram incubados por 2 minutos em 2 ml de Tris/CaCl 2 ph 7,8 e a absorbância lida em 256 nm. Uma unidade de enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima necessária para hidrolizar 1 g de substrato (TAME ou BTEE) por 1 minuto por mg proteína. Tabela 1. Composição das dietas experimentais (%). Ingredientes D24 D27 D30 Farinha de carne e ossos Farelo de soja Milho moído 23,99 23,99 23,99 Farelo de trigo Óleo de soja Sal comum Fosfato bicálcico Mistura vitamínica e mineral Inerte Antioxidante (BHT) 0,01 0,01 0,01 Composição (%) Umidade 4,20 5,20 4,10 Proteína bruta 24,68 27,04 30,41 Matéria mineral 11,09 11,03 12,16 Extrato etéreo 6,21 7,59 9,04 Fibra bruta 3,80 4,14 4,41 Cálcio 1,98 2,35 2,72 Fósforo 1,25 1,52 1,67 Rancidez Composição da mistura vitamínica e mineral (kg de produto/supre MAIS): Ác.Fólico: 1200mg, Ác. Nicotínico: 24000mg, Ác. Pantotênico: 12000mg, Cobalto: 10mg, Cobre: 3000mg, Cloreto de colina: 108 g, Ferro: 50000mg, Biotina: 48 mg, Iodo: 100mg, Manganês: 20000mg, Selênio: 100mg, Vit.A: UI, Vit. B1: 4800mg, Vit. B2: 4800mg, Vit. B6: 4800mg, Vit. B12: 4800mcg, Vit. C: 48 g, Vit. D3: UI, Vit. E: mg, Vit. K3: 2400mg, Zinco: 3000mg. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância de 2 vias, sendo que as diferenças entre os sexos foram comparadas pelo teste "t" de Student e o efeito do nível protéico foi avaliado através de regressão polinomial, a 5% de significância. Para as análises estatísticas foi utilizado o pacote estatístico "SAS" (1997). Resultados e Discussão A atividade de protease ácida no estômago dos jundiás (Tabela 2) sofreu influência da proteína, onde ocorreu efeito linear crescente do nível protéico da dieta. Quanto ao sexo, as

4 fêmeas apresentaram maior quantidade (14,00) em relação aos machos (8,84). Matrinxãs (Brycon cephalus) apresentam maior atividade de protease ácida de acordo com a elevação da proteína dietária (Vieira et al., 2002). Segundo este autor, a atividade de protease ácida parece estar mais relacionada com a quantidade de nutrientes ingeridos e principalmente com o nível protéico. Não se pode atribuir o efeito do consumo de alimento para a maior atividade desta enzima nas fêmeas, pois a quantidade oferecida foi a mesma. Recomendam-se maiores estudos sobre a secreção desta enzima para o jundiá. Para tripsina, os peixes alimentados com 27%PB apresentaram maior atividade (5,08), sendo os machos com valores superiores aos das fêmeas. Ao contrário da protease ácida, as proteases alcalinas (tripsina e quimiotripsina) não respondem linearmente ao nível protéico da dieta, estando mais sujeitas à variação da composição do alimento e substâncias inibitórias, como os presentes no farelo de soja. Tabela 2. Atividade de proteases (U/mg proteína) de jundiás alimentados com diferentes níveis de proteína bruta e separados por sexo. Quimiotripsina Tripsina Protease ácida Nível PB(%) ,91 4,67 10, ,66 5,08 11, ,67 4,35 13,25 Sexo Macho 1650,93 5,37ª 8,84 b Fêmea 1619,89 3,94 b 14,00 a ANOVA Sexo NS 0,0001 0,0001 Nível PB 0,0001 0,005 0,0001 Sexo X nível PB 0,0001 NS 0,003 CV(%) 11,68 12,90 13,14 Médias com letras diferentes, na coluna, diferem estatisticamente pelo teste t de Student. Não se verificou diferenças na atividade de quimiotripsina entre os sexos; entretanto, da mesma forma que a tripsina, os peixes alimentados com a dieta contendo 27%PB apresentaram maior valor (1833,66). Os resultados obtidos em relação a atividade de proteases mostra evidências que o equilíbrio de nutrientes da dieta, principalmente a relação proteína/energia, influencia na secreção de enzimas. Da mesma forma, devem-se associar a atividade enzimática com parâmetros de desempenho, como ganho em peso e outros. Quanto à composição da dieta, a inclusão de ingredientes de origem vegetal pode acarretar inibição enzimática. Lazzari (2005) verificou que dietas contendo altos níveis de farelo de soja provocam redução na atividade de tripsina e no ganho em peso de juvenis de jundiá. Conforme Lundstedt et al. (2004), somente a atividade de enzimas digestivas não é suficiente para se estabelecer uma dieta adequada para o peixe. Porém, estas geralmente atuam de acordo com a composição da dieta e, quando associadas a parâmetros metabólicos, são indicadores confiáveis do estado nutricional dos peixes. Mais estudos deverão ser conduzidos com o jundiá, nas diferentes fases de criação, de forma a definir um manejo nutricional adequado para esta espécie.

5 Conclusão Conclui-se que o nível de proteína dietária afeta a atividade de proteases do jundiá e o sexo influencia na atividade de tripsina e protease ácida. Agradecimentos Os autores expressam agradecimento à SEAP/MCT/FINEP/Fundo Setorial Agronegócio/Fundo CT Hidro-Aqüicultura (processo n.3602/05) pelo auxílio financeiro ao trabalho, à CAPES pelo fornecimento de bolsa de estudos para Rafael Lazzari e ao CNPq pela bolsa de produtividade em pesquisa (1D) para o professor João Radünz Neto. Referências DE SILVA, S.S.; ANDERSON, T.A Fish Nutrition in Aquaculture. Ed. Chapman & Hall, London. 319p. FANG, L.S.; CHIOU, S.F. Effect of salinity on the activities of digestive proteases from the tilapia fish, Oreochromis niloticus in different culture environments. Comparative Biochemistry Physiology, n.93, p , GARCIA-CARREÑO, F.L.; et al. Digestive proteinases of Brycon orbignyanus (Characidae, Teleostei): characteristics and effects of protein quality. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B. v.132, p , HIDALGO, M.C.; UREA, E.; SANZ, A. Comparative study of digestive enzymes in fish with different nutritional habits: Proteolytic and amylase activities. Aquaculture, v.170, p , HUMMEL, B.C.W. A modified spectrophotometric determination of chymotrypsin, trypsin and thrombin. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology, v.37 (12), p LAZZARI, R. Estudo de enzimas digestivas, crescimento e composição centesimal de filés de juvenis de jundiá (Rhamdia quelen) alimentados com diferentes fontes protéicas. Santa Maria f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Universidade Federal de Santa Maria RS, LAZZARI, R. et al. Diferentes fontes protéicas para a alimentação do jundiá (Rhamdia quelen). Ciência Rural, v.36, n.1, p , LUNDSTEDT, L.M.; MELO, J.F.B.; MORAES, G. Digestive enzymes and metabolic profile of Pseudoplatystoma corruscans (Teleostei:Siluriformes) in response to diet composition. Comparative Biochemistry and Physiology Part B, v.137, p MELO, J.F.B.; et al. Respostas enzimáticas do trato digestório de juvenis de jundiá Rhamdia quelen alimentados com diferentes níveis de proteína. In: XXXIX REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA. RECIFE, PE., Anais..., 2002, Cd-room.

6 MEYER, G.; FRACALOSSI, D.M. Protein requirement of jundia fingerlings, Rhamdia quelen, at two dietary energy concentrations. Aquaculture, v.240, p , RAY, A.K. On the digestive enzymes in three Indian freshwater perches in relation to food and feeding habits. Journal Inland Fishery Society India, v.20, n.1, p.1-5, SAS. Statistical Analysis System. User's Guide. Version 6.08, 4. Ed. North Caroline, p. STEFFENS, W Principios fundamentales de la alimentación de los peces. Ed. Acribia, 275p. VIEIRA, V.L.P. Estudo dos processos digestivos em Brycon cephalus (matrinxã) e Brycon orbignyanus (piracanjuba) alimentados com diferentes teores de proteína: Aspectos adaptativos e resposta metabólica. São Carlos, f. Tese (Doutorado em Genética e Evolução) Universidade Federal de São Carlos, 2002.