Marcadores de DNA para registro de animais e diagnóstico de maciez de carne

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1 Marcadores de DNA para registro de animais e diagnóstico de maciez de carne Dario rattapaglia ENOMAX Tecnologia enômica Brasília

2 Tópicos Identificação animal baseada non DNA Tipagem no serviço de registro genealógico Tipagem sanguínea x DNA: vantagens e desafios Base genética e validação ISA de marcadores moleculares Aplicações do DNA no gerenciamento genético de rebanhos Testes de DNA para maciez de carne Mapeamento de QTL e mapeamento por associação Base genética e molecular Testes comercias existentes Validação de testes Como, quando e porque adotar testes de DNA no meu rebanho?

3 Serviço de registro genealógico A identificação animal na maior parte das Associações de Criadores adota variações da seguinte rotina: (1) Inseminação artificial ou monta: notificação à Associação da data inseminação/monta e da origem do sêmen pedido de registro RN à Associação comprovado c/ c/ documentação do touro e da vaca avaliação fenotípica do animal em idade adequada concessão do registro RD (PO ou PC) (2) Transferência de embrião notificação à Associação da data coleta de embrião e do cruzamento utilizado pedido de registro RN à Associação comprovado com documentação do touro e da vaca, acompanhado da descrição fenotípica da receptora avaliação fenotípica do animal em idade adequada concessão do registro RD (PO ou PC)

4 Tipagem no serviço de registro genealógico Legislação atual : tipagem para confirmação de parentesco é obrigatória para 100% dos reprodutores inscritos em centrais 100% dos animais de TE e FIV 3% por amostragem doa aniamais de monta natural 3% dos animais de inseminação artificial Algumas associações adotaram 10% a partir de 01/2003 (ex. ABCZ) Nova instrução normativa em fase final de aprovação no MAPA: 100% dos reprodutores inscritos em centrais 100% dos animais de TE e FIV10% % dos animais de inseminação artificial 5% dos animais de monta natural 100% dos animais nascidos de monta com reprodutores múltiplos A partir de 01/01/2006 as Associações deverão exigir o teste de paternidade, em todos os produtos registrados

5 Vantagens Tecnologia estabelecida e rotineira Atende á legislação vigente Bancos de dados existentes Custo barato Desafios Tecnologia rapidamente se tornando obsoleta no resto do mundo Animais importados não vem com tipagem sanguínea Baixa resolução em situações de parentesco Não fornece informações adicionais para gerenciamento genético Necessidade de produção de reagentes in vivo Exige sangue fresco Dificuldade de automação Não permite armazenamento de amostra em larga escala Laboratórios atuais não atendem à demanda crescente Tipagem sanguínea

6 ENOMA: Material genético total de uma célula ou indivíduo cromossomo célula gene DNA

7 Vantagens Tecnologia estabelecida e rotineira no resto do mundo Animais importados vem com DNA Alta resolução mesmo em situações de parentesco: permite qualificação por busca Fornece informações adicionais para gerenciamento genético Automatizável em larga escala Permite comparação eletrônica de perfis genéticos para teste de parentesco Utiliza qualquer amostra biológica (sêmen, pelos, sangue, swab nasal) Permite armazenamento de amostra em larga escala Atende à legislação brasileira vigente Desafios Elevado custo (caindo rapidamente e hoje competitivo com tipagem sanguínea) Necessidade de migração de bancos de dados (pacotes de backlog) Necessidade de instrução normativa e credenciamento de laboratórios (06/2004) Laboratórios atuais não atendem à demanda (vários em montagem) Tipagem do DNA

8 Unicidade : cada indivíduo tem um perfil de DNA único com exceção de gêmeos univitelinos ou clones de uma planta ou microorganismo Variabilidade: : apesar do fato de que a maior parte do genoma é muito conservada entre indivíduos, algumas regiões genômicas específicas são altamente variáveis permitindo uma discriminação altamente precisa, quantificável e reproduzível Immutabilidade : ou melhor, mutabilidade extremamente baixa (da ordem de a /geração; o DNA de um indivíduo é o mesmo em todas as células e este é estável ao longo de sua vida Marcadores de DNA: ferramenta poderosa para resolver questões de identificação individual e parentesco Estabilidade física : moléculas de DNA podem ser recuperadas, purificadas e analisadas de quase qualquer material biológico

9 Como funciona a identificação animal baseada na sequência de DNA? Cada animal possui uma sequência única e exclusiva de DNA Nenhum outro animal vivo (ou morto) possui a mesma sequência (exceção: gêmeos univitelinos,, clones) O DNA contém a informação genética básica responsável pelo desenvolvimento de um organismo Cada bezerro recebe, em cada loco do DNA, um gene do touro e um outro da vaca Alguns destes locos possuem formas gênicas (alelos) que não diferem entre os indivíduos da população No entanto, outros pontos do DNA possuem grande variação, isto é, é, as formas gênicas neles observados são altamente variáveis na população É raro encontrar outro animal com a mesma sequência naquele ponto do DNA. Estes locos são chamados de hipervariáveis.

10 Esquema resumido da determinação de perfil de DNA com base em marcadores microssatélites amostra biológica PCR - amplificação do DNA em locos específicos DNA célula Determinação dos genótipos dos indivíduos através de eletroforese e detecção a laser semiautomatizada em sequenciador

11 Coleta de amostras de sangue em papel especial Papel especial para coleta de sangue para análise de DNA - CARTÃO DE COLETA ENOMAX Método simples, rápido e barato Pode ser realizado por qualquer pessoa, na fazenda mesmo Não requer refrigeração e transporte especial Kit de coleta é fornecido sem custos adicionais Permite um controle automatizado do processamento da amostra Permite armazenamento a longo prazo para contraprovas

12 Base genética de tipagem do DNA: marcadores microssatélites 5 5 Cromossomo 12 IIIIIIIIIIIIIIII...CACACACACA.....CACACACACA......TTTTT ALELO 5 IIIIIIIIIIIIIIII Cromossomo 12 IIIIIIIIIIIIIIII ALELO 7...CACACACACACACA.....TTTTTTT. IIIIIIIIIIIIIIII Cromossomo 12 IIIIIIIIIIIIIIII ALELO 7...CACACACACACACA.....TTTTTTT. IIIIIIIIIIIIIIII Cromossomo 12 IIIIIIIIIIIIIIII ALELO 7...CACACACACACACA.....TTTTTTT. IIIIIIIIIIIIIIII 5 5 Indivíduo HETEROZIOTO Loco 1 enótipo 5/7 Loco 1 Loco 2 Loco 3 Loco 4 Indivíduo HOMOZIOTO Loco 1 enótipo 7/7

13 Princípios básicos do teste de paternidade pelo DNA INCLUSÃO M C SP M C SP EXCLUSÃO O Suposto Pai (touro) possui o alelo paterno obrigatório O suposto Pai é incluído no grupo de indivíduos que poderiam ser o pai biológico do bezerro M C SP M C SP O Suposto Pai (touro) não possui o alelo paterno obrigatório O suposto Pai é excluído do grupo de indivíduos que poderiam ser o pai biológico do bezerro Cálculo de probabilidades Conclusão categórica

14 Análise automatizada de genótipos em teste de paternidade INCLUSÃO EXCLUSÃO Vaca Vaca Bezerra Bezerra Touro Touro Amelogenina - controle de sexo

15 9+2 marcadores microssatélites recomendados pela ISA (International Society of Animal enetics) para tipagem de bovinos LOCO TLA227 BM2113 TLA53 ETH10 SPS115 TLA126 TLA122 INRA23 ETH3 ETH225 BM1824

16 Banco de dados de frequências alélicas para raças bovinas para realização de cálculos estatísticos de identidade e vínculo 0.6 TLA Frequência NELORE SIMENTAL

17 Marcadores de DNA utilizados pela ENOMAX em exames de equinos e bovinos locos recomendados pela ISA ENOMAX membro institucional da ISA desde 2002 Participou com sucesso do exercício ISA de controle de qualidade de tipagem de bovinos, equinos,, caninos, ovinos e caprinos Validou um total de 15 marcadores bovinos Utiliza em rotina um sistema de 11 marcadores ISA + amelogenina Atualmente aguardando I.N. do MAPA para processo de credenciamento ainda 2004 Aliança estratégica com laboratório Hermes Pardini (abrangência e logística em todo o território nacional)

18 Exemplo de um laudo ENOMAX de exclusão (não qualificação) de paternidade pelo DNA

19 Exemplo de um laudo ENOMAX de inclusão (qualificação) de paternidade pelo DNA

20 Coleta e envio de amostras é muito simples e de baixo custo Marcadores abundantes e distribuídos dos pelo genoma Podem ser detectados via PCR (técnica requer pouco DNA) Altamente polimórficos,, alto poder de discriminação Permitem detectar, com máxima precisão, exclusões de paternidade mesmo em situações de parentesco próximo entre progenitores Permitem declarar paternidade com probabilidade acima de 99,999% de certeza Permitem estudos refinados de distância genética, parentesco e mapeamento genético de características importantes Custo acessível e plenamente competitivo com tipagem sanguínea Vantagens da d tipagem de DNA por microssatélites para determinação de identidade e vínculo genético

21 Aplicações de marcadores de DNA no registro e gerenciamento genético de rebanhos Registro de animais elite verificação de parentesco Determinação de paternidade em sistemas de cruzamento em campo (monta) com múltiplos touros ( multisire breeding ) Certificação e controle de qualidade de sêmens Estudos de distância genética para planejamento de cruzamentos Reconstrução de pedigrees e estimativas de parentesco Verificação de pedigrees de animais elite Suporte aos programas de melhoramento para estimativas precisas de valor de melhoramento de animais elite Rastreamento de animais e produtos até depois do abate

22 Análise de distância genética entre animais visando otimizar esquemas de cruzamentos Visualização via dendrograma

23 Implementação imediata de identificação animal baseado em DNA pela ABCRS 1. Animais de interesse, especialmente reprodutores em centrais, e doadoras seriam selecionados para tipagem 2. Coleta de amostras na propriedade, sob supervisão da Associação (pelos,, swab nasal, sangue em papel) 3. Busca ou envio pelo correio em envelopes lacrados para o laboratório de análise 4. Laudos via internet para o criador e Associação em 10 a 20 dias úteis 5. DNA permite a qualificação bem como busca de touros em banco 6. Construção de banco de dados de animais já tipados via sangue 7. Contratos de maior volume a preços competitivos com a tipagem sanguínea

24 Registro genealógico on line de animais na American Simmental Association ASA - EUA

25 enômica na medicina e agropecuária Característica /doença com componente genético monogênica x multifatorial ene mapeado mapas genéticos e físicos ene identificado sequência do genoma Humanos Prevenção Farmacogenômica Terapia gênica Diagnóstico Plantas e animais Seleção assistida Transformação

26 O genoma é como uma lista telefônica LISTA TELEFÔNICA Nomes de pessoas Sobrenomes comuns entre pessoas podem indicar relacionamento, função Endereço, bairro, vizinhança Profissão, função?? Interações com outras pessoas e redes de relacionamento?? SEQUÊNCIA DO ENOMA Nomes de genes Sequências comuns entre genes indicam relacionamento de função Local no genoma, vizinhanças etc. Função?? Interações com outros genes e cadeias metabólicas?? O RANDE DESAFIO PARA O PRÓXIMO SÉCULO É DESVENDAR A FUNÇÃO DOS ENES E SUAS INTERAÇÕES NA DEFINIÇÃO FINAL DA COMPLEXIDADE DO FUNCIONAMENTO DO ORANISMO

27 Teste de DNA para características qualitativas Heranças geneticamente simples Alelos de grande efeito Pouca ou nenhuma influência ambiental Mutações conhecidas e de fácil detecção Tipicamente de baixo impacto econômico Determinação de sexo Cor de pelagem Musculatura dupla - miostatina Chifres Algumas doenças genéticas mendelianas

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29 Características quantitativas - multifatoriais Características de maior importância econômica Produtividade - carcassa Fertilidade e eficiência reprodutiva Qualidade (maciez, marmoreio etc.) Resistência a doenças Crescimento Produtividade de leite Heranças geneticamente complexas baixa herdabilidade Alelos de pequeno efeito e penetrância variável enes desconhecidos e de difícil detecção Ampla influência ambiental e interação genótipo x ambiente Expressão tardia (ex. mensuração somente em carcassa)

30 CARACTERÍSTICAS QUANTITATIVAS: de fenótipos a genes via mapeamento genético de QTLs e associação com genes candidatos Marcadores e genes mapeados ESTs mapeados ene A Promotor QTL MAPEADOS 5 UTR Codante 3 UTR enes candidatos Simental 2 Simental 1 Nelore 2 Nelore 1 Angus 2 Angus 1 Jersey 2 Jersey 1 MENSURAÇÃO DE FENÓTIPOS Peso Maciez Fertilidade Resistência Mapa genético de marcadores microssatélites Mapa físico de grandes pedaços de DNA (clones de BAC) ancorado no mapa genético Mapa de diversidade alélica (SNPs) funcional intra e interespecífica aos genes candidatos de interesse

31 Mapeamento de genes de interesse em pedigrees estruturados para seleção assistida As duas pistas na esquerda no gel são os dois genitores, seguidos de 46 indivíduos F1. Os dois marcadores nos dois painéis is são totalmente informativos segregando 1:1:1:1 para A1A3:A1A4:A2A3:A2A4. EMBRA QTL EMBRA173 EMBRA51 EMBRA27 EMBRA120 EMBRA358 EMBRA347 EMBRA320 EMBRA288 EMBRA126 EMBRA48 EMBRA56 EMBRA387 EMBRA324 EMBRA69 EMBRA282 EMBRA36 EMBRA403 rupo 1

32 De QTL a gene: desafio da clonagem posicional Informação de QTL é útil para o melhoramento (teste de marcadores ligados) porém não permite a identificação precisa dos genes responsáveis O intervalo de confiança no qual o QTL é mapeado tipicamente envolve dezenas de centimorgans,, i.e, dezenas ou centenas de genes LOD score > 3.0 Posição mais provável do QTL intervalo de 5 % de recombinação 5 cm em Bos pode corresponder a entre 1 e 10 milhões de pares de bases DNA, centenas de genes

33 Desafios no mapeamento de QTLs DETECÇÃO DE QTL Proporção da variância explicada pelo QTL: quanto maior a variância mais fácil a detecção Correlação entre marcador e o loco funcional: depende da extensão do desequilibrio de ligação (DL), quanto maior melhor a detecção Correção para múltiplos testes de hipóteses: quanto maior a estringência estatística menor o poder e maior a amostra LOCALIZAÇÃO DO QTL Alta correlação marcador-gene = alto DL, bom para detecção mas ruim para localização Baixa correlação marcador-gene = baixo DL, ruim para detecção mas bom para localização precisa e potencialmente clonagem do gene

34 Comparação de resolução e tempo necessário de diferentes abordagens para dissecar a variação quantitativa Mapeamento de associação Mapeamento de QTL

35 Desequilíbrio de ligação ASSOCIAÇÃO 1 2 Equilíbrio de ligação NÃO ASSOCIAÇAO 1 2 marcador 1 Marcador 1 Marcador D =1 Marcador D =0 Rafalski, 2001 Current Op. Pl. Biology

36 Mapeamento de associação para maciez de carne Animais com alto WBS Animais com baixo WBS

37 Mapeamento de associação Ocorrência de desequilíbrio de ligação entre um marcador SNP e um QTN (Quantitative Trait Nucleotide). A extensão do DL no genoma que permite a detecção de associações depende de diversos fatores incluíndo: a a história genética da população a frequência de recombinação no segmento genômico analisado SNP SNP A A A A A A A A A A 9 0 QTN T T T T T T T QTN p=0, T 0 7 DESEQUILÍBRIO DE LIAÇÃO SNP SNP A A A A A A A A A A 5 2 QTN T T T T T T T T T QTN p=0,3575 T 4 5 EQUILÍBRIO DE LIAÇÃO

38 Recombinação reduz o desequilíbrio de ligação ALTO DL BAIXO DL enitores tempo Descendentes Haplótipos ancestrais conservados são reduzidos em tamanho pela recombinação

39 Mapeamento de associação VANTAENS Permite Permite o estabelecimento de relações diretas entre a variabilidade de sequência destes genes e a variabilidade fenotípica SNPs são mais frequentes do que SSR e permitem análises a distâncias mais curtas Permite a análise direta de bancos de germoplasma e coleções de animais elite sem necessidade de populações segregantes DESAFIOS Definição de quais genes candidatos devem ser analisados Desconhecimento da extensão do desequilíbrio de ligação em Bos (espécie e/ou população específica) Seleção de populações adequadas para análise Caracterização fenotípica detalhada

40 Desafio: : seleção de genes candidatos Conhecimento de função pelo papel bioquímico de enzimas Inferência de função com base em similaridades em bancos de dados Existência de mutantes em animais modelo com fenótipo relacionado Expressão diferencial do gene entre fenótipos contrastantes Análise de expressão diferencial em nível de proteína ABORDAEM ENÉTICA: co-localização do gene com QTLs mapeados para características Isenta de premissas Baseada em modelo mendeliano Parte de caracterização fenotípica

41 SNPs Single Nucleotide Polymorphisms Polimorfismos de nucleotídeo único SNP: uma posição de base na qual dois nucleotídeos alternativos ocorrem a uma frequência significativa (>1%) na população SNP individualidade genética Nos torna mais ou menos susceptíveis a doenças Podem influenciar o efeito de fármacos TTTTACATC ATC TTTTACTATC ATC Exemplo: TTT TAC C C ATC TTT TAC TC C ATC Phe Tyr Asn Met Phe Tyr Ser Met NORMAL ASSOCIADO COM COLESTEROL ELEVADO

42 SNPs single nucleotide polymorphisms (polimorfismos de nucleotídeo único) Associado com diferença fenotípica?? Animal 1 Animal 2 Animal 3 Animal 4 Animal 5 Animal 6

43 Exemplo clássico em humanos: SNPs para anemia falciforme Detecção via corte com enzima e hibridização de sonda Hemoglobina alterada Mutação bem caracterizada de A para T Detectada com digestão por MstII Enzima reconhece sítio CCTNA Mutação elimina sítio de restrição Normal Anemia falciforme

44 Exemplo clássico em bovinos: gene DAT para gordura no leite Fenótipo QTL gene candidato confirmação funcional da mutação MAPEAMENTO DE QTL CLONAEM POSICIONAL ASSOCIAÇÃO DA MUTAÇÃO COM TEOR DE ORDURA CONFIRMAÇÃO BIOQUÍMICA FUNCIONAL DA MUTAÇÃO Lisina-Alanina posição 232

45 Detecção de SNPs em heterozigose enotipagem Segregação Mapeamento Output:

46 Mãe Detecção de SNPs em heterozigose Pai X A A 1 : 1 A A Filho 1 Filho 2

47 ENOTIPAEM DE SNPs DE TOURO HETEROZIOTO ALELO 1 AACCCTA ALELO 2 AACCTA ½ AACCCTA ½ AACCTA MACIEZ aumentada MACIEZ reduzida

48 Testes de DNA comerciais nos EUA para características quantitativas em gado de corte 1. enestar Marbling Marmoreio - gene da tiroglobulina enetic Solutions/Bovigen 2. enestar Tenderness Maciez - Mutação no gene da calpastatina enetic Solutions/Bovigen 3. enestar Tenderness 2 Maciez - Uma mutação no gene da calpastatina e uma no gene da calpaina enetic Solutions/Bovigen 4. TenderENE Maciez - Maciez Duas mutações no gene da calpaina Frontier Beef Systems/eneSeek 5. IENITY L Marmoreio e apetite - gene do hormônio leptina Merial/Quantum enetics 6. MMI Mu-Calpain Tender - Maciez - Mutações no gene da calpaina Metamorphix Inc. enomics

49 Alelo 2 Teste para MARMOREIO mutações na região 5 UTR do gene TIROLOBULINA duas mutações (SNP) que definem alelos AACTTCCTCTCCTTTTTTTCTACTCCTACAAAAAATACTACATATACTTCTTTTTCTTATCTCATCAA AATCTCTACATTCTTTTAATATCTCCTTTTTTTCCCTCCATATCCTCATCCTAAATATTCTCTTCTCTATCAACTCTAAAAAACATT CTAAAAAAACATATAAAACATTTTTTCTCTCACTCCTAACTTCCCACCAATTTTAACTTT CCTTTACCCCTAAATAATTATAACCACACCCCCATTCTTCCTTTCTCAATTCAAAATCCACCTCAATCAACCTTTT ATCCCTTTAAATCCCCTAAAAATCTACCCACTCCATATTCTCCTAAATCCCATACAAACCTCATC ATCCATTCTCAAATCAATTACTACACTTTCACACACATTCTCCCTTTCTCTCCCCTACACCTCCACAAATTTTCACCCCA CACTCCACATATTCCTCCAAACAACCATAACCTCCTTTACCACAAAAAACATCACTCTTCCCTATC CTTTCTAATACCCACACATCTATAAACTCCTTCCAACCCTAATCACACTTCTAACCCTTCTCCCTAACT CCCAAATCCCTCCCTATTCTTCTCTCTACTTAATCTCTTCATCCCCAACATCTTTTAATTCTACCCTCTCTCAA CATCTTAACCTCTACCAACTCCTTTTACCAACCTCCCCACCATAACATTTTACCTCATTTAATCCTCATTCCC ATCATTATCACTCTTTCCTTTTCAATAAAACAATCTAAATCACAATCATATC Alelo 3 AACTTCCTCTCCTTTTTTTCTACTCCTACAAAAAATACTACATATACTTCTTTTTCTTATCTCATCAA AATCTCTACATTCTTTTAATATCTCCTTTTTTTCCCTCCATATCCTCATCCTAAATATTCTCTTCTCTATCAACTCTAAAAAACATT CTAAAAAAACATATAAAACATTTTTTCTCTCACTCCTAACTTCCCACCAATTTTAACTTT CCTTTACCCCTAAATAATTATAACCACACCCCCATTCTTCCTTTCTCAATTCAAAATCCACCTCAATCAACCTTTT ATCCCTTTAAATTCCCTAAAAATCTACCCACTCCATATTCTCCTAAATCCCATACAAACCTCATC ATCCATTCTCAAATCAATTACTACACTTTCACACACATTCTCCCTTTCTCTCCCCTACACCTCCACAAATTTTCACCCCA CACTCCACATATTCCTCCAAACAACCATAACCTCCTTTACCACAAAAAACATCACTCTTCCCTATC CTTTCTAATACCCACACATCTATAAACTCCTTCCAACCCTAATCACACTTCTAACCCTTCTCCCTAACT CCCAAATCCCTCCCTATTCTTCTCTCTACTTAATCTCTTCATCCCCAACATCTTTTAATTCTACCCTCTCTCAA CATCTTAACCTCTACCAACTCCTTTTACCAACCTCCCCACCATAACATTTTACCTCATTTAATCCTCATTCCC ATCATTATCACTCTTTCCTTTTCAATAAAACAATCTAAATCACAATCATATC Patente US 6,383,751 Assessing lipid metabolism 1997 Primeiro teste comercial para qualidade de carne (07/2000) O teste distingue alelos do gene Tiroglobulina, um hormônio envolvido na via metabólica de criação de células adiposas Associação demonstrada em Angus, Shorthorn e Wagyu Desenvolvido no CSIRO Australia

50 Teste para MARMOREIO Mutações na região 5 UTR do gene TIROLOBULINA Animais homozigotos 33 (2 star) apresentaram em média maior nota de marmoreio (4 e maior) do que animais homozigotos 22 (0 star) ou heterozigotos 23 (1-star)

51 Teste de DNA para MACIEZ DE CARNE: gene CAST CALPASTATINA enestar Tenderness: primeiro teste comercial para maciez de carne (Novembro de 2002) Desenvolvido pelo CSIRO - Australia Calpastatina é uma enzima que inibe o amaciamento post mortem da carne pela ação da enzima calpaina Se baseia na detecção de dois variantes alélicos no gene da calpastatina Animais homozigotos para o alelo favorável: 2 estrelas (2-star) Em um estudo da empresa que comercializa o teste, a diferença entre animais 0 star e 2 star foi de 1,34 Kg em WBS Muito pouca informação pública sobre o teste Os dois variantes alélicos detectados via amplificação de um segmento de 500pb e resolução via SSCP

52 TESTE DE DNA PARA MACIEZ DE CARNE: gene CAPN1 CALPAINA Fenótipo QTL gene candidato mutações associadas Ainda falta a confirmação funcional das mutações: mutações possivelmente em DL e não causais da diferença

53 Teste para o gene CAPN1 Calpaina Duas mutações com efeito aditivo Tender ENE (tambem( enestar Tenderness 2): segunda geração de teste comercial para maciez de carne (Setembro( de 2003) Desenvolvido pelo MARC - EUA Calpaina é uma enzima que estimula o amaciamento post mortem da carne Se baseia na detecção de dois variantes alélicos em dois codons no gene da calpaina Variantes não são funcionais mas apenas associados (desequilíbrio de ligação) Animais para o alelo favorável: 2 estrelas (2-star) em cada mutação Em um estudo da empresa que comercializa o teste, a diferença entre animais 0-star 0 e 2-star 2 foi de 1,34 Kg em WBS

54 Teste de DNA para o gene CAPN1 Calpaina Duas mutações com efeito aditivo códon 316 e códon 530 SNP SNP no códon 316 do exon 9 - C ou glicina(alelo ) x alanina(alelo C) alelo alelo C ((alanina) ) é o alelo favorável para maciez SNP SNP no códon 530 do 13 - A ou Isoleucina (alelo A) x valina(alelo ) Alelo Alelo (Valina) é o alelo favorável para maciez Animais podem ser de nove genótipos distintos (3 x 3) Animal superior é aquele duplo homozigoto CC na posição 316 e na posição 530

55 DNA para maciez: o mito Pedigree Progênie adaptado de Thallman M Fenótipos Testes de DNA Fenótipos Fenótipos Diferenças esperadas na progênie Avaliação fácil, rápida, precoce e altamente precisa do mérito genético Tem sido dito aos melhoristas e produtores, que os testes de DNA para maciez permitiriam avaliar a superioridade genética de um animal diretamente sem necessidade de pedigrees, testes de progênie, fenotipagem etc...

56 Uma visão realista do uso do DNA para maciez adaptado de Thallman M PEDIREE PROÊNIE Fenótipos Teste de DNA Fenótipos Teste de DNA Fenótipos Teste de DNA Avaliação nacional Diferenças observadas em progênies, ajustadas pela teste de DNA Avaliação mais precisa do mérito genético Neste cenário, fenótipos e resultados de testes de DNA dos indivíduos e parentes são combinados através de avaliações nacionais para produzir estimativas mais acuradas sobre as quais são tomadas as decisões de seleção

57 Questões pendentes com os testes para maciez de carne 1 Validações independentes dos testes de DNA ainda precárias QTL team do US National Beef Cattle Evaluation Consortium ainda não os considera validados pois somente utilizou dados e delineamentos das empresas (maio 2004) enes testados explicam apenas uma pequena porção da variância fenotípica na característica Muito pouca informação na literatura: questões de proteção intelectual ectual (patentes) Delineamento experimentiais utilizados para os testes de associação muitas vezes tem efeito confundido de subestruturação populacional o que gera falsos positivos Necessidade de populações adequadas e fenotipadas

58 Questões pendentes com os testes para maciez de carne 2 Testes são bialélicos quando sabemos que estes genes muito provavelmente segregam de forma multialélica nas populações Perda de alelos mais favoráveis existentes na população pode ocorrer se seleção por DNA for implementada Testes são baseados em associação (DL) e não genes funcionais Validação em diferentes raças ainda não existe ou é contraditória a (ex. SNP na posição 530 teve efeito contrário em população de Santa ertrudis Bos indicus (Pollack 2004) Falta avaliação de efeitos ambientais e de manejo sobre a magnitude do efeito de substituição alélica Faltam avaliações comparativas de DNA x testes de progênie: muita a pesquisa em andamento principalmente nos EUA, Canadá e NZ

59 Como, quando e porque adotar testes de DNA para maciez de carne no meu rebanho? Devemos usar testes de DNA? Quais testes usar? Quais características serão mais beneficiadas pelo teste? Quais animais testar? Como utilizar os resultados dos testes? O que as Associações devem fazer a respeito dos testes?

60 Considerações sobre testes de DNA em geral (adaptado de Thallman M. 2004) Benefícios potenciais: acurácia aumentada na seleção especialmente para características de mensuração cara, limitadas pelo sexo ou mensuradas post mortem Usar ou não?: é uma decisão comercial que deve ser tomada de acordo com a posição no mercado e os custos envolvidos Apenas uma ferramenta de marketing? Adoção de novas tecnologias também tem este componente no início, mas geralmente leva ao sucesso Qual teste usar? Buscar informações sobre validação e magnitude do efeito; considerar experimento piloto para estimar frequências alélicas das mutações na sua população Funciona na minha raça? Muitas vezes não tem dados; buscar participar de pesquisas via associações

61 Considerações sobre testes de DNA em geral (adaptado de Thallman M. 2004) Quais animais testar? Reprodutores mais influentes; candidatos de maior potencial; animais mais provavelmente portadores de alelos favoráveis Como usar os resultados? Combinandos com avaliações fenotípicas; ; DNA aumenta a contribuição da informação fenotípica mas não substitui fenótipo O que esperar da minha associação? Estabelecer procedimentos para aquisição direta de resultados; estabelecer políticas para evitar relatos seletivos de resultados; fomento a redes de pesquisa; informação e educação de produtores Testes de DNA para heranças multifatoriais ainda constituem um desafio Testes de DNA vão se tornar melhores e mais baratos com o tempo Testes de DNA não vão simplificar o melhoramento mas torná-lo mais rápido Deverá se tornar rotina no melhoramento bovino e possivelmente na n a produção

62 Telefax