ESTUDO CINÉTICO DA ESTABILIDADE DA COR DE BEBIDA ISOTÔNICA ELABORADA COM O PERMEADO DE LEITE E EXTRATO DE ANTOCIANINAS

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1 ESTUDO CINÉTICO DA ESTABILIDADE DA COR DE BEBIDA ISOTÔNICA ELABORADA COM O PERMEADO DE LEITE E EXTRATO DE ANTOCIANINAS E.A.F.Fontes 1, R. C. Sabioni 2, P.C. Stringheta 1, P.R. Fontes 1 1-Departamento de Tecnologia de Alimentos Universidade Federal de Viçosa CEP: Viçosa - MG Brasil, Telefone: +55 (31) Fax: 55 (31) (eaffontes@ufv.br; stringap@ufv.br; prfontes@vicosa.ufv.br) 2- Mestranda em Engenharia de Produção Universidade Federal de Itajubá CEP: Itajubá - MG Brasil, Telefone: +55 (35) Fax: 55 (35) (rachelcamposabioni@gmail.com) RESUMO O presente trabalho objetivou realizar um estudo de estabilidade da cor em uma bebida isotônica elaborada a partir do permeado da ultrafiltração de leite no qual foi adicionado extratos antociânicos de açaí. Amostras de bebidas foram estocadas na presença e ausência de luz a 4 ºC e 25 ºC. Foram realizadas as análises das coordenadas de cor ( L*, a*, b*, c* e h*) e determinado o teor de antocianinas totais a cada sete dias durante 56 dias. As cores das bebidas e as antocianinas foram afetadas pela exposição à luz (p<0,05) e com maior ação deletéria a 25 o C. A condição de armazenamento ausência de luz/4 o C foi a que mais conservou a cor e as antocianinas. Portanto, é indicado o uso de embalagens que possam proteger o produto da luz combinado com armazenamento sob refrigeração que juntos amenizam o efeito de degradação das antocianinas. ABSTRACT This study aimed to carry out a study of color stability in an isotonic drink made from milk ultrafiltration permeate in which was added anthocyanin extracts of açai. Drinks samples were stored in the presence and absence of light at 4 C and 25 C. analysis of the color coordinates were performed (L *, a *, b *, C * and h *) and determined the content of anthocyanins every seven days for 56 days. The colors of beverages and anthocyanins were affected by exposure to light (p <0.05) and most deleterious action at 25 o C. The storage condition absence of light / 4 C was the one that kept the color and anthocyanins. Therefore, it is indicated the use of packaging which can protect from light combined with storage under refrigeration that together alleviate the effect of degradation of anthocyanins. PALAVRAS-CHAVE: bebida hidroeletrolítica; ultrafiltrarão; coordenada de cor; açaí. KEYWORDS: electrolyte drink; ultrafiltration; color coordinate; açaí. 1. INTRODUÇÃO O permeado, derivado do processo da ultrafiltração de leite ou do soro de leite, resulta em um co-produto lácteo que é composto por lactose, sais minerais, vitaminas e água. Devido a sua composição, tem sido utilizado na elaboração de bebidas isotônicas (Fontes et al. 2015). As bebidas hidroeletrolítica ou isotônicas são à base de água, sais minerais e carboidratos, ideais para reposição de líquidos e eletrólitos perdidos no suor durante atividade física, por possuírem formulação semelhante ao plasma, o que facilita a absorção.

2 O propósito de elaborar uma bebida isotônica a base de permeado de leite que além de ter o benefício da hidratação (Fontes et al. 2015), o uso de um corante natural irá proporcionar cor e presença de compostos bioativos no produto. O açaí possui elevado teor de compostos fenólicos totais, dentre eles, as antocianinas que podem ser utilizadas como corantes naturais. Entretanto, existem muitas limitações para a aplicação comercial das antocianinas em produtos alimentícios e bebidas em razão da baixa estabilidade desses pigmentos, que depende da própria estrutura química, da concentração, do ph, da temperatura, da presença de oxigênio, da luz, do ácido ascórbico, dos cofatores e dos açúcares, etc. (Rosso, 2006). Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo estudar a estabilidade da cor das bebidas isotônicas elaboradas a partir do permeado da ultrafiltração de leite adicionado de extrato de antocianinas da polpa de açaí, durante 56 dias, em diferentes condições de luz e temperatura de armazenamento. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Matéria-prima O permeado utilizado foi obtido pela ultrafiltração de leite no sistema de membranas do Laticinio Funarbe na UFV-Viçosa. A planta-piloto de ultrafiltração utilizada foi da marca WGM Sistemas, equipado com membrana espiral de polisulfona/poliamida, com massa molar de corte de 10 kda. Durante a concentração, foi utilizada temperatura entre 45 C e 50 C. A variação de pressão aplicada no leite foi de 0,99 atm, sendo a pressão de entrada de 2,96 atm e a de saída de 1,97 atm. A área filtrante da membrana equivaleu a 6 m². A polpa de açaí (médio, tipo B) foi utilizada para obtenção do extrato de antocianinas Obtenção do extrato de antocianinas Centrifugou-se 10 gramas da polpa de açaí em centrífuga Excelsa II Modelo 206 MP (São Paulo, Brasil), a x g /10 min. Ao sobrenadante adicionou-se etanol 70 % (v/v) (1:2 sobrenadante/solvente), e a acidificação do extrato foi feita por meio de adição controlada de ácido cítrico mono-hidratado dissolvido em solvente extrator até ph 2,0. A mistura foi mantida em repouso em ausência de luz e sob refrigeração (4 ºC± 1 ºC) por 24 h. Após este período, o extrato foi filtrado em papel Whatman n 1 a vácuo, em funil de Buchner, e o volume aferido para 100 ml. Para a obtenção do extrato concentrado de açaí, foi realizada a evaporação do solvente extrator, em evaporador à vácuo a ± 38 ºC. O armazenamento dos extratos concentrados foi feito em frascos de vidros opacos a -18 o C Elaboração da bebida Para isso foi adicionado ao permeado a sucralose na concentração de 0,0075% (m/v), houve um pré-aquecimento em micro-ondas até atingir a temperatura de 40 ºC. Em seguida, a mistura foi pasteurizada em banho-maria (62,8 a 65 o C/30 minutos) e realizado um resfriamento rápido em banho de gelo, até atingir a temperatura de 40 ºC, para a adição dos conservantes sorbato de potássio (0,01% (m/v) e benzoato de sódio (0,05% (m/v). Na sequência, foi adicionado o extrato antociânico de açaí (3 mg L -1 ) e o aromatizante idêntico ao natural sabor frutas vermelhas 0,01% (v/v). A bebida foi envasada em frascos de vidros transparente ou âmbar de capacidade de 60 ml (previamente higienizados por 30 minutos em água em ebulição e secos em estufas) hermeticamente fechados com tampa de plástico Delineamento Experimental

3 O experimento para estudo da estabilidade foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado em esquema de parcela subdividida, sendo na parcela a condições de armazenamento: luz/4 ºC; luz/25 ºC; ausência de luz/4 ºC e ausência de luz/25 ºC. Na subparcela, foi o tempo de estocagem de amostras de bebidas (0, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 dias) para cada condição de armazenamento. Para avaliação do efeito da luz, frascos transparentes foram colocados sob lâmpadas fluorescentes (40W, ~2.500 lumens), correspondente à luz do dia, mantendo distância em torno de 5 cm entre si, protegidos de qualquer outra fonte de luz, à 25 o C e os demais mantidos em geladeira display a 4 o C. Os frascos âmbar foram em parte armazenados em BOD sob ausência de luz com temperatura controlada à 4 ºC e parte estocados em ambiente fechado, protegido da luz a 25 ºC. Todo o experimento foi realizado em três repetições experimentais e as análises realizadas em duplicata Estudo de estabilidade No estudo de estabilidade foram avaliados a cinética de degradação ou alteração do valor a* e antocianinas totais. Para isso foram determinados as velocidades de degradação (k) e o tempo de meiavida (t 1/2 tempo necessário para degradar ou alterar em 50% a variável analisada). Para determinação da constante de velocidade de alteração ou degradação (k) foi admitido cinética de 1ª ordem e sua estimativa seguiu conforme Equação (1): (1) Em que C é a concentração ou valor da variável após o tempo de armazenamento das bebidas sob as condições do estudo e C o a inicial no tempo zero e t o tempo, em dias. A partir dos valores obtidos para k foram calculados para cada condição os valores de t 1/2 a partir da relação (Eq.2): (2) 2.6. Análise instrumental da cor e antocianinas totais A avaliação objetiva da cor das amostras da bebida foi realizada utilizando o espectrofotômetro de cor (ColorQuest II - HunterLab, Reston, VA). O equipamento foi devidamente calibrado para reflectância incluída, ângulo de observador de 10 e iluminante D65, com o posicionamento dos dispositivos protetor de luz, azulejo branco calibrado e azulejo cinza calibrado, respectivamente, na porta de reflectância. As amostras de bebidas foram transferidas para uma cubeta de quartzo com capacidade para 50 ml, para as leituras das coordenadas L*, a* e b*. Os valores de tonalidade (h*) e saturação (C*) foram calculados a partir dos valores de a* e b*, conforme as Equações 3 e 4: (3) (4) O teor de antocianinas totais foi determinado por espectrofotometria de acordo com Fuleki e Francis (1968), utilizando o método de quantificação por ph único, que consistiu na transferência de uma alíquota da amostra para um balão volumétrico de 5 ml, tendo o volume completado com solução Etanol 95% - HCl 1,5 N (85:15). Em seguida foi realizada a leitura em espectrofotômetro (Biospectro, modelo SP-22), no comprimento de onda de 535 nm. Para os cálculos, foi utilizado o Coeficiente de Extinção médio (ɛ 535 1% 1cm = 98,2 L cm -1 g -1 ), que corresponde à cianidina-3- glicosídeo. Nas bebidas o conteúdo total de antocianinas foi expresso em mg de antocianinas por litro de bebida (Equação 5):

4 (5) Em que, AT: antocianinas totais (mg L -1 ); A 535 : Absorbância em 535 nm; V: Volume da diluição final (ml); v: Volume da alíquota de amostra (ml); ɛ: Coeficiente de absortividade (98,2 L cm -1 g -1 ) e b a espessura da cubeta (cm) Análise estatística Os dados foram interpretados por análise de variância (ANOVA) e análise de regressão. Para comparação entre as médias dos tratamentos foi utilizado teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade. Para efetuar as análises estatísticas, utilizou-se o programa Statistical Analyses System (SAS), versão 9.2 licenciado para uso pela Universidade Federal de Viçosa. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Houve efeito da exposição ou não a luz das amostras de bebidas armazenadas a 4 o C e 25 o C (p < 0,05) sobre as coordenadas de cor e na concentração de antocianinas totais. Na Tabela 1 encontram-se os resultados do efeito da luz e temperatura de estocagem sobre amostras de bebidas formuladas com permeado da ultrafiltração de leite adicionada de extrato antociânico de açaí. Tabela 1 - Valores médios ± desvio-padrão das coordenadas de cor e concentração de antocianinas em amostras de bebidas estocadas em diferentes condições de luz e temperatura de armazenamento por 56 dias. Condição L* a* b* c* h* Antocianinas (mg L -1 ) Ausência luz/4 o C 51,62 c ±1,93 18,74 a ±2,11 16,13 a ±1,57 24,77 a ±1,04 40,71 c ±3,60 3,01 a ±0,45 Ausência luz /25 o C 53,98 b ±1,64 15,65 b ±2,24 18,18 a ±2,11 24,14 a ±1,41 49,30 b ±6,45 2,68 a ±0,60 Luz/4 o C 55,29 b ±2,61 15,16 b ±2,24 11,98 b ±1,41 19,38 b ±2,15 38,49 c ±4,45 2,56 a ±0,61 Luz/25 o C 59,99 a ±2,81 7,94 c ±4,69 15,62 a ±1,98 18,08 b ±2,34 63,96 a ±13,83 1,86 b ±0,72 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes, na coluna, diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Durante a estocagem foi possível perceber que as bebidas submetidas às quatro condições diferentes apresentaram valores positivos de a * e b*, isto é, apresentando tonalidades entre as cores amarela e vermelha. Nota-se pelo valor c* que as bebidas expostas à luz, independente da temperatura, apresentaram saturação menor (cor menos intensa) do que aquelas que não foram expostas, provando que esta variável é mais influenciada pela luz do que pela temperatura. É interessante observar que o valor h* é mais influenciado pela temperatura, já que as amostras mantidas à 4 ºC, independente da condição de exposição à luz, apresentaram valores próximos (p>0,05), indicando tom vermelho claro. Já as amostras mantidas a 25 ºC em ausência de luz apresentaram tonalidade mais próxima do alaranjado, e por fim, as amostras que apresentaram maior perda de coloração, expostas a luz a 25 ºC, ao final dos 56 dias de armazenamento encontravam-se com tonalidade laranja claro tendendo ao amarelo. Tendo em vista que as antocianinas são as responsáveis pela coloração, a sua instabilidade e degradação influencia diretamente na coloração do produto final. Num processo degradativo, as antocianinas podem sofrer duas mudanças básicas quanto a sua coloração ao longo do tempo, são elas, a variação na cor, que pode tornar-se gradativamente menos intensa, pela perda de saturação, e/ou, a mudança na tonalidade pela formação de compostos da degradação, o que resulta em cores diferentes da original (Constant, 2003).

5 Foi feito um estudo cinético em que foi estimada a velocidade de alteração no valor a* e a velocidade de degradação de antocianinas (k) e tempo de meia-vida (Tabela 2). Tabela 2 - Estimativa dos coeficientes cinéticos para alteração da cor (valor a*) e degradação de antocianinas nas bebidas isotônicas, em diferentes condições de armazenamento durante 56 dias. Variável Condição C o k x 10-2 (dias -1 ) t 1/2 (dias) R 2 Ausência luz /25 o C 19,06 0,737 94,04 0,9855 Valor a * Luz/4 o C 18,34 0,712 97,38 0,9587 Luz/25 o C 16,13 3,135 22,11 0,9460 Ausência luz /25 o C 3,211 0, ,9 0,9521 Antocianinas totais Luz/4 o C 3,020 0, ,6 0,6766 Luz/25 o C 2,813 2,458 28,20 0,8019 A velocidade de alteração do valor a* e a velocidade de degradação de antocianinas é muito maior para as amostras que foram estocadas na presença de luz em temperatura ambiente (25 o C) com redução em 50% do seu valor em aproximadamente 22 dias e 28 dias, respectivamente. Entretanto, para as amostras que foram estocadas em ausência de luz a 25ºC e em presença de luz a 4º C, os valores das velocidades de alteração do valor a* ou das velocidades de degradação de antocianinas ficaram bem próximos não sendo afetados pelas temperaturas de armazenamento; seriam necessários aproximadamente 94 dias e 102 dias para que houvesse redução de 50% no valor da coordenada a* e antocianinas, respectivamente. Isto indica que as bebidas mantiveram a cor avermelhada por um tempo considerável quando estocadas na presença de luz a 4º C ou ausência a 25º C. As bebidas estocadas a 25 ºC em presença de luz apresentaram maior degradação de compostos antociânicos. Isso evidencia que a presença de luz e a temperatura mais elevada (25 ºC), atuando em conjunto, possuem efeito altamente deletério sobre as antocianinas; entretanto, se apenas a temperatura for reduzida até níveis de refrigeração a 4º C ou o armazenamento for feito em ausência de luz, torna-se possível amenizar esse efeito. É conhecido que as antocianinas são rapidamente destruídas pelo calor durante o processamento e estocagem dos alimentos. Os mecanismos de degradação térmica estão relacionados com a clivagem do anel heterocíclico da pseudobase com formação da chalcona, e posterior formação de produtos derivados de coloração marrom (Schwartz et al., 2010). Segundo Malacrida et al. (2006), a hidrólise glicosídica das antocianinas é proporcional à velocidade de perda da cor vermelha. Logo é possível que esse pigmento natural tenha sofrido essa hidrólise ao longo do tempo. A cor amarelada das bebidas expostas à luz pode ser explicada pela coloração resultante dos compostos oriundos da degradação das antocianinas, bem como da coloração resultante da degradação fotoquímica da riboflavina, visto que, apesar de esta ser estável a altas temperaturas, apresenta grande sensibilidade à luz. 4. CONCLUSÕES As bebidas isotônicas elaboradas com permeado de leite adicionado de corante natural, no caso, extrato de antocianinas de açaí, sofreram alterações significativas nas coordenadas de cor durante o armazenamento nas condições de presença de luz e temperatura 25 o C. Portanto, é indicado o uso de embalagens que possam proteger o produto da luz combinado com armazenamento sob refrigeração que juntos amenizam o efeito de degradação das antocianinas.

6 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Fapemig pelo apoio financeiro e ao PIBIC-UFVCredi pela concessão de bolsa de iniciação científica. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Constant, P. B. L.(2003). Extração, Caracterização e Aplicação de Antocianinas de Açaí (Euterpe oleracea, M.) Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos).Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. Fontes, E. A. F., Alves, Y. P. C., Fontes, P. R., Minim, V. P. R. (2015). Bebida eletrolítica a base de permeado da ultrafiltração de leite: avaliação física, química e microbiológica durante o armazenamento. Ciência Rural,45(2), Fuleki, T., Francis, F.J. (1968). Quantitative methods for anthocyanins: 2. Determination of total anthocyanins and degradation index for cranberry juice. Journal of Food Science, 33, Malacrida, C.R., Motta, S.(2006). ANTOCIANINAS em suco de uva: composição e estabilidade. Boletim CEPPA, 24, Rosso, V.V. (2006). Composição de carotenóides e antocianinas em acerola. Estabilidade e atividade antioxidante de extratos antociânicos em sistemas-modelo de extratos antociânicos de acerola e açaí. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos).Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP),Campinas. Schwartz, S.J., Von Helbe, J., Giusti, M.M.(2010).Corantes. In: FENNEMA, O.R. Química de Alimentos. Porto Alegre: Artmed.