TÉCNICA PARA UTILIZAÇÃO DO BACTRAY I e II (Bactérias Gram negativas oxidase negativa)

Transcrição

1

2 TÉCNICA PARA UTILIZAÇÃO DO BACTRAY I e II (Bactérias Gram negativas oxidase negativa) A) Método de incubação normal (18 a 24 horas) A1) Suspender em água destilada ou deionizada estéril (ph 6,8 a 7,2) a bactéria a ser identificada, de maneira a se obter uma turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala Mac Farland. Obs.: Inóculos com concentrações superiores podem induzir resultados insatisfatórios, assim como o uso de solução salina. Preferencialmente, utilize o crescimento de cultura recente (18-24 horas de incubação). A2) A suspensão acima deve ser bem homogênea, sendo aconselhável o uso de um agitador mecânico. A3) Inocule 1,0 ml da suspensão bacteriana (A1) a cada conjunto (Bactray I e II), após remover a tampa (fig. 1). Fig. 1 A4) Inclinando para trás (fig.2) o conjunto, num ângulo de aproximadamente 45, incline para a esquerda, após para a direita, repetindo esta operação duas vezes, sempre mantendo o mesmo ângulo de inclinação (fig.3). Apoie o tray na mesa de trabalho e incline-o para frente de maneira a obter uma perfeita distribuição do inóculo em todos os substratos (fig. 4). Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 A5) Mantendo-o nesta posição, adicionar 3 gotas de óleo mineral estéril (ou mais se necessário) às provas bioquímicas sublinhadas (ADH, LDC, ODC, H2S, URE) (fig. 5). Obs.: É imprescindível que estes substratos estejam completamente vedados Fig. 5. A6) Recoloque a tampa (de maneira a se obter uma perfeita vedação) e incube o tempo desejado (neste caso, incubação normal de 18 a 24 horas). Recomenda-se incubar em câmara úmida para evitar ressecamento. A7) Após a incubação adicione 2 a 3 gotas dos reagentes necessários: Alfa Naftol e KOH no VP. Observar após 15 a 20 minutos de reação. Cloreto Férrico no PD. Aguardar 2 a 3 minutos para leitura da reação. Reativo de Kovac's no IND. Observar a formação de anel dentro de 2 minutos. Bactray Instruções de uso Página 01

3 B) Método enzimático (4 horas) Proceder como no item A1 à A7 com exceção da turvação, que deve ser igual ao tubo 2 da escala de Mac Farland, e da incubação de 4 horas ao invés de 24 horas. Neste caso, devemos verificar a presença de algum sinal de reação positiva (turvação). Quando isto não ocorrer, devemos reincubar por mais uma hora e adicionar os reagentes necessários. Caso os resultados não sejam satisfatórios, realize o método normal (18 a 24 horas). TESTE ONPG ADH LDC ODC HS 2 URE VP PD IND CIT MAL RHA ADO ARA SAL INO SOR SAC MAN RAF FUNDAMENTO DAS PROVAS REALIZADAS PRINCÍPIOS FÍSICO-QUÍMICOS A hidrólise da beta-galactosidase (o-nitrofenol-beta-d-galacto-piranoside) para galactose na presença do o-nitrofenol desenvolve cor amarela Arginina dehidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia. Isto ocasiona uma elevação do ph do sistema com a conseqüente mudança do indicador de amarelo para púrpura. Lisina descarboxilase transforma a lisina num composto básico de amina primária (cadaverina) e Co 2. Esta amina produz uma elevação do ph do sistema com a conseqüente mudança do indicador de amarelo para púrpura. Ornitina descarboxilase transforma a ornitina num composto básico de amina primária (putrescina) e Co 2. Esta amina produz uma elevação do ph do sistema com a conseqüente mudança do indicador de amarelo para púrpura. O sulfeto de hidrogênio é produzido pela hidrólise enzimática do tiossulfato. Na presença do citrato férrico forma um precipitado negro. A urease hidrolisa enzimaticamente a uréia com produção de amônia e Co 2. Este é um teste para verificação da produção de acetoína, produto este intermediário da degradação da glicose. Sua presença é indicada pela cor vermelha ou rosa, formada pela reação do complexo hidróxido de potássio e alfa naftol. A desaminação da fenilalanina, produzida pelo ácido fenil pirúvico, forma uma cor verde na presença de cloreto férrico. A metabolização do triptofano pela triptofanase resulta na produção de indol formando um complexo de cor rosa ou vermelho com o reagente de Kovac's. Consiste na utilização de citrato como única fonte de carbono, o qual quando metabolizado, resulta num produto alcalino de coloração azul ou verde azulado. Consiste na utilização de malonato como única fonte de carbono, o qual quando metabolizado, resulta num produto alcalino de coloração azul ou verde azulado. Consiste na utilização de carboidratos com a concomitante produção de ácido, mudando o indicador de azul para amarelo. COMPONENTE REATIVO ONPG Arginina Lisina Ornitina Tiossulfato de sódio Uréia Glicose L-fenilalanina Triptona Citrato de sódio Malonato Rhamnose Adonitol Salicina Arabinose Inositol Sorbitol Sacarose Manitol Rafinose Bactray Instruções de uso Página 02

4 Interpretação das provas após incubação É interessante que o bacteriologista possua sempre mais informações que as fornecidas pelas reações bioquímicas (tais como origem e morfologia colonial), visando uma perfeita identificação final. Estas alternativas não são usadas como dados básicos computáveis e sim, consideradas como informações complementares para todas as identificações. Examine cuidadosamente todas as reações, pois não são idênticas às dos outros sistemas. As reações do BACTRAY devem ser definidas exatamente da maneira como se descrevem. TESTE POSITIVO NEGATIVO OBSERVAÇÕES ONPG amarelo inalterado Qualquer tonalidade de amarelo é considerada reação positiva. ADH LDC ODC púrpura HS 2 precipitado negro Amarelo, marrom*, cinza, vermelho/vinho, amarelo esverdeado ausência de precipitado URE vermelho amarelo ou laranja 1. Positivo forte = púrpura escuro 2. Positivo claro = púrpura claro 3. Negativo = amarelo 3.1. Não fermentação de dextrose: a) Cinzento = característica de Acinetobacter sp b) Vermelho-vinho-violeta = característica de Pseudomonas sp *3.2. Fraca fermentação da dextrose : Marrom avermelhado = característica de Serratia sp 3.3. Boa fermentação de dextrose: Amarelo ou amarelo esverdeado = característica de E. coli (fracamente negativo) Para obter uma boa leitura cobrir com óleo mineral estéril. Uma coloração marrom desenvolvida no meio é considerada reação negativa. Só reação de cor vermelha ou cereja é considerada positiva. Devese utilizar uma camada de óleo mineral estéril. * VP Vermelho ou rosa inalterado Após 15 ou 20 minutos de reação. A observação de alguma tonalidade de vermelho ou rosa é considerada positiva. * adicionar: 2 a 3 gotas de alfa naftol e 2 a 3 gotas de KOH a 40% * PD verde amarelo Aguardar um ou dois minutos para leitura da reação. Tome cuidado pois esta reação desaparece em poucos minutos * adicionar 2 a 3 gotas de cloreto férrico * IND anel rosa ou vermelho * 2 a 3 gotas do reativo de KOVAC'S CIT MAL RHA ADO SAL ARA INO SOR SAC MAN RAF azul ou azul esverdeado Azul, verde escuro, azul esverdeado Amarelo Anel amarelo verde Amarelo ou verde claro Verde ou azul esverdeado A reação ocorre dentro de dois minutos após adicionado o reagente. Fazer este teste por último Esta é uma reação aeróbia Organismos com crescimento lento podem demonstrar positividade como azul esverdeado após 18 horas. A reação deverá ser lida dentro de 24 horas pois incubação mais longa pode provocar a alteração do meio para alcalino. Bactray Instruções de uso Página 03

5 TÉCNICA PARA UTILIZAÇÃO DO BACTRAY III (Bactérias Gram negativas oxidase positiva) As recomendações para o uso do Bactray I e II são válidas para este, exceto a selagem das provas bioquímicas (item A5) que estão sublinhadas, ou seja, controle dehidrolase (CTL), ARG e URE, onde se coloca 3 gotas de óleo mineral para cada reação. Após incubação (18 a 24 horas) verifique as reações ESC, CET e ARG. Se alguma delas for positiva, adicione o reagente para indol no pocinho apropriado e determine o código. Caso contrário, reincube por mais 24 horas. Após esta incubação, caso não haja crescimento, ou este tenha sido escasso, deve-se repetir a prova fazendo novo inóculo, usando-se soro fisiológico estéril (ao invés de água destilada). Este procedimento é realizado quando se suspeita de um microorganismo exigente, por exemplo, algumas espécies do gênero Vibrio. FUNDAMENTOS DAS PROVAS BIOQUÍMICAS Cetrimide Acetamida Malonato Citrato Maltose Esculina L-Arginina CTL (Controle) Uréia Indol Crescimento indica tolerância para cetrimide. A utilização destas substâncias como única fonte metabólica de carbono, produz a alcalinização do meio. Uma elevação do ph muda o indicador de verde para azul. A utilização de carboidratos resulta na produção de ácido, mudando o indicador (vermelho de fenol) de vermelho para amarelo, ou amarelo-alaranjado. A hidrólise da esculina é detectada pelo citrato férrico amoniacal, formando um precipitado negro. A arginina dehidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia. Isto ocasiona uma elevação do ph do sistema, mudando o indicador de amarelo para alaranjado ou vermelho. Esta prova serve de branco para leitura da arginina. Observe a coloração deste controle. Caso a cor obtida na arginina seja de maior intensidade (vermelho, laranja ou rosa), esta é considerada positiva. A hidrólise enzimática da uréia pela urease resulta na produção de amônia e Co 2, mudando o indicador para vermelho. A desagregação (metabolização) do triptofano pela triptofanase resulta na produção de indol, formando um complexo de cor rosa para vermelho com o reagente de Kovac's. Bactray Instruções de uso Página 04

6 Interpretação das provas após incubação TESTE POSITIVO NEGATIVO COMENTÁRIOS Cetrimide Crescimento Ausência de A turvação (crescimento) fornece positividade à prova crescimento Acetamida Malonato Citrato Azul ou Azul esverdeado Verde Alguma tonalidade de azul é considerada reação positiva Maltose Amarelo Amarelo alaranjado Vermelho alaranjado Vermelho Alguma tonalidade de alaranjado sugere a produção de ácido: considera-se positivo Esculina Marrom Negro Claro A Pseudomonas aeruginosa pode formar uma pigmentação marrom brilhante indicando a presunção duma reação positiva. Esta pigmentação, usualmente, forma um efeito de superfície fosca na área reativa que pode ser confundida como reação positiva. O positivo verdadeiro é mais escuro e difundido uniformemente, em toda a superfície L-Arginina Vermelho Rosa Dehidrolase ou alaranjado Amarelo A interpretação da reação é baseada na coloração obtida no controle. Vide quadro abaixo. Uréia Vermelho Cereja Amarelo Alaranjado Qualquer tonalidade de vermelho observada é considerada reação positiva. Indol Anel Rosa ou Vermelho Inalterado Para uma reação positiva existe uma demora de 2 minutos. CTL CONTROLE ARG RESULTADO 1) Amarelo Amarelo Negativo 2) Vermelho Vermelho Negativo 3) Laranja Laranja Negativo 4) Amarelo Vermelho Positivo 5) Laranja Vermelho Positivo 6) Amarelo Rosa ou laranja Positivo Bactray Instruções de uso Página 05

7 CÁCULO MANUAL DOS CÓDIGO 1. BACTRAY I ONPG ADH LDC ODC HS 2 URE VP PD IND CIT 1 2. BACTRAY I e II Neste caso obteremos um número de 7 algarismos com maior precisão na identificação BACTRAY I ONPG ADH LDC ODC HS 2 URE VP PD IND CIT a. Após a interpretação das provas assinale com um círculo as provas positivas. Estas tem o valor numérico pré-estabelecido demonstrado acima. Executa-se as somas conforme sua disposição, ou seja 3 a 3, com exceção da última (CIT) que vale 1 se positiva, zero se negativa. 1b. A soma anterior nos fornecerá um número de 4 algarismos. 1c. Este número é lançado no manual onde encontramos as probabilidades de identificação. No exemplo acima citado (nº 5411), o manual identifica este microorganismo como sendo Klebsiella pneumoniae BACTRAY II MAL RHA ADO SAL ARA INO SOR SAC MAN RAF 2 BACTRAY II Para obtenção deste número com 7 algarismos acopla-se os valores obtidos no conjunto I com o II (figura acima), fazendo-se a união da prova do citrato (CIT) com as provas de malonato (MAL) e rhamnose (RHA). Segue-se como no item anterior 1c. * No exemplo acima obtivemos um algarismo de 7 dígitos, o qual lançado no manual nos fornecerá a identificação de Klebsiella pneumoniae. CET ACE MAL CIT MLT ESC CTL ARG URE IND a) Circunde as provas positivas, some conforme as disposições das provas no desenho acima (3 a 3). b) O número obtido (máximo de 3 algarismos), lance no manual de microorganismos oxidase positiva. c) Código de acesso ao manual: 713. Identificação: Pseudomonas aeruginosa. Bactray Instruções de uso Página 06

8 Provas bioquímicas dos microorganismos abrangidos pelo sistema Bactray I e II - Percentual de positividade considerando: ONP:ONPG ADH:ARGININA DEHIDROLASE LDC:LISINA DESCARBOXILASE ODC:ORNITINA DESCARBOXILASE. HS:GÁS 2 SULFÍDRICO URE:URÉIA VP:VOGES PROSKAUER PD:FENILALANINA DESAMINAÇÃO IND:INDOL CIT:CITRATO DE SIMMONS MAL:MALONATO RAM:RAMNOSE ADO:ADONITOL SAL:SALICINA ARA:ARABINOSE INO:INOSITOL SOR::SORBITOL SAC:SACAROSE MAN:MANITOL RAF:RAFINOSE Nome do organismo ONPG ADH LDC ODC H2S URE VP PD IND CIT MAL RHA ADO SAL ARA INO SOR SAC MAN RAF Pseudomonas luteola Pseudomonas oryzihabitans Acinetobacter baumannii Acinetobacter lwoffii Acinetobacter spp Acinetobacter spp Acinetobacter spp Acinetobacter spp Acinetobacter spp Acinetobacter spp Citrobacter amaloniticus Citrobacter diversus Citrobacter freundii Cedecea davisae Cedecea lapagei Cedecea neteri Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterobacter gergoviae Enterobacter sakazakii Enterobacter asburiae Enterobacter cancerogenus Escherichia coli Escherichia fergusonii Escherichia hermannii Escherichia vulneris Ewingella americana Edwardsiella tarda Edwardsiella hoshinae Hafnia alvei Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae Klebsiella pneumoniae Klebsiella rhinoschlero Klebsiella ornithinolytica Kluyvera ascorbata Kluyvera cryocrescens Moellerella wisconsensis Morganella morganii Pantoea dispersa Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus penneri Providencia rettgeri Providencia stuartii Providencia alcalifaciens Providencia rustigianii Rahnella aquatilis Salmonella choleraesuis Salmonella paratyphi a Salmonella typhi Salmonella gallinarum Salmonella grupo 3a Serratia fonticola Serratia liquefaciens Serratia marcescens Serratia odorifera Serratia odorifera Serratia plymuthica Serratia ficaria Serratia rubideae Shigella boydii grupo c Shigella dysenteride grupo a Shigella flexneri grupo b Shigella sonnei grupo d Leclercia adecarboxylata Stenotrophomonas maltophilia Tatumela ptyseos Yersinia enterocolitica Yersinia frederiksenii Yersinia intermedia Yersinia kristensenni Yersinia pestis Yersinia pseudotubberculosis Yokenella regensburgei Bactray Instruções de uso Página 07

9 Provas bioquímicas dos microorganismos abrangidos pelo sistema Bactray III - Percentual de positividade considerando: CET :CETRIMIDE ACE :ACETAMIDA MAL :MALONATO CIT :CITRATO MLT :MALTOSE ESC :ESCULINA CTL :CONT. DESCARBOXILASE ADH :L-ARGININA URE :URÉIA IND :INDOL Nome do organismo CET ACE MAL CIT MLT ESC CTL ARG URE IND Agrobacterium radiobacter * Alcaligenes faecalis * Alcaligenes piechaudii * Alcaligenes xylosoxidans denitrificans * Alcaligenes xylosoxidans xylosoxidans * Bergeyella zoohelcum * Bordetella bronchiseptica * Brevundimonas diminuta * Brevundimonas vesicularis * Burkholderia cepacia * Burkholderia gladioli * Burkholderia pickettii VA * Burkholderia pickettii VA * Burkholderia pickettii VA * Burkholderia pseudomallei * CDC grupo IVc * Chryseobacterium indologenes * Chryseobacterium meningosepticum * Comamonas acidovorans * Comamonas testosteroni * Empedobacter brevis * Flavobacterium odoratum * Methylobacterium * Moraxella lacunata * Moraxella osloensis * Ochrobactrum anthropi * Oligella urethralis * Pseudomonas aeroginosa * Pseudomonas alcaligenes * Pseudomonas fluorescens * Pseudomonas mendocina * Pseudomonas pseudoalcaligenes * Pseudomonas putida * Pseudomonas stutzeri * Shewanella putrefaciens * Sphingobacterium multivorum * Sphingomonas paucimobilis * Weeksella virosa * Chromobacterium violaceum * Pasteurella haemolytica * Pasteurella multocida * Pasteurella aerogenes * Aeromonas hydrophila * Plesiomonas shigelloides * Eikenella corrodens * Vibrio cholerae * Vibrio parahaemolyticus * Vibrio alginolyticus * Vibrio fluvialis * Vibrio hollisae * Vibrio metschnikovii * Vibrio mimicus * Vibrio vulnificus * Bactray Instruções de uso Página 08

10 OCS 0009 Rua Cassemiro de Abreu, 521 CEP Pinhais Paraná Serviço de Assessoria ao Cliente sac@laborclin.com.br LB rev 01-04/04