sistema de identificação versão 2.4 Bactray

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1 sistema de identificação versão 2.4

2 TÉCNICA PARA UTILIZAÇÃO DO BACTRAY I e II (Bactérias Gram negativas oxidase negativa) A) Método de incubação normal (18 a 24 horas) A1) Suspender em água destilada ou deionizada estéril (ph 6,8 a 7,2) a bactéria a ser identificada, de maneira a se obter uma turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala Mac Farland. Obs.: Inóculos com concentrações superiores podem induzir resultados insatisfatórios, assim como o uso de solução salina. Preferencialmente, utilize o crescimento de cultura recente (18-24 horas de incubação). A2) A suspensão acima deve ser bem homogênea, sendo aconselhável o uso de um agitador mecânico. Fig. 1 A3) Inocule 1,0 ml da suspensão bacteriana (A1) a cada conjunto ( I e II), após remover a tampa (fig. 1). A4) Inclinando para trás (fig.2) o conjunto, num ângulo de aproximadamente 45, incline para a esquerda, após para a direita, repetindo esta operação duas vezes, sempre mantendo o mesmo ângulo de inclinação (fig.3). Apoie o tray na mesa de trabalho e incline-o para frente de maneira a obter uma perfeita distribuição do inóculo em todos os substratos (fig. 4). Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 A5) Mantendo-o nesta posição, adicionar 3 gotas de óleo mineral estéril (ou mais se necessário) às provas bioquímicas sublinhadas (ADH, LDC, ODC, H2S, URE) (fig. 5). Obs.: É imprescindível que estes substratos estejam completamente vedados Fig. 5. A6) Recoloque a tampa (de maneira a se obter uma perfeita vedação) e incube o tempo desejado (neste caso, incubação normal de 18 a 24 horas). Recomenda-se incubar em câmara úmida para evitar ressecamento. A7) Após a incubação adicione 2 a 3 gotas dos reagentes necessários: Alfa Naftol e KOH no VP. Observar após 15 a 20 minutos de reação. Cloreto Férrico no PD. Aguardar 2 a 3 minutos para leitura da reação. Reativo de Kovac's no IND. Observar a formação de anel dentro de 2 minutos. instruções de uso página 01

3 B) Método enzimático (4 horas) Proceder como no item A1 à A7 com exceção da turvação, que deve ser igual ao tubo 2 da escala de Mac Farland, e da incubação de 4 horas ao invés de 24 horas. Neste caso, devemos verificar a presença de algum sinal de reação positiva (turvação). Quando isto não ocorrer, devemos reincubar por mais uma hora e adicionar os reagentes necessários. Caso os resultados não sejam satisfatórios, realize o método normal (18 a 24 horas). Fundamento das provas realizadas Teste ONPG Princípios físico-químicos A hidrólise da beta-galactosidase (o-nitrofenol-beta-d-galacto-piranoside) para galactose na presença do o-nitrofenol desenvolve cor amarela Componente Reativo ONPG ADH LDC ODC H 2 S Arginina dehidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia. Isto ocasiona uma elevação do ph do sistema com a conseqüente mudança do indicador de amarelo para púrpura. Lisina descarboxilase transforma a lisina num composto básico de amina primária (cadaverina) e Co 2. Esta amina produz uma elevação do ph do sistema com a conseqüente mudança do indicador de amarelo para púrpura. Ornitina descarboxilase transforma a ornitina num composto básico de amina primária (putrescina) e Co 2. Esta amina produz uma elevação do ph do sistema com a conseqüente mudança do indicador de amarelo para púrpura. O sulfeto de hidrogênio é produzido pela hidrólise enzimática do tiossulfato. Na presença do citrato férrico forma um precipitado negro. Arginina Lisina Ornitina Tiossulfato de sódio URE VP A urease hidrolisa enzimaticamente a uréia com produção de amônia e Co 2. Este é um teste para verificação da produção de acetoína, produto este intermediário da degradação da glicose. Sua presença é indicada pela cor vermelha ou rosa, formada pela reação do complexo hidróxido de potássio e alfa naftol. Uréia Glicose PD IND A desaminação da fenilalanina, produzida pelo ácido fenil pirúvico, forma uma cor verde na presença de cloreto férrico. A metabolização do triptofano pela triptofanase resulta na produção de indol formando um complexo de cor rosa ou vermelho com o reagente de Kovac's. L-fenilalanina Triptona CIT MAL RHA ADO ARA SAL INO SOR SAC MAN RAF Consiste na utilização de citrato como única fonte de carbono, o qual quando metabolizado, resulta num produto alcalino de coloração azul ou verde azulado. Consiste na utilização de malonato como única fonte de carbono, o qual quando metabolizado, resulta num produto alcalino de coloração azul ou verde azulado. Consiste na utilização de carboidratos com a concomitante produção de ácido, mudando o indicador de azul para amarelo. Citrato de sódio Malonato Rhamnose Adonitol Salicina Arabinose Inositol Sorbitol Sacarose Manitol Rafinose instruções de uso página 02

4 É interessante que o bacteriologista possua sempre mais informações que as fornecidas pelas reações bioquímicas (tais como origem e morfologia colonial), visando uma perfeita identificação final. Estas alternativas não são usadas como dados básicos computáveis e sim, consideradas como informações complementares para todas as identificações. Examine cuidadosamente todas as reações, pois não são idênticas às dos outros sistemas. As reações do BACTRAY devem ser definidas exatamente da maneira como se descrevem. Teste Positivo Negativo Observações ONPG amarelo inalterado Qualquer tonalidade de amarelo é considerada reação positiva. ADH LDC ODC púrpura Amarelo, marrom*, cinza, vermelho/vinho, amarelo 1. Positivo forte = púrpura escuro 2. Positivo claro = púrpura claro 3. Negativo = amarelo 3.1. Não fermentação de dextrose: a) Cinzento = característica de Acinetobacter sp b) -vinho-violeta = característica de Pseudomonas sp *3.2. Fraca fermentação da dextrose : Marrom avermelhado = característica de Serratia sp 3.3. Boa fermentação de dextrose: Amarelo ou amarelo = característica de E. coli (fracamente negativo) precipitado H 2 S negro URE * VP ou rosa ou rosa ausência de precipitado amarelo ou laranja inalterado * adicionar: 2 a 3 gotas de alfa naftol e 2 a 3 gotas de KOH a 40% Para obter uma boa leitura cobrir com óleo mineral estéril. Uma coloração marrom desenvolvida no meio é considerada reação negativa. Só reação de cor vermelha ou cereja é considerada positiva. Deve-se utilizar uma camada de óleo mineral estéril. Após 15 ou 20 minutos de reação. A observação de alguma tonalidade de vermelho ou rosa é considerada positiva. * PD verde amarelo * adicionar 2 a 3 gotas de cloreto férrico * IND CIT anel rosa ou vermelho * 2 a 3 gotas do reativo de KOVAC'S azul ou azul Anel amarelo verde Aguardar um ou dois minutos para leitura da reação. Tome cuidado pois esta reação desaparece em poucos minutos A reação ocorre dentro de dois minutos após adicionado o reagente. Fazer este teste por último Esta é uma reação aeróbia MAL Azul, verde escuro, azul Amarelo ou verde claro Organismos com crescimento lento podem demonstrar positividade como azul após 18 horas. RHA ADO SAL ARA INO SOR SAC MAN RAF Amarelo Verde ou azul A reação deverá ser lida dentro de 24 horas pois incubação mais longa pode provocar a alteração do meio para alcalino. instruções de uso página 03

5 Técnica para utilização do BACTRAY III (Bactérias Gram negativas oxidase positiva) As recomendações para o uso do I e II são válidas para este, exceto a selagem das provas bioquímicas (item A5) que estão sublinhadas, ou seja, controle dehidrolase (CTL), ARG e URE, onde se coloca 3 gotas de óleo mineral para cada reação. Após incubação (18 a 24 horas) verifique as reações ESC, CET e ARG. Se alguma delas for positiva, adicione o reagente para indol no pocinho apropriado e determine o código. Caso contrário, reincube por mais 24 horas. Após esta incubação, caso não haja crescimento, ou este tenha sido escasso, deve-se repetir a prova fazendo novo inóculo, usando-se soro fisiológico estéril (ao invés de água destilada). Este procedimento é realizado quando se suspeita de um microorganismo exigente, por exemplo, algumas espécies do gênero Vibrio. Fundamentos das provas bioquímicas Teste Observações Cetrimide Crescimento indica tolerância para cetrimide. Acetamida Malonato Citrato Maltose Esculina L-Arginina CTL (Controle) Uréia Indol A utilização destas substâncias como única fonte metabólica de carbono, produz a alcalinização do meio. Uma elevação do ph muda o indicador de verde para azul. A utilização de carboidratos resulta na produção de ácido, mudando o indicador (vermelho de fenol) de vermelho para amarelo, ou amarelo-alaranjado. A hidrólise da esculina é detectada pelo citrato férrico amoniacal, formando um precipitado negro. A arginina dehidrolase transforma a arginina em citrulina e amônia. Isto ocasiona uma elevação do ph do sistema, mudando o indicador de amarelo para alaranjado ou vermelho. Esta prova serve de branco para leitura da arginina. Observe a coloração deste controle. Caso a cor obtida na arginina seja de maior intensidade (vermelho, laranja ou rosa), esta é considerada positiva. A hidrólise enzimática da uréia pela urease resulta na produção de amônia e Co 2, mudando o indicador para vermelho. A desagregação (metabolização) do triptofano pela triptofanase resulta na produção de indol, formando um complexo de cor rosa para vermelho com o reagente de Kovac's. instruções de uso página 04

6 Interpretação das provas após incubação Teste Positivo Negativo Comentários Cetrimide Crescimento Ausência de crescimento A turvação (crescimento) fornece positividade à prova Acetamida Malonato Citrato Azul ou Azul Verde Alguma tonalidade de azul é considerada reação positiva Maltose Amarelo Amarelo alaranjado alaranjado Alguma tonalidade de alaranjado sugere a produção de ácido: considera-se positivo Esculina Marrom Negro Claro A Pseudomonas aeruginosa pode formar uma pigmentação marrom brilhante indicando a presunção duma reação positiva. Esta pigmentação, usualmente, forma um efeito de superfície fosca na área reativa que pode ser confundida como reação positiva. O positivo verdadeiro é mais escuro e difundido uniformemente, em toda a superfície L-Arginina Dehidrolase Rosa ou alaranjado Amarelo A interpretação da reação é baseada na coloração obtida no controle. Vide quadro abaixo. Uréia ou rosa Amarelo Alaranjado Qualquer tonalidade de vermelho observada é considerada reação positiva. Indol Anel Rosa ou Inalterado Para uma reação positiva existe uma demora de 2 minutos. CTL CONTROLE ARG Resultado 1) Amarelo Amarelo Negativo 2) Negativo 3) Laranja Laranja Negativo 4) Amarelo Positivo 5) Laranja Positivo 6) Amarelo Rosa ou laranja Positivo instruções de uso página 05

7 Cálculo manual dos códigos 1. BACTRAY I ONPG ADH LDC ODC H2S URE VP PD IND CIT a. Após a interpretação das provas assinale com um círculo as provas positivas. Estas tem o valor numérico pré-estabelecido demonstrado acima. Executa-se as somas conforme sua disposição, ou seja 3 a 3, com exceção da última (CIT) que vale 1 se positiva, zero se negativa. 1b. A soma anterior nos fornecerá um número de 4 algarismos. 1c. Este número é lançado no manual onde encontramos as probabilidades de identificação. No exemplo acima citado (nº 5411), o manual identifica este microorganismo como sendo Klebsiella pneumoniae. 2. BACTRAY I e II Neste caso obteremos um número de 7 algarismos com maior precisão na identificação BACTRAY I ONPG ADH LDC ODC H2S URE VP PD IND CIT BACTRAY II MAL RHA ADO SAL ARA INO SOR SAC MAN RAF Para obtenção deste número com 7 algarismos acopla-se os valores obtidos no conjunto I com o II (figura acima), fazendo-se a união da prova do citrato (CIT) com as provas de malonato (MAL) e rhamnose (RHA). Segue-se como no item anterior 1c. * No exemplo acima obtivemos um algarismo de 7 dígitos, o qual lançado no manual nos fornecerá a identificação de Klebsiella pneumoniae. BACTRAY III CET ACE MAL CIT MLT ESC CTL ARG URE IND a) Circunde as provas positivas, some conforme as disposições das provas no desenho acima (3 a 3). b) O número obtido (máximo de 3 algarismos), lance no manual de microorganismos oxidase positiva. c) Código de acesso ao manual: 713. Identificação: Pseudomonas aeruginosa. instruções de uso página 06

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