UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO E s c o l a d e E n g e n h a r i a d e L o r e n a EEL PEDRO HENRIQUE DAMIÃO DALÓ Medicamentos Biológicos: Estudo da produção e comércio de hormônios e anticorpos monoclonais no Brasil Área de Concentração: Engenharia Química/ Produção de Fármacos Lorena - SP 2015

2 PEDRO HENRIQUE DAMIÃO DALÓ Medicamentos Biológicos: Estudo da produção e comércio de hormônios e anticorpos monoclonais no Brasil Projeto de monografia apresentado à Escola de Engenharia de Lorena Universidade de São Paulo como requisito parcial para obtenção de título de Engenheiro Industrial Químico. Orientadora: Profª. Drª. Elisângela de Jesus Cândido Moraes Lorena - SP 2015

3 AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado da Escola de Engenharia de Lorena, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a) Daló, Pedro Henrique Damião Medicamentos Biológicos: Estudo da produção e comércio de hormônios e anticorpos monoclonais no Brasil / Pedro Henrique Damião Daló; orientadora Elisângela de Jesus Cândido Moraes. - Lorena, p. Monografia apresentada como requisito parcial para a conclusão de Graduação do Curso de Engenharia Industrial Química - Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo OrientadorA: Elisângela de Jesus Cândido Moraes 1. Engenharia química. 2. Produção de fármacos. 3. Medicamentos biológicos. 4. Hormônios. 5. Anticorpos monoclonais. I. Título. II. Moraes, Elisângela de Jesus Cândido, orient.

4 4 RESUMO DALÓ, P. H. D. Medicamentos Biológicos: Estudo da produção e comércio de hormônios e anticorpos monoclonais no Brasil f. Monografia (Trabalho de Graduação em Engenharia Industrial Química) Escola de Engenharia de Lorena, Universidade de São Paulo, Lorena, O mercado farmacêutico tem se modernizado a fim de suprir as necessidades da população e oferecer melhor tratamento às doenças que atualmente são fatais. Uma notável forma dessa modernização são os medicamentos biológicos, produzidos a partir de biotecnologia, como os hormônios e anticorpos monoclonais, ambos apresentados neste trabalho. Hormônios produzidos a partir da técnica de DNA recombinante têm propiciado melhora da qualidade de vida de pacientes com Diabetes Mellitus e têm ajudado pacientes com dificuldade de reprodução a gerarem filhos, ao suprirem a deficiência de hormônios que normalmente são produzidos de forma natural no organismo humano. Além disso, os anticorpos monoclonais apresentam grande potencial no tratamento de doenças autoimunes e de câncer, ao serem produzidos para ligar-se a antígenos específicos, aumentando a eficácia do tratamento. Neste trabalho será apresentada uma revisão da literatura dos hormônios e anticorpos monoclonais que nos dias atuais são comercializados no Brasil, suas estatísticas de vendas e crescimento, além de um esclarecimento sobre os procedimentos de testes clínicos e registro junto à agência regulamentadora (Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA). Palavras-chave: Medicamentos biológicos, biomedicamentos, anticorpos monoclonais, hormônios, proteína recombinante.

5 5 ABSTRACT DALÓ, P. H. D. Biomedicines: A study about the production and market of hormones and monoclonal antibodies in Brazil p. Monograph (Research Project for Graduation in Industrial Chemical Engineering) Engineering College of Lorena, University of São Paulo, Lorena, The pharmaceutical market has been modernized to fulfill the needs of the population and to provide a better treatment for diseases that are currently fatal. A remarkable fact of this modernization is the introduction of the biomedicines, produced from biotechnology, such as hormones and monoclonal antibodies, both presented in this work. Hormones produced by the technique of recombinant DNA have led to an improved quality of life on patients with Diabetes Mellitus and have helped patients with reproductive health issues to bear children, by overcoming the deficiency of hormones that are produced naturally in the human body. Moreover, monoclonal antibodies have a great potential in the treatment of autoimmune diseases and cancer, being produced to bind to specific antigens, increasing the efficacy of treatment. This study presents a literature review of hormones and monoclonal antibodies that are currently marketed in Brazil, as well as their sales statistics and growth, and a clarification on clinical trials and registration procedures with the regulatory agency (National Health Surveillance Agency - ANVISA). Key words: biomedicines, biological drugs, monoclonal antibodies, hormones, recombinant protein.

6 6 AGRADECIMENTOS À minha família, Laércio, Ângela, Maria Fernanda, Ana Beatriz e Helena, por serem a base da minha vida, por me incentivarem a ser melhor a cada dia e pela eterna confiança depositada em mim. Aos meus amigos da EEL, que caminharam comigo nessa jornada e que compartilham da mesma luta e dos mesmos desafios. À Profª. Dra. Elisângela de Jesus Cândido Moraes por ter gentilmente aceitado me orientar nesse trabalho, e por tê-lo feito com maestria. Às Srtas. Minji Kang (Daewoong Pharmaceutical) e Juliana Mazza Reis (Eurofarma) pelos valiosos dados fornecidos, indispensáveis para o enriquecimento do meu trabalho. Aos colegas da Daewoong Pharmaceutical Co. Ltd., empresa onde realizei o meu estágio e que contribuiu para a minha escolha do tema deste trabalho, por todos os ensinamentos e companheirismo com que me acolheram. Aos professores da Escola de Engenharia de Lorena, em especial às professoras Dra. Larissa de Freitas Teixeira e Dra. Patrícia Caroline Molgero da Rós, por todos os conhecimentos transmitidos, essenciais para a minha formação e crescimento. E a todos que, de uma forma direta ou indireta, contribuíram para a minha formação e realização deste trabalho.

7 7 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Estrutura de alguns aminoácidos encontrados em proteínas Figura 2 Conformações α-hélice e β-folhas Figura 3 Síntese de proteína Figura 4 Ação dos hormônios no fígado, músculo e tecido adiposo Figura 5 Diferenças entre anticorpos policlonais e monoclonais Figura 6 Método Hibridoma com células murinas Figura 7 Estrutura de um anticorpo Figura 8 Classes de anticorpos monoclonais existentes hoje no mercado Figura 9 Atuação da enzima de restrição no DNA e no plasmídeo Figura 10 Estrutura do plasmídeo Figura 11 Esquema da Ultrafiltração Figura 12 Cromatografia em coluna Figura 13 Cromatografia por exclusão

8 8 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Mercado de Hormônios e Anticorpos Monoclonais no Brasil Gráfico 2 Registros de Anticorpos Monoclonais no Brasil, EUA e Europa... 49

9 9 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Pesos moleculares de moléculas sintéticas e biológicas Tabela 2 Hormônios registrados no Brasil Tabela 3 Anticorpos Monoclonais registrados no Brasil Tabela 4 Dados coletados do IMS Health Tabela 5 Requerimentos para registro

10 10 LISTA DE SIGLAS ANVISA BHK CHO DDCM DMCD DNA EU EUA FDA FSH GnRH hcg hgh HIV LH mrna NPH ORPC PBC PTM RDC RNA TNF trna Agência Nacional de Vigilância Sanitária Rim de Hamster Bebê Ovário de Hamster Chinês Dossiê de Desenvolvimento Clínico de Medicamento Drogas Modificadoras do Curso da Doença Ácido Desoxirribonucleico União Européia Estados Unidos da América Food and Drug Administration Hormônio Folículo Estimulante Hormônio de Liberação das Gonadotropinas Gonadotropina Coriônica Humana Hormônio do Crescimento Humano Vírus da Imunodeficiência Humana Hormônio Luteinizante RNA Mensageiro Protamina Neutra Hagedorn Organização Representativa de Pesquisa Clínica Produto Biológico Comparador Modificação Pós-Translacional Resolução da Diretoria Colegiada Ácido Ribonucleico Fator de Necrose Tumoral RNA Transportador

11 11 SUMÁRIO OBJETIVO Introdução Metodologia Experimental Revisão Bibliográfica Medicamentos Biológicos Definição Histórico Proteínas Síntese de proteínas Modificação pós-translacional de proteínas Hormônios Insulina Diabetes Mellitus tipos 1 e Produção de Insulina Hormônio do Crescimento Humano Deficiência do hgh Uso terapêutico do hgh Gonadotropinas Deficiência e uso terapêutico Produção comercial de Gonadotropinas Anticorpos Monoclonais Método de produção hibridoma Anticorpos monoclonais de primeira geração Anticorpos monoclonais de segunda geração Anticorpos monoclonais inteiramente humanos Tratamentos com anticorpos monoclonais Anticorpos monoclonais no tratamento de artrite reumatóide Anticorpos monoclonais em tratamentos oncológicos Técnica de DNA Recombinante Processo Upstream Processo Downstream Recuperação Concentração Purificação Mercado Brasileiro Diferentes tipos de Insulina no mercado... 45

12 Diferentes tipos de Gonadotropinas no mercado Evolução do mercado de hormônios e anticorpos monoclonais Ensaios Clínicos no Brasil Registro de Medicamentos Biológicos no Brasil Conclusão REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 56

13 13 OBJETIVO O presente trabalho tem por objetivo realizar um estudo através da pesquisa bibliográfica sobre os medicamentos biológicos da classe dos hormônios e anticorpos monoclonais no Brasil, sua produção e comércio, bem como dados estatísticos de venda e crescimento. Além disso, será abordado como são feitos os estudos sobre a eficácia desses medicamentos no Brasil e o processo de registro na agência reguladora (ANVISA), a fim de oferecer um esclarecimento sobre procedimentos de testes e registros no país.

14 14 1. Introdução As terapias medicinais têm sua base nas substâncias farmacêuticas. Atualmente, grande parte dos princípios ativos dos medicamentos é obtida por via sintética. Esses medicamentos são denominados químicos. No entanto, com o diagnóstico de novas doenças, com difícil tratamento (ou sem tratamento ainda), as indústrias farmacêuticas tentam se adaptar, e os setores de pesquisa e desenvolvimento estão em constante trabalho, a fim de oferecer tratamento a essas doenças. Com a descoberta da técnica de DNA recombinante, em 1973, as empresas farmacêuticas passaram a ter mais um recurso em suas pesquisas e desenvolvimento, até 1982, quando o primeiro medicamento produzido a partir dessa técnica foi aprovado pela FDA. Esse medicamento é indicado para pacientes com Diabetes Mellitus, e seu princípio ativo é a insulina humana. 1 A partir de então, outros medicamentos foram produzidos utilizando essa técnica. Esses medicamentos são denominados medicamentos biológicos, e são produzidos a partir da biotecnologia. Outros biomedicamentos podem ser gonadotropinas, interleucinas, fatores de crescimento, e os potenciais anticorpos monoclonais que são fonte de inúmeras pesquisas atualmente, principalmente contra doenças como câncer ou doenças autoimunes. 2 Neste trabalho, é apresentada uma revisão bibliográfica dos medicamentos biológicos da classe dos hormônios e anticorpos monoclonais produzidos e comercializados no Brasil. Além disso, são apresentados dados estatísticos sobre venda e crescimento, além de um esclarecimento sobre como são feitos os estudos de eficácia e o registro desses medicamentos no Brasil.

15 15 2. Metodologia Experimental Este estudo foi desenvolvido a partir de uma pesquisa bibliográfica, utilizando publicações de artigos e livros referentes ao tema proposto. Inicialmente, foi realizada uma revisão bibliográfica sobre o que são os medicamentos biológicos, seu histórico e também sobre as proteínas e sua síntese. Em seguida foram apresentados os produtos foco deste trabalho, hormônios e anticorpos monoclonais, suas definições, sintomas e causas de suas deficiências, e tratamentos. Além disso, foi feita uma revisão bibliográfica também sobre o método de proteína recombinante, amplamente utilizado na produção dos medicamentos biológicos. Depois desta revisão, foram analisados o mercado e a produção atual dos hormônios e anticorpos monoclonais no país, seu crescimento ao longo dos anos, e por último os requerimentos para testes clínicos e registro desses produtos no país. As pesquisas da primeira parte, desde a definição dos medicamentos biológicos até o processo de DNA recombinante foram feitas em bancos de dados acadêmicos, como ScienceDirect, Scielo, e Google Acadêmico. Para isso foram usadas palavras-chave, em inglês, pertinentes ao assunto pesquisado, por exemplo: recombinant human insulin ou monoclonal antibody hybridoma. Além disso, foram utilizadas publicações da Interfarma e da ANVISA. Para a lista dos hormônios e anticorpos monoclonais registrados no Brasil, foi consultado o meio de busca de medicamentos registrados do sítio eletrônico da ANVISA e a Lista de Preços de Medicamentos, que é disponibilizada no site da agência, e atualizada constantemente. A partir dessa lista de moléculas, os dados sobre a produção e mercado brasileiro foram coletados da plataforma de pesquisa da IMS Health, e então analisados. Algumas empresas foram consultadas, porém poucas se dispuseram a fornecer informações. Por último, o sítio eletrônico da ANVISA foi novamente consultado, dessa vez com foco em suas normas para registro de medicamentos biológicos e para a realização de testes clínicos no Brasil, na finalização do trabalho de pesquisa. A conclusão foi feita analisando-se as perspectivas do mercado desses produtos no Brasil para o futuro.

16 16 3. Revisão Bibliográfica 3.1. Medicamentos Biológicos Definição Medicamentos produzidos a partir de biossíntese em sistemas vivos são denominados medicamentos biológicos. No geral são proteínas, e podem ser extraídos de órgãos ou tecidos de origem animal, ou podem ser produzidos em células geneticamente modificadas, utilizando-se de biotecnologia, em escala industrial. 1 Esses medicamentos são mais complexos que os medicamentos denominados sintéticos (de origem química), devido aos seus componentes ativos terem mecanismo de ação heterogêneo, podendo variar no corpo humano; além de terem difíceis replicação e caracterização, e possuírem peso molecular de 100 a 1000 vezes maiores que as moléculas sintéticas, conforme listado na Tabela 1. 2 Tabela 1 Pesos moleculares de moléculas sintéticas e biológicas. Químicos Biológicos Composto Massa molar (u) Ác. Acetilsalicílico 180 Meropenem 383 Rituximabe Somatropina Fonte: Encyclopedia of Ind. Biotech.: Bioprocess, Bioseparation and Cell Technology 3 De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), e de sua resolução RDC nº 55 4, e também de acordo com Walsh 1, os medicamentos de origem biológica podem ser divididos em diferentes categorias. Abaixo estão listadas as categorias, seguidas de exemplos. Fatores de coagulação sanguínea: Fator VIII e Fator IX; Agentes trombolíticos: Alteplase, Reteplase; Hormônios: Insulina, Somatropina, Gonadotropina; Fatores de Crescimento: Eritropoietina (EPO), Fator estimulante de colônias (CSF);

17 17 Citocinas: Interferona-α (IFN-α), Interleucina-2 (IL-2); Anticorpos Monoclonais: Adalimumabe, Bevacizumabe; Vacinas: vacina recombinante contra Hepatite B Histórico A indústria farmacêutica, durante quase todo o século XX esteve fundamentada nos medicamentos químicos, que são moléculas de baixo peso molecular, produzidas a partir de sínteses químicas. Esses produtos dominaram o mercado e atingiram um valor estimado de 100 bilhões de dólares nos anos No entanto, métodos de terapias utilizando moléculas extraídas de fontes biológicas já haviam sido estudados. Em 1922, Frederick Banting e Charles Best obtiveram sucesso ao utilizar insulina coletada do pâncreas de um animal no tratamento de um paciente com diabetes, doença fatal na época. 5 Também, em 1958, Raben extraiu hormônio do crescimento (hgh) da hipófise de um cadáver, e o utilizou para tratar um garoto de 17 anos. 6 Com isso, essas duas moléculas foram, por muitos anos, utilizadas no tratamento de deficiência hormonal como únicas opções. 2 Com a descoberta da estrutura dupla hélice do DNA, por James Watson e Francis Crick em , algumas proteínas que eram produzidas naturalmente pelo corpo humano, e suas aplicações terapêuticas foram pesquisadas. Porém, apesar de terem grande potencial, devido ao fato de serem produzidas naturalmente em pouca quantidade, o estudo e prováveis aplicações terapêuticas tornaram-se inviáveis. 8 Então, em 1973, Stanley Cohen e Herbert Boyer realizaram o primeiro experimento de engenharia genética, introduzindo a técnica de criação de DNA recombinante. 9 Esse método se tornou foco de grandes estudos na área de biomedicamentos, e fundamenta os principais produtos baseados em proteínas recombinantes que são produzidos em escala industrial atualmente. 8 O primeiro produto aprovado pela FDA (Food and Drugs Administration), para comércio produzido a partir da técnica de proteína recombinante, em 1982, foi

18 o Humulin, insulina humana recombinante, idêntica à insulina humana nativa, produzida em Escherichia coli No Brasil o Humulin foi aprovado em 1983 (segundo informação fornecida pela fabricante Eli Lilly), e desde então vários outros biomedicamentos têm conseguido aprovação. Esses medicamentos são na sua maioria importados, e em 2013 a ANVISA autorizou a produção do primeiro biomedicamento totalmente nacional, o etanercepte, utilizado no tratamento de artrite reumatóide Proteínas A maior parte dos biomedicamentos, já comercializados ou ainda em estudos, é baseada em proteínas, e são na sua maioria produzidos através da tecnologia de proteína recombinante. 1 Proteínas são cadeias poliméricas consistindo de séries, que podem ser curtas ou longas, de aminoácidos (aminoácidos esses que podem ser de vinte tipos diferentes, porém cada tipo pode aparecer várias vezes na cadeia), que estão ligados entre si por ligações peptídicas. 11 Os aminoácidos são compostos orgânicos, sintetizados a partir da junção de três nucleotídeos (denominados códons, formados por ácido fosfórico, açúcar e uma base que pode ser citosina, adenina, guanina, tiamina ou uracila), e têm em sua estrutura um grupo amina (-NH2) e um grupo carboxílico (-COOH), e uma cadeia ramificada específica. A Figura 1 exemplifica alguns tipos de aminoácidos e suas estruturas químicas. 12 Figura 1 Estrutura de alguns aminoácidos encontrados em proteínas. Fonte: Lehninger's Principles of Biochemistry, adaptado. 11

19 Ao ligar-se na cadeia peptídica, os aminoácidos recebem a denominação de resíduos de aminoácidos porque perdem o elemento água ao ligarem-se em outro aminoácido por ligação peptídica. Dois aminoácidos formam um dipeptídeo, três formam um tripeptídeo, e muitos aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas formam um polipeptídeo. Usualmente os termos proteína e polipetídeo são usados no mesmo sentido, porém cientistas assumem que polipeptídeos têm um peso molecular menor que as proteínas. 11 Ao ligarem-se entre si, e formarem as proteínas, os aminoácidos assumem uma conformação específica tridimensional. Essa conformação depende da cadeia de aminoácidos (com os vinte diferentes aminoácidos possíveis, pode-se sintetizar proteínas imensamente diferentes, específicas para determinada função na célula), e é estabilizada por fracas interações não covalentes. Se essas interações forem desfeitas, por algum agente externo, a conformação tridimensional da proteína também é desfeita, causando a desnaturação da proteína e consequente perda da sua função. 1, Segundo Murray 12, as estruturas das proteínas podem ter quatro diferentes aspectos, dependendo dos aminoácidos presentes: Estrutura primária: Nível estrutural mais simples da cadeia, dado pela sequencia de aminoácidos, de onde deriva o arranjo espacial. 1 Estrutura secundária: É dada pela conformação espacial dos aminoácidos da cadeia principal da proteína, excluindo as cadeias ramificadas. Na sequencia principal podem-se observar padrões de conformação que se repetem. Os padrões mais comumente observados são α-hélice e β-folhas, conforme ilustrados na Figura 2, que são estabilizados por pontes de hidrogênio entre os aminoácidos próximos nas cadeias Estrutura terciária: É a estrutura tridimensional exata da proteína, indicando a posição no espaço de todos os polipeptídios presentes. É resultado das α-hélice e β-folhas enoveladas, e mantida por ligações hidrofóbicas. 13 Estrutura quaternária: Estrutura adotada pela união de um número de moléculas protéicas, por ligações não covalentes, agindo como um único complexo de proteínas

20 20 Em adição, as estruturas das proteínas não são rígidas. Elas podem adquirir diferentes conformações enquanto desempenham as suas funções. 12 Figura 2 Conformações α-hélice e β-folhas. Fonte: Molecular biology of the cell, adaptado Síntese de proteínas A síntese de proteínas ocorre dentro das células. Ela inicia-se no núcleo, onde os genes de uma fita da dupla hélice do DNA são lidos pela enzima RNAúnica fita, de polimerase, que sintetiza o RNA mensageiro (mrna), uma acordo com os genes copiados do DNA. No mrna está o código genético formado pelos nucleotídeos, e que dará origem aos aminoácidos da proteína. Esse processo é denominado transcrição. O mrna então é transportado para o citoplasma, onde ocorrerá o processo de tradução. 14 Na Figura 3 estão ilustrados os passos da síntese de proteína. No citoplasma encontram-se os ribossomos, que participam da síntese protéica, ligando-se ao códon inicial do mrna. Toda célula tem em seu citoplasma os RNA transportadores (trna), cada um com um anticódon para a a tradução de um aminoácido específico. No instante em que o ribossomo liga-se ao códon inicial do mrna, esse códon é reconhecido por um trna com o anticódon específico, que liga-se ao mrna, formando uma base complementar e traduzindo em um aminoácido. Esse processo continua ao longo da molécula

21 do mrna até que encontre-se um códon terminal. Então um fator de liberação se liga ao códon terminal, liberando a cadeia polipeptídica finalizada Figura 3 Síntese de proteína. Fonte: Protein Synthesis, disponível em svg/640px-protein_synthesis.svg.png Modificação pós-translacional de proteínas Após a síntese da proteína (ou durante, em poucos casos), os polipeptídeos podem sofrer modificações covalentes que são denominadas modificações pós-translacionais (PTM). Essas modificações podem alterar a função biológica e/ou estruturas das proteínas, e são de grande importância no ramo dos biomedicamentos. 1 Seguem as mais importantes PTMs para os biomedicamentos: Glicosilação: É o processo de anexar carboidratos às proteínas. Essas glicoproteínas podem ter a sua meia-vida ou atividade biológica alterada, melhorada. Além disso, a glicosilação pode melhorar a conformação da estrutura tridimensional das proteínas. 15 Carboxilação e hidroxilação: Processos usados nos produtos de fatores sanguíneos VII e IX. A carboxilação converte resíduos de aminoácido glutamato em carboxiglutamato, enquanto que a hidroxilação converte os resíduos de aspartato em hidroxiaspartato. Ambos os processos ajudam na ligação de íons de cálcio, essenciais para o funcionamento dos fatores sanguíneos. 1, 15

22 22 Existem vários tipos de proteínas no corpo humano que são usadas em medicamentos biológicos. Um tipo dessas proteínas são os hormônios, grupo no qual se inclui o primeiro medicamento biológico produzido a partir de DNA recombinante, a insulina Hormônios De acordo com a US National Library of Medicine, hormônios são substâncias que regulam a atividade de órgãos específicos do corpo. São produzidos principalmente pelas glândulas endócrinas, como a Insulina produzida pelo pâncreas, que liberam os hormônios na rede sanguínea até que cheguem à sua célula de destino. Na célula, os hormônios ligam-se a seus receptores, e ativam funções específicas. 16 Baseado em sua natureza química, os hormônios podem ser classificados em peptídicos (proteínas) e não peptídicos. Os hormônios peptídicos são os de maior número, e seu tamanho pode variar de três a mais de duzentos aminoácidos. Os hormônios são essenciais para o crescimento e desenvolvimento dos organismos eucariontes, e sua deficiência pode causar sérias doenças. 17 Os hormônios que estão em foco neste trabalho são a insulina, o hormônio do crescimento (Somatropina) e as gonadotropinas. Esses três hormônios são produzidos por glândulas endócrinas e são comercializados mundialmente, produzidos pelo método de proteína recombinante ou coletados de fonte animal Insulina Insulina é um hormônio, com massa molecular de 5.800Da, produzido pelas células Beta das Ilhotas de Langerhans, que são um grupo especial de células localizadas no pâncreas. Esse hormônio é responsável pela captação e utilização dos nutrientes dos alimentos ingeridos, regulando assim o nível de glicose no sangue. Apesar de muitas células no corpo expressarem o receptor da insulina, sua ação principal é no fígado, músculos e tecido adiposo, onde começam a agir a partir de poucos minutos após a ingestão do alimento. 18

23 23 Quando o alimento é ingerido, o nível de glicose no sangue aumenta, devido aos carboidratos. Esse aumento da glicose estimula a liberação de insulina pelo pâncreas, que é liberada na rede sanguínea. Ao atingir as células do fígado, a insulina liga-se a seus receptores na superfície celular, e assim estimula a síntese de glicogênio, que é armazenado, a partir da glicose. 1 Além disso, nos músculos e tecidos adiposos, a insulina estimula a absorção da glicose que será convertida em glicogênio no primeiro, em ácidos graxos para ser armazenada como triglicérides no segundo. A Figura 4 ilustra a ação desses hormônios nos órgãos e tecidos citados. 19 Figura 4 Ação dos hormônios no fígado, músculo e tecido adiposo. Fonte: Endocrinology: an integrated approach, adaptado. 19 O glucagon é um hormônio produzido pelas células Alfa das ilhotas de Langerhans, e tem mecanismo de ação contrário à insulina. Enquanto a insulina ativa as vias anabólicas, como a síntese de glicogênio (ao estimular a enzima glicogênio sintase e inibir a enzima glicogênio fosforilase) 19, o glucagon ativa as vias catabólicas, sintetizando a glicose a partir do glicogênio, a liberando na rede sanguínea. O glucagon é liberado pelo pâncreas quando o nível de glicose no sangue está baixo. 1

24 Diabetes Mellitus tipos 1 e 2 O diabetes mellitus tipo 1 caracteriza-se pela deficiência de produção de insulina no pâncreas. Isso ocorre devido à destruição das células β das ilhotas de Langerhans, que são responsáveis pela produção de insulina, que são atacadas pelo próprio sistema imunológico do indivíduo. Normalmente ocorre na infância ou adolescência. 18 A destruição das células produtoras de insulina pode se dar por fatores genéticos, ambientais, ou acredita-se ainda que pode ser desencadeado por uma invasão viral. Neste caso, o sistema imunológico atacaria as células infectadas pelo vírus, e juntamente as células β do pâncreas. 20 Essa condição pode ser controlada pela administração de insulina, que nos dias atuais é produzida e comercializada mundialmente pelo método de DNA recombinante, normalmente por injeções subcutâneas. 1 O diabetes mellitus tipo 2 é uma condição que ocorre mais comumente em pessoas com mais de 40 anos e obesas. Nesse tipo, a insulina ainda é produzida pelo corpo, porém sua ação é dificultada, causando uma resistência do corpo à insulina. Esse tipo não pode ser tratado com injeções de insulina Produção de Insulina A insulina para uso comercial, tradicionalmente era extraída diretamente de animais (porcos e gado de casas de abate), e passavam por processos cromatográficos de purificação. Essa insulina, segundo Walsh 1, derivada de animais, possuía algumas desvantagens, como a baixa disponibilidade para tratar as 200 milhões de pessoas com diabetes no mundo. Além disso, a insulina bovina possui três aminoácidos diferentes da humana, o que pode causar uma resposta imunológica. Com os avanços da técnica de DNA recombinante, cientistas passaram a produzir a insulina com essa técnica, e em 1982 o primeiro biomedicamento produzido por DNA recombinante foi aprovado para uso médico. Atualmente, há diversos fabricantes comercializando a insulina idêntica à humana, além de

25 insulinas modificadas geneticamente, que podem ter um efeito prolongado ou mais rápido Hormônio do Crescimento Humano O hormônio do crescimento humano (hgh), também conhecido por Somatropina ou Somatotropina, é um hormônio polipeptídico, contendo 191 resíduos de aminoácidos e massa molecular igual a 22kDa, sintetizado na glândula adeno-hipófise. Sua síntese e liberação são reguladas por dois fatores hormonais, a somatorelina para a liberação, e somatostatina para inibição. 18 Esse hormônio é o principal responsável pelo crescimento e desenvolvimento do corpo em humanos e animais, além do crescimento e regeneração celular e crescimento das células dos ossos, músculos e cartilagens. Seu mecanismo de ação, como outros hormônios, baseia-se na ligação a um receptor específico na superfície celular. 1, Deficiência do hgh Durante os anos de crescimento corporal, a deficiência na produção e/ou liberação do hgh pode ocasionar nanismo pituitário, caracterizado pela altura 20% menor do que as pessoas que não apresentam nanismo. Por outro lado, produção acima da média desse hormônio pode causar gigantismo e acromegalia, caracterizados por alargamento de mãos, pés e do maxilar e estatura acima da média. 21 Outros problemas causados pela deficiência do hgh podem ser o atraso da maturidade sexual em jovens, e em adultos, pode causar um aumento da massa gordurosa e relativa perda da massa muscular Uso terapêutico do hgh O hgh foi usado terapeuticamente em 1958 no tratamento de nanismo pituitário. 6 O tratamento com o hormônio difundiu-se desde então, e em meados dos anos 80 ele era usado em grande escala. Nessa época, o hormônio usado nos tratamentos era extraído de cadáveres humanos. Em 1985, o uso desse hormônio extraído de cadáveres foi terminado devido à

26 ligação do uso dessa substância, para tratar um paciente quinze anos antes, com a doença de Creutzfeld-Jakob, condição rara, porém fatal que afeta o cérebro. 23 A partir desse caso, diversos outros casos dessa doença foram ligadas à administração de hgh nos pacientes, o que causou o fim da produção e comércio desse hormônio nas condições em que eram realizados. 24, Nesse mesmo período, os primeiros hgh recombinantes estavam começando a surgir, o que pôde suprir as necessidades dos pacientes com deficiência desse hormônio, após o término do hgh extraído de cadáveres. 1 Nos dias atuais, todo o hgh comercializado é produzido pela técnica recombinante. Ele tem se mostrado efetivo também no tratamento de outras condições, incluindo Sindrome de Turner, insuficiência renal crônica, e como anabolizante. Ainda assim, o tratamento contra nanismo é o principal motivo de uso dessa substância Gonadotropinas Esta família de hormônios é denominada gonadotropina devido a seus alvos de ação serem as gônadas (ovários e testículos), e estão ligados diretamente à produção de gametas e consequentemente à reprodução. Existem três hormônios dessa família que são usados terapeuticamente: o hormônio luteinizante (LH) e o hormônio folículo estimulante (FSH) que são produzidos na adeno-hipófise e ocorrem tanto em homens quanto em mulheres; e a gonadotropina coriônica (hcg), hormônio sintetizado por trofoblastos extra-embrionários e por células da placenta apenas em mulheres grávidas. 18 O hormônio hcg é liberado pelos trofoblastos durante o inicio da gravidez, e garante a manutenção do corpo lúteo no ovário nesse período, liberando progesterona e garantindo a continuidade da gravidez. A partir da décima/décima primeira semana, esse hormônio passa a ser liberado pela placenta. 26 A produção e liberação do LH e do FSH na adeno-hipófise são controladas pelo hormônio de liberação das gonadotropinas (GnRH). Esse

27 27 hormônio é considerado como um neuro hormônio, por ser sintetizado em células neurais e sua liberação é regulada pelo hipotálamo. Quando liberado, esse hormônio liga-se ao seu receptor nas células da adeno-hipófise, estimulando a secreção dos hormônios. A atividade do GnRH é baixa durante a infância, porém atinge alto índice durante a maturidade sexual e nos períodos de ovulação. 27 O FSH em homens atinge as células de Sertoli, encontradas nos testículos, onde vai estimular a espermatogênese. Nas mulheres, esse hormônio atinge as células do folículo ovariano. O FSH estimula o desenvolvimento e crescimento folicular, e com isso a ovulação. 1 O LH tem seus receptores nas células de Leydig, localizadas nos testículos, e nas células da teça e da granulosa nas mulheres. Ele estimula a síntese de testosterona e progesterona, além de romper o folículo dominante durante ovulação e ser necessário para a expressão do receptor do FSH nas mulheres Deficiência e uso terapêutico A deficiência dessa família de hormônios pode causar infertilidade, tanto em homens quanto em mulheres, devido à falta de maturação dos gametas. 18 O uso de gonadotropinas na estimulação de ovários para a ovulação dáse desde o começo dos anos 60. De lá para cá, o tratamento evoluiu, com a tecnologia recombinante, e formas mais puras e modificadas dos hormônios para obtenção de melhores resultados. 28 A principal indicação das gonadotropinas é para a indução da ovulação em mulheres que não ovulam devido à disfunção da hipófise, ou que tenham síndrome do ovário policístico. Mulheres que apresentam infertilidade, apesar de não apresentarem nenhuma das duas condições citadas e apresentarem ovulação normal, também podem ser tratadas com esses hormônios. 18, 29 Em homens, esses hormônios são usados em tratamentos de fertilidade para iniciar a espermatogênese. Homens com hipogonadismo hipogonadotrópico, condição causada pela diminuição do funcionamento das gônadas e consequentemente baixa taxa de produção de hormônios sexuais,

28 são submetidos a esse tratamento, que tem mostrado resultados satisfatórios em estudo Além disso, o hcg é a base dos testes de gravidez vendidos em farmácia. No início da gravidez a mulher produz esse hormônio, que ao serem detectados na urina durante o teste indicam resultado positivo para a gravidez Produção comercial de Gonadotropinas Os hormônios dessa classe são comercializados desde meados dos anos 60. Nessa época, havia apenas uma fonte, eles eram extraídos da urina de mulheres na pós-menopausa, obtendo-o FSH. Esse tipo de FSH, que também contém níveis variáveis de LH, é chamado de Menotropina. O hcg é extraído da urina de mulheres grávidas. 31 Esse processo persiste ainda atualmente. Há padrões a serem seguidos, como coleta de urina apenas de países com baixa incidência de HIV e ausência da doença de Creutzfeld-Jakob (para evitar o ocorrido com o hgh, citado anteriormente). A urina, que contém aproximadamente 2% de FSH passa por múltiplos processos de purificação por cromatografia para remover qualquer vírus, e ainda passa por um processo de desativação viral. O produto final contém mais de 95% de FSH puro, e é aprovado pela FDA. 32 Em 1995, tornaram-se disponíveis no mercado as gonadotropinas recombinantes, porém as que são produzidas a partir da urina não deixaram de existir. 31 Os hormônios FSH recombinante recebem a denominação rhfsh, e são clinicamente efetivos na estimulação do crescimento folicular em mulheres. São produzidos em células ovarianas de hamsters e apesar de exibirem sequencia de aminoácidos idêntica à humana, possuem glicosilação levemente diferenciada. Essa preparação é bem tolerada quando administrada em humanos, sem efeitos adversos inesperados Anticorpos Monoclonais Anticorpos monoclonais são anticorpos específicos idênticos, que são clonados a partir de uma única célula imunizada. Esse conceito foi

29 29 primeiramente desenvolvido por Kohler e Milstein em 1975, ao fundirem com sucesso uma célula de mieloma (tipo de câncer que atinge os linfócitos-b no sangue) com linfócito-b (no caso essa célula foi clonada de linfócitos-b de ratos imunizados), que são células produtoras de anticorpos e principais agentes do sistema imunológico. 33 Figura 5 Diferenças entre anticorpos policlonais e monoclonais. Fonte: Pharmaceutical Biotechnology: Concepts and Applications, adaptado. 1 Os linfócitos-b, um tipo de glóbulo branco, são as células responsáveis por produzirem os anticorpos na presença de um antígeno, regulando assim a imunidade humoral. A região no antígeno onde se ligam os anticorpos é denominada epítopo, e um antígeno tem centenas de epítopos diferentes em sua molécula. As células de linfócito-b, assim como os antígenos, são específicas e produzem diferentes anticorpos que se ligarão ao seu epítopo especifico no antígeno. Os anticorpos policlonais são produzidos de clones celulares contendo anticorpos que se ligarão a epítopos diferentes. Os anticorpos monoclonais são produzidos de forma que apenas um tipo de anticorpo especifico para apenas um antígeno esteja presente, aumentando a eficácia terapêutica ao atacar o epítopo específico que destruirá o antígeno. 1 A

30 Figura 5 ilustra a diferença entre os anticorpos produzidos no corpo humano, e os monoclonais, de única especificidade. 30 Hoje, esses anticorpos monoclonais são assunto de inúmeras pesquisas e estudos, pois representam grande potencial no tratamento de doenças como câncer, doenças autoimunes e inflamatórias Método de produção hibridoma O experimento de Kohler e Milstein, em 1975, que gerou o processo hibridoma, consistiu em uma linha celular produzida a partir da fusão de células de mieloma de ratos (células essas que não produziam anticorpos), com células do baço de rato previamente imunizado. Essas células do baço produzem linfócitos-b, e consequentemente anticorpos. Ao serem fundidas, essas células formam um hibridoma, que mantém características de célula imortal do mieloma, e produzem anticorpos por um longo tempo (diferente das células B isoladas, que têm um curto tempo de vida in vitro). Assim, como ilustrado pela Figura 6, podem-se produzir anticorpos monoclonais ao isolar os linfócitos-b de interesse e formar os hibridomas desses linfócitos. 33, 34 Figura 6 Método Hibridoma com células murinas. Fonte: Culture Cell Dish Website, adaptado. 35

31 31 No entanto, esses anticorpos, apesar do grande potencial no tratamento de doenças autoimunes e tumores, mostraram-se ineficientes durante testes clínicos, e em alguns casos provocaram reações adversas indesejadas Anticorpos monoclonais de primeira geração Os anticorpos produzidos a partir do método original de Kohler e Milstein são denominados de anticorpos monoclonais de primeira geração. Eles eram produzidos totalmente de células murinas (células de ratos), e durante testes clínicos demonstraram grande ineficácia em humanos. Por serem proteínas derivadas de células de camundongos, esses anticorpos provocaram, em 50 a 75% dos receptores, resposta imunológica indesejada. Além disso, eles apresentaram penetração insuficiente nos tumores, e baixa meia-vida em humanos. A partir de então, buscaram-se outras técnicas para criar os anticorpos monoclonais sem as inconveniências das células totalmente murinas. 2 O primeiro anticorpo monoclonal, produzido inteiramente de células murinas, aprovado para uso clinico em humanos pela FDA foi o Muromomabe, em Esse medicamento pode desencadear desde reações alérgicas até encefalopatias ou edemas pulmonares, além da produção de anticorpos humanos anti-camundongo (HAMA human anti-mouse antibodies), o que levaria a uma posterior eliminação do anticorpo monoclonal murino. A indicação do muromomabe era para o tratamento de rejeição em transplante de órgãos Anticorpos monoclonais de segunda geração Para contornar o problema das células murinas, cientistas criaram em 1984 uma forma de anticorpo monoclonal denominada quimérica, utilizando de técnicas de DNA recombinante. Neste modelo, o anticorpo consistia de uma parte de célula murina variável e específica (a parte que se liga ao antígeno), e uma parte fixa, de célula humana. 37 Pela estrutura do anticorpo, na Figura 7, podem-se notar duas regiões diferentes: Fc e Fab. A região hipervariável é a região que se liga ao antígeno,

32 32 sendo especifica para cada epítopo existente. A região Fc é fixa e não se altera nos anticorpos. A partir de técnicas de DNA recombinante, clona-se o domínio Fab murino e o acopla a regiões de Fc humano, originando assim os anticorpos monoclonais quiméricos, que possuem maior meia vida no organismo humano e melhor capacidade de ativar os mecanismos de defesa. 38 Figura 7 Estrutura de um anticorpo. Fonte: Medicamentos biológicos na prática médica. 2 Além do quimérico, desenvolveu-se outro tipo de anticorpo monoclonal, o humanizado, tentando assim aproximar-se ao máximo possível do anticorpo produzido em humanos. Neste tipo de anticorpo, as regiões Fc e Fab são derivadas de anticorpos humanos, e apenas a região hipervariável da área Fab é descendente de células murinas, obtendo-se assim uma melhor aceitação pelo sistema imune do corpo humano Anticorpos monoclonais inteiramente humanos A partir dos anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, cientistas tentaram criar anticorpos monoclonais inteiramente humanos, para minimizar ainda mais o risco de imunogenicidade que as células murinas poderiam causar. Duas abordagens de sucesso foram identificadas: utilização de ratos transgênicos, e a técnica de Phage Display. 40 Na Figura 8 estão os diferentes anticorpos monoclonais atualmente produzidos.

33 33 O método de utilização de ratos transgênicos consiste em transferir genes de imunoglobina humana no genoma do animal, que é vacinado em seguida contra o antígeno específico para o qual se deseja produzir os anticorpos monoclonais. Ao ser vacinado, os linfócitos B do rato produzem anticorpos com a região hipervariável idêntica à humana, diminuindo assim os riscos de resposta imunológica ao serem administrados nos pacientes humanos. Essa técnica tem grande sucesso na produção de anticorpos monoclonais humanos, sendo usada em sete dos nove produtos que são comercializados (outros dois usando técnica de Phage Display). 41 A técnica de Phage Display consiste em uso de bacteriófagos para determinar interações proteína proteína ou proteína DNA. Nessa técnica, insere-se o código de uma proteína de interesse no fago, que vai exibir essa proteína em seu exterior e ter o código genético dela no seu interior. Esses fagos passam então por uma varredura em uma biblioteca de proteínas, peptídeos e DNA, para detectar possíveis interações. Assim, pôde-se criar uma biblioteca de fagos exibindo anticorpos, que podem ser acessados para coletar o anticorpo de interesse para a posterior síntese. 41 Figura 8 Classes de anticorpos monoclonais existentes hoje no mercado. Fonte: Monoclonal antibody therapeutics: history and future, adaptado. 39

34 Tratamentos com anticorpos monoclonais Anticorpos monoclonais no tratamento de artrite reumatóide A artrite reumatóide atinge aproximadamente 25 homens e 54 mulheres a cada , e se apresenta entre os 30 e 50 anos de idade. É uma doença sistêmica autoimune, inflamatória e crônica, que causa inflamação de tecidos e órgãos, principalmente das juntas, causando dor e debilitando os movimentos. A doença caracteriza-se por uma inflamação da membrana sinovial (membrana que envolve as juntas), seguida de inchaço, secreção de altas quantidades de fluidos sinoviais, e desenvolvimento de tecido fibroso. A patologia leva à destruição da cartilagem envolvendo essas áreas e fusão das juntas. 42 A falha na identificação de pacientes com artrite em estagio inicial pode levar ao subseqüente desenvolvimento de artrite reumatóide. Pacientes apresentando inchaço, dor e endurecimento poliarticular, em padrões simétricos podem ser clinicamente diagnosticados com artrite reumatóide, o que pode ser posteriormente confirmado com radiografias e exames laboratoriais. 43 Os anticorpos monoclonais que são comercializados atualmente para o tratamento da artrite reumatóide são: adalimumabe, certolizumabe, golimumabe e infliximabe. Esses medicamentos têm a função de bloquear o fator de necrose tumoral (TNF), que é uma citocina inflamatória encontrada no fluido sinovial de pacientes com artrite reumatóide, cuja inibição tem se mostrado eficiente no tratamento dessa doença. Usualmente, o tratamento demonstra resultados superiores se a droga for administrada em associação com outras drogas modificadoras do curso da doença (DMCD) Anticorpos monoclonais em tratamentos oncológicos Atualmente, alguns tipos de câncer estão sendo tratados com anticorpos monoclonais, caso do câncer colorretal, câncer de mama e de pulmão. Como um grande número de pacientes só tem a doença diagnosticada já em estágio avançado, fazendo da cirurgia inviável, as drogas de ação neoplásica são o único tratamento disponível, porém apresentam grande inconveniente por comprometerem os tecidos saudáveis, além dos patológicos. 2

35 35 Os anticorpos monoclonais são direcionados para células específicas, aumentando assim a eficácia e diminuindo os efeitos adversos devidos à destruição de células saudáveis. Medicamentos como bevacizumabe, nimotuzumabe e cetuximabe já são comercializados no Brasil no tratamento de câncer, apresentando melhor controle da doença, diminuindo a progressão e o risco de morte Técnica de DNA Recombinante A técnica de DNA recombinante consiste basicamente em inserir, no DNA de outro organismo, o gene da proteína humana de interesse, fazendo com que esse organismo que recebeu o gene produza a proteína idêntica à humana em cultivos laboratoriais ou industriais. 16 Para os medicamentos biológicos, os organismos que recebem o gene para produzir a proteína podem ser Escherichia coli (bactéria), Saccharomyces cerevisiae (levedura), ou células animais como células de ovário de hamster chinês (CHO), ou células de rim de hamster bebê (BHK). 1 As primeiras publicações descrevendo com sucesso a replicação intracelular de DNA recombinante apareceram entre 1972 e 1973, e nesses estudos foram utilizadas colônias de E. coli para a produção da proteína recombinante. 9, 44 Figura 9 Atuação da enzima de restrição no DNA e no plasmídeo. Fonte: Diagram of molecular cloning with bacteria and plasmids, disponível em 20px-Gene_cloning.svg.png O primeiro passo desse processo é identificar e isolar o código genético da proteína de interesse. Isso ocorre pela utilização das enzimas de restrição

36 (usualmente endonucleases de restrição). 45 Essas enzimas reconhecem e cortam sequências de DNA definidas, normalmente deixando extremidades coesivas (Sticky ends), as quais serão preenchidas ao se inserir esse fragmento de DNA no vetor, conforme ilustrado na Figura 9. Atualmente, cerca de 800 enzimas de restrição já foram identificadas, cada uma cortando o DNA em um gene específico. Nesta etapa, um mrna com o código da proteína também pode ser um ponto de partida. Nesse caso, através de enzimas, o código contido no mrna é transcrito reversamente, gerando DNA complementar (cdna). 1, Em seguida, coletam-se os vetores, usualmente plasmídeos, que são pequenos segmentos de DNA contendo código necessário para a replicação. Na Figura 10 pode-se ver a estrutura de um plasmídeo, onde há um gene denominado LacZ, que é responsável por sua cor azul. Dentro do LacZ, estão os locais de clonagem, e os locais da restrição, que é onde atuará a mesma endonuclease de restrição que atuou no DNA, abrindo a estrutura do plasmídeo e deixando-o com extremidades coesivas. Como foi utilizada a mesma enzima de restrição, as extremidades coesivas terão as mesmas bases do gene de DNA previamente isolado, fazendo com que o gene de interesse seja incluído nos plasmídeos. Alguns vetores, porém, se fecham logo após serem abertos, não recebendo gene nenhum. 45 Figura 10 Estrutura do plasmídeo. Fonte: Diagram of molecular cloning with bacteria and plasmids, disponível em 20px-Gene_cloning.svg.png Posteriormente os plasmídeos são introduzidos no meio junto com a bactéria. Algumas bactérias são preenchidas com plasmídeo que foi

37 modificado, enquanto outras são preenchidas com plasmídeo sem o gene da proteína de interesse, e outras não tomam plasmídeo nenhum. Como o gene LacZ foi interrompido, no caso dos plasmídeos modificados, a bactéria mantém sua cor original, enquanto que nos outros casos ela fica azul. A esse meio introduz-se um antibiótico, fazendo com que as bactérias que não foram introduzidas com plasmídeo nenhum não sobrevivam. 1, Em laboratórios, essas células são colocadas em placas de Petri de ágar, e incubadas, a fim de começarem a formar colônias. Essas colônias podem ser diferenciadas pela sua coloração, já que as bactérias com plasmídeos sem o gene clonado formarão colônias azuis. As células contendo o plasmídeo com o código da proteína recombinante de interesse são coletadas e formam um banco de células de trabalho, o qual será multiplicado e usado continuamente conforme as necessidades do fabricante. Em processos industriais, devido ao alto nível de expressão heteróloga de proteínas que se podem alcançar, essas células contendo o código da proteína humana normalmente são células de S. cerevisiae ou E. coli. Elas passam então pelos processos Upstream e Downstream, para a obtenção do produto final. 1, Processo Upstream Um frasco é coletado do banco de células de trabalho, mantendo o banco para produções futuras. As células desse frasco são utilizadas para inocular um pequeno volume de meio de cultura estéril, gerando as culturas iniciais em escalas de laboratório. Essa cultura inicial será então utilizada para inocular o biorreator, para a produção dos lotes desejados, onde ocorrerá a fermentação. 1 O biorreator deve ser especificado para controlar os parâmetros do processo a valores pré-determinados pelo fabricante. Parâmetros a serem manipulados podem ser temperatura, pressão e volume, ph do meio, oxigênio dissolvido, taxa de agitação, concentração celular, entre outros pertinentes ao processo. As condições presentes no ambiente interno do reator dependem não só da manipulação pelo operador, mas também das interações celulares com o ambiente, e podem interferir no crescimento celular e na síntese de proteínas. 46