UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA GEISA MOREIRA DA COSTA MICROPROPAGAÇÃO DE Erythrina velutina Willd. (MULUNGU) Feira de Santana, BA 2009

2 GEISA MOREIRA DA COSTA MICROPROPAGAÇÃO DE Erythrina velutina Willd. (MULUNGU) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. José Raniere Ferreira de Santana. Feira de Santana, BA 2009

3 Aos meus pais (Washington e Lucivânia), meu esposo (João Neto) e minha irmã (Jane), por todo apoio e incentivo.

4 AGRADECIMENTOS À Deus, meu refúgio e fortaleza. Ele me mantém viva a cada dia. Sem Ele eu não seria nada, mas com Ele me sinto forte. Aos meus pais, pelo carinho e cuidado que sempre tiveram comigo. Ao meu esposo querido, pela paciência e compreensão. Ao meu orientador, José Raniere, pela oportunidade e orientação. À Flávia Dionísio (Flavinha), pela amizade e por todo apoio no primeiro ano de curso. À Cristina Nepomuceno (Cris), pela contribuição na montagem, análise dos experimentos e revisão do manuscrito. À Alone Lima, pelos conselhos e ajuda nos momentos de dificuldade. Ao professor Lenaldo Muniz, por compartilhar seus conhecimentos e experiências. Às amigas, Cimille Gabriele (Mille), Íngrid, Cíntia e Emília (Mi) por todos os momentos vividos e amizade sincera. À amiga-irmã, Marcela Fonseca, pelos preciosos ensinamentos e por me transmitir paz de espírito. Aos alunos de iniciação científica do LCTV pelos momentos de alegria compartilhados. Aos funcionários do Horto Florestal, em especial, D. Beth e Seu Vicente pela simpatia e ajuda nos experimentos de campo. À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos. Ao secretário do PPG-Biotec, Helton Ricardo pela eficiência. Aos meus sogros, Carlos e Ana pelo carinho. Ao meu cunhado, Juliano (Juninho) por toda ajuda no período do mestrado. Às minhas amigas da graduação que estão sempre presentes me dando apoio: Cecília e Alana. À toda minha família e a todos que de alguma maneira contribuíram para mais essa conquista, Obrigada! Agradecimento especial: À minha querida irmã, Jane, que está sempre torcendo por mim em tudo que eu faço. Nine eu agradeço a Deus por ter uma irmã tão maravilhosa como você. Jamais me esquecerei do apoio espiritual que você me deu durante esse período de mestrado. Muito obrigada minha malinha!

5 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Caracterização da espécie Importância medicinal da espécie (aspectos econômicos) Cultura de tecidos vegetais MATERIAL E MÉTODOS Estabelecimento in vitro de Erythrina velutina Meio de cultura, esterilização e condições experimentais Germinação in vitro de sementes de Erythrina velutina Multiplicação in vitro de Erythrina velutina Efeito do tipo de explante e diferentes combinações de BAP e ANA na 23 propagação in vitro de Erythrina velutina Efeito do hipocótilo e epicótilo e de diferentes concentrações de BAP e ANA 24 na propagação in vitro de Erythrina velutina Efeito de diferentes tipos de explantes e concentrações de TDZ na propagação 25 in vitro de Erythrina velutina Efeito de diferentes concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de 26 Erythrina velutina utilizando cotilédone e folha cotiledonar com pecíolo como explantes Efeito do nitrato de prata (AgNO 3 ) e de BAP na multiplicação in vitro de 27 Erythrina velutina 3.3 Enraizamento in vitro de Erythrina velutina Aclimatização de Erythrina velutina 28 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Multiplicação in vitro de Erythrina velutina Efeito do tipo de explante e diferentes combinações de BAP e ANA na 29 propagação in vitro de Erythrina velutina Efeito do hipocótilo e epicótilo como fontes de explantes e de diferentes 37 concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de Erythrina velutina Efeito de diferentes tipos de explantes e concentrações de TDZ na propagação 40 in vitro de Erythrina velutina Efeito de diferentes concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de 45 Erythrina velutina utilizando cotilédone e folha cotiledonar com pecíolo como explantes Efeito do nitrato de prata (AgNO 3 ) e de BAP na multiplicação in vitro de 46 Erythrina velutina 4.2 Enraizamento in vitro e aclimatização de Erythrina velutina 50 5 CONCLUSÃO 52 REFERÊNCIAS 54

6 RESUMO Erythrina velutina Willd. (mulungu), é uma planta nativa do semi-árido brasileiro, que vem sendo utilizada na ornamentação e na medicina popular. A cultura de tecidos poderá contribuir para redução de possíveis impactos ambientais, possibilitando a propagação rápida dessa espécie. Objetivou-se com a realização deste trabalho desenvolver um protocolo de micropropagação do mulungu. Avaliou-se o efeito de diferentes reguladores de crescimento (BAP, ANA e TDZ) sobre diferentes tipos de explantes [hipocótilo (H), nó cotiledonar (NC), epicótilo (E), segmento nodal (SN), folha (F) e cotilédone (C)] obtidos de plântulas in vitro com 12 dias. Também foi testado o efeito do AgNO 3 e do BAP. Para o enraizamento, foi utilizado o regulador de crescimento AIB. O meio de cultura utilizado em todos os experimentos foi o WPM acrescido de 30g. L -1 de sacarose e 7g. L -1 de ágar. Todas as avaliações foram feitas após 30 dias, utilizando análise de regressão e o teste de Scott-Knott e um nível de 5% de probabilidade. O NC foi considerado o melhor explante, seguido do SN. Dos reguladores de crescimento testados, o BAP foi o que promoveu os melhores resultados, quando utilizado sozinho ou em combinação com ANA. O maior número de brotos (2,68), para NC e SN foi obtido no meio suplementado com 17,76 µm de BAP. Quando a maior dose de TDZ (4,52 µm) foi utilizada esses valores diminuíram para 2,16 e 1,40 para NC e SN, respectivamente. Os explantes, H, E e F não foram capazes de produzir brotações em nenhuma das condições testadas, enquanto que o explante C não produziu um número significativo de brotos. A utilização do AgNO 3 não favoreceu a taxa de multiplicação de mulungu e quando combinado com BAP não foi observado um efeito significativo. Os brotos enraizaram em todas as condições testadas, inclusive no meio de cultura sem auxina. Na aclimatização das mudas obteve-se 85% de sobrevivência. Palavras-chave: Mulungu. Cultura de tecidos. BAP. ANA. TDZ. Nitrato de prata. AIB.

7 ABSTRACT Erythrina velutina Will. (mulungu) is a native plant of the Brazilian semi-arid, which is used in ornamentation and in popular medicine. The plant tissue culture can help to reduce possible environmental impacts, allowing the rapid propagation of this species. The objective of this work was to develop a protocol for micropropagation of mulungu. The effect of different plant growth regulators (BAP, NAA or TDZ) on different types of explants [hypocotyls (H), cotyledonary node (CN), epicotyls (E), nodal segment (NS), leaves (L) or cotyledon (C)] obtained from in vitro seedlings of 12 days. It was also tested the effect of AgNO 3 and BAP. For rooting, it was used the growth regulator IBA. The culture medium used in all experiments was the WPM supplemented 30g.L -1 sucrose and 7g.L -1 agar. All evaluations were made after 30 days, using a regression analysis and test of Scott-Knott and a level of 5% probability. The CN was considered the best explant, followed by NS. Of the growth regulators tested, BAP presented the best results when used alone or in combination with NAA. The highest number of shoots (2.68) for CN and NS was obtained in medium supplemented with 17,76 µm BAP. When the highest concentration of TDZ (4,52 µm) was used these values decreased to 2.16 and 1.40 for CN and NS, respectively. The explants, H, E and L were not able to produce shoots in any of the conditions tested, while the C explants did not produce a significant number of shoots. The use of AgNO 3 not favored the multiplication rate of mulungu and when combined with BAP there was not a significant effect. The shoots rooted in all conditions tested, even in the culture medium without auxin. In the acclimatization of the seedlings obtained 85% survival. Keywords: Mulungu. Tissue culture. BAP. NAA. TDZ. Silver nitrate. IBA.

8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Aspecto visual de uma planta adulta (A); da inflorescência (B); dos frutos (C); das sementes (D); da casca (E) e da madeira (F) de mulungu. Fonte: Lorenzi, Um lagarto conhecido como a mabuia de Noronha (Euprepis atlanticus) explorando o néctar das inflorescências de Erythrina velutina. Fonte: Sazima et al., Plântula com 12 dias e explantes de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana-BA, Plântula com 12 dias, epicótilo e hipocótilo de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana-BA, Plântula com 12 dias e quatro tipos de explantes de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana- BA, Plântula com 12 dias e os explantes folha e cotilédone de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana-BA, Número de brotos obtidos a partir do nó cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) de Erythrina velutina, inoculados em meio de cultura WPM com diferentes concentrações de ANA e BAP. Feira de Santana-BA, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01). Cultivo in vitro de Erythrina velutina em meio de cultura WPM contendo 17,76 µm de BAP (A). Aspecto visual de calos compactos formados na base do explante (B e C). Formação de raízes adventícias na base do explante (D). Feira de Santana-BA, Comprimento da parte aérea (cm) de brotos obtidos do nó cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) de Erythrina velutina, inoculados em meio de cultura WPM com diferentes concentrações de ANA e BAP. Feira de Santana-BA, *

9 significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01). Figura 10 Número médio de folhas formadas em plantas de Erythrina 35 velutina, a partir do nó cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) mantidas in vitro por 30 dias sob diferentes concentrações de ANA e BAP em meio de cultura WPM. Feira de Santana, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01). Figura 11 Matéria fresca (A) e seca (B) da parte aérea (mg) de plantas de 37 Erythrina velutina obtidas do nó cotiledonar, mantidas in vitro por 30 dias com diferentes concentrações de BAP e ANA no meio de cultura WPM. Feira de Santana, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01). Figura 12 Formação de raízes (A) e calo (B) em segmentos de hipocótilo de 38 Erythrina velutina Willd. em meio de cultura WPM. Feira de Santana BA, Figura 13 Brotos de Erythrina velutina com 30 dias de idade obtidos do nó 41 cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) em meio de cultura WPM contendo 4,52 µm de TDZ. Feira de Santana-BA, Figura 14 Valores médios para o número de brotos (A), número de folhas, 43 matéria fresca (C) e seca (D) da parte aérea de plantas de Erythrina velutina mantidas in vitro por 30 dias em meio de cultura WPM acrescido de TDZ. Feira de Santana, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01). Figura 15 Formação de calo na base dos explantes de Erythrina velutina 44 com 30 dias de idade obtidos do hipocótilo (A), epicótilo (B), nó cotiledonar (C) e do segmento nodal (D) em meio de cultura WPM contendo 4,52 µm de TDZ. Feira de Santana-BA, Figura 16 Aspecto da indução de brotações adventícias em folhas e 45 cotilédones de Erythrina velutina inoculados em meio WPM acrescido de BAP e ANA após 30 dias. Calo (A), raiz (B) e amarelecimento nas folhas. Formação de brotos diretamente do cotilédone (D), calo (E) e raiz (F) no cotilédone. Feira de Santana BA, Figura 17 Cultivo in vitro de Erythrina velutina em meio de cultura WPM 48

10 suplementado com 10,0 µm de AgNO 3. Feira de Santana BA, Figura 18 Média do número de brotos (A), do comprimento da parte aérea 49 (cm) (B), da matéria fresca (C) e matéria seca (D) da parte aérea (mg) de Erythrina velutina obtidos do nó cotiledonar cultivado em meio de cultura WPM suplementado com nitrato de prata. Feira de Santana BA, ** altamente significativo (P 0,01). Figura 19 Planta enraizada em meio de cultura WPM suplementado com 51 2,46 µm de AIB. Feira de Santana BA, Figura 20 Mudas de Erythrina velutina após 21 (A) e 51 (B) dias na casade-vegetação. Feira de Santana BA, Figura 21 Propagação in vitro de Erythrina velutina Willd. 53

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6 Tabela 7 Resumo da análise de variância para número de brotações (NB), número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), matéria seca da parte aérea (MS) e matéria fresca da parte aérea (MF) na multiplicação in vitro de Erythrina velutina submetida a diferentes concentrações de BAP e ANA e diferentes explantes após 30 dias de inoculação in vitro. Feira de Santana, Porcentagem (%) de calos (C) e raízes (R) em segmentos de hipocótilo e epicótilo de Erythrina velutina obtida em meio de cultura WPM acrescido de combinações de BAP e ANA após 30 dias. Feira de Santana-BA, Resumo da análise de variância para número de brotações (NB), número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), matéria seca (MS) e matéria fresca (MF) da parte aérea na multiplicação in vitro de Erythrina velutina a partir de diferentes explantes submetida a diferentes concentrações de TDZ após 30 dias de inoculação in vitro. Feira de Santana, Comprimento da parte aérea (cm) de brotos de obtidos a partir de diferentes tipos de explantes de Erythrina velutina, mantidos in vitro por 30 dias. Feira de Santana BA, Porcentagem (%) de calos formados na base dos explantes de Erythrina velutina submetidos a diferentes concentrações de TDZ após 30 dias. Feira de Santana-BA, Efeito da interação BAP e ANA sobre a porcentagem de calos (C), porcentagem de brotações (B) e porcentagem de raízes (R), a partir de folhas e cotilédones de Erythrina velutina Willd. Feira de Santana BA, Resumo da análise de variância para número de brotos (NB), comprimento da parte aérea (CPA), matéria fresca (MF) e matéria seca (MS) da parte aérea na multiplicação in vitro de Erythrina velutina submetida a nitrato de prata (AgNO 3 ) e BAP utilizando o nó cotiledonar como explante após 30 dias de inoculação in vitro. Feira

12 Tabela 8 de Santana BA, Resumo da análise de variância para o número de raízes (NR) e o comprimento da maior raiz (CMR) de brotações de Erythrina velutina aos 30 dias de cultivo. Feira de Santana BA,

13 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 2,4-D Ácido 2,4-Diclorofenoxiacético AgNO 3 Nitrato de Prata AIA Ácido Indolacético AIB Ácido Indolbutírico ANA Ácido Naftalenoacético BA Benziladenina BAP Benzilaminopurina CMR Comprimento da Maior Raiz CPA Comprimento da Parte Aérea C.V(%) Coeficiente de Variação FV Fator de Variação GL Grau de Liberdade MF Matéria Fresca MS Matéria Seca NaOCl Hipoclorito de Sódio NB Número de Brotos NF Número de Folhas NR Número de Raízes TDZ Thidiazuron WPM Wood Plant Medium

14 1 INTRODUÇÃO A Erythrina velutina Willd. (Fabaceae), também conhecida como mulungu, suinã, corticeira e sanaduva, é uma árvore nativa da caatinga do nordeste brasileiro e Vale do São Francisco, apresentando grande resistência aos estresses térmico (altas temperaturas) e hídrico (escassez de água). É uma espécie ornamental quando em floração, sendo ocasionalmente empregada no paisagismo. Sua casca e frutos são utilizados na medicina popular em algumas regiões do nordeste embora a eficácia e segurança do seu uso não tenham sido ainda comprovadas cientificamente. Sua utilização vem sendo feita, assim, com base na tradição popular. São atribuídas às preparações de sua casca propriedades sudorífica, calmante, emoliente e peitoral e, do seu fruto seco, ação anestésica local, usado na forma de cigarro como odontálgico. O infuso da casca é empregado como sedativo e calmante de tosses e bronquites, bem como para o tratamento de verminoses e hemorróidas e, o seu cozimento (decocto) para acelerar a maturação de abscessos nas gengivas (LORENZI & MATOS, 2008). A E. velutina produz anualmente grande quantidade de sementes, entretanto, sua coleta é feita de forma extrativista. Em algumas regiões do nordeste brasileiro ocorre a retirada de quase todas as sementes da árvore e coleta das que estão no solo para a utilização no artesanato. Este fator aliado à dormência tegumentar das sementes tem impedido que novas plantas surjam e novas populações se formem na natureza. E, embora, a E. velutina seja propagada com sucesso através da estaquia, a utilização desse método requer uma grande quantidade de material da planta-mãe e de um grande espaço para que a propagação ocorra (NEVES et al., 2006; BORGES et al., Devido às dificuldades encontradas no processo de propagação desta espécie, a técnica do cultivo in vitro representa uma importante alternativa para a produção de mudas e conservação desse recurso genético, com destaque para a micropropagação, que permite obter plantas com características genéticas idênticas, em larga escala e em curto espaço de tempo. Na propagação in vitro um explante (célula, tecido ou órgão) é isolado e cultivado sob condições assépticas em um meio artificial geralmente suplementado com reguladores de crescimento. O princípio básico da cultura de tecidos é a totipotencialidade das células, ou seja, qualquer célula no organismo vegetal contém toda a informação genética necessária para a regeneração de uma planta completa. O cultivo in vitro é um método viável para propagação clonal e massal de diversas espécies lenhosas. No entanto, um dos maiores entraves no estabelecimento in vitro dessas espécies, está na dificuldade de obter tecidos livres de contaminações provocadas por fungos

15 e bactérias e ainda por oxidações provocadas por compostos fenólicos (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). A obtenção de plântulas provenientes de sementes germinadas assepticamente pode resolver alguns problemas, como por exemplo, a contaminação por microrganismos. Outro aspecto a ser considerado são espécies recalcitrantes à micropropagação. A recalcitrância é a falta de resposta morfogenética da espécie às condições estabelecidas para seu cultivo (DEBERGH & ZIMMERMAN, 1991). A técnica de micropropagação também pode apresentar, para muitas espécies vegetais, soluções para outros problemas como dificuldade de enraizamento e produção de mudas com maior eficiência, uniformidade e tempo reduzido. A partir de uma única matriz é possível produzir centenas de mudas idênticas à original, com todas as suas características e vantagens como: mudas sadias de matrizes selecionadas, tamanho uniforme, melhor desempenho no campo e maior produtividade. Diante do exposto e devido à falta de relatos sobre a propagação in vitro de mulungu (E. velutina), objetivou-se com a realização desse trabalho o estabelecimento de um protocolo de micropropagação de plantas de E. velutina através da indução de brotos adventícios em explantes derivados de plântulas estabelecidas in vitro, pelo estudo do efeito de diferentes reguladores de crescimento. 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 CARACTERIZAÇÃO DA ESPÉCIE Segundo Joly (1998) a família das leguminosas compreende mais de seiscentos gêneros que reúnem mais de 13 mil espécies, uma das maiores dentre as dicotiledôneas, e estão espalhadas em todo o mundo, especialmente nas regiões tropicais e subtropicais. O gênero Erythrina (família FABACEAE sub-família Papilionoideae) é largamente conhecido, ocorre nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Possui cerca de 110 espécies, das quais 70 são nativas da América (VASCONCELOS et al., 2003). Para o Brasil são relacionadas cerca de doze espécies (EPAMIG, 1993). O nome Erythrina vem do grego "erythros", que significa vermelho, em alusão à cor de suas flores. Erythrina velutina é popularmente conhecida como suinã, mulungu, canivete, corticeira, mulungu-da-catinga, paude-coral, sanaduí, sananduva, dentre outros (LORENZI, 1992; EPAMIG, 1993). Erythrina velutina Willd. é uma árvore decídua, de copa aberta e arredondada, muito florífera e ornamental, espinhenta, atinge 6 a 12 m de altura. Apresenta folhas compostas

16 trifolioladas, alternas, de folíolos cartáceos, velutino-pubescentes, medido de 3 a 12 cm de comprimento. Suas flores são vermelho-coral, grandes, dispostas em panículas racemosas com raque pulverulenta, formadas com a árvore despida de sua folhagem. Os frutos são do tipo legume (vagem) deiscente, com 5 a 8 cm de comprimento, contendo 1-3 sementes reniformes de cor vermelha e brilhantes (LORENZI & MATOS, 2008) (Figura 1). A espécie Erythrina velutina Willd. é uma árvore comumente usada em jardins e parques no nordeste brasileiro (DA-CUNHA et al., 1996). É uma planta heliófita, característica de várzeas úmidas e beira de rios da caatinga da região semi-árida do nordeste brasileiro. Ocorre preferencialmente nas formações secundárias apresentando, entretanto, dispersão bastante irregular e descontínua. Produz anualmente grande quantidade de sementes viáveis, porém com dormência tegumentar. A B C D E F Figura 1: Aspecto visual de uma planta adulta (A); da inflorescência (B); dos frutos (C); das sementes (D); da casca (E) e da madeira (F) de mulungu. Fonte: Lorenzi, 2000.

17 O mulungu é uma árvore de grande resistência à seca, apresentando rusticidade e rápido crescimento, podendo ser utilizada para a recuperação de áreas degradadas. Na época da floração, que ocorre entre os meses de setembro e outubro, a árvore apresenta-se desfolhada no semi-árido, porém completamente florida, sendo registrada com freqüência a presença de diversos animais, como aves e lagartos para alimentarem-se não só do néctar, mas, também, de partes da própria planta (Figura 2). Sua madeira é leve e pouco resistente a agentes agressivos, com expressiva utilização no artesanato para confecção de tamancos, brinquedos, caixotes, dentre outros (LORENZI & MATOS, 2002). Figura 2: Um lagarto conhecido como a mabuia de Noronha (Euprepis atlanticus) explorando o néctar das inflorescências de Erythrina velutina. Fonte: Sazima et al., IMPORTÂNCIA MEDICINAL DA ESPÉCIE (ASPECTOS ECONÔMICOS) As plantas do gênero Erythrina são conhecidas por produzirem alcalóides, flavonóides e isoflavonóides. Estas plantas representam a principal fonte de alcalóides tetracíclicos, sendo que estes possuem atividade semelhante ao curare, causando paralisia muscular (AMER et al., 1991; DECKER et al., 1995). A Erythrina velutina é uma espécie nativa da flora brasileira que tem sido utilizada na medicina popular em algumas regiões do nordeste brasileiro. São atribuídas às preparações da casca propriedades sudorífica, calmante, emoliente, peitoral e do seu fruto seco ação anestésica local, que é usado na forma de cigarro como odontálgico, embora a eficácia e

18 segurança de seu uso ainda não tenham sido confirmadas cientificamente (LORENZI & MATOS, 2002). Por meio de estudos farmacológicos empregando-se o extrato da E. velutina foram demonstrados os seus efeitos periféricos e sobre o sistema nervoso central (VIRTUOSO et al., 2005). Dantas et al. (2004) evidenciaram que o extrato aquoso das folhas de E. velutina em baixas doses interferiu em processos mnemônicos e em doses maiores agiu como sedativo e bloqueador neuromuscular periférico. Virtuoso et al. (2005) utilizando métodos de difusão em disco e concentração inibitória mínima, demonstraram que o extrato etanólico bruto e a fração hexano extraídos da casca de E. velutina possuem atividade contra Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes. Segundo Santos et al. (2007) o extrato aquoso das folhas de E. velutina possui efeito relaxante em ducto deferente de rato. Também foi demonstrado que o extrato aquoso e a fração alcalóide total das folhas de E. velutina apresentam atividade anticolinesterásica (ESTEVAM et al., 2007). Em vista disso, torna-se imperioso o investimento na pesquisa fitoquímica e biológica a fim de se comprovar seu potencial terapêutico. 2.3 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS Nas últimas quatro décadas, as ciências biológicas lograram avanços consideráveis com o desenvolvimento de uma série de técnicas que tem permitido estudar as plantas aos níveis celular e molecular. Estes novos enfoques compõem o que se denomina de biotecnologia e, quando integrados entre si e com métodos convencionais de melhoramento genético, têm superado desafios e encontrados soluções para muitos problemas relacionados com a biologia vegetal. Entre os diversos procedimentos biotecnológicos, sem dúvida alguma, o ramo da biologia celular e particularmente a cultura de tecidos é um dos que mais êxito alcançou, inclusive por ser aquele que vem sendo estudado há mais tempo (SOUZA et al., 2006). A cultura de tecidos vegetais compreende um conjunto de técnicas nas quais um explante (célula, tecido ou um órgão) é isolado e cultivado sob condições assépticas em um meio artificial. O princípio básico da cultura de tecidos é a totipotencialidade das células, ou seja, qualquer célula no organismo vegetal contém toda a informação genética necessária para a regeneração de uma planta completa (TORRES et al., 1998).

19 A cultura de tecidos tem como base os mesmos princípios anatomo-fisiológicos envolvidos no crescimento e desenvolvimento de qualquer planta sob outras condições. Três processos interagem no desenvolvimento: o crescimento, a diferenciação celular e a morfogênese. O crescimento é o aumento irreversível no tamanho, que pode ou não estar acompanhado de um incremento de massa. A diferenciação celular consiste na transformação de células geneticamente idênticas em células especializadas bioquímica, fisiológica e estruturalmente. A morfogênese pode ser definida como o processo resultante da integração e coordenação da divisão e diferenciação celular (MOORE, 1979). Durante o desenvolvimento de um organismo, o processo de diferenciação celular reflete o efeito de pelo menos três grupos de fatores: o fator genético, as características originadas durante a ontogênese e as características cuja expressão depende apenas do ambiente (KERBAUY, 1999). Vários são os fatores que influenciam a eficiência da regeneração in vitro, como o meio de cultura, o genótipo, reguladores de crescimento (citocininas e auxinas), tamanho, idade e posição dos explantes, fotoperíodo e intensidade luminosa (LIU & PIJUT, 2008). As plantas ou explantes cultivados in vitro possuem exigências nutricionais específicas. Assim, ao se excisar parte da planta para o cultivo in vitro, observa-se que os explantes não são completamente autotróficos e requerem meio nutritivo para suplementar suas necessidades exógenas, em termos de elementos essenciais, constituintes orgânicos e energia (TORRES et al., 2001). Dentre os principais meios nutritivos utilizados para o cultivo in vitro, há o MS, desenvolvido por Murashige & Skoog (1962) e o WPM, formulado por Lloyd & Mc Cown (1980) (George, 1996). O meio WPM foi desenvolvido para cultura de brotações em plantas lenhosas. Este apresenta 1/4 das concentrações de íons de nitrato, amônia e potássio do meio MS e os níveis de PO 3- dobrados. Este meio tem sido recomendado para espécies lenhosas, por apresentar baixas concentrações totais de íons (NICIOLI, 2006). Em vários tecidos cultivados in vitro, a utilização de substâncias reguladoras de crescimento apresenta importância fundamental para o estabelecimento da competência e determinação, imprescindíveis para a formação de meristemas caulinares e/ou radiculares (KERBAUY, 1999). Os reguladores de crescimento exercem sua ação por reconhecimento de receptores específicos, presentes em células responsivas, traduzindo sinais hormonais em eventos bioquímicos e fisiológicos (GUERRA et al., 1999). Reguladores de crescimento são usados para suportar um nível de crescimento básico e são igualmente importantes para direcionar a resposta do propágulo ao desenvolvimento. O

20 sinergismo entre auxinas e citocininas é crítico para o controle da morfogênese in vitro. Elevadas concentrações de citocininas e baixas de auxinas induzem, predominantemente, a formação de gemas em detrimento da formação de raízes e calos e vice-versa. Em geral, a rizogênese é induzida pela presença isolada de auxina ou em combinação com uma citocinina em baixa concentração (SANTANA, 2003). Das citocininas comercialmente disponíveis, a 6-benzilaminopurina (BAP) é o regulador de crescimento que, em geral, apresenta melhores resultados in vitro para promover a multiplicação de diversas espécies, sendo utilizado em aproximadamente 60% dos meios. As auxinas mais utilizadas são o ácido indolbutírico (AIB), o ácido naftalenoacético (ANA) e o ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D). As duas primeiras são, geralmente, utilizadas na fase de enraizamento, e a última, na indução de calos e embriogênese somática (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Diversos trabalhos têm demonstrado um efeito sinergístico entre auxinas e citocininas para muitas plantas propagadas in vitro (CASADO et al., 2002; SALVI et al., 2002; MARTIN, 2003). Em Malus zumi, o número de brotos por explante foi significativamente maior nos meios onde havia combinação de BAP com ANA ou AIA (ácido indolacético) (XU et al., 2008). Geralmente uma citocinina é requerida para a indução e proliferação de brotos axilares in vitro. Entretanto, o tipo efetivo e sua ótima concentração variam em função da espécie (PARK et al., 2008). Em alguns casos quando as citocininas mais comuns, como BAP, são ineficientes para induzir brotações, o uso de reguladores de crescimento com alta atividade de citocinina, como o thidiazuron (TDZ), pode ser uma alternativa para induzir ou aumentar a taxa de brotações adventícias (CORREDOIRA et al., 2008). Embora tenha sido desenvolvido para ser utilizado como desfoliante para o algodão, com o nome comercial de Dropp, o TDZ possui alta atividade de citocinina em cultivos in vitro, quando utilizado em pequenas concentrações (MOK et al., 1982). Na maioria dos casos, o TDZ tem apresentado resultados superiores em relação às outras citocininas na indução e multiplicação de brotos de várias espécies. Entretanto, seu uso requer cautela, já que problemas como hiperhidricidade de brotações, folhas com morfologia anormal, brotações curtas e compactas e dificuldades no alongamento e no enraizamento têm sido observados na sua presença (LU, 1993). Diversos trabalhos de micropropagação in vitro de espécies lenhosas têm demonstrado a eficiência do TDZ na indução de múltiplas brotações (HUSAIN et al., 2007; SIDDIQUE & ANIS, 2007; SUJATHA et al., 2008; CORREDOIRA et al., 2008).

21 As diversas técnicas de cultura de tecidos vegetais podem ser dividas em dois grupos: organogênese e embriogênese somática (PASQUAL et al., 1997). Este último, que consiste do desenvolvimento de embriões a partir de células somáticas, não será abordado neste trabalho. A organogênese é definida como a formação de estruturas a partir de tecidos e/ou células, podendo ocorrer por duas vias: via direta, através da regeneração de plantas provenientes de tecidos não meristemáticos, sem passar pela fase de calo, apresentando alta fidelidade genética; e, por via indireta, quando o processo de regeneração é precedido pela formação de calo. A partir das células do calo surgem gemas adventícias capazes de desenvolverem novas estruturas (parte aérea ou raiz) (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Entretanto, a regeneração via calos, às vezes, resulta em aparecimento de variação somaclonal, tornando essa estratégia questionável para multiplicação clonal. A multiplicação de brotos, por outro lado, é um método seguro que pode ser usado quando a produção de clones de plantas lenhosas for requerida (RIBEIRO et al., 2002). Após o desenvolvimento das brotações oriundas de gemas cultivadas in vitro, essas são repicadas e transferidas para um meio de cultura suplementado com auxina e carvão ativado para favorecer o desenvolvimento do sistema radicular, resultando, assim, na formação de novas plântulas, que seguem para a fase mais crítica do cultivo in vitro (aclimatização). O enraizamento de espécies lenhosas, quando comparado ao de espécies herbáceas, geralmente é mais difícil e se agrava à medida que não se utiliza material jovem, uma vez que a restauração da competência de enraizamento diminui ao aproximar-se da fase adulta. A qualidade das partes aéreas provenientes da fase de multiplicação determina, em geral, o sucesso do enraizamento (DECCETTI, 2000). Outro problema ligado ao enraizamento de lenhosas é a formação de calos na base do explante durante a fase de multiplicação. Erig e Schuch. (2004) afirmam que a formação de calos na zona de enraizamento é indesejável, pois ela pode afetar a qualidade das raízes, principalmente no que se refere à conexão vascular com a planta. A formação de raízes adventícias em várias espécies lenhosas tem sido beneficiada pelo uso de carvão ativado no meio de enraizamento. Dotado de uma alta capacidade de adsorção, esta substância tem a propriedade de modificar a composição dos meios de cultura, adsorvendo uma série de substâncias adicionadas ao meio, ou liberadas pelos explantes ou presentes no ágar. Outra propriedade atribuída ao carvão ativado, como sendo benéfica no processo de enraizamento, diz respeito à redução da intensidade de luz na região de formação de raízes (ASSIS & TEIXEIRA, 1998). Entretanto, o uso do carvão ativado nem sempre

22 influencia na formação de raízes, como em Arbutus unedo L., onde a adição de carvão ativado no meio não aumentou a formação de raízes (GOMES & CANHOTO, 2008). O nitrato de prata (AgNO 3 ), um potente inibidor da ação do etileno, tem sido utilizado em alguns trabalhos por beneficiar a formação de brotos e aumentar a freqüência de brotações como em Brassica campestris (ZHANG et al., 1998). O etileno é considerado por suprimir a morfogênese in vitro. Em angico (Anadenanthera colubrina) o AgNO 3 ao ser utilizado para controle da abscisão foliar também promoveu um incremento significativo, tanto no número de gemas quanto de brotações, mostrando-se eficiente para o processo de micropropagação (NEPOMUCENO et al., 2007). A aclimatização pode ser considerada a fase final da micropropagação e sua importância é tal que pode significar a limitação de todo processo de multiplicação in vitro de plantas. Caracteriza-se pela mudança de uma condição heterotrófica para autotrófica. Plântulas oriundas do cultivo in vitro podem apresentar algumas deficiências anatômicas, morfológicas e fisiológicas, como a redução no número de estômatos e epiderme com cutícula reduzida. Isto contribui para a rápida desidratação da plântula quando transferida para o ambiente normal, comprometendo, assim, sua sobrevivência ex vitro (GEORGE, 1993). Dentre as principais características das plantas cultivadas in vitro, destaca-se a baixa regulação da perda de água, decorrente, principalmente, da limitada ou pouca funcionalidade dos estômatos e da deficiente formação de cera epicuticular (LAMHAMEDI et al., 2003), além de reduzido desenvolvimento do mesofilo foliar, especialmente os parênquimas clorofilianos e feixes vasculares (SANDOVAL et al., 1994; AMÂNCIO et al., 1999; GONÇALVES et al., 2000; ROMANO & MARTINS-LOUÇÃO, 2003). Essas características podem levar a uma perda excessiva de água no início da aclimatização, o que representa um estresse crítico, sendo então necessário manter a umidade alta e a temperatura amena, pelo menos no início do processo. O estabelecimento de condições de umidade relativa alta é fator decisivo para a sobrevivência das plantas desde sua retirada dos recipientes até a total adaptação ao novo ambiente (SOUZA et al., 2006). 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 ESTABELECIMENTO IN VITRO DE Erythrina velutina Meio de cultura, esterilização e condições experimentais

23 O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, localizado na Unidade Experimental Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana. O meio de cultura básico utilizado foi o WPM (LLOYD & MCCOWN, 1980), suplementado com 30 g.l -1 de sacarose, 7 g.l -1 de ágar (Himedia ) e o ph foi ajustado para 5,7 ± 0,1, antes da autoclavagem, utilizando-se NaOH ou HCl 0,1N. O meio de cultura foi autoclavado, à temperatura de 127 o C e à pressão de 1,05 kg.cm -2, durante 15 minutos. O ambiente na sala de crescimento, para todos os experimentos, foi mantido na temperatura de 25 ± 3 o C, com fotoperíodo de 16 horas com radiação fotossintética ativa de mol m -2 s - 1 fornecidos por lâmpadas fluorescentes Germinação in vitro de sementes de Erythrina velutina Foram utilizadas sementes de Erythrina velutina coletadas na Fazenda Caiçara Petrolina PE (latitude 34º00 00 N e longitude 68º54 22,5 E) no mês de setembro de Inicialmente as sementes de mulungu foram escarificadas (SILVA et al., 2007) com miniretífica (Western R-40) no lado oposto ao arilo e depois lavadas em água corrente por 10 minutos. Em câmara de fluxo laminar foram desinfestadas com imersão em álcool a 70% por 1 minuto, seguido de solução de hipoclorito de sódio - NaOCl (água sanitária comercial - 2,5% de cloro ativo) com 2 gotas de detergente neutro por 15 minutos e lavadas 4 vezes em água destilada estéril. Em seguida as sementes foram colocadas para embeber em água destilada esterilizada e depois de 24h foram inoculadas em tubos de ensaio, contendo 20 ml de meio de cultura sólido WPM. As plântulas provenientes da germinação in vitro foram utilizadas como fonte de material asséptico após 12 dias. 3.2 MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE Erythrina velutina Efeito do tipo de explante e de diferentes combinações de BAP e ANA na propagação in vitro de Erythrina velutina Doze dias após a germinação in vitro, foram utilizados o segmento nodal, o nó cotiledonar e o hipocótilo como fonte de explantes (Figura 3). Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio contendo 15 ml do meio de cultura WPM, acrescido de diferentes combinações de BAP (0,0; 2,22; 4,44; 6,66; 8,88; 17,76 µm) e ANA (0,0; 1,34; 2,68; 5,37 µm).

24 O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com arranjo em fatorial 3 x 6 x 4 (tipos de explantes x concentrações de BAP x concentrações de ANA), com 5 repetições, sendo cada repetição formada por 5 tubos (um explante / tubo). Segmento Nodal Nó Cotiledonar Hipocótilo Figura 3: Plântula com 12 dias e explantes de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana-BA, Após trinta dias foram avaliados o número de brotos (NB), o número de folhas (NF), o comprimento da parte aérea (CPA) e a matéria fresca (MF) e seca (MS) da parte aérea. A secagem do material foi feita na estufa com ventilação forçada, à temperatura de 60ºC, por 72 horas. Os dados foram submetidos à análise de variância, testando-se as médias por regressão, através do programa SISVAR, v 4.3, desenvolvido pela UFLA (FERREIRA, 2003) Efeito do hipocótilo e epicótilo e de diferentes concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de Erythrina velutina Segmentos de hipocótilo e epicótilo com aproximadamente 1,5 cm de comprimento foram obtidos de plântulas estabelecidas in vitro, com aproximadamente 12 dias de idade, foram utilizados como fonte de explante para esse experimento (Figura 4).

25 Os explantes foram inoculados na posição horizontal em tubos de ensaio contendo 15 ml de meio de cultura WPM acrescido de diversas combinações de BAP (0,0; 2,22; 4,44; 6,66; 8,88; 17,76 µm) e ANA (0,0; 1,34; 2,68; 5,37 µm). O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com arranjo em fatorial 2 x 6 x 4 (tipos de explantes x concentrações de BAP x concentrações de ANA), com 5 repetições, cada uma formada por 5 tubos (um explante/tubo). Epicótilo Hipocótilo Figura 4: Plântula com 12 dias, epicótilo e hipocótilo de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana-BA, Os explantes foram colocados na posição horizontal para que ocorresse a quebra da dominância apical e a fim de testar se o maior contato do explante com o meio promoveria a indução de brotações, já que em experimentos preliminares com os explantes colocados na posição vertical não foi observada a formação de brotos. Após trinta dias foram avaliados a formação de brotações adventícias, a presença de calo e de raízes nas extremidades dos explantes Efeito de diferentes tipos de explantes e concentrações de TDZ na propagação in vitro de Erythrina velutina Neste experimento foram utilizados quatro tipos de explantes: hipocótilo, nó cotiledonar, epicótilo e segmento nodal provenientes de plântulas obtidas assepticamente com

26 12 dias de idade (Figura 5). Esses explantes foram inoculados em tubos de ensaio, contendo 8 ml de meio de cultura WPM acrescido de diferentes concentrações de TDZ (0,0; 1,13; 2,27; 4,54 µm). Seg. Nodal Epicótilo Nó Cotiledonar Hipocótilo Figura 5: Plântula com 12 dias e quatro tipos de explantes de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana-BA, O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado com arranjo em fatorial 4 x 4 (tipos de explantes x concentrações de TDZ), com 5 repetições, sendo cada repetição formada por 5 tubos (um explante/tubo). Após trinta dias foram avaliados o número de brotos (NB), o número de folhas (NF), o comprimento da parte aérea (CPA) e a matéria fresca (MF) e seca (MS) da parte aérea. A secagem do material foi feita na estufa com ventilação forçada, à temperatura de 60ºC, por 72 horas. Os dados foram submetidos à análise de variância testando-se as médias pelo teste de Scott-Knott (dados qualitativos) e regressão (dados quantitativos), através do programa SISVAR, v 4.3, desenvolvido pela UFLA (FERREIRA, 2003) Efeito de diferentes concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de Erythrina velutina utilizando cotilédone e folha com pecíolo como explantes

27 Foram utilizados o cotilédone e o primeiro par de folhas com pecíolo como fonte de explante, obtidos de plantas estabelecidas in vitro com 12 dias de idade (Figura 6). Esses foram inoculados em tubos de ensaio contendo 10 ml do meio de cultura WPM acrescido de diferentes combinações de BAP (0,0; 2,22; 4,44; 6,66; 8,88; 17,76 µm) e ANA (0,0; 1,34; 2,68; 5,37 µm). Folha Cotilédone Figura 6: Plântula com 12 dias e os explantes folha e cotilédone de Erythrina velutina utilizados para a propagação in vitro. Feira de Santana-BA, O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com arranjo em fatorial 2 x 6 x 4 (tipos de explantes x concentrações de BAP x concentrações de ANA), com 5 repetições, sendo cada repetição formada por 4 tubos (um explante / tubo). Após trinta dias foram avaliados a formação de brotações adventícias, a presença de calo e de raízes nas extremidades dos explantes Efeito do nitrato de prata (AgNO 3 ) e de BAP na multiplicação in vitro de Erythrina velutina Foram testadas diferentes concentrações de nitrato de prata (0,0; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0 µm) em meio de cultura WPM, acrescido ou não de 17,76 µm de BAP, totalizando oito tratamentos mais o controle (ausência de AgNO 3 e BAP), utilizando como fonte de explante o

28 nó cotiledonar. Tanto a concentração do regulador de crescimento BAP quanto o tipo de explante foram escolhidos com base nos resultados obtidos no primeiro experimento. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com arranjo em fatorial 2 x 4 (concentração de BAP x concentrações de AgNO 3 ), com cinco repetições, sendo cada uma formada por 4 tubos (um explante por tubo). Após trinta dias avaliou-se o número de brotos (NB), o comprimento da parte aérea (CPA), a matéria fresca (MF) e a matéria seca (MS) da parte aérea. A secagem do material foi feita na estufa com ventilação forçada, à temperatura de 60ºC, por 72 horas. Os dados foram submetidos à análise de variância, tesando-se as médias por regressão polinomial a 5% de probabilidade através do programa SISVAR, v 4.3, desenvolvido pela UFLA (FERREIRA, 2003). 3.3 ENRAIZAMENTO IN VITRO DE Erythrina velutina Para o enraizamento in vitro, brotações com 1-2 cm obtidas in vitro foram inoculadas em 15 ml de meio de cultura WPM com diferentes concentrações do ácido indolbutírico AIB (0,0; 2,46; 4,92; 9,89 µm). O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com 12 repetições por tratamento, sendo cada repetição composta por um tubo de ensaio contendo um broto. Após trinta dias os dados foram submetidos à análise de variância, sendo avaliada a porcentagem de enraizamento, o número médio de raízes e o comprimento da maior raiz através do teste de médias de Scott-Knott. 3.4 ACLIMATIZAÇÃO DE Erythrina velutina Foram utilizadas plantas enraizadas in vitro, após trinta dias de inoculação em meio de cultura WPM. As plantas foram retiradas do tubo de ensaio e lavadas em água destilada para a remoção do excesso do meio de cultivo. Em seguida foram transferidas para sacos de polietileno contendo terra vegetal e areia lavada (1:1) como substrato. Foram utilizadas garrafas pet de 1L para a manutenção da umidade relativa alta no microambiente. Não foi realizado o controle da temperatura nem da umidade durante a aclimatização. Durante as três primeiras semanas de aclimatização foi realizado o controle da intensidade luminosa, onde as plantas foram mantidas sob sombrite 30%. Durante esse período, a tampa da garrafa pet foi desenroscada no 3º dia e retirada no 8º dia. A garrafa foi

29 retirada no 21º dia. As plantas foram regadas diariamente com água durante esse período. Aos 21 e 51 dias foi avaliada a taxa de sobrevivência das mudas. 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 MULTIPLICAÇÃO IN VITRO DE Erythrina velutina Efeito de diferentes tipos de explantes e concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de Erythrina velutina A interação tripla BAP x ANA x Explante foi altamente significativa, (P 0,01), para todas variáveis analisadas (Tabela 1). Tabela 1: Resumo da análise de variância para número de brotações (NB), número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), matéria seca da parte aérea (MS) e matéria fresca da parte aérea (MF) na multiplicação in vitro de Erythrina velutina submetida a diferentes concentrações de BAP e ANA e diferentes explantes após 30 dias de inoculação in vitro. Feira de Santana, Quadrados Médios FV GL NB z NF z CPA z MS z MF z BAP (B) 5 3,03** 64,37** 9,46** 113,97** 4782,60 ns ANA (A) 3 0,47** 20,95** 2,67** 74,77** 34838,33** EXPLANTE (E) 2 79,62** 1212,24** 199,06** 17780,99** ,15** BxA 15 0,48** 4,42* 0,86** 90,24** 10032,95** BxE 10 0,99** 26,77** 3,21** 106,64** 9273,39** AxE 6 0,14 ns 7,71** 0,90** 32,76 ns 17891,05** BxAxE 30 0,28** 3,95** 0,81** 81,26** 9031,30** Resíduo 359 0,10 2,14 0,26 16, ,76 CV (%) 7,80 15,21 9,83 17,53 18,33 * Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F. z Dados transformados em (x+1) 0,5. ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F.

30 Nº de Brotos Nº de Brotos O nó cotiledonar apresentou a maior capacidade de regeneração, seguido do segmento nodal, enquanto que o hipocótilo não apresentou capacidade organogênica, pois não foi observada a formação de brotos a partir dele. Pode-se observar que houve formação de brotos em todos os tratamentos testados, mesmo na ausência de reguladores de crescimento, exceto para o hipocótilo. Entretanto a adição de BAP e ANA ao meio de cultura proporcionou aumento do número de brotos formados por explante (Figura 7). 3 2,4 A 1,8 1,2 0,6 0 0,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 ANA (0,00 µm) ANA (1,34 µm) ANA (2,68 µm) ANA (5,37 µm) BAP (µm) y = 0,0058x 2-0,0317x + 1,4061 R² = 95,35%** 3 B 2,4 1,8 1,2 0,6 0 0,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 BAP (µm) ANA (0,00 µm) y = 0,0041x 2-0,0194x + 1,0758 R² = 68,81%* ANA (1,34 µm) y = 0,0066x 2-0,0185x + 0,9493 R² = 92,58%** ANA (2,68 µm) y = 0,0554x + 0,7777 R² = 98,16%** ANA (5,37 µm) y = 0,0486x + 0,816 R² = 54,66%** Figura 7: Número de brotos obtidos a partir do nó cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) de Erythrina velutina, inoculados em meio de cultura WPM com diferentes concentrações de ANA e BAP. Feira de Santana-BA, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01).

31 Para o número de brotos, a curva de regressão indicou um comportamento quadrático, atingindo o maior valor (2,68 brotos por explante) quando foi adicionado 17,76 µm de BAP ao meio de cultura (Figura 7A e 8A). Esse mesmo resultado foi obtido pelos explantes nó cotiledonar e segmento nodal, entretanto, para esse foi necessária a adição de 1,34 µm de ANA ao meio de cultura (Figura 7B). Nesse caso, sugere-se que nessa concentração o regulador de crescimento ANA estaria estabelecendo um balanço hormonal com as citocininas adicionadas ao meio e com as endógenas do explante. O menor número de brotos (0,88/explante) ocorreu quando se utilizou o nó cotiledonar como explante no meio de cultura WPM acrescido de 8,88 µm de BAP e 5,37 µm de ANA (Figura 7A). Já para o segmento nodal o menor número de brotos (0,56/explante) foi observado na ausência de BAP e no meio contendo 5,37 µm de ANA (Figura 7B). De acordo com Santos et al. (2006) as pequenas variações nas respostas obtidas decorrem, certamente, do balanço hormonal interno de cada planta, bem como do tipo de explante para desenvolver a resposta morfogenética. A adição de reguladores de crescimento em meios de cultura e um balanço adequado entre eles são importantes para desencadear processos organogenéticos em diversas espécies, o mesmo sendo evidenciado para Erythrina velutina. Berrios et al. (1991), trabalhando com quatro espécies de Erythrina (E. berteroana, E. costaricensis, E. fusca e E. peoppigiana) verificaram que a regeneração de brotos a partir do nó cotiledonar ocorreu apenas em E. berteroana e E. costaricensis, quando utilizaram 8,88 ou 17,76 µm de BA independente da adição de AIB no meio de cultura e 4,92 µm de AIB + 35,52 µm de BA para E. berteroana e E. costaricensis, respectivamente, obtendo, entretanto, uma baixa taxa de multiplicação (aproximadamente apenas 1 broto/explante). Os resultados encontrados neste experimento corroboram aqueles observados em diversas espécies lenhosas, como Myracrodruon urundeuva (ANDRADE et al., 2000), Schizolobium amazonicum (CORDEIRO et al., 2004) e Cabralea canjerana (ROCHA et al., 2007) onde também se verificou baixa taxa de multiplicação. Segundo esses autores isso pode ser explicado em parte, pelas características morfogenéticas da própria planta, de possuir caule ereto e uma pequena copa. Entretanto, os resultados aqui reportados referentes ao experimento com E. velutina são inferiores àqueles encontrados para as espécies Prosopis laevigata, Searsia dentata, Sesbania drummondii e Mucuna pruriens onde se observou taxa de multiplicação de 3,37; 6,1; 7,75 e 12,6 brotos/explante, respectivamente (GONZÁLEZ et al. 2007; PRAKASH & STADEN, 2008; CHEEPALA et al., 2004; FAISAL et al., 2006)

32 utilizando o nó cotiledonar ou o segmento nodal em meio de cultura MS suplementado com diferentes concentrações de benziladenina (BA). A formação de calo na base dos explantes (Figuras 8B e 8C) mostrou ser diretamente proporcional à adição de BAP, sendo o tamanho do calo influenciado pelas altas concentrações de BAP e ANA utilizadas (dados não mostrados). Isto se deve, provavelmente, ao desbalanceamento nos níveis de fitormônios contidos nos explantes. Resultado semelhante foi observado por Soares et al. (2007) ao trabalhar com mangabeira (Harconia speciosa), a qual aumentou a calogênese em 90% com o acréscimo de BAP no meio de cultura, até a concentração de 17,76 µm. Segundo Santos (1998), elevadas concentrações de citocininas parecem reagir com a quantidade de auxina endógena do explante, o que leva à formação de calo provocando certa inibição no surgimento dos brotos. A B D C Figura 8: Cultivo in vitro de Erythrina velutina em meio de cultura WPM contendo 17,76 µm de BAP (A). Aspecto visual de calos compactos formados na base do explante (B e C). Formação de raízes adventícias na base do explante (D). Feira de Santana-BA, Nos meios de cultura sem adição de BAP, não ocorreu a formação de calo na base dos explantes, apenas de raízes adventícias (Figura 8D). Esse resultado é corroborado por Berrios et al. (1991), quando cultivaram ápices vegetativos em meio não suplementado com BA,

33 obtiveram tendência uniforme na diferenciação de raízes, sugerindo que o nível endógeno de auxina no gênero Erythrina é alto. Fráguas et al. (2004) também reportaram que na multiplicação in vitro de figueira (Ficus carica L.), ocorreu rizogênese nos tratamentos que não continham cinetina e que houve a formação de calo na base dos explantes nos meios de cultura suplementados com cinetina. Em geral, a rizogênese é induzida pela presença isolada de auxina ou em combinação com uma citocinina em baixa concentração. Para o comprimento da parte aérea, o melhor resultado foi obtido quando se utilizou 2,68 µm de ANA na ausência de BAP, que promoveu crescimento médio de 4,83 cm nos brotos obtidos a partir do nó cotiledonar. Foi observado que a altura da parte aérea diminuiu significativamente dentro de cada concentração de ANA à medida que aumentou a concentração de BAP (Figura 9A). Em relação ao segmento nodal notou-se uma mesma tendência, entretanto, os brotos foram menores em relação aos obtidos a partir do nó cotiledonar, o maior comprimento (2,99 cm) foi observado no meio contendo 1,34 µm de ANA (Figura 9B). Diversos autores citam que o aumento da concentração de citocininas no meio pode provocar a diminuição do comprimento dos brotos (ERIG et al., 2002; NICIOLI et al., 2008; PURKAYASTHA et al., 2008). Grattaplagia & Machado (1998) relatam que a tendência da diminuição do comprimento das brotações a partir de determinadas concentrações de citocinina pode decorrer de um possível efeito fitotóxico deste hormônio. Pasqual (2008) cita que elevadas concentrações de citocininas podem reduzir o tamanho das brotações e estimular a ocorrência de hiperidricidade e formação de folhas anormais. Os resultados apresentados na figura 7 indicam que a presença da citocinina no meio promove um aumento no número de brotações nos explantes nó cotiledonar e segmento nodal, sendo que para esse a presença da auxina no meio contribuiu para esse efeito. Entretanto, observa-se que o aumento das concentrações de citocinina provoca diminuição no tamanho das brotações (Figura 9). Diante desses resultados sugere-se a indução de brotações em meio contendo citocinina e posteriormente a transferência para um meio sem regulador de crescimento ou com ANA para favorecer o alongamento dos brotos.

34 Comprimento da Parte Aérea (cm) Comprimento da Parte Aérea (cm) ,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 A ANA (0,00 µm) ANA (1,34 µm) ANA (2,68 µm) ANA (5,37 µm) BAP (µm) y = ns y = -0,144x + 3,8243 R² = 94,12%** y = 0,0226x 2-0,573x + 4,8445 R² = 99,06%** y = 0,0164x 2-0,4045x + 3,6216 R² = 80,82%** 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 BAP (µm) ANA (0,00 µm) y = -0,0748x + 2,108 R² = 86,22%** ANA (1,34 µm) y = 0,0061x 2-0,1921x + 2,6182 R² = 57,72%* ANA (2,68 µm) y = 0,0072x 2-0,1903x + 2,3517 R² = 81,7%* ANA (5,37 µm) y = 0,0068x 2-0,1331x + 1,663 R² = 71,24% B Figura 9: Comprimento da parte aérea (cm) de brotos obtidos do nó cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) de Erythrina velutina, inoculados em meio de cultura WPM com diferentes concentrações de ANA e BAP. Feira de Santana-BA, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01). Em relação ao número de folhas por planta ajustou-se um modelo matemático quadrático, sendo o maior NF (10,12) alcançado quando se utilizou 4,44 µm de BAP e 1,34 µm de ANA no meio de cultura WPM, utilizando o nó cotiledonar como explante. A partir desse ponto verificou-se uma diminuição no número de folhas, que pode ter sido causado por um efeito fitotóxico do regulador de crescimento BAP (Figura 10A). Já quando se utilizou o

35 Nº de Folhas Nº de Folhas segmento nodal como explante, observou-se um efeito linear crescente e um menor número de folhas por explante (9,4) quando comparado ao nó cotiledonar, no meio suplementado com 17,76 µm de BAP e 1,34 µm de ANA (Figura 10B). 12 A ,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 ANA (0,00 µm) ANA (1,34 µm) ANA (2,68 µm) ANA (5,37 µm) BAP (µm) y = -0,0213x 2 + 0,6183x + 3,8946 R² = 59,16%* y = -0,0413x 2 + 0,8701x + 5,0548 R² = 53,99** ,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 BAP (µm) B ANA (0,00 µm) y = 0,205x + 1,955 R² = 69,45** ANA (1,34 µm) y = 0,427x + 1,2993 R² = 90,72%** ANA (2,68 µm) y = 0,3509x + 1,163 R² = 92,94%** ANA (5,37 µm) y = 0,1203x + 1,9323 R² = 66,62%** Figura 10: Número médio de folhas formadas em plantas de Erythrina velutina, a partir do nó cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) mantidas in vitro por 30 dias sob diferentes concentrações de ANA e BAP em meio de cultura WPM. Feira de Santana, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01).

36 Em uvaieira (Eugenia pyriformis Cambess), utilizando segmentos caulinares, obtevese o maior número de folhas (13,7) no meio de cultura WPM suplementado com 4,44 µm de BAP (NASCIMENTO, 2006). A matéria fresca da parte aérea atingiu o valor máximo (429,12 mg) quando se utilizou o nó cotiledonar como explante e 4,44 µm de BAP e 1,34 µm de ANA. A partir desse ponto, o regulador de crescimento BAP passou a inibir o desenvolvimento das brotações in vitro, apresentando um decréscimo na matéria fresca (Figura 11A). Resultado semelhante foi obtido na micropropagação de amoreira-preta (Rubus spp.), onde a maior matéria fresca da parte aérea (797,0 mg) foi alcançado até 8,88 µm de BAP, sendo que a partir desse ponto observouse uma diminuição na matéria fresca (VILLA et al., 2006). Ainda segundo esses autores o excesso de reguladores de crescimento pode dificultar o desenvolvimento da parte aérea. Ao utilizar o segmento nodal como explante observou-se que não houve efeito significativo da interação BAP e ANA para essa variável. Em relação à matéria seca da parte aérea, a interação BAP x ANA x Explante foi altamente significativa (P 0,01) apenas para o explante nó cotiledonar. A curva de regressão apresentou um efeito quadrático, atingindo o maior valor (35,56 mg) no meio de cultura WPM suplementado com 2,68 µm de ANA na ausência de BAP (Figura 11B). Observa-se pelo modelo matemático que houve diminuição do peso seco à medida que aumentou a concentração de BAP no meio. Esse resultado difere do obtido por Bonilla, et al. (2007) que obtiveram um efeito linear positivo sobre o peso da matéria seca dos brotos de Rudgea viburnoides à medida que aumentou a concentração de BAP no meio de cultura. Segundo Torres et al. (1998) o uso de citocininas estimula maior produção de parte aérea através do aumento da massa fresca, número de gemas e folhas, porém o contrário é obtido com a utilização de concentrações mais elevadas, acima da ótima para a multiplicação da espécie em estudo. Em mulungu, a presença de BAP no meio de cultura mostrou-se indispensável para a proliferação de brotos, pois à medida que aumentou a sua concentração no meio, aumentou o número de brotos formados até a máxima concentração (17,76 µm). Desse modo, esses resultados indicam que é necessário testar outras citocininas, ou até mesmo concentrações maiores de BAP para verificar até quanto o balanço hormonal interno não será afetado a ponto de reduzir o número de brotos formados. Por outro lado, a adição de citocininas não é necessária para promover o alongamento da parte aérea.

37 Matéria Seca da Parte Aérea (mg) Matéria Fresca da Parte Aérea (mg) ,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 BAP (µm) ANA (0,00 µm) y = -0,7312x ,753x + 249,53 R² = 61,33%** ANA (1,34 µm) y = -1,0448x 2 + 8,9053x + 386,08 R² = 94,28%** ANA (2,68 µm) y = 1,2591x 2-33,787x + 433,39 R² = 87,81%** ANA (5,37 µm) A ,00 2,22 4,44 6,66 8,88 11,10 13,32 15,54 17,76 BAP (µm) ANA (0,00 µm) y = ns ANA (1,34 µm) y = 0,052x 2-2,1187x + 35,668 R² = 68,8%* ANA (2,68 µm) y = 0,1194x 2-3,2826x + 37,29 R² = 95,79%** ANA (5,37 µm) y = ns B Figura 11: Matéria fresca (A) e seca (B) da parte aérea (mg) de plantas de Erythrina velutina obtidas do nó cotiledonar, mantidas in vitro por 30 dias com diferentes concentrações de BAP e ANA no meio de cultura WPM. Feira de Santana, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01) Efeito do hipocótilo e epicótilo como fontes de explantes e de diferentes concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de Erythrina velutina

38 Embora este experimento tenha sido conduzido com o objetivo de induzir brotações, a presença de brotos não foi observada em tratamento algum. Esse resultado difere do obtido por Yang. et al. (2006) que obtiveram 1,48 brotos/explante a partir de epicótilo de Fortunella crassifolia em meio MS acrescido de 22,2 µm de BAP. Santana (2003) também obteve formação de brotações adventícias em segmentos de hipocótilo e epicótilo de Annona squamosa em meio WPM suplementado com 8,88 µm de BAP independente da posição do explante no meio. Sousa et al. (2007) verificaram que a combinação de 4,44 µm de BAP e 2,85 µm de AIA foi a que proporcionou a melhor resposta organogênica dos explantes de mangabeira (Hancornia speciosa), independente da posição do segmento internodal. Esses autores comentam que apesar de muitos explantes formarem gemas, necessariamente nem todas as gemas se desenvolvem em brotos. Neste experimento verificou-se a formação de raízes em segmentos de hipocótilo e epicótilo nos meios contendo apenas ANA (Figura 12A), enquanto que a formação de calo em ambas as extremidades dos explantes foi observada nos meios contendo apenas o regulador de crescimento BAP e BAP combinado com ANA (Figura 12B). Em relação ao hipocótilo observou-se que 100% dos explantes desenvolveram calo. Já no epicótilo houve uma formação um pouco menor de calo a depender do tratamento (Tabela 2). O tamanho dos calos variou a depender do tipo de explante utilizado e da concentração dos reguladores de crescimento utilizada. Essa variação também foi reportada por Rajeswari e Paliwal (2008) em calos obtidos em segmentos de epicótilo, pecíolo e cotilédone de Albizia odoratissima L.f. (Benth.) em meio MS contendo diversas combinações de BAP e ANA. A B Figura 12: Formação de raízes (A) e calo (B) em segmentos de hipocótilo de Erythrina velutina Willd. em meio de cultura WPM. Feira de Santana BA, 2008.

39 Tabela 2: Porcentagem (%) de calos (C) e raízes (R) em segmentos de hipocótilo e epicótilo de Erythrina velutina obtida em meio de cultura WPM acrescido de combinações de BAP e ANA após 30 dias. Feira de Santana-BA, BAP (µm) Tipo de 0,0 2,22 4,44 6,66 8,88 17,76 explante C R C R C R C R C R C R ANA (0,0 µm) Hipocótilo Epicótilo ANA (1,34 µm) Hipocótilo Epicótilo ANA (2,68 µm) Hipocótilo Epicótilo ANA (5,37 µm) Hipocótilo Epicótilo Santana (2003) relata que o sinergismo entre auxinas e citocininas é crítico para o controle da morfogênese in vitro. Concentrações excessivas de auxinas podem inibir a multiplicação ou favorecer demasiadamente o enraizamento ou a formação de calo em detrimento da multiplicação (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Durante o processo de organogênese in vitro os tecidos vegetais possuem a capacidade de responder a determinados estímulos hormonais e quando isso ocorre os tecidos são denominados competentes. Entretanto, muitas vezes ocorre uma falha na aquisição da competência e o tecido não responde ao estímulo hormonal e conseqüentemente não forma órgãos, isso pode acontecer devido ao próprio metabolismo hormonal do tecido. Desse modo, explantes com alta atividade de citocinina oxidase, enzima que degrada citocininas, podem não chegar a um balanço auxina/citocinina endógeno indutor da formação de gemas, mesmo que sejam adicionadas elevadas concentrações de citocininas ao meio de cultura (PERES, 2002). Outro problema relacionado à falta de resposta nesse tipo de tecido pode ter sido a ausência de células meristemáticas.

40 4.1.3 Efeito de diferentes tipos de explantes e concentrações de TDZ na propagação in vitro de Erythrina velutina Observou-se efeito altamente significativo (P 0,01) da interação dupla TDZ x Tipos de explantes para todas as variáveis analisadas, exceto para o comprimento da parte aérea (CPA). Verificou-se também efeito altamente significativo (P 0,01) do tipo de explante sobre comprimento da parte aérea (Tabela 3). Tabela 3: Resumo da análise de variância para número de brotações (NB), número de folhas (NF), comprimento da parte aérea (CPA), matéria seca (MS) e matéria fresca (MF) da parte aérea na multiplicação in vitro de Erythrina velutina a partir de diferentes explantes submetida a diferentes concentrações de TDZ após 30 dias de inoculação in vitro. Feira de Santana, Quadrados Médios FV GL NB z NF z CPA z MS z MF z TDZ 3 1,22** 12,31** 0,40ns 20184,40** 91,48** EXPLANTE 3 10,60** 69,26** 12,62** ,44** 22,17** TDZ x EXPLANTE 9 0,46** 4,61** 0,15ns 9757,00** 37,04** Resíduo 64 0,08 0,73 0, ,94 13,25 CV (%) 7,86 15,16 10,90 28,11 22,43 ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F, z Dados transformados em (x+1) 0, 5, ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. Em relação ao número de brotos, o nó cotiledonar apresentou o melhor resultado, obtendo-se em média 2,16 brotos/explante no meio contendo 4,52 µm de TDZ. Nessa mesma concentração também se obteve o maior número de brotos por explante a partir do segmento nodal (média de 1,40 brotos/explante) (Figura 13). O menor número de brotos para esses dois explantes, 0,84 e 0,36, respectivamente, foi obtido na ausência do regulador de crescimento. Observa-se, na equação de regressão, que o número de brotos obtidos por organogênese direta apresentou uma tendência linear crescente proporcional ao aumento da concentração do TDZ (Figura 14A) Em relação ao número de folhas observou-se a mesma tendência da variável anterior. As brotações obtidas a partir do nó cotiledonar apresentaram em média 6,28 folhas por explante, enquanto que a partir do segmento nodal esse número foi praticamente reduzido à metade, obtendo-se em média 3,56 folhas/explante no meio de cultura WPM contendo 4,52

41 µm de TDZ. A equação de regressão também mostrou um comportamento linear positivo à medida que aumentou a concentração do regulador. (Figura 14B). Figura 13: Brotos de Erythrina velutina com 30 dias de idade obtidos do nó cotiledonar (A) e do segmento nodal (B) em meio de cultura WPM contendo 4,52 µm de TDZ. Feira de Santana-BA, Thidiazuron (TDZ), um potente regulador de crescimento, é considerado mais ativo do que BAP e tem sido recomendado para a micropropagação de várias espécies, especialmente lenhosas (LU, 1993). Entretanto, os resultados desse experimento não confirmam uma maior eficiência do TDZ em relação ao BAP na indução de brotações nos explantes de E. velutina Willd. Sendo esse resultado também observado em Mandevilla velutina (Mart.) Woodson quando segmentos nodais foram submetidos ao meio de cultura MS suplementado com TDZ. O maior número de brotos (1,53/explante) foi obtido quando se utilizou 0,44 µm de BA (BIONDO et al., 2007). A taxa de multiplicação obtida nesse experimento foi abaixo do esperado, sendo o número total de brotos menor do que o obtido no experimento com BAP. Sugere-se, portanto a utilização de concentrações maiores de TDZ para testar sua eficiência na multiplicação in

42 vitro de Erythrina velutina Willd. Entretanto, deve-se ressaltar o alto custo do TDZ quando comparado ao BAP, sendo necessário, portanto, um estudo econômico para saber o custobenefício dessas substâncias na multiplicação in vitro dessa espécie. Graça et al. (2001) comparando o efeito de BAP e TDZ na multiplicação in vitro de Eucalyptus dunnii Maid. verificaram que em todas as concentrações testadas (1,0; 5,0; 10,0 µm) o regulador de crescimento BAP promoveu uma maior proliferação de brotos quando comparando com o TDZ, obtendo-se aproximadamente 3,5 e 1,3 brotos por explante respectivamente no meio contendo 1,0 µm. Segundo os autores, além de uma menor proliferação no meio suplementado com TDZ, as brotações apresentaram-se pouco desenvolvidas e atrofiadas e com excessiva calosidade, o mesmo não sendo observado em E. velutina. Em relação às matérias fresca e seca da parte aérea, observou-se um comportamento quadrático para o explante nó cotiledonar, sendo os valores máximos (382,2 mg e 30,28 mg) atingidos quando se utilizou a maior concentração do TDZ. Para o explante segmento nodal, os maiores valores (110,64 mg e 9,96 mg) também foram atingidos quando se utilizou 4,52 µm de TDZ no meio de cultura WPM, podendo ser visto no gráfico uma tendência linear crescente (Figura 14C e D). Para o comprimento da parte aérea, observou-se que este não foi influenciado pelo TDZ, apenas o tipo de explante interferiu significativamente nessa variável. A maior brotação foi obtida quando se utilizou o nó cotiledonar como explante, obtendo-se em média um comprimento de 1,65 cm (Tabela 4). A formação de calo na base dos explantes foi observada e verificou-se que na maior concentração de TDZ obteve-se a maior porcentagem de explantes com calo, valores iguais ou superiores a 80% (Figura 15) (Tabela 5). Nenhuma das condições de cultura testadas induziu a formação de brotações nos explantes hipocótilo e epicótilo, indicando que a utilização desses dois tipos de explantes é inviável para essa espécie nas condições testadas. De acordo com Peres (2002), quando um explante falha em desenvolver organogênese in vitro, essa falha normalmente se dá na etapa de aquisição de competência. Porém, pouco se conhece, até o momento, sobre os mecanismos envolvidos na aquisição de competência para organogênese (KERBAUY, 1999). Segundo Cary et al. (2001), no processo de organogênese, a competência seria entendida como a capacidade de responder ao estímulo hormonal necessário à indução de

43 Matéria Fresca da Parte Aérea (mg) Matéria Seca da Parte Aérea (mg) Nº de Brotos Número de Folhas formação do órgão. A falta de competência de um tecido poderia refletir, portanto, a falta de receptores para a classe hormonal que irá induzir o processo organogenético. 2,5 2 A B 1, , ,00 1,13 2,26 3,39 4,52 TDZ (µm) Nó Cotiledonar y = 0,2646x + 0,9847 R² = 90,62%** Seg. Nodal y = 0,1901x + 0,4327 R² = 58,59%** 0 0,00 1,13 2,26 3,39 4,52 TDZ (µm) Nó Cotiledonar y = 0,9065x + 2,1305 R² = 90,21%** Seg. Nodal y = 0,5977x + 0,4736 R² = 74,53%** ,00 1,13 2,26 3,39 4,52 TDZ (µm) Nó Cotiledonar Seg. Nodal y = 8,2139x 2 + 6,3794x + 182,32 R² = 94,4%* y = 14,236x + 33,541 R² = 57,35%** C ,00 1,13 2,26 3,39 4,52 TDZ (µm) Nó Cotiledonar y = 0,7487x 2-1,064x + 19,341 R² = 86,38%* Seg. Nodal D Figura 14: Valores médios para o número de brotos (A), número de folhas, matéria fresca (C) e seca (D) da parte aérea de plantas de Erythrina velutina mantidas in vitro por 30 dias em meio de cultura WPM acrescido de TDZ. Feira de Santana, * significativo (P 0,05); ** altamente significativo (P 0,01).

44 Tabela 4: Comprimento da parte aérea (cm) de brotos de obtidos a partir de diferentes tipos de explantes de Erythrina velutina, mantidos in vitro por 30 dias. Feira de Santana BA, EXPLANTE COMPRIMENTO DA PARTE AÉREA (cm) Hipocótilo - Nó Cotiledonar 1,65 a Epicótilo - Seg. Nodal 0,83 b Mesma letra na coluna não difere estatisticamente (P 0,05) pelo teste de Scott-Knott. A B C D Figura 15: Formação de calo na base dos explantes de Erythrina velutina com 30 dias de idade obtidos do hipocótilo (A), epicótilo (B), nó cotiledonar (C) e do segmento nodal (D) em meio de cultura WPM contendo 4,52 µm de TDZ. Feira de Santana-BA, Tabela 5: Porcentagem (%) de calos formados na base dos explantes de Erythrina velutina submetidos a diferentes concentrações de TDZ após 30 dias. Feira de Santana- BA, TDZ (µm) Explante 0,00 1,13 2,26 4,52 Hipocótilo Nó Cotiledonar Epicótilo Seg. Nodal

45 4.1.4 Efeito de diferentes concentrações de BAP e ANA na propagação in vitro de Erythrina velutina utilizando cotilédone e folha com pecíolo como explantes As folhas de Erythrina velutina utilizadas nesse experimento apresentaram incapacidade para a produção de brotações adventícias e trinta dias após a inoculação os explantes estavam amarelados (dados não mostrados), com calo ou raiz no pecíolo (Figura 16A, B e C). Esse resultado difere do encontrado por Santana (2003) que obteve formação de brotações adventícias em folhas cotiledonares de Annona squamosa em meio de cultura WPM acrescido de diferentes combinações de BAP e ANA, sendo consideradas excelentes fontes de explantes para a micropropagação dessa espécie. A B C D E F Figura 16: Aspecto da indução de brotações adventícias em folhas e cotilédones de Erythrina velutina inoculados em meio WPM acrescido de BAP e ANA após 30 dias. Calo (A), raiz (B) e amarelecimento nas folhas. Formação de brotos diretamente do cotilédone (D), calo (E) e raiz (F) no cotilédone. Feira de Santana BA, 2008.

46 Em muitas espécies os cotilédones expandidos de plântulas produzem mais brotos adventícios que todo o embrião, hipocótilo, ou qualquer outro tecido da plântula, sendo considerados como o melhor explante (GEORGE, 1993). Nesse trabalho, verifica-se que em E. velutina houve a formação de brotos diretamente do cotilédone, embora numa porcentagem muito baixa (10% do total de 20 explantes) apenas no de meio de cultura WPM acrescido de 17,76 µm de BAP e 5,37 µm de ANA (Figura 16D). Nos demais tratamentos ocorreram formação de calo e raízes, a depender da combinação dos reguladores de crescimento utilizada (Tabela 6) (Figura 16E e F). Resultados semelhantes foram encontrados por Marinucci et al. (2004) que reportaram que houve formação de calos compactos nos cotilédones de Erythrina crista-galli em meio MS suplementado com cinetina e 2,4-D, entretanto, não foi observado a formação de brotações adventícias em tratamento algum. Tabela 6: Efeito da interação BAP e ANA sobre a porcentagem de calos (C), porcentagem de brotações (B) e porcentagem de raízes (R), a partir de folhas e cotilédones de Erythrina velutina Willd. Feira de Santana BA, BAP (µm) Tipo de 0,00 2,22 4,44 6,66 8,88 17,76 explante C B R C B R C B R C B R C B R C B R ANA (0,00 µm) Folha Cotilédone ANA (1,34 µm) Folha Cotilédone ANA (2,68 µm) Folha Cotilédone ANA (5,37 µm) Folha Cotilédone Efeito do nitrato de prata (AgNO 3 ) e de BAP na multiplicação in vitro de E. velutina Observou-se efeito significativo (P 0,05) das concentrações de AgNO 3 utilizadas sobre as variáveis número de brotos e comprimento da parte aérea e efeito altamente

47 significativo (P 0,01) sobre as variáveis matéria fresca e seca da parte aérea. Não foi observado efeito significativo (P 0,05) da interação BAP x AgNO 3 para as variáveis analisadas (Tabela 7). Tabela 7: Resumo da análise de variância para número de brotos (NB), comprimento da parte aérea (CPA), matéria fresca (MF) e matéria seca (MS) da parte aérea na multiplicação in vitro de Erythrina velutina submetida a nitrato de prata (AgNO 3 ) e BAP utilizando o nó cotiledonar como explante após 30 dias de inoculação in vitro. Feira de Santana BA, Quadrados Médios FV GL NB z CPA z MF z MS z AgNO3 4 0,55* 1,16* 12548,28** 82,58** BAP*AgNO 3 3 0,09 ns 0,37 ns 4645,34 ns 16,57 ns Resíduo 28 0,18 0, ,28 17,43 CV (%) 9,32 10,48 13,21 12,31 ** Significativo ao nível de 1% de probabilidade pelo teste F, z Dados transformados em (x+1) 0,5, ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F. Embora tenha sido utilizado com o objetivo de otimizar a multiplicação in vitro da E. velutina, o nitrato de prata quando suplementado sozinho ao meio de cultura não estimulou uma maior taxa de multiplicação no explante nó cotiledonar quando comparado com o número de brotos (2,68 por explante) obtidos no experimento O maior número de brotos obtidos (1,57 por explante) foi alcançado quando se utilizou 10,0 µm de AgNO 3 no meio de cultura WPM (Figura 17). A partir desse ponto observou-se na curva de regressão que o número de brotos diminuiu. Entretanto, o menor número de brotos foi obtido no meio de cultura WPM básico (sem adição de regulador de crescimento nem de AgNO 3 ) (Figura 18A). Resultado semelhante ao obtido neste trabalho foi reportado por Ozden-Tokatli et al. (2005) quando avaliaram a resposta de segmentos nodais de Pistacia vera L. cv. Kirmizi ao nitrato de prata e verificaram que a presença de 48,0 µm de nitrato de prata, quando suplementado sozinho no meio de cultura, aumentou a freqüência de múltiplas brotações (superior a 83,3%), quando comparado com o experimento controle (meio de cultura MS sem AgNO 3 ). Comparando a influência de citocininas, GA 3, e AgNO 3 na regeneração e na formação de brotações, esses autores reportaram que a inclusão de AgNO 3 no meio contendo BA aumentou significativamente a taxa de regeneração de brotos, sendo a maior taxa (100%)

48 obtida quando o meio foi suplementado com 9,0 µm de BA, 0,2 µm de GA 3 e 24,0 ou 48,0 µm de AgNO 3 em combinação. Por outro lado, a influência do nitrato de prata no meio de cultura suplementado com cinetina não teve efeito positivo na regeneração de brotos de Pistacia vera L. cv. Kirmizi. Figura 17: Cultivo in vitro de Erythrina velutina em meio de cultura WPM suplementado com 10,0 µm de AgNO 3. Feira de Santana BA, O nitrato de prata tem sido utilizado para aumentar a taxa de regeneração de plantas a partir da cultura de tecidos de várias espécies (PALMER, 1992; NAIK & CHAND, 2003; OZDEN-TOKATLI et al., 2005; AKASAKA-KENNEDY et al., 2005; MICELI et al., 2008). Em Renealmia mexicana (Klotzsch ex. Petersen) a adição de 11,7 µm de AgNO 3 ao meio de cultura MS suplementado com 4,4 µm de BA e 2,5 µm de AIB promoveu a indução de 3,2 vezes mais brotos do que o meio controle (4,4 µm de BA e 0,5 µm de AIB, sem AgNO 3 ) (MICELI, et al., 2008). Mesmo resultado foi obtido por Naik e Chand (2003) trabalhando com Punica granatum, quando adicionaram 20,0 µm de nitrato de prata ao meio de regeneração (MS + 8,9 µm de BA + 5,4 µm de ANA) obtiveram um aumento significativo tanto na porcentagem de regeneração dos brotos (57%) quanto no número de brotos por explante (5,3). Em angico (Anadenanthera colubrina), ao utilizar o AgNO 3 para o controle da abscisão foliar, obteve-se também um efeito positivo na formação de brotações, sendo o maior número de brotos (2,08) obtido na concentração 5,0 µm (NEPOMUCENO et al., 2007). A maioria dos trabalhos relaciona o efeito do nitrato de prata sobre a porcentagem de regeneração e o número de brotos obtidos por explante. Entretanto, no estudo da propagação in vitro da E. velutina foram avaliadas outras variáveis para tornar ainda mais evidente o

49 Matéria Fresca da Parte Aérea (mg) Matéria Seca da Parte Aérea (mg) Nº de Brotos Comprimento da Parte Aérea (cm) efeito do AgNO 3 no cultivo in vitro. Em relação ao comprimento da parte aérea, a presença do nitrato de prata teve um efeito linear decrescente. O maior comprimento (1,94 cm) foi obtido na concentração 20,0 µm, sendo observada uma baixa correlação (67,32%) entre as concentrações de nitrato de prata utilizadas e o comprimento da parte aérea (Figura 18B). Quando comparado aos resultados do primeiro experimento (4.1.1) verifica-se que o maior comprimento dos brotos obtidos nesse experimento foi cerca de 2 vezes menor. 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 AgNO 3 (µm) y = -0,0016x 2 + 0,0655x + 0,9408 R² = 78,85%** A 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 AgNO 3 (µm) y = -0,0199x + 2,0158 R² = 67,41%** B C D ,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 AgNO 3 (µm) 0 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 AgNO 3 (µm) y = -0,2664x ,268x + 140,26 R² = 85,84%** y = -0,1701x + 18,784 R² = 66,99%** Figura 18: Média do número de brotos (A), do comprimento da parte aérea (cm) (B), da matéria fresca (C) e matéria seca (D) da parte aérea (mg) de Erythrina velutina obtidos do nó cotiledonar cultivado em meio de cultura WPM suplementado com nitrato de prata. Feira de Santana BA, ** altamente significativo (P 0,01).

50 Para a matéria fresca da parte aérea, a curva de regressão mostrou um efeito quadrático, sendo o maior peso alcançado (224,24 mg) quando o meio de cultura WPM foi suplementado com 10,0 µm de AgNO 3, verificando um decréscimo a partir desse ponto (Figura 18C). Em relação a essa variável observou-se uma alta correlação (99,86%) com o nitrato de prata. Para a variável matéria seca da parte aérea, observou-se um efeito linear decrescente à medida que aumentou a concentração do nitrato de prata no meio de cultura, sendo a maior média (18,42 mg) obtida na concentração 20,0 µm de AgNO 3, sendo observado também uma baixa correlação (67,01%) entre essa variável e o nitrato de prata (Figura 18D). 4.2 ENRAIZAMENTO IN VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DE Erythrina velutina Em relação ao enraizamento in vitro das brotações de E. velutina, pode-se observar que não houve diferença significativa (P 0,05) para as variáveis número de raízes e comprimento da maior raiz na presença de diferentes concentrações de AIB (Tabela 8). Tabela 8: Resumo da análise de variância para o número de raízes (NR) e o comprimento da maior raiz (CMR) de brotações de Erythrina velutina aos 30 dias de cultivo. Feira de Santana BA, Quadrados Médios FV GL NR z CMR z AIB 3 0,86 ns 1,31 ns Resíduo 20 0,84 6,09 CV (%) 17,86 21,79 z Dados transformados em (x+1) 0,5, ns Não significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F Ocorreu enraizamento dos brotos em todos os tratamentos, independentemente da concentração de AIB utilizada, entretanto, o maior percentual de brotos enraizados (75%) ocorreu no meio de cultura WPM acrescido de 2,46 µm de AIB (Figura 19). Vários autores descrevem a importância da utilização de auxinas no enraizamento in vitro de espécies (AUGUSTO, et al., 2006). O que se pode constatar é que não houve necessidade da adição do regulador de crescimento AIB para o enraizamento de E. velutina. Essa ocorrência provavelmente, se deve à facilidade de enraizamento da espécie.

51 Resultados semelhantes ao encontrado no presente trabalho, foram reportados por Park et al. (2008) que observaram enraizamento de brotos de Salix pseudolasiogyne em meio de cultura WPM sem a presença reguladores de crescimento. Em Arbus unedo L. os brotos também foram capazes de enraizar em todas as condições testadas, até mesmo na ausência de auxinas, entretanto altas freqüências de indução de raízes (entre 76,7% e 93,3%) foram alcançadas com a adição de 25,0 µm de AIB no meio de enraizamento por seis dias (GOMES & CANHOTO, 2008). Carvalho et al. (2005) também verificaram que o maior número de brotações enraizadas de urucum (Bixa orellana L.) ocorreu no meio ½ MS suplementado com 5,0 µm de AIB. A rizogênese é considerada uma fase crítica na regeneração de plantas in vitro, pois determina a sobrevivência das mesmas durante a aclimatização. Dentre os fatores determinantes na indução e na formação de raízes in vitro, destacam-se o genótipo e as auxinas. Para o enraizamento dessa espécie constatou-se que não é necessário suplementar o meio de cultura WPM com auxina. Este resultado pode representar uma grande vantagem econômica, pois reflete na imediata redução dos custos com a eliminação do uso de reguladores na fase de enraizamento in vitro. Figura 19: Planta enraizada em meio de cultura WPM suplementado com 2,46 µm de AIB. Feira de Santana BA, 2008.

52 A aclimatização é uma das fases mais críticas do processo de micropropagação, pois geralmente grande parte das mudas não sobrevive quando transferidas da condição in vitro para a ex vitro. Entretanto, para essa espécie, verificou-se que após 21 dias na casa-devegetação, do total de mudas transplantadas, aproximadamente 85% sobreviveram sendo esse percentual mantido aos 51 dias. (Figura 20). A B Figura 20: Mudas de Erythrina velutina após 21 (A) e 51 (B) dias na casa-de-vegetação. Feira de Santana BA, CONCLUSÃO Os resultados obtidos nas diferentes etapas desse estudo, relacionados à micropropagação da espécie E. velutina Willd., permitem as seguintes conclusões: a) A propagação clonal in vitro é possível utilizando-se explantes juvenis provenientes de plântulas cultivadas assepticamente em meio de cultura WPM. b) Um maior número de brotações pode ser obtida em meio de cultura WPM acrescido de 17,76 µm de BAP utilizando o nó cotiledonar ou o segmento nodal como explantes. c) A utilização de TDZ nas concentrações testadas não induziu aumento do número de brotos por explante de Erythrina velutina. d) Os explantes hipocótilo, epicótilo e folha não foram responsivos aos reguladores de crescimento utilizados nesse trabalho.

53 e) A utilização de nitrato de prata e BAP no meio de cultura WPM não apresentaram um efeito sinergístico sobre as variáveis analisadas. A utilização de nitrato de prata sozinho não aumentou a taxa de multiplicação de E. velutina em relação ao obtido com o BAP. f) Para o enraizamento de brotos de mulungu não é necessária a adição de AIB no meio de cultura WPM. g) A aclimatização pode ser feita em casa-de-vegetação utilizando garrafas pet para controle da umidade relativa e areia lavada e terra vegetal como substrato. Com a realização deste trabalho foi possível obter um protocolo de propagação in vitro da Erythrina velutina, indicando possibilidades viáveis e concretas que poderão servir de base para futuros trabalhos com esta espécie (Figura21). Entretanto, sugere-se que a etapa da multiplicação in vitro seja otimizada a fim de se obter um maior número de brotos por explantes. Figura 21: Propagação in vitro de Erythrina velutina Willd.