INFLUÊNCIA DOS ÁCIDOS TÂNICO E GÁLICO NA ESTABILIDADE DE BETACIANINAS DO EXTRATO BRUTO DE BETERRABA VERMELHA (Beta vulgaris L.)*

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1 INFLUÊNCIA DOS ÁCIDOS TÂNICO E GÁLICO NA ESTABILIDADE DE BETACIANINAS DO EXTRATO BRUTO DE BETERRABA VERMELHA (Beta vulgaris L.)* Deisy Alessandra DRUNKLER ** Leila Denise FALCÃO *** Marilde Terezinha BORDIGNON-LUIZ **** RESUMO: O uso dos corantes naturais na indústria alimentícia é limitado em função de sua baixa estabilidade frente às condições de preparação, processamento e estocagem. Técnicas de estabilização de corantes naturais, tais como a copigmentação, vem encontrando destaque em pesquisas científicas. As betacianinas (coloração vermelha violeta), pertencentes ao grupo de pigmentos naturais denominados betalaínas, são as que predominam na beterraba vermelha (Beta vulgaris L.), sendo utilizadas como corante em alimentos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a estabilidade de betacianinas em extrato de beterraba (Beta vulgaris L.) etanólico a 70% adicionadas dos ácidos orgânicos tânico e gálico, nas concentrações de 0,462g/100mL e 0,925g/100mL, nos valores de ph de 5,00 0,05 e 6,80 0,05, temperatura de 25,0 1,0ºC, ausência de luz e em presença de oxigênio. Os resultados revelaram que o valor de ph e a adição dos ácidos orgânicos influenciaram significativamente (p<0,05) na estabilidade das betacianinas. O ácido tânico e o ácido gálico promoveram aumento significativo da estabilidade da cor do pigmento betacianina em ph de 5,00 0,05 sendo que o ácido tânico apresentou maior efeito protetor. PALAVRAS-CHAVE: Betacianinas; beterraba vermelha (Beta vulgaris L.); ácido tânico; ácido gálico; estabilidade. Introdução A qualidade de um alimento, além do aspecto microbiológico, é geralmente baseada na cor, flavor, textura e no valor nutricional. Dentre estes fatores, um dos mais importantes atributos sensoriais de um alimento é a cor 35. Assim, admite-se que a aceitação comercial de um alimento pelo consumidor é dependente da qualidade e quantidade dos pigmentos presentes 26. Na indústria de alimentos, corantes artificiais são amplamente utilizados por apresentarem alta estabilidade e poder tintorial. Entretanto, ações legislativas que freqüentemente proíbem o uso de destes corantes como aditivos em alimentos, bem como, a exigência do consumidor quanto à qualidade dos alimentos, têm aumentado o interesse no desenvolvimento de corantes de fontes naturais visando a substituição dos artificiais 34. Betalaínas são pigmentos naturais de importância quimiotaxonômica significativa, tipicamente associados com plantas da ordem Cariofilales, responsáveis pela coloração da beterraba vermelha e incluem duas classes de pigmentos: as betacianinas vermelhas e as betaxantinas amarelas 3. As betacianinas compreendem 80-90% das betalaínas da beterraba vermelha. Todas as betacianinas são glicosiladas e derivam das agliconas betanidina e isobetanidina (epímero do C-15 da betanidina) 20. Dentre as betacianinas, a betanina e o seu diastereoisômero, isobetanina, são os pigmentos que apresentam a maior percentagem (75-95 %) na beterraba vermelha e se destacam como corante em alimentos 3, 25 ; os demais pigmentos são representados por prebetanina e isoprebetanina, os quais contêm um grupo fosfato com carga negativa na posição 6 da molécula de glicose 26. O fato de a beterraba vermelha ter uma alta capacidade de cultivo e baixo custo de processamento e término do produto final em relação aos demais corantes naturais 9, bem como seus pigmentos serem destituídos de toxicidade aguda e atividade mutagênica 6, 41 e possuírem atividade antioxidante reconhecida 38, 39 justifica a sua utilização. No entanto, seu uso em alimentos é limitado devido à baixa estabilidade da cor, que é dependente de fatores como ph, temperatura, presença ou ausência de oxigênio e de luz, atividade de água, entre outros 11, 31, 32. A degradação térmica das betalaínas segue uma reação cinética de primeira ordem e é dependente do ph 14. A pesquisa sobre técnicas de estabilização de corantes naturais é de grande relevância, pois busca melhorar sua estabilidade ampliando seu uso e, conseqüentemente, diminuindo seu custo 28. A copigmentação é amplamente estudada visando aumentar a estabilidade de corantes naturais, principalmente de antocianinas 42 ; estudos têm *Este trabalho é parte da dissertação de Mestrado submetida por Drunkler, D.A. ao programa de Pós Graduação em Ciências dos Alimentos - CAL/CCA/UFSC **Mestre em Ciência dos Alimentos-CAL/CCA/UFSC. Profa. UNIOSTE/Cascavel-PR. ***Doutoranda em Ciência dos Alimentos CAL/CCA/UFSC ****Profa. Dra. do Programa de Pós-Graduação em Ciências dos Alimentos - CAL/CCA/UFSC 43

2 demonstrado a ocorrência deste fenômeno também para betacianinas 15, 16, 36. Esta reação pode ocorrer intra ou intermolecularmente 26 e, a estabilidade de cor aumenta devido à interação dos pigmentos com substâncias incolores (copigmentos), tais como flavonóides, alcalóides, ácidos orgânicos, entre outros 14. A copigmentação é evidenciada por um aumento nos valores de absorvância (efeito hipercrômico) bem como um deslocamento batocrômico, geralmente entre 5 e 20 nm ou mais, no comprimento de onda de máxima absorção do pigmento que é conferido por certos copigmentos 23, 29. Em estudos realizados por Heuer et al. 21 com Bunganville glabra foram encontrados flavonóis campeferol e quercetina com traços de isoramnetina, na razão 1:1 flavonóis:betacianinas, sugerindo a copigmentação intermolecular entre flavonóis e betacianinas. Fatores como presença de etanol, luz, ph, altas temperaturas, a estrutura do copigmento e do pigmento e a concentração de ambos, entre outros, influenciam significativamente a reação de copigmentação 29. O ácido tânico e o ácido gálico são ácidos orgânicos conhecidos que apresentam capacidade de participar da reação de copigmentação com antocianinas 24, 29 estão naturalmente presente em uvas, vinhos e chás 4, 23, 30 e possuem capacidade de capturar radicais livres 32, 34, propriedades antimutagênicas 4, antimicrobianas 5 e anticancerígenas reconhecidas 7. Falcão et al. 12 avaliaram a estabilidade de antocianinas e betalaínas adicionadas de ácido tânico em sistema modelo de iogurte e verificaram que o ácido tânico aumentou sensivelmente o tempo de meia vida e a percentagem de retenção das betalaínas e que ambos os pigmentos apresentaram potencial para aplicação como corante em iogurte. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência dos ácidos orgânicos tânico e gálico sobre estabilidade de betacianinas em extrato de beterraba (Beta vulgaris L.) etanólico a 70%, nos valores de ph 5,00 0,05 e 6,80 0,05, na presença de oxigênio, em temperatura de 25,0 1,0ºC em ausência de luz. Material e métodos Material A beterraba vermelha de mesa (Beta vulgaris L., variedade Asgrow Wonder) foi gentilmente cedida pela Empresa de Pesquisa Agropecuária de Santa Catarina (EPAGRI), Estação Experimental de Florianópolis (SC). A amostra foi selecionada, eliminando as unidades que apresentavam danos mecânicos, lavada em água corrente, cortada em pedaços de aproximadamente 1cm 3, branqueada por 10 minutos sob vapor e rapidamente resfriada 1. As amostras foram armazenadas a temperatura de 18 2,0 o C em embalagens de polietileno. Os principais reagentes utilizados foram: álcool etílico absoluto, ácido cítrico monohidratado, ácido L-ascórbico, fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Nuclear, p. a.); sorbato de potássio (comercial) e os ácidos orgânicos tânico e gálico (Vetec, p. a.). Extrato de beterraba (Beta vulgaris L.) etanólico a 70% A escolha do solvente extrator foi baseada em testes preliminares utilizando cinco diferentes solventes, aquosos e alcoólicos, tendo como parâmetros de escolha a concentração dos pigmentos extraídos e sua estabilidade. Os solventes aquosos proporcionaram extratos com maior concentração de betalaínas, mas, devido à beterraba ser uma fonte rica de nutrientes e passível de contaminação microbiana, o uso de solventes aquosos impossibilitou o estudo da estabilidade da cor. O etanol 70%, apesar de não ter sido o melhor solvente nos parâmetros avaliados, foi selecionado dentre os demais por viabilizar o estudo de estabilidade das betacianinas, devido à sua propriedade antisséptica 8. Foi utilizada a proporção de 1:2 m/v, relação massa de beterraba por volume de etanol 70%. A mistura foi homogeneizada cerca de 1 (um) minuto em homogeneizador (Arno). O material permaneceu sob maceração por 24 horas, ao abrigo da luz e sob refrigeração (5,0 1,0ºC). Após a maceração, o material foi prensado manualmente em tecido fino e filtrado em papel filtro Whatman nº1, através de um funil de Büchner. O extrato obtido foi armazenado em frasco âmbar e sob refrigeração (5,0 1,0ºC). Adicionou-se a este extrato de beterraba 0,05 ml de sorbato de potássio a 5% para cada 10 ml de extrato, para prevenir a contaminação microbiana. Estudo da estabilidade A escolha das concentrações dos ácidos orgânicos foi realizada em função de sua solubilidade e da presença de efeito hipercrômico e/ou batocrômico no comprimento de onda de máxima absorção das betacianinas 15, 16, 36, 37. Foram utilizadas quatro concentrações iniciais dos ácidos tânico e gálico (0,231g, 0,462g, 0,925g e 1,850g) que foram diluídas em 100 ml de extrato de beterraba etanólico a 70%, nos valores de ph 5,00 0,05 e de 6,80 0,05 (quando necessário o ph foi corrigido com NaOH 1N ou HCl 1N, conforme Huang & von Elbe 18 utilizando phmetro MP220 METTLER TOLEDO). As soluções obtidas foram homogeneizadas até completa solubilização dos ácidos em agitador mecânico (Quimis) e posteriormente foram mantidas em repouso por duas horas 13, em ausência de luz à temperatura de 25,0 1,0 C. Alíquotas do extrato bruto com e sem os ácidos tânico e gálico foram transferidas para balões volumétricos de 25mL e completados com solução tampão citrato-fosfato ph 5,00 0,05 e 6,80 0,05 com o objetivo de se obter absorvância inicial entre 1,0-1,1. Leituras da absorvância das soluções foram realizadas na faixa de comprimento de onda de 390 a 600 nm, utilizando espectrofotômetro UV-Vis (HP 8452A diode array spectrophotometer), visando verificar possíveis efeitos hipercrômico e/ou batocrômico no comprimento de onda 44

3 de máxima absorção das betacianinas, que sugerem a copigmentação destes pigmentos 15, 16. Para o estudo da estabilidade em função do tempo selecionou-se as duas melhores concentrações dos ácidos tânico e gálico, baseando-se no efeito hipercrômico. Repetiuse todo o procedimento de preparo, homogeneização e repouso acima mencionados. Foram transferidos 10 ml do extrato alcoólico 70% de beterraba para tubos de ensaio com tampas rosqueáveis (25 ml). Todas as amostras foram mantidas na ausência de luz, presença de oxigênio, temperatura de 25,0 1,0ºC, em valores de ph 5,00 0,05 e 6,80 0,05 durante a realização do experimento. Denominou-se amostras controle aquelas que continham somente o extrato de beterraba etanólico 70%, e amostras testes aquelas com ácido tânico (AT) ou com ácido gálico (AG). Para manter as amostras em ausência de luz, os tubos foram envoltos com papel alumínio 2. Para leituras espectrofotométricas, alíquotas do extrato bruto com e sem os ácidos tânico e gálico foram transferidas para balões volumétricos de 25mL e completados com solução tampão citrato-fosfato ph 5,00 ± 0,05 e 6,80 ± 0,05 visando obter absorvância inicial entre 1,0-1,1. A medida dos valores de absorvância das amostras, feita logo em seguida ao repouso das amostras (2h) caracterizou o tempo zero. Realizouse leituras em intervalos de tempo variáveis, no comprimento de onda de máxima absorção das betacianinas (l=536 nm), utilizando espectrofotômetro HP 8452A (diode array spectrophotometer) e célula de quartzo (1,0 cm de percurso óptico) com volume de amostra de 3,0 ml. O experimento foi interrompido quando 60%, ou mais, dos pigmentos encontravam-se degradados. O cálculo da constante k da reação de primeira ordem e do tempo de meia vida dos pigmentos (t1/2), foram calculados conforme Kirca & Cemeroglu 21 e são descritos abaixo: ln (At/A0) = -k x t and t1/2 = - ln 0.5 x k -1 Onde: t = tempo (horas), At= Absorvância no tempo t, A0 = Absorvância inicial no tempo zero. Análise estatística Realizou-se a análise de variância (ANOVA/ MANOVA) para verificar a existência de diferenças significativas entre os tratamentos e aplicou-se o Teste de Tukey studentized (HSD) ao nível de confiança de 95% (p<0,05) para analisar as diferenças entre as médias. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa STATISTICA, versão 5.1 ( ). O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado no esquema fatorial 5 2, com três repetições (em duplicata). Resultados e discussão O comportamento espectrofotométrico das amostras testes nas quatro concentrações iniciais de ácido tânico (AT) e de ácido gálico (AG) pode ser visualizado na Figura 1 (a, b, c, d). FIGURA 1 - Efeito do ácido tânico (a) e ácido gálico (b) em ph 5,00 ± 0,05 e ácido tânico (c) e ácido gálico (d) em ph 6,80±0,05 em diferentes concentrações (1: controle; 2: 0,231g/100 ml; 3: 0,462g/100 ml 4: 0,925g/100 ml e 5: 1,850g/100 ml), no espectro de absorção do extrato de beterraba etanólico a 70%, no comprimento de onda de máxima absorção para betacianina (536 nm). A adição dos ácidos orgânicos tânico e gálico ao extrato de beterraba etanólico a 70% conferiu efeito hipercrômico no comprimento de onda de máxima absorção das betacianinas (536 nm), em ambos os valores de ph e nas diferentes concentrações testadas, onde o ácido tânico apresentou maior efeito hipercrômico (em ph 5,00 0,05: A=0,1088 0,2151 e em ph 6,80 0,05 : A= 0,0478-0,0866,) quando comparado ao ácido gálico (em ph 5,00 0,05: A=0,0127-0,0646 e em ph 6,80 0,05: (a) (b) (c) (d) 45

4 A=0,0149-0,0574,) nas concentrações avaliadas. O aumento na concentração dos ácidos orgânicos (p/v) resultou em um aumento no efeito hipercrômico das betacianinas (Figura 1 a, b, c, d). Não foi verificado efeito batocrômico no comprimento de onda de máxima absorção para a betacianina. Em estudo realizado por Heuer et al. 16, verificou-se a ocorrência de efeito batocrômico de 7 nm para betacianinas aciladas presentes na Gomphrena globosa (gonfrenina II e III) quando comparada com betacianina não acilada (gonfrenina I). Resultados similares foram encontrados por Heuer et al. 15 e Schliemann et al. 36, na avaliação de betacianinas aciladas presentes na Bugainville glabra e Phytollaca americana, respectivamente. Estes estudos sugerem a ocorrência de copigmentação intramolecular. Para o estudo da estabilidade da betacianina foram selecionadas as concentrações de 0,925g/100mL (AT1 e AG1) e 0,462g/100mL (AT2 e AG2), dos ácidos orgânicos tânico e gálico, que apresentaram o maior efeito hipercrômico no comprimento de onda de máxima absorção das betacianinas. A influência das diferentes condições do estudo da estabilidade sobre os valores de absorvâncias das betacianinas nos tratamentos controle e testes é visualizada nas Tabelas 1 e 2. As amostras testes adicionadas mantiveram os maiores valores de absorvância durante todo o período de avaliação quando comparados com as amostras controle. Nas amostras adicionadas de ácido tânico, foram observados os maiores valores de absorvância, em ambos os valores de ph (5,00 e 6,80), quando comparados com as amostras controle. Nas adicionadas de ácido gálico a maior estabilidade foi observada em ph 5,00. Isto refletiu significativamente nos valores de tempo de meia vida das betacianinas (Tabela 3). Através da análise de variância (ANOVA/MANOVA) feita sobre os valores de tempo de meia vida da betacianinas dos tratamentos controle e testes, verificou-se uma diferença significativa entre os tratamentos e entre os valores de ph avaliados, verificando ainda interação significativa entre tratamento e ph (p<0,05). Ao aplicar o Teste de Tukey studentized (HSD) (p 0,05) para a interação dupla entre tratamentos e valores de ph, foi verificado que os ácidos orgânicos em ph 5,00 0,05 resultaram em um maior valor do tempo de meia vida das betacianinas (AT1: 854,38 17,50 h; AT2: 735,17 49,96 h, AG1: 427,14 3,21 h e AG2: 334,51 1,16 h) quando comparado com o controle (197,06 2,07 h). Em estudo similar, Schliemann & Strack 37 também verificaram um aumento na estabilidade de betacianinas que continham Tabela 1 - Valores de absorvâncias das amostras controle e amostras testes de betacianina, em extrato de beterraba (Beta vulgaris L.) etanólico a 70%, em função do tempo, à temperatura de 25,0 1,0 C, em ph 5,00 0,05 na presença de oxigênio, ausência de luz, (AT1: 0,925g/100 ml e AT2: 0,462g/100 ml) e gálico (AG1: 0,925g/100 ml e AG2: 0,462g/100 ml). Tempo (horas) Controle 1,0583 1,0390 0,9893 0,6526 0,5628 0,4922 0,2943 0,2405 AT1 1,0778 1,0680 1,0650 0,9568 0,9126 0,9086 0,8460 0,8030 AT2 1,0698 1,0600 1,0598 0,9375 0,9008 0,8868 0,7878 0,7645 AG1 1,0968 1,0543 1,0143 0,8523 0,7983 0,7412 0,6022 0,5453 AG2 1,0816 1,0366 0,9973 0,7833 0,7242 0,6616 0,5032 0,4483 Tabela 2 - Valores de absorvâncias em função do tempo, das amostras controle e amostras testes de betacianina, em extrato de beterraba (Beta vulgaris L.) etanólico a 70%, à temperatura de 25,0 1,0 C, em ph 6,80 0,05 na presença de oxigênio e ausência de luz. (Amostras testes com ácido tânico= AT1: 0,925g/100 ml e AT2: 0,462g/100 ml; Amostras testes com ácido gálico = AG1: 0,925g/ 100 ml e AG2: 0,462g/100 ml). Tempo (horas) Controle 1,0908 1,0583 1,0390 0,9893 0,6527 0,5628 0,4922 AT1 1,1382 1,0778 1,0680 1,0650 0,9568 0,9127 0,9087 AT2 1,1483 1,0698 1,0600 1,0598 0,9375 0,9008 0,8868 AG1 1,0955 1,0968 1,0543 1,0143 0,8523 0,7983 0,7412 AG2 1,0925 1,0812 1,0367 0,9973 0,7833 0,7242 0,

5 ácido ferrúlico em sua estrutura (lanfrantina II e celosianina II) quando comparadas às respectivas betacianinas sem o ácido (amarantina e betanina), possivelmente em função da copigmentação intramolecular. O aumento na estabilidade conferido pelos ácidos tânico e gálico as betacianinas foi dependente de sua concentração sendo o melhor efeito observado quando estes foram adicionados em maior concentração (Tabela 3). Estudos de copigmentação intermolecular, mais amplamente estudados para antocianinas demonstram que o efeito protetor do copigmento é diretamente proporcional a sua concentração 10, 42. Tabela 3 - Tempo de meia vida (horas) das betacianinas nos tratamentos controle e testes (AT=ácido tânico e AG=ácido gálico) onde: AT1 e AG1 = 0,925g/ 100mL; AT2 e AG2 = 0,463g/100mL, nos valores de ph 5,00 0,05 e ph 6,80 0,05, ausência de luz, em presença de oxigênio e temperatura de 25,0 1,0 C. Tratamentos Meia vida (horas) ph 5,00 0,05 ph 6,80 0,05 controle 79,11 197,06 AT1 100,99 854,38 AT2 97,41 735,17 AG1 79,99 427,14 AG2 74,62 334,51 A influência destes ácidos orgânicos foi diretamente dependente do valor do ph. Em ph 6,80 0,05 não foi verificado diferença significativa (p 0,05) entre os valores de tempo de meia vida da betacianina adicionada de ácido tânico e de ácido gálico. A maior estabili-dade em ph 5,00 0,05 quando comparado com o ph 6,80 0,05 mostra o efeito deste fator na estabilidade das betalaínas e está de acordo com o resultado encontrado por von Elbe et al. 40 onde, sob aquecimento a 100 C e em presença de oxigênio, em ph 5,0 o extrato de beterraba apresentou maior valor de meia vida (28,6 horas) quando comparado com o ph 7,0 (5,1 horas). Huang & von Elbe (1987) 19 observaram que em solução tampão a betanina e a vulgoxantina I apresentaram maior estabilidade na faixa de ph 4,0 e 5,0. Conclusões O ph influenciou significativamente na estabilidade das betacianinas, sendo a maior estabilidade verificada em ph 5,00 0,05. Os ácidos orgânicos tânico e gálico, nas concentrações avaliadas e no valor de ph 5,00 0,05 aumentaram significativamente (p<0,05) o tempo de meia DRUNKLER. D.A.; FALCÃO, L.D.; BORDIGNON-LUIZ, M.T. Influence of the tannic and gallic acids on stability of betacyanins from red beetroot (Beta vulgaris L.) crude extract. Alim. Nutr., Araraquara, v. 15, n. 1, p , ABSTRACT: The use of e natural colorants in the food industry is limited because to its low stability under preparation, processing and storage conditions. Techniques for natural colorant s stabilization, such as copigmentation, have been used frequently in scientific researches. The betacyanins that belong to the groups of the betalain presents in the red beetroot and are used as colorant in food. Tannic and gallic acids were used in this study as a copigment of betacyanin crude extract from red beetroot (Beta vulgaris L.). Betacyanin stability was investigated with and without tannic and gallic acid under different storage conditions in 70% ethanol extract: concentrations of 0.925g/100mL and 0.462g/100mL, ph values 5.00±0.05 and 6.80±0.05 at temperature of 25±1ºC, in the dark and in the presence of oxygen. Results revealed that ph and tannic and gallic acid addition (p<0.05) increased significantly the betacyanins half-life time. The tannic and gallic acids provided significant increase in stability of the betacyanins pigments at both concentrations evaluated, at ph value of 5.00 ± 0.05, tannic acid being more effective. KEYWORDS: Betacyanin; red beetroot (Beta vulgaris L.); tannic acid; gallic acid; stability. Referências bibliográficas 1. ABEYSEKERE, M. et al. Studies on different methods of extraction of betalaines from red beet (Beta vulgaris). J. Food Sci. Technol., v. 27, n. 6, p , CAI, Y.; SUN, M.; CORKE, H. Colorant properties and stability of Amaranthus betacyanin pigments. J. Agric. Food Chem., v. 46, n. 11, p , CASTELLAR R. et al. Color properties and stability of betacyanins from opuntia fruits, J. Agric. Food Chem., v. 51, p , CHEN, S.-C.; CHUNG, K.-T. Mutagenicity and antimutagenicity studies of tannic and its related compounds. Food Chem. Toxicol., v. 38, p. 1-5, CHUNG, K. T. et al. Tannins and human health. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., v. 38, n. 6, p , CONFORTI-FROES, N.; VARELLA-GARCIA, M.; SILVA, A. A. Utilização do corante da beterraba como aditivo alimentar. Alim. Nutr., São Paulo, v. 4, p , CORSI L. et al. Antiproliferative effects of Ceratonia siliqua L. on mouse hepatocellular carcinoma cell line. Phytoterapy, [S. l.], n.73, p , DRUNKLER, D. A. Estudo da estabilidade de 47

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